Production de sinalbine extraite de graines de moutarde blanche de
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Production de sinalbine extraite de graines de moutarde blanche de
FICHE D’APPLICATION Benoît PINEL1, Jérémy MEUCCI1, Olivier SUAREZ1, François DE LA POYPE1, Alix TORIBIO2, Luc MARCHAL3, Jean-Marc NUZILLARD2, Alain FOUCAULT3 et Jean-Hugues RENAULT2 Production de sinalbine extraite de graines de moutarde blanche de l’échelle laboratoire à industrielle par CPC en mode échange d’ions forts RÉSUMÉ La purification à l’échelle pilote avec une productivité élevée du p-hydroxybenzylglucosinolate, ou sinalbine, un glucosinolate extrait des graines de moutarde blanche (Sinapis alba var. concerta, Brassicaceae) a été réalisée en utilisant une variante de la chromatographie à contre courant : la chromatographie de partage centrifuge en mode échange d’ions fort (SIXCPC, pour Strong Ion-eXchange Centrifugal Partition Chromatography). Initialement, l’isolement de la sinalbine a été effectué à l’échelle du laboratoire, obtention de 2,4 g sur un appareil FCPC® A200 de la société Kromaton, puis la montée en échelle a été réalisée avec un pilote CPC comportant une colonne de 5,7 litres permettant ainsi d’obtenir 70,3 g de sinalbine en moins de 3 heures. Une seconde montée en échelle permettant le passage éventuel d’un rotor de 5 litres à un rotor de 20 litres pourrait permettre de purifier 240 g par injection. Les résultats montrent que la production de sinalbine à l’échelle pilote, mais également industrielle, est envisageable par SIXCPC et donne ainsi accès à ces composés avec des puretés et des quantités permettant d’envisager des études pharmacologiques et de biodisponibilité. MOTS CLÉS Sinalbine, agent anticancéreux, chromatographie par échange d’ions forts, chromatographie de partage centrifuge, montée en échelle I - Introduction Evolution La Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) constitue une branche de la Chromatographie à Contre Courant (CCC). La CCC est une technique de chromatographie liquide-liquide sans support solide, basée sur les différences de partage des solutés entre deux phases liquides non miscibles, voir l’article « du milligramme au kilogramme : une technique séparative, la chromatographie à contre courant (NDR, en page 18 de ce numéro). Cette technique très capacitive présente de nombreux avantages, tels que : l’absence de support solide (celle-ci induisant l’absence de phénomènes d’absorption irréversible et/ou de dégradation des solutés et l’obtention de taux de recouvrement des produits injectés proches de 100 %), la possibilité d’atteindre des sélectivités très élevées, la possibilité de réaliser des montées en échelle de manière relativement aisée et une faible consommation de solvant. Comme pour les autres techniques de chromatographie liquide plus conventionnelles, il existe trois modes de développement en CCC et donc en CPC : le mode frontal, le mode par élution (phase normale et inverse) et le mode par déplacement (pH-zone refining et échange d’ions). De plus, ces différents modes peuvent être mis en œuvre sur une colonne unique. Les modes par élution et par déplacement sont les plus couramment utilisés. Nous allons développer plus particulièrement le déplacement par échange d’ions forts (SIXCPC) car celui-ci sera utilisé par la suite pour la séparation ainsi que la purification de glucosinolates (GSLs) tel que le p-hydroxybenzylglucosinolate (sinalbine). Les modes de développement par déplacement comme le SIXCPC (1) ou le pH-zone refining introduit par Ito et al. (2) présentent l’avantage de pouvoir atteindre des productivités très élevées, ce qui les rend particulièrement intéressants pour des utilisations industrielles. Le développement par SIXCPC fait intervenir des ions lipophiles appelés « échangeurs » (Aliquat 336® ou chlorure de trioctylméthylammonium) présents en phase stationnaire organique, des espèces nommées « déplaceurs » (iodures) présentes en phase mobile aqueuse, et bien entendu les analytes qui doivent être sous forme ionique. Le mécanisme d’échange d’ions est le suivant : les analytes dissous dans de la phase mobile aqueuse (sans déplaceur) vont dans un premier temps « s’associer » avec l’échangeur lipophile. Ils seront alors extraits de la phase mobile aqueuse vers la phase stationnaire organique en fonction de leur constante d’association avec l’échangeur. Il en résulte un début de fractionnement de l’extrait injecté, dans la mesure où plus la constante d’association analyte/échangeur est grande, plus le composé sera extrait « tôt » dans la 1 Kromaton SARL – Atelier 3 – ZA Vernusson Pierre Martine – 39, rue Cugnot – Ste-Gemmes-sur-Loire 49130 – E-Mail : [email protected] www.kromaton.com 2 FRE CNRS 2715 – IFR 53 Biomolécules – UFR Pharmacie – Université de Reims Champagne-Ardenne – Bât. 18, Moulin de la Housse – BP 1039 – 51687 Reims Cedex 2 3 Laboratoire de Génie des Procédés-Environnement-Agroalimentaire – Université de Nantes – UMR CNRS 6144 – CRTT – BP 406-44602 – Saint-Nazaire Cedex SPECTRA ANALYSE n° 267 • Avril - Mai 2009 35 FICHE D’APPLICATION colonne. Dans un second temps, la phase mobile 2 (avec déplaceur) est pompée à travers la phase stationnaire,ledéplaceurs’associantpréférentiellement avec l’échangeur ce qui permet ainsi de déplacer les analytes vers la phase mobile, et ainsi de les mobiliser dans la colonne de CPC. Le principe de l’échange d’ions repose sur la combinaison des affinités des différentes espèces (force ionique) pour l’échangeur d’ions (et/ou la stabilité des espèces formées avec l’échangeur) ainsi que le caractère hydrophobe/hydrophile (KD) de chaque espèce. La présence du groupement sulfate (OSO3-) sur la partie aglycone des GSLs induit un caractère anionique fort, tandis que la partie glucosidique amène la forte hydrophilie. C’est pourquoi ces métabolites secondaires sont de bons candidats pour la technique SIXCPC. La Figure 1 illustre le processus chromatographique mis en œuvre pour la purification par SIXCPC de GSLs. Les GSLs sont des métabolites secondaires que l’on rencontre dans la plupart des Brassicaceae ou Crucifères ainsi que d’autres familles de plantes de l’ordre des Capparales. Ce sont des phytoanticipines : ils apparaissent au sein des vacuoles cellulaires dès le début de croissance de la plante et sont fabriqués en permanence, même en l’absence de substances pathogènes. Ils sont hydrolysés par une enzyme spécifique (la myrosinase) lorsque la plante est agressée. Le végétal libère alors des substances protectrices actives (isothiocyanates, dérivés indoliques, nitriles, thiocyanates) qui contribuent à sa défense. Ces composés libérés comme l’isothiocyanate de p-hyroxybenzyl possèdent des propriétés antimicrobiennes et anti-insecticides (3) tandis que le sulforaphane, dérivant de la glucoraphanine du brocoli, présente des propriétés anticancéreuses avérées (4). Les GSLs sont des esters de (Z)-N-hydroximinosulfate contenant un atome de soufre lié à une molécule de β-D-glucose et une chaîne latérale R variable. Le radical R peut être de nature aliphatique (saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié…), aromatique (phénolique, benzylé…) ou encore hétérocyclique indolique…) (5). Il existe plus de 120 GSLs différents recensés à ce jour. La plante herbacée dont nous allons extraire les GSLs et les purifier par SIXCPC est la moutarde blanche (Sinapis alba sp.). Elle contient une douzaine de GSLs, parmi eux, nous avons entrepris de purifier le glucosinolate majoritaire : la sinalbine (figure 2). Il est intéressant de noter que la propriété mise en œuvre pour purifier ce métabolite secondaire, à savoir la faculté des ammoniums quaternaires à s’associer avec les sulfates, est utilisée par la plante pour véhiculer la sinalbine. En effet, cette dernière est souvent associée à un ester aromatique de choline : la sinapine (figure 2). Différentes molécules telles que les GSLs ou encore les anthocyanes ont déjà été purifiées par la méthode SIXCPC sur un FCPC® A200 (6-8), c’est pourquoi nous allons utiliser cette même méthode pour la purification de la sinalbine issue des graines de moutarde blanche. Nous avons tout d’abord réalisé la purification de la sinalbine sur un appareil FCPC® A200 muni d’une colonne de 200 mL puis nous avons effectué une montée en échelle de cette purification en passant sur un appareil FCPC® B5000 comprenant un rotor de 5700 mL et enfin nous discuterons d’une industrialisation potentielle sur un FCPC® P20 comprenant un rotor de 20 L. L’objectif de cet article est de montrer que la montée en échelle de l’échelle laboratoire à pilote puis l’industrialisation est aisée sans modifier la pureté de la sinalbine obtenue et sans grande augmentation de temps de manipulation. II - Matériels et méthodes 1. Instrumentation Le chromatographe de partage centrifuge à l’échelle laboratoire est un FCPC® A200. Le rotor est composé de 20 disques de partage (1320 cellules de partage : 0,130 mL par cellule ; capacité totale de la colonne de 200 mL ; volume mort de la colonne de 32,3 mL). La distance entre le centre du rotor et chaque cellule est de 105 mm. La vitesse de rotation peut être ajustée de 0 à 2000 tpm (tours par minute), produisant Affinité pour l'échangeur zone D Phase stationnaire organique contenant l'échangeur (Ech+) Concentration dans la phase mobile aqueuse Phase mobile aqueuse contenant le déplaceur (Dépl-) zone n zone 2 zone 1 zone R Al336+ Al336+ Al336+ Al336+ Al336+ Dépl GSL0 GSL2 GSL1 Ret GSLnNa+ GSL2Na+ GSL1Na+ INa+ " Front de reteneur " " Front de déplaceur " Dépl Na+ GSLnNa+ CINa+ GSL2Na+ GSL1Na+ CINa+ Longueur de colonne Figure 1 Train isotactique de la sinalbine et ses métabolites dans le mode de déplacement par échange d’ions forts (SIXCPC). 36 SPECTRA ANALYSE n° 267 • Avril - Mai 2009 Fiche d’application Production de sinalbine extrait de graines de moutarde blanche de l’échelle laboratoire à industrielle par CPC en mode échange d’ions forts sinalbine OH 6' 4' O 1' 5' HO HO 3' 2' 2 5 3 OH N O3SO H 3C KA 1 (Château-Thierry, France), le filtrat a été évaporé jusqu’à obtenir un extrait sec de GSLs respectivement (102 g et 370 g). L’extrait a été stocké à -10 °C jusqu’à utilisation pour la purification par CPC. 6 OH O + N H3C CH 3 O sinapine OCH3 OH OCH3 Figure 2 Structure chimique de la sinalbine et de la sinapine. un champ de force centrifuge dans les cellules de partage d’environ 120 g à 1100 tpm et 420 g à 2000 tpm. Le FCPC® A200 est équipé d’une pompe binaire à gradient haute pression Dionex P580HPG 4 (Sunnyvale, Etats-Unis). La valve d’injection à basse pression Upchurch (CIL Cluzeau ; Sainte-Foy-La-Grande, France) est équipée d’une boucle d’injection de 21 mL. Le chromatographe de partage centrifuge à l’échelle pilote est un FCPC® B5000 développé par la société Kromaton SARL (Ste-Gemmes-sur-Loire, France). Il est équipé de deux rotors contenant chacun 20 disques de partage, chaque disque contient 27 cellules de partage (1080 cellules de partage : 4,13 mL par cellule ; capacité totale de la colonne de 5,7 L ; volume mort de la colonne de 1,232 L). La distance entre le centre du rotor et chaque cellule est de 142,5 mm. La vitesse de rotation peut être ajustée de 0 à 1200 tpm, produisant un champ de force centrifuge dans les cellules de partage d’environ 120 g à 900 tpm et 410 g à 1200 tpm. Le FCPC® B5000 est équipé d’une pompe Dynamax SD-1 avec une tête de pompe titan 800 (Varian ; Les Ulis, France). Le débit peut être ajusté de 0 à 800 mL/min. 2. Système biphasique de solvants Le système de solvants a été préparé en mélangeant dans une ampoule à décanter de l’acétate d’éthyle, du n-butanol et de l’eau dans les proportions (3:2:5, v/v). La phase mobile 1 (3,5 L) correspond à la phase aqueuse sans ajout d’iodure de potassium. La phase mobile 2 (4,5 L) correspond à la phase aqueuse avec ajout de 80 mM d’iodure de potassium. La phase stationnaire (6 L) est la phase organique avec ajout de 80 mM d’Aliquat 336®. 3. Extraits bruts de glucosinolates Des graines de moutarde blanche (Alpha semences ; Douai, France) respectivement 1,5 kg et 5 kg pour les manipulations sur FCPC® A200 et FCPC® B5000, ont été immergées dans un volume d’eau bouillante, de respectivement 9 L et 30 L, correspondant à six fois la masse de graines. Une fois la température abaissée à 70 °C, le mélange a été agité pendant 4h. Le surnageant a été séparé du mélange chaud par filtration (filtre papier Whatman No 4). Un volume équivalent d’éthanol a ensuite été ajouté trois fois pour précipiter les mucilages. Après séparation solide/liquide sur un séparateur Westfalia de type 4. Préparation des échantillons • Echantillon pour l’échelle laboratoire (FCPC® A200) : 12 g d’extrait brut de GSLs dissous dans 19 mL de phase mobile aqueuse 1 et saturés par 1 mL de phase organique stationnaire sans reteneur Aliquat 336®. • Echantillon pour l’échelle pilote (FCPC® B5000) : 341 g d’extrait brut de GSLs dissous dans 1200 mL de phase mobile aqueuse 1 et saturés par 10 mL de phase organique stationnaire sans reteneur Aliquat 336®. 5. Analyse des fractions de CPC Toutes les fractions CPC issues des FCPC® A200 et FCPC® B5000 ont été analysées par chromatographie sur couche mince sur des plaques de gel de silice Merck 60 F 254. Un mélange n-butanol/acide acétique/ eau (60:15:25 v/v) a été utilisé comme solvant d’élution et du nitrate d’argent ammoniacal comme agent révélateur. Après chauffage des plaques pendant 2 minutes à 120 °C, des tâches brunes correspondant à la sinalbine sont apparues. Le dosage de la sinalbine a été réalisé sur un système CLHP Dionex Summit équipé d’une pompe P580, d’un injecteur automatique ASI-100, d’un four à colonne STH, d’un détecteur à barrettes de diodes UVD340S et d’une colonne C18 Uptisphere 5HDO25QS (250×4,6 mm de diamètre interne, 5 μm de taille de particules ; Interchrom, Montluçon, France). Le solvant utilisé était composé de 10 mM d’Aliquat 336® dissous dans un mélange acétonitrile/eau 50:50 pompé à un débit de 1 mL/min. La détection UV est effectuée à λ=235 nm. La température du four a été fixée à 25 °C. Les données chromatographiques ont été enregistrées par le logiciel Chromeleon, version 6.0.1(Dionex). Les analyses RMN 1H, 13C, COSY (spectroscopie de corrélation), HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) et HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) ont été réalisées dans D2O sur un spectromètre Bruker (Wissembourg, France) Avance DRX 500 (1H à 500 MHz et 13C à 125 MHz). Les analyses de spectrométrie de masse ESI ont été réalisées sur un appareil Micromass (Guyancourt, France) Q-TOF (Quadripole - Time Of Flight) 6. Procédure de purification par CPC Les conditions expérimentales des manipulations sur FCPC® A200 et FCPC® B5000 sont résumées dans le Tableau I (voir page suivante). Les colonnes ont d’abord été remplies en mode descendant par de la phase stationnaire organique contenant le reteneur (Aliquat 336®). Les échantillons ont été injectés dans la colonne à des débits de 2 mL/min et 50 mL/min à 1200 tpm et 700 tpm, respectivement SPECTRA ANALYSE n° 267 • Avril - Mai 2009 37 FICHE D’APPLICATION pour les manipulations laboratoire et pilote. Ensuite, la phase mobile aqueuse 1 (sans déplaceur) a été pompée pendant 40 minutes avec les mêmes débits afin d’extraire les GSLs vers la phase stationnaire organique et éluer les impuretés polaires comme les polyphénols ou les sucres libres. Une fois ces impuretés éluées, la phase mobile 2 a été pompée pendant respectivement 40 et 50 minutes. Les fractions ont été récoltées toutes les minutes (échelle laboratoire) et toutes les 2 ou 5 minutes (échelle pilote) avant d’être analysées par CCM. III - Résultats et discussion L’objectif de cet article est de démontrer que le mode de développement SIXCPC peut être appliqué à la production de sinalbine à l’échelle pilote puis pourrait être envisagé à l’échelle industrielle. Le principal avantage du mode de développement par déplacement en CCC ou en CPC est son aspect capacitif. Le mode particulier par SIXCPC ne déroge pas à cette règle : il permet d’injecter jusqu’à 10 fois plus d’échantillon que le mode par élution. En effet, en SIXCPC ou en pH-zone refining, la colonne peut être remplie jusqu’à saturation de la phase stationnaire (la charge n’est limitée que par la solubilité de l’échantillon) sans diminuer le pouvoir de séparation. Capacité de la colonne CPC L’un des atouts majeurs de la CPC est la grande facilité pour l’utilisateur de réaliser la montée en échelle d’une manipulation. En effet, il suffit d’appliquer le principe de la linéarité des volumes entre des colonnes de différentes tailles pour trouver les nouveaux paramètres chromatographiques comme le débit de phase mobile ou la masse d’échantillon injectée. La purification de sinalbine par SIXCPC a été mise au point à l’échelle laboratoire. La Figure 3 (voir page suivante) montre le chromatogramme classiquement obtenu dans le cadre de ce type d’expérience. Il résulte de l’injection de 12 g d’extrait de graine de moutarde blanche. La quantité d’échangeur (Al336) a été calculée sur la base d’une teneur d’environ 20 % de GSL dans l’extrait. Des travaux précédents avaient montré qu’un rapport échangeur/analytes voisin de 4-5 était optimal. Les conditions expérimentales sont présentées dans le Tableau I. Les fractions éluées entre 127 et 162 min ont été rassemblées, évaporées à sec et ont fourni 2,35 g de sinalbine à 98 %. Comme précédemment expliqué, la transposition sur l’appareil pilote a été réalisée en appliquant le facteur de « scale-up » simplement calculé sur la base du rapport des volumes des colonnes laboratoire et pilote. Ce rapport est de 28,5, et il a été directement utilisé pour adapter la masse Echelle laboratoire Echelle pilote 200 mL 5700 mL Facteur de montée en échelle Echantillon Système biphasique de solvants Phase stationnaire (PS) Phase mobile (PM) ~28 12 g dans 1 mL de PS + 19 mL de PM sans déplaceur AcOEt / n-BuOH / eau 3:2:5, v/v (mode descendant) Phase organique supérieure + Al336 (80 mM) Phase aqueuse inférieure + NaI (80 mM) Après 60 min d’élution Teneur en GSL estimée Phase aqueuse inférieure + NaI (80 mM) après 40 min d’élution ~20 % (m/m) Ratio échangeur/GSL estimé Ratio déplaceur/GSL 341 g dans 100 mL de PS + 1,2 L de PM sans déplaceur 2,2 1 1 Débit 2 mL/min 50 mL/min Vitesse de rotation 1200 tpm 1000 tpm 71% 82% 23 bars 24 bars λ = 235 nm (UV, online) TLC (offline) Temps de collecte (volume) 2 min (4 mL) 5 min (250 mL) Masse de sinalbine obtenue avec une pureté > 98 % * 2,35 g (19,5 %) 70,3 g (20,6 %) Consommation totale de solvants 0,44 L 13,6 L Concentration en GSL dans les fractions en sortie de colonne 75 mM 79 mM Rétention de la phase stationnaire Perte de charge Système de détection Tableau I Conditions expérimentales des purifications de sinalbine effectuées sur FCPC® A200 et FCPC® B5000. * rendement par rapport à l’extrait brut 38 Pinel3.indd 38 SPECTRA ANALYSE n° 267 • Avril - Mai 2009 6/05/09 18:51:48 Fiche d’application Production de sinalbine extrait de graines de moutarde blanche de l’échelle laboratoire à industrielle par CPC en mode échange d’ions forts Etape de lavage : phase aqueuse sans déplaceur Etape de déplacement : phase aqueuse avec déplaceur (NaI) Absorbance (235 nm) 5000 4000 3000 Front de solvent 2000 Sinalbine 1000 -500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 182 Temps (min) Figure 3 Chromatogramme obtenue pour la purification de sinalbine extrait de graines de moutarde blanche. RMN 1H Analyse CLHP λ = 225 nm mAU 150 5,078 min 100 -20 0 7.0 5 10 15 min 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 ppm Rf sinalbine 0.18 19 20 21 22 24 25 26 28 30 31 32 Fractions CPC Figure 4 Fractogramme, chromatogramme de chromatographie liquide haute performance et spectre RMN 1H obtenue pour la sinalbine extraite des graines de moutarde d’échantillon injectée (341 g) et le débit de phase mobile (50 mL/min). Les concentrations d’échangeur et de déplaceur, ainsi que le champ de force généré par la colonne (F=ω2r) ont été conservés afin de garder constantes les conditions chromatographiques. Pour ce dernier aspect, un ajustement de la vitesse de rotation afin de tenir compte de la différence de rayon des deux rotors CPC a été réalisé. L’injection des 341 g d’extrait de GSL dans la colonne pilote de 5 litres a permis la séparation de 70,3 g de sinalbine, collectée entre 120 et 160 min, ce qui correspond à une productivité d’environ 560 g/ j. Le fractogramme obtenu par chromatographie sur couche mince est présenté Figure 4. Que ce soit pour la séparation à l’échelle du laboratoire ou pour celle à l’échelle pilote, la concentration en sinalbine dans l’effluent est d’environ 80 mM, c’est-à-dire égale à celle du déplaceur. Cette constatation confirme si besoin en était que le mode chromatographique en jeu relève bien du concept de déplacement. De manière prospective, il est aussi possible d’envisager la montée en échelle en réalisant la purification de sinalbine sur un appareil FCPC® de 20 L. Cette manipulation n’a pas encore été réalisée, toutefois le principe de la linéarité des volumes permet d’estimer les résultats que l’on SPECTRA ANALYSE n° 267 • Avril - Mai 2009 Pinel3.indd 39 39 6/05/09 18:51:51 FICHE D’APPLICATION Echelle labo. Echelle pilote Production Capacité de la colonne CPC 200 mL 5700 mL 20 000 mL Masse d’échantillon injectée 12 g 341 g 1193 g Montée en échelle ~ 28 x ~ 3,5 x Volume total de solvants consommés 0,4 L 13,6 L 46,7 L Masse totale de sinalbine purifiée avec une pureté > 98 % 2,35 g 70,3 g 238 g Rendement en sinalbine par rapport à la masse initiale de graines de moutarde 1, 33 % 1,52 % / Tableau II Résultats attendus de la montée en échelle de l’échelle pilote (FCPC® B5000) à industrielle (FCPC® P20). pourrait en attendre (tableau II). Le passage d’un volume de colonne de 5,7 L à 20 L représente une montée en échelle de 3,5×. IV - Conclusion Avant le développement récent d’appareils industriels de chromatographie de partage centrifuge tel que le FCPC® B5000, les études étaient limitées à la purification de molécules naturelles ou synthétiques à l’échelle laboratoire ou semi-préparative (9, 10). Dernièrement, quelques exemples d’applications industrielles de chromatographie à contre courant utilisant le mode par élution ont été publiés (11). En revanche, peu de procédures utilisant les modes par déplacement tel que le pH-zone refining ou l’échange d’ions ont été réalisées. Pourtant l’un des avantages majeurs de ces modes de développement est de pouvoir augmenter la capacité de chargement de la colonne permettant ainsi de conduire à de grandes productivités sans diminuer le pouvoir de séparation (12, 13). Cette étude a démontré que le mode de déplacement SIXCPC possède de nombreux atouts et qu’il est intéressant de l’utiliser à l’échelle industrielle car la montée en échelle est très aisée à mettre en œuvre. La purification de plus de 70,3 g de sinalbine (23,6 g/h), a facilement et rapidement été transférée et appliquée de l’échelle laboratoire à l’échelle pilote via le FCPC® B5000. En effet, la manipulation sur le FCPC® B5000, sans réelle étape d’optimisation, n’a duré que 0,2 h de plus que celle réalisée sur le FCPC® A200. Les rendements en sinalbine sont de 1,33 % avec le FCPC® A200 et 1,52 % avec le FCPC® B5000. On peut s’attendre à des rendements similaires en utilisant le FCPC® P20. Les résultats ont aussi montré que la SIXCPC est une méthode robuste et efficace qui peut être appliquée à différentes échelles du moment que les paramètres chromatographiques sont choisis avec soin (système biphasique, nature et concentration du déplaceur et de l’échangeur). BIBLIOGRAPHIE (1) MACIUK A. et al., Anal. Chem., 2005, 76, 6179-6186. (9) AUDO G., DE LA POYPE F., Spectra analyse, 2005, 243, 42-47. (2) ITO Y., MA Y., J. Chromatogr. A, 1996, 753, 1-36. (10) BOUAT-COTTARD S., BURGAUD H., Spectra analyse, 2005, 244, 42-45. (3) EKANAYAKE A. et al., Acta Hort., 2006, 709, 101-108. (4) HOLST B., WILLIAMSON G., Nat. Prod. Rep., 2004, 213, 425-447. (5) FAHEY JW et al., Phytochemistry, 2001, 561, 5-51, Review. (6) TORIBIO A. et al., J. Chromatogr. A, 2007, 1170, 44–51. (7) TORIBIO A. et al., In Macromolecules and Secondary Metabolites of Grapevine and Wines, Jeandet P. et al., Eds., Lavoisier Tec&Doc, Paris, 2007, 247-252. 40 SPECTRA ANALYSE n° 267 • Avril - Mai 2009 (11) FISHER D. et al., J. Liq. Chrom. Rel. Tech., 2005, 28, 1913-1922. (12) DU Q. et al., J. Chromatogr. A, 2005, 1074, 43-46. (13) ITO Y., J. Chromatogr. A, 2005, 1065, 145-168.