Rapport de synthèse BIO 12(17((12(05 (fr) - NF VALIDATION

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ACCREDITATION
N°1-0144
PORTEE DISPONIBLE
SUR WWW.COFRAC.FR
bioMérieux
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
NF VALIDATION
Validation des méthodes alternatives d’analyse
Application à la microbiologie alimentaire
Rapport de synthèse
Validation EN ISO 16140
de la méthode TEMPO® TC
pour le dénombrement des coliformes totaux
Ce document comprend 45 pages dont 1 annexe.
La reproduction de ce document n’est autorisée que sous sa forme intégrale.
L’accréditation du COFRAC atteste de la compétence du laboratoire pour les seuls essais
couverts par l’accréditation qui sont identifiés par le symbole.
Version 0
22 octobre 2013
ADRIA DEVELOPPEMENT
Creac’h Gwen - F. 29196 QUIMPER Cedex - Tél. (33) 02.98.10.18.18 - Fax (33) 02.98.10.18.08
E-mail : [email protected] - Site web : http://www.adria.tm.fr
ASSOCIATION LOI DE 1901 - N° SIRET 306 964 271 00036 - N° EXISTENCE 532900006329 - N°TVA FR4530696427100036
bioMérieux
Sommaire
1
RAPPEL SUR LA METHODE ALTERNATIVE _________________________ 6
1.1 Date de la première validation et date de reconduction ___________ 6
1.2 Protocole et principe de la méthode alternative __________________ 6
1.3 Méthode de référence à laquelle la méthode alternative a été
comparée _________________________________________________ 7
1.4 Principaux résultats obtenus lors de la validation initiale (2005), des
études d’extension (2011) et de reconduction (2013) _____________ 8
1.4.1 Etude comparative des méthodes (Validation initiale - 2005) ______ 8
1.4.1.1
Linéarité ______________________________________________________ 8
1.4.1.2
Exactitude relative _____________________________________________ 15
1.4.1.3
Complément d’étude d’exactitude sur les produits végétaux ____________ 21
1.4.1.4
Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ) _____________ 25
1.4.1.5
Sensibilité relative _____________________________________________ 26
1.4.1.6
Spécificité/Sélectivité ___________________________________________ 27
1.4.1.7
Praticabilité __________________________________________________ 28
1.4.1.8
Conclusion ___________________________________________________ 31
1.4.2 Etude d’extension (laits crus) – 2011 ___________________________ 32
1.4.2.1
Nombre et nature des échantillons ________________________________ 32
1.4.2.2
Résultats bruts ________________________________________________ 32
1.4.2.3
Interprétation _________________________________________________ 34
1.4.2.4
Conclusion ___________________________________________________ 36
1.4.3 Etude interlaboratoire _________________________________________ 37
2
1.4.3.1
Organisation de l’étude _________________________________________ 37
1.4.3.2
Contrôle des paramètres expérimentaux ____________________________ 38
1.4.3.3
Calculs et interprétation statistique (Etude de reconduction – 2013) ______ 40
1.4.3.4
Conclusion ___________________________________________________ 45
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE _____________________________________ 45
Annexe 1 – Méthode de référence NF ISO 4832 _________________________________________ 47
ADRIA Développement
(Synthèse TEMPO TC - Version 0)
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Avant Propos
L’ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des analyses
est tenu à la disposition de la Société bioMérieux.
Les résultats sont synthétisés au sein de tableaux et interprétés selon la norme
NF EN ISO 16140.
o Fabricant :
bioMérieux
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
o Laboratoire expert :
ZA Creac’h Gwen
29196 QUIMPER Cedex
o Méthode à valider :
Méthode TEMPO® TC pour le dénombrement
des coliformes totaux
o Référentiel de validation :
Norme NF EN ISO 16140 (octobre 2003) :
protocole pour la validation des méthodes
alternatives
o Méthode de référence :
NF EN ISO 4832 (février 2003) : directives
générales pour le dénombrement des coliformes méthode par comptage des colonies
o Etendue de la validation :
Tous produits d’alimentation humaine et
aliments pour animaux de compagnie
o Organisme de validation :
AFNOR Certification

Essai effectué sous le couvert de l’accréditation
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1
RAPPEL SUR LA METHODE ALTERNATIVE
1.1
Date de la première validation et date de reconduction
La méthode TEMPO® TC a été validée le 8 décembre 2005 (n° attestation
BIO 12/17 - 12/05). La méthode a été reconduite le 4 décembre 2009. Une
extension a été réalisée le 3 février 2011 afin d’étendre le champ
d’application à l’analyse des laits crus. La validation a été reconduite en
octobre 2013.
1.2
Protocole et principe de la méthode alternative
TEMPO® est une solution automatisée qui permet de réaliser le
dénombrement des germes indicateurs de la qualité sanitaire dans les
produits d’alimentation humaine et pour animaux de compagnie.
La numération des micro-organismes est basée sur la méthode NPP :
Nombre le Plus Probable associée à la technologie des cartes TEMPO®.
Le système TEMPO® réalise l’interprétation de la croissance microbienne de
chaque carte TEMPO® et calcule le résultat des numérations (UFC/g).
TEMPO® est composé en deux postes d'activité distincts :
- poste de préparation TEMPO® pour réaliser l’ensemencement, avec
distribution d'un échantillon alimentaire dilué dans un flacon de milieu,
puis remplissage et le scellage des cartes TEMPO® au moyen d'un
instrument : TEMPO® Filler.
- poste de lecture TEMPO® pour effectuer la lecture et l’interprétation des
cartes TEMPO® par l'intermédiaire d'un instrument : TEMPO® Reader.
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Le protocole général est présenté ci-après :
Préparation échantillon 1/10ème en sac TEMPO®
Diluant : peptone-sel
Dilution 1/4000
3,9 ml eau distillée
Dilution 1/400
Dilution 1/40
3,9 ml eau distillée stérile
3 ml eau distillée
®
en flacon TEMPO TC
0,1 ml suspension 1/100
0,1 ml suspension 1/10
1 ml suspension 1/10
dans flacon (une carte)
Incubation 24 h - 27 h à 30°C  1°C
Lecture
La dilution au 1/40ème permet une numération dans la gamme 10 à 49 000 ufc/g.
La dilution au 1/400ème permet une numération dans la gamme 100 à 490 000 ufc/g.
La dilution au 1/4000ème permet une numération dans la gamme 1 000 à
4 900 000 ufc/g.
1.3
Méthode de référence à laquelle la méthode alternative a été
comparée
La méthode de référence est la norme NF EN ISO 4832 (février 2003) :
directives générales pour le dénombrement des coliformes - méthode par
comptage des colonies. Le protocole est schématisé en annexe 1.

Essai effectué sous le couvert de l’accréditation
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1.4
Principaux résultats obtenus lors de la validation initiale (2005),
des études d’extension (2011) et de reconduction (2013)
1.4.1
Etude comparative des méthodes (Validation initiale - 2005)
1.4.1.1 Linéarité

Matrices utilisées et protocole de contamination
Cinq catégories de produits ont été analysées (une matrice par catégorie), à
cinq niveaux de contamination et deux répétitions ont été réalisées par
échantillon. Au total, 50 analyses ont été effectuées à la fois par la méthode
de référence et la méthode alternative.
Les niveaux de contamination, les matrices testées, ainsi que les souches
utilisées sont listés dans le tableau suivant :
Matrice testée
Souche
Taux d’inoculation
Steak haché
Klebsiella oxytoca 42
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Tablettes au bœuf pour chien
Citrobacter freundii 35
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Concombre tranché
E. coli 19
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Crème pâtissière
Enterobacter agglomerans 74
100 - 500 -1 000 - 5.103 - 5.104
Poisson cru
Enterobacter cloacae Ad 230
100 - 500 - 1 000 - 5.103 - 5.104
Une dilution 1/40 a été effectuée pour l’analyse d’échantillons inoculés à des
taux compris entre 100 et 5.103 UFC/g. Une dilution 1/400 a été effectuée
pour l’analyse d’échantillons inoculés à des taux compris entre 100 et
5.104 UFC/g. Une dilution 1/4000 a également été réalisée pour l’analyse
d’échantillons inoculés à des taux compris entre 5 000 et 5.10 4 UFC/g.
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
Résultats bruts
Les échantillons ont été testés en double par chacune des deux méthodes.
Deux interprétations de résultats ont été effectuées :
- Interprétation avec des dilutions combinées :
Niveau 1 : 1/40
Niveau 2 : 1/40
Niveau 3 : 1/400
Niveau 4 : 1/400
Niveau 5 : 1/4000
- Interprétation en minimisant la variation des dilutions :
Niveau 1 : 1/40
Niveaux 2-3-4-5 : 1/400
Les graphiques bidimensionnels pour chaque couple matrice / souche sont
donnés Figure 1.
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Figure 1 - Graphiques bidimensionnels
Dilutions combinées
Barres pour chien
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
log(Méthode alternative)
Steak haché
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
log(Méthode de référence)
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
9,00
5,00
4,00
3,00
1,00
5,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
3,00
1,00
4,00
7,00
4,00
2,00
3,00
6,00
5,00
2,00
2,00
5,00
Crème patissière
9,00
1,00
4,00
Concombres
0,00
0,00
3,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Filet de cabillaud
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
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Dilutions les plus usuelles
Barres pour chien
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
Steak haché
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
9,00
5,00
4,00
3,00
1,00
5,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
3,00
1,00
4,00
7,00
4,00
2,00
3,00
6,00
5,00
2,00
2,00
5,00
Crème patissière
9,00
1,00
4,00
Concombres
0,00
0,00
3,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Filet de cabillaud
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
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
Interprétation statistique
Les résultats des interprétations statistiques sont donnés dans les tableaux
suivants pour l’interprétation avec les dilutions combinées ou non.
- Dilutions combinées :
Matrice
Steak haché
Crème pâtissière
Concombres
Filet de cabillaud
Tablette au bœuf
pour chien
R
2,29
4,43
1,43
3,00
2,50
Régression
utilisée
OLS1
OLS1
GMFR
OLS1
OLS1
Rob.F
5,529
2,549
9,573
1,473
23,280
Valeur
critique
5,41
5,41
5,41
5,41
5,41
P%
5
17
2
33
0
Coefficient de
corrélation
0,987
0,972
0,994
0,990
0,982
Droite de régression*
log Alt= 0,072+0,980 log Réf.
log Alt= -0,133+1,071 log Réf.
* le choix de l’abscisse et de l’ordonnée dépend du type de régression retenue.
Interprétation statistique :
P5%
:
pas significatif
P<1%:
très significatif
1 % < P < 5 % : significatif
- Dilutions (1/40 – 1/400) :
Matrice
Steak haché
Crème pâtissière
Concombres
Filet de cabillaud
Tablette au bœuf
pour chien
R
4,86
6,29
2,57
3,00
7,75
Régression
utilisée
OLS1
OLS1
OLS1
OLS1
OLS1
Rob.F
0,231
2,055
3,921
1,907
5,152
Valeur
critique
5,41
5,41
5,41
5,41
5,41
P%
87
22
9
25
5
Coefficient de
corrélation
0,982
0,947
0,987
0,988
0,961
Droite de régression*
log Alt = 0,254+0,909 log Réf.
log Alt = -0,057+1,030 log Réf.
log Alt = -0,639+1,175 log Réf.
log Alt = -0,639+1,175 log Réf.
log Alt = -0,488+1,134 log Réf.
* le choix de l’abscisse et de l’ordonnée dépend du type de régression retenue.
Interprétation statistique :
P5%
:
pas significatif
P<1%:
très significatif
1 % < P < 5 % : significatif
Les droites de régression pour chaque couple matrice / souche sont
données Figure 2 (dilutions combinées ou non).
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Figure 2 - Droites de régression
Dilutions combinées
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Dilutions usuelles
Steak haché - Régression OLS 1
6,00
y = 0,9099x + 0,254
Alternative
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
Référence
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
Discussion
Les tests de linéarité sont acceptés d’emblée dans la plupart des cas :
- interprétations des dilutions 1/40 – 1/400,
- interprétations des dilutions combinées pour les matrices « steak haché »,
« crème pâtissière » et « filet de cabillaud ».
Dans la plupart des cas, les coefficients de corrélation sont supérieurs à
0,98, valeurs élevées pouvant mettre en défaut la robustesse des tests de
linéarité. Ainsi, la linéarité ne peut être réfutée pour les matrices concombres
et tablettes au bœuf pour chien lors de l’interprétation de dilutions
combinées.
Le test de linéarité est accepté dans tous les cas.
1.4.1.2 Exactitude relative

Nombre et nature des échantillons
Les catégories et types d’aliments analysés sont répertoriés dans le
tableau 1.
Tableau 1 - Nombre et nature des échantillons
Catégories
Produits carnés
Produits laitiers
Fruits et végétaux
Produits de la mer
Aliments pour animaux de
compagnie
Types
Viande crue - Charcuterie - Plats
cuisinés
Fromages au lait cru - Fromages
frais - Glaces - Divers
Légumes IVème gamme Déshydratés et divers - Congelés
Crus - fumés - plats traiteurs
produits déshydratés - pâtés viandes crues
Nombre
d’échantillons
analysés
Nombre de
résultats
exploités
18
10
27
10
22
10
19
14
27
10
Les échantillons non exploités sont dus à l’obtention de résultats inférieurs
ou supérieurs au seuil de numération de l’une et/ou de l’autre des méthodes.
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
Contamination artificielle des échantillons
Quatre échantillons ont été contaminés par contamination croisée :
- échantillons n° 1218 et 1219 : contaminés par du fromage au lait cru
- échantillons n° 1222 et 1223 : contaminés par un produit pour animaux de
compagnie cuit type saucisson.

Résultats bruts
Les échantillons ont été analysés en double par chacune des deux
méthodes.
Tableau 2
Catégorie d’aliments
Domaine de contamination (log)
Produits carnés
1,00 à 4,63
Aliments pour animaux de compagnie
1,00 à 5,43
1,85 à 6,15
Produits laitiers
1,52 à 5,48
Produits de la mer
1,40 à 5,04
Les graphiques bidimensionnels pour chaque catégorie et pour l’ensemble
des échantillons sont donnés Figure 3.
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Produits alimentation animale
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
Produits carnés
5,00
4,00
3,00
5,00
4,00
3,00
2,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
6,00
9,00
5,00
4,00
3,00
1,00
5,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
7,00
8,00
9,00
3,00
1,00
4,00
7,00
4,00
2,00
3,00
6,00
5,00
2,00
2,00
5,00
Produits laitiers
9,00
1,00
4,00
Produits végétaux
0,00
0,00
3,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Produits de la mer
Tous produits
9,00
9,00
8,00
8,00
7,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
6,00
1,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00
0,00
9,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
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
Interprétation
Tableau 3
Catégorie
n
R
Régression
utilisée
P%
a
t(a)
b
t(b)
T critique
Ordonnée
Pente à
à0
1
Produits carnés
10
2,15
OLS1
-0,357
0,097
0,864
1,224
2,306
93
26
Produits laitiers
10
1,32
GMFR
-0,166
0,397
1,052
0,430
2,306
70
68
10
3,90
OLS1
0,997
1,235
0,611
2,094
2,306
25
7
Produits de la mer
14
1,73
GMFR
-0,555
1,401
1,061
0,526
2,179
19
61
10
6,00
OLS1
0,0405
0,145
0,960
0,552
2,306
89
60
54
2,42
OLS1
0,184
0,835
0,855
2,397
2,00
41
2
Aliments pour animaux
de compagnie
Tous produits
Les limites de répétabilité obtenues pour la méthode alternative et la
méthode de référence ainsi que le biais D obtenu entre les deux méthodes
sont données dans le tableau 4.
Tableau 4
Biais D
Limite de répétabilité
méthode alternative
méthode de référence
Produits carnés
- 0,368
0,411
0,191
Produits laitiers
0,015
0,367
0,279
- 0,418
0,572
0,147
Produits de la mer
- 0,188
0,382
0,220
Aliments pour animaux de
compagnie
- 0,063
0,705
0,117
Toutes catégories confondues
- 0,303
0,435
0,176
Catégorie
Les droites de régression (sous la forme de graphiques et d’équations) pour
chacune des matrices et pour l’ensemble des matrices sont données
Figure 4.
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Figure 4 - Droites de régression pour chacune des matrices
et pour l’ensemble des matrices
Produits carnés - Régression OLS 1
Produits d'alim entation anim ale Régression OLS 1
6,00
6,00
y = 0,9597x + 0,0405
5,00
5,00
4,00
4,00
Alternative
Alternative
y = 0,8638x - 0,0347
3,00
2,00
1,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Référence
Produits végétaux - Régression OLS 1
Produits laitiers - Régression GMFR
6,00
y = 0,6109x + 0,9972
y = 1,0522x - 0,1655
5,00
4,00
4,00
Alternative
5,00
3,00
2,00
1,00
0,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00
1,00
Référence
3,00
4,00
5,00
6,00
Tous produits - Régression OLS 1
6,00
5,00
5,00
4,00
4,00
Alternative
6,00
3,00
2,00
y = 0,8551x + 0,1842
3,00
2,00
1,00
1,00
0,00
0,00
0,00
2,00
Référence
Produits de la m er - Régression GMFR
y = 1,0608x - 0,555
Alternative
2,00
Référence
6,00
Alternative
1,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
6,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Référence
Référence
1,00
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Certains écarts de dénombrements sont observés entre les deux méthodes :
- dénombrement supérieur par la méthode de référence :
 échantillon 505, jambon cuit
 échantillon 509, plat préparé à base de poisson
 échantillon 423, cubes de tomate
 échantillon 1130, betteraves rouges
 échantillon 1132, petits pois surgelés
Dans tous les cas, les colonies étaient de diamètre supérieur à 0,5 mm
sur gélose VRBL, avec une coloration rouge en absence d’auréole.
Des colonies ont été prélevées sur gélose VRBL : elles présentent toutes
une activité oxydase négative. Des caractérisations et identifications ont
été réalisées par galerie API. Ainsi, des souches montrant un phénotype
lactose négatif ont été identifiées aux espèces :


Enterobacter agglomerans pour l’échantillon 509, 423 et 1132
Serratia liquefaciens pour l’échantillon 1132.
- dénombrement supérieur par la méthode TEMPO® TC :
 échantillon 1218, glace à la vanille

Discussion
Les tests statistiques valident des ordonnées à l’origine proches de 0 et les
pentes proches de 1 pour chacune des catégories étudiées séparément.
Une dispersion des résultats est observée entre les deux méthodes pour la
catégorie végétaux. Cette dispersion semble être imputable aux
dénombrements de colonies caractéristiques avec toutefois absence
d’auréole sur gélose VRBL et montrant un phénotype [lactose] négatif. Si l’on
s’accorde sur le phénotype lactose positif des entérobactéries rassemblées
dans le groupe des coliformes, la méthode de référence montre alors un
manque de spécificité. Les biais entre les deux méthodes sont compris entre
-0,418 Log UFC/g et 0,015 Log UFC/g. Ces observations permettent
d’appréhender les résultats de tests statistiques indiquant une pente
différente de 1 pour toutes catégories confondues. Enfin, les limites de
répétabilité de la méthode alternative varient de 0,367 à 0,705, celles de la
méthode référence de 0,117 à 0,279. Les limites de répétabilité de la
méthode alternative sont supérieures à celle de la méthode de référence,
telle qu’observée de manière générale entre une méthode basée sur le
principe NPP et une méthode de dénombrement sur gélose (Gangar 1 et
Gambrel-Lenarz, 1999).
1
Gangar V., Curiale M.S., Lindberg K., Gambrel-Lenarz S. (1999) Dry rehydratable film method for
enumerating confirmed Escherichia coli in poultry, meats and seafood: collaborative study. J. AOAC
Int., 82 (1) :73-8
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1.4.1.3 Complément d’étude d’exactitude sur les produits végétaux

Protocole
Vingt produits végétaux ont été analysés en double, à la fois par la méthode
TEMPO® TC et par la méthode de référence NF EN ISO 4832, avec deux
marques de milieu VRBL afin d’évaluer la variabilité entre milieux provenant
de fournisseurs différents.

Résultats
Les échantillons analysés sont tous naturellement contaminés. Une attention
particulière a été portée à l’analyse de types peu représentés lors de l’étude
présentée le 19 septembre 2005, afin d’augmenter la variabilité des
matrices. Vingt-trois échantillons ont été analysés pour obtenir vingt-deux
résultats exploitables.
Les graphiques bidimensionnels sont donnés Figure 5. Deux représentations
et interprétations ont été réalisées pour le milieu A :
- la première en cumulant les données acquises lors du complément
d’étude à celles acquises lors de l’étude préliminaire, soit trente-deux
résultats,
- la deuxième avec uniquement les données du complément pour que cette
interprétation soit comparable à celle réalisée avec le milieu B.
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TEMPO® TC / VRBL A (22 échantillons)
TEMPO® TC / VRBL A (32 échantillons)
TEMPO® TC / VRBL B (22 échantillons)
TEMPO® TC / VRBL A / VRBL B
Produits végétaux
8
7
6
VRBL
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
TEMPO TC
VRBL A
22/45
VRBL B
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
Interprétation
Les interprétations relatives à l’acceptation des pentes à 1 et des ordonnées
à 0 sont indiquées ci-dessous :
n
R
Régression
a
+ (a)
b
+ (b)
Tcritique
P(0)
P (1)
utilisée
Milieu A
32
2,31
OLS1
0,374
0,824
0,814
1,836
2,042
42
8
Milieu B
22
1,42
GMFR
- 0,630
1,765
1,067
0,840
2,086
9
41
Milieu A
22
2,08
OLS1
- 0,022
0,066
0,940
0,795
2,086
95
43
Les limites de répétabilité pour la méthode alternative et pour la méthode de
référence, ainsi que le biais obtenu entre les deux méthodes sont donnés
tableau ci-après :
Biais D
Méthode alternative
Méthode de référence
Milieu A
(n = 32)
- 0,205
0,440
0,191
Milieu A
(n = 22)
- 0,140
0,396
0,191
Milieu B
(n = 22)
- 0,217
0,396
0,279
Les droites de régression pour chacune des interprétations sont reportées
Figure 6.
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Figure 6 - Droites de régression
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
Discussion
Les résultats obtenus avec les deux milieux VRBL montrent une différence
importante au niveau de l’ordonnée à l’origine : celle-ci est de - 0,630 avec le
milieu B et de - 0,022 avec le milieu A. Selon le nombre d’échantillons
considérés, les pentes varient de 0,814 à 0,940 lors d’une comparaison avec
le milieu A. Elle est de 1,067 pour le milieu B.
Le graphique bidimensionnel présenté figure 5 permet d’évaluer la variabilité
des résultats générés par la méthode de référence selon le milieu VRBL
utilisé, indiquant l’hétérogénéité de la flore dénombrée entre deux milieux
différents utilisés dans une même méthode de référence. Alors, selon le cas,
le dénombrement par la méthode TEMPO ® TC est davantage similaire à
celui obtenu sur milieu VRBL A, ou au contraire, à celui obtenu sur milieu
VRBL B.
1.4.1.4 Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

Protocole
La limite de détection de la méthode a été réalisée en cultures pures.
Trois niveaux d’inoculation ont été testés, à raison de six réplicats par
niveau, soit dix-huit analyses par la méthode alternative.
Une dilution 1/40 a été effectuée. Une souche d’E. coli a été utilisée pour la
limite de détection de la méthode TEMPO® TC.
La limite de quantification a été effectuée pour six déterminations
indépendantes de diluant stérile.
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
Résultats
Les données sont intrinsèques à la méthode. Les résultats sont donnés dans
les tableaux suivants :
Tableau 5
Niveau
0 UFC/g
10 UFC/g
50 UFC/g
Nombre
d’échantillons positifs
0/6
4/6
6/6
Ecart-type
Biais
/
12,785
207,29
/
10
71
Tableau 6
Formules
Valeurs obtenues
LC
1,65 S0 + X0
31,1
LOD
3.3 S0 + X0
52,2
LOQ
10 S0 + X0
137,9
1.4.1.5 Sensibilité relative
Les données sont intrinsèques à la méthode. Elles sont obtenues à partir
des résultats obtenus dans l’étude de linéarité.
Les profils de précision obtenus pour les différentes matrices sont présentés
figure 7.
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Figure 7 - Profils de précision obtenus pour les différentes matrices
100,0%
90,0%
80,0%
70,0%
CV(<x(y)>)
60,0%
Steak haché
Barres pour chien
Concombres
Filet de cabillaud cru congelé
Crème patissière
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
0
1
2
3
4
5
6
7
Méthode de référence log ufc/g (x)
1.4.1.6 Spécificité/Sélectivité

Protocoles d’essai
Après décongélation et cultures en bouillon BHI aux températures
appropriées, des dilutions décimales ont été effectuées et dénombrées en
double à la fois par la méthode TEMPO ® TC et la méthode ISO 4832. Un
dénombrement a été effectué en parallèle en gélose PCA par inclusion afin
de vérifier le taux d’inoculation.

Résultats d’inclusivité
Sur les 30 souches testées, 4 n’ont pas répondu par le système TEMPO ®
TC. Il s’agit de :
-
Enterobacter sakazakii 90, de phénotype lactose positif,
Escherichia hermanii 395, de phénotype lactose négatif,
Hafnia alvei 40, de phénotype lactose négatif,
Hafnia alvei 167, de phénotype lactose négatif.
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Sur la base de la définition du groupe des coliformes rassemblant des
entérobactéries de phénotype [lactose]positif, la croissance de trois de ces
souches sur gélose VRBL met en défaut la sélectivité de la méthode de
référence.
11 souches non cibles montrent une croissance sur gélose VRBL :
Lactobacillus paracasei ATCC 10746, Morganella morganii CIP A236,
Proteus mirabilis 54, Proteus vulganis 56, Providencia rettgeri 12,
Providencia stuartii 46, 3 souches de Salmonella, Shigella flexneri CIP 8248
et Xanthomaras maltophilia CIP 6077. La méthode TEMPO® TC détecte 5
d’entre elles : 3 souches de Salmonella, Lactobacillus paracasei ATCC
10746 et Proteus mirabilis 54.
La méthode TEMPO® TC montre une spécificité et une sélectivité
supérieures à celles de la méthode de référence, permettant d’expliquer
certains écarts de dénombrements entre les deux méthodes observés lors
de l’étude d’exactitude relative, principalement pour la catégorie Végétaux.
1.4.1.7 Praticabilité

Temps réel de manipulation et flexibilité de la technique par rapport au
nombre d’échantillons à analyser
Temps en minutes
Etape
Prélèvement
Ajout diluant
Broyage
Préparation
des boîtes (2)
Dilutions
Ensemencements
Lecture
Temps total
Temps pour
1 échantillon
(2)
Méthode NF ISO 4832
1 échantillon
20 échantillons
4
45
Méthode TEMPO TC
1 échantillon
20 échantillons
4
45
2
15
2
15
0,3
13
/
/
4
64
2
20
2,5
12,8
60
197
0,45
8,45
2
82
12,8
9,9
8,45
4,1
3 dilutions x 2 boîtes
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Les temps indiqués ne tiennent pas compte de la préparation des milieux qui
vient s’ajouter uniquement pour la méthode de référence. La méthode
TEMPO utilise le milieu TEMPO® TC qui est prêt à l’emploi.
L’utilisation de la méthode TEMPO® TC réduit considérablement les temps
de manipulation, en particulier au niveau du poste de lecture. Il faut deux fois
moins de temps pour réaliser la méthode TEMPO ® TC que la méthode
NF ISO 4832 lors de l’analyse d’une grande série (20 échantillons).
Il faut souligner également le gain de temps au niveau de la gestion des
déchets.
Le volume des consommables par la méthode TEMPO ® TC est négligeable
par rapport au volume des consommables nécessaires pour la méthode NF
ISO 4832. Pour un échantillon, il faut :
- pour la réalisation de la méthode TEMPO :
* 90 ml de diluant,
* 1 carte TC,
* 1 flacon TC,
- pour la réalisation de la méthode NF ISO 4832 :
* 90 ml de diluant,
* 2 tubes de TS de 9 ml,
* 6 boîtes de VRBL.
L’espace d’incubation nécessaire pour la méthode TEMPO ® TC est
particulièrement restreint par rapport à celui de la méthode NF ISO 4832. Un
portoir de 20 cartes TEMPO (20 tests TC) mesure 22,5 cm x 10,5 cm ; pour
la méthode NF ISO 4832 (analyse de 20 échantillons), il faut 120 boîtes, soit
20 piles de 6 boîtes de Pétri.

Délai d’obtention des résultats
Etape
Méthode NF ISO 4832
Méthode TEMPO TC
J0
J0
J1
J1
Prélèvement
Broyage
Analyse
Lecture
Le délai d’obtention des résultats est identique pour les deux méthodes.
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
Traçabilité des résultats
Une traçabilité complète est assurée au niveau du TEMPO Filler et du
TEMPO Reader, à savoir :
-
identification de l’échantillon,
heure de réalisation du test,
manipulateur ayant réalisé le test,
lots de réactifs et consommables utilisés,
durée d’incubation écoulée ou restant avant lecture des cartes,
heure de lecture des cartes,
nombre de lecture réalisée pour chaque carte
- manipulateur ayant réalisé la lecture,
- édition des résultats, associant le résultat (UFC/g) à l’échantillon, au
paramètre testé et à la date d’analyse,
- transfert possible vers un LIMS (Laboratory Information Management
System).

Maintenance par le laboratoire
Les performances du TEMPO Reader sont contrôlées une fois par mois à
l’aide du kit TEMPO QC qui est composé de :
-
3 flacons TEMPO QC 8 µM,
2 flacons TEMPO QC 20 µM,
3 cartes TEMPO QC 8 µM,
2 cartes TEMPO QC 20 µM,
1 notice.
Ce kit permet de vérifier que le niveau de fluorescence donné par le TEMPO
Reader se situe bien dans la plage de valeurs attendues, signifiant que
l’appareil est conforme.
®
L’intérêt majeur de la méthode TEMPO TC réside :
- dans le gain de temps important au niveau de l’analyse
et de la lecture,
- dans le gain de place à l’incubation des cartes TEMPO® TC
et la gestion facilitée des déchets,
- dans la traçabilité complète de l’analyse.
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1.4.1.8 Conclusion
La méthode TEMPO® TC montre une linéarité et une exactitude relative
satisfaisantes. Certains écarts de dénombrements sont observés entre les
deux méthodes, plus particulièrement dans la catégorie végétaux. Vingt
produits végétaux supplémentaires ont été analysés, par la méthode
TEMPO® TC et par la méthode de référence NF EN ISO 4832, avec deux
marques de milieu VRBL. Lors de la comparaison des données avec les
dénombrements issus de la méthode TEMPO ® TC, les résultats montrent
l’hétérogénéité de la flore dénombrée entre deux milieux différents utilisés
dans une même méthode de référence. Alors, selon le cas, le
dénombrement par la méthode TEMPO® TC est davantage similaire à celui
obtenu par l’un ou l’autre des milieux VRBL testés. Les identifications
menées à partir de colonies sur milieu VRBL indiqueraient de meilleures
sélectivité et spécificité de la méthode TEMPO ® TC en comparaison à celles
de la méthode de référence, méthode de référence dont les caractéristiques
de spécificité et sélectivité dépendraient de la marque de milieu utilisé.
Les limites de répétabilité de la méthode alternative sont supérieures à celle
de la méthode de référence, mais montrent des valeurs satisfaisantes.
Les biais entre les deux méthodes
-0,368 Log UFC/g et 0,015 Log UFC/g.
sont
faibles,
compris
entre
La méthode TEMPO® TC montre une sélectivité et spécificité satisfaisantes
L’intérêt majeur de la méthode TEMPO® TC réside :
- dans le gain de temps important au niveau de l’analyse
et de la lecture,
- dans le gain de place à l’incubation des cartes TEMPO® TC
et la gestion facilitée des déchets,
- dans la traçabilité complète de l’analyse.
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1.4.2
Etude d’extension (laits crus) – 2011
Lors de l’étude d’extension en 2011, seule l’étude d’exactitude relative a été
réalisée, le protocole à appliquer pour le lait cru étant identique à celui validé
pour les autres catégories de matrices
1.4.2.1 Nombre et nature des échantillons
19 échantillons ont été analysés ; 10 ont donné des résultats exploitables
par les 2 méthodes. 6 échantillons ont été contaminés artificiellement, 3 ont
donné des résultats exploitables.
Les souches inoculées, les stress appliqués ainsi que l’évaluation du stress
sont données ci-après :
Tableau 7
N°
Ech
Produit
Inoculations artificielles
Souche
Origine
Protocole de stress Stress
5100 Lait cru de vache
Escherichia coli 14
Lait cru
4°C 7 jours
0,5
Escherichia coli 94
Fromage Bethmal
4°C 7 jours
0,5
Escherichia coli E17
Lait cru
4°C 7 jours
0,5
Escherichia coli 14
Lait cru
4°C 7 jours
0,5
Escherichia coli 119
Lait cru
4°C 7 jours
0,5
Escherichia coli 94
Fromage Bethmal
4°C 7 jours
0,5
1.4.2.2 Résultats bruts
Le domaine de contamination se situe entre 2,15 et 3,81 log. Les graphiques
bidimensionnels pour la catégorie « Laits crus » sont donnés figure 8 et pour
tous produits figure 9.
A noter que des milieux VRBL de fournisseurs différents ont été utilisés
selon les échantillons :
- fournisseur A pour les échantillons n° 4714 à 4717,
- fournisseur B pour les échantillons n° 4912 à 5114.
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Figure 8 – Graphique bidimensionnel
Catégorie « Laits crus »
Tempo TC
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
Figure 9 – Graphique bidimensionnel
Catégorie « Tous produits »
Tous produits
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
33/45
8,00
10,00
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1.4.2.3 Interprétation
Tableau 8
Catégorie
n
R
Régression
utilisée
a
t(a)
b
t(b)
T
critique
Laits crus
10
2,89
OLS1
0,629
0,906
0,833
0,756
Tous produits
86
2,42
OLS1
0,143
0,792
0,889
2,336
P%
Ordonnée à
0
Pente à
1
2,306
39
47
1,989
43
2
Un dénombrement plus élevé des coliformes est observé pour la méthode
alternative, en particulier, pour les échantillons n° 4714, 4715 et 4912. A
noter que les deux premiers échantillons ont été analysés avec des géloses
VRBL provenant du fournisseur A, l’échantillon 4912 avec des géloses
provenant du fournisseur B.
Des identifications ont été réalisées pour ces échantillons à partir des puits
positifs observés sur les cartes TEMPO. Les résultats sont présentés ciaprès :
Tableau 9
N°
éch.
Dilution
Résultat
(UFC/g)
Isolement des puits moyens
positifs sur gélose COLI ID
Isolement des petits puits
positifs sur gélose COLI ID
4714-1
1/400
>490000
Présence de Coliformes et E. coli
4714-2
1/400
>490000
4715-1
1/40
=6000
Présence de Coliformes
Présence de Coliformes
4715-2
1/40
=12000
4912-1
1/40
1 500
/
4912-2
1/40
2 100
/
La présence de coliformes est bien confirmée dans les puits positifs.
Les mêmes constatations avaient été réalisées lors de l’étude initiale, en
particulier pour la catégorie « Végétaux », les différences observées entre la
méthode alternative et la méthode de référence dépendant de la marque de
la gélose VRBL utilisée dans la méthode de référence.
Les limites de répétabilité obtenues pour la méthode alternative et la
méthode de référence, ainsi que les biais D obtenus sont donnés ci-après :
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Tableau 10
Catégorie
Biais D
(médiane)
Répétabilité
méthode alternative
Répétabilité
méthode de référence
Laits crus
- 0,010
0,382
0,132
Tous produits
- 0,133
0,426
0,176
Les droites de régression sont données figure 10 pour la catégorie « Laits
crus » et figure 11 pour « Tous produits ».
Figure 10 – Droite de régression Catégorie « Laits crus »
Régression OLS 1
5,00
y = 0,8333x + 0,6287
Alternative
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
Référence
Figure 11 – Droite de régression
Catégorie « Tous produits »
Tous produits -Tempo TC- Régression OLS 1
y = 0,8899x + 0,1429
8,00
Alternative
6,00
4,00
2,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
Référence
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8,00
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Bien que le biais calculé entre les 2 méthodes soit faible, quelques écarts de
dénombrements sont observés entre les 2 méthodes. Les résultats des
confirmations montrent que la méthode TEMPO ® TC permet un meilleur
recouvrement des coliformes par rapport à la méthode de référence. La
limite de répétabilité de la méthode alternative est plus élevée que celle de la
méthode de référence.
L’équation de la droite de régression obtenue pour les laits crus est la
suivante :
log Alt = 0,833 log Réf. + 0,629
La droite de régression obtenue pour tous produits est la suivante :
log Alt = 0,889 log Réf. + 0,143
La méthode TEMPO® TC montre des résultats d’exactitude satisfaisants
pour l’analyses des laits crus.
1.4.2.4 Conclusion
La méthode TEMPO® TC donne des résultats de dénombrements parfois
supérieurs à ceux observés pour la méthode de référence, mais la présence
de coliformes a toujours été confirmée. Ces résultats avaient déjà été
observés lors de l’étude de validation initiale, en particulier pour les
végétaux.
Il est à noter que la limite de répétabilité observée pour la méthode
TEMPO® TC est supérieure à celle observée pour la méthode de référence.
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bioMérieux
1.4.3
Etude interlaboratoire
1.4.3.1 Organisation de l’étude
Douze laboratoires ont participé à l’étude. Des instructions détaillées ont été
transmises aux laboratoires par le laboratoire expert.
Du lait pasteurisé demi-écrémé a été inoculé par Escherichia coli 94, isolée
de produit laitier.
Les taux d’inoculation visés ont été les suivants :
- <10 UFC/ml,
- 100 – 1 000 UFC/ml,
- 1 000 – 10 000 UFC/ml,
- 10 000 – 100 000 UFC/ml.
Les échantillons ont été répartis à raison de 25 ml par flacon ; chaque
laboratoire a reçu deux flacons par taux. Un échantillon non inoculé a été
joint au colis pour dénombrement de la flore aérobie mésophile par la
méthode NF ISO 4833.
Les échantillons codés (code connu uniquement du laboratoire expert) ont
été placés dans des caisses isothermes contenant des blocs réfrigérants et
expédiés aux différents laboratoires à l’aide d’un transport express.
Un flacon témoin température contenant un enregistreur de température a
été joint au colis, afin de suivre la température au cours du transport et de la
mesurer à réception.
Les échantillons ont été livrés en 24 h aux laboratoires collaborateurs. La
température des échantillons devait être inférieure ou égale à 8°C pendant le
transport, et comprise entre 0°C et 8°C à l’arrivée.
Les laboratoires collaborateurs et le laboratoire expert ont effectué les
analyses à la fois par la méthode alternative et par la méthode de référence.
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1.4.3.2 Contrôle des paramètres expérimentaux

Stabilité de la souche au cours du transport
Afin de vérifier la stabilité de la souche d’Escherichia coli 94, un
dénombrement des six flacons inoculés a été effectué le jour de l’inoculation,
ainsi qu’après 24 h et 48 h de conservation à 2°C ; les résultats sont
reportés dans le tableau 11.
Tableau 11 - Dénombrement d’Escherichia coli 94
par la méthode NF EN ISO 4832 (en log UFC/ml)
Taux 1
Taux 2
Taux 3
Répétition 1
Répétition 2
Répétition 1
Répétition 2
Répétition 1
Répétition 2
J0
1,91
2,04
2,97
2,93
3,96
3,83
J1
1,89
1,77
2,92
2,99
3,83
3,90
J2
1,98
2,04
2,88
2,93
3,84
3,90
Aucune évolution de la souche n’est observée au bout de 48 h de
conservation dans la caisse isotherme.

Résultats obtenus pour les deux méthodes
Les résultats de dénombrement des coliformes par le laboratoire expert par
la méthode ISO 4832 et par la méthode TEMPO ® TC sont présentés dans le
tableau 8, ainsi que les résultats obtenus à partir des dilutions 1/40 et 1/400
pour la méthode TEMPO® TC.
Tableau 12 - Résultats du laboratoire expert (en log UFC/g)
Taux visé
(log UFC/g)
ISO 4832
Duplicat 1
<1
1à2
2à3
3à4
< 1,00
1,89
2,92
3,83
Duplicat 2
< 1,00
1,77
2,99
3,90
TEMPO® TC
Duplicat 1
Duplicat 2
D 1/40
D 1/400
D 1/40
D 1/400
< 1,00
< 1,00
< 2,00
< 2,00
1,85
2,08
2,00
< 2,00
2,92
2,86
2,93
2,86
3,83
3,83
4,32
4,08
Les taux de contamination visés ont été atteints.
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
Température des échantillons à réception
Les températures mesurées à réception sont données dans le tableau 13.
Tableau 13 - Température des échantillons à réception
Laboratoires
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L

Température mesurée
à réception (°C)
2,6
3,4
4,9
2,0
4,2
3,2
3,2
4,8
2,7
1,4
4,9
4,8
Date de réception
des échantillons
Date
d’analyse
J1 (18/10/2005)
J1 (18/10/2005)
Température des échantillons pendant le transport
Aucune anomalie n’a été observée pendant le transport ; la température
mesurée pendant le transport était comprise entre 0 et 3,5°C.
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1.4.3.3 Calculs et interprétation statistique (Etude de reconduction – 2013)
Les calculs ont été réalisés selon l’amendement 1 de la norme EN ISO
16140 (15 août 2011).
Définitions

Exactitude : « Etroitesse de l’accord entre un résultat d’essai et la
valeur de référence acceptée ».

Fidélité : « Etroitesse de l’accord entre les résultats d’essais
indépendants obtenus dans des conditions de répétabilité et de
reproductibilité stipulées ».

Répétabilité : « Etroitesse d’accord entre des résultats successifs et
indépendants obtenus avec la même méthode en utilisant un matériau
d’essai identique, dans des conditions identiques (appareillage,
opérateur, laboratoires et intervalles de temps courts, c’est-à-dire des
conditions de répétabilité) ».

Limite de répétabilité (r) : « Valeur inférieure ou égale à laquelle la
différence absolue entre deux résultats d’essai obtenus dans des
conditions de répétabilité est attendue avec une probabilité de 95 % ».

Reproductibilité : « Etroitesse d’accord entre des résultats d’essai
individuels effectués sur un matériau d’essai identique en utilisant la
même méthode et obtenus par des opérateurs de différents
laboratoires utilisant un équipement différent (c’est-à-dire dans des
conditions de reproductibilité) ».

Limite de reproductibilité (R) : « Valeur inférieure ou égale à laquelle la
différence absolue entre deux résultats d’essai obtenus dans des
conditions de reproductibilité est attendue avec une probabilité de
95 % ».
Synthèse des résultats obtenus par les deux méthodes
Une synthèse des résultats est présentée tableau 14 (résultats obtenus avec
la dilution 1/40 par la méthode TEMPO® TC) et tableau 15 (résultats obtenus
avec la dilution 1/400 par la méthode TEMPO® TC).
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Tableau 14 - Synthèse des résultats obtenus avec la dilution 1/40
par la méthode TEMPO® TC (en log UFC/g)
Niveau 0
Laboratoires Méthode de
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
Méthode
Méthode de
Méthode
Méthode de
Méthode
Méthode de
Méthode
référence
alternative
référence
alternative
référence
alternative
référence
alternative
A
<1
<1
<1
<1
2,00
1,95
2,00
1,85
2,90
2,96
2,97
3,23
3,95
3,95
4,08
3,72
B
<1
<1
<1
<1
2,04
2,00
2,00
2,11
2,93
2,98
3,04
3,04
4,00
3,92
4,32
4,04
C
<1
<1
<1
<1
1,93
2,00
1,86
2,11
2,71
2,83
2,86
2,72
3,85
3,85
3,96
4,08
D
<1
<1
<1
<1
1,98
1,90
1,64
2,00
2,91
2,91
3,00
2,72
3,89
3,95
4,08
4,04
E
<1
<1
<1
<1
2,04
2,11
1,77
1,84
2,93
2,93
2,92
2,86
3,93
3,99
4,04
3,89
F
<1
<1
<1
<1
1,88
1,95
2,00
1,85
2,83
2,90
2,80
2,86
3,94
3,93
4,04
4,08
G
<1
<1
<1
<1
1,98
2,11
2,04
2,04
2,80
2,90
3,11
2,76
3,85
3,77
3,96
4,32
H
<1
<1
<1
<1
2,00
1,78
2,15
2,15
2,77
2,82
2,96
3,00
3,89
3,95
4,32
4,40
I
<1
<1
<1
<1
2,08
1,95
2,08
1,85
2,86
2,95
3,04
3,04
3,93
3,94
4,08
4,18
J
<1
<1
<1
<1
1,81
1,85
1,00
1,86
3,04
2,90
2,86
2,92
3,85
3,87
3,96
3,89
K
<1
<1
<1
<1
1,98
1,85
1,93
1,77
2,90
2,91
2,92
3,08
3,89
3,95
4,08
4,04
L
<1
<1
<1
<1
2,04
1,93
1,65
2,11
2,92
2,97
2,95
3,08
3,96
4,00
4,18
4,48
Tableau 15 - Synthèse des résultats obtenus avec la dilution 1/400
par la méthode TEMPO®® TC (en log UFC/g)
Niveau 0
Laboratoires
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
Méthode
Méthode
Méthode
Méthode
Méthode
Méthode
Méthode
Méthode
de référence
alternative
de référence
alternative
de référence
alternative
de référence
alternative
A
<1
<1
<2
<2
2,00
1,95
<2
2,00
2,90
2,96
2,64
2,86
3,95
3,95
3,92
3,97
B
<1
<1
<2
<2
2,04
2,00
2,32
<2
2,93
2,98
2,76
2,65
4,00
3,92
4,00
3,91
C
<1
<1
<2
<2
1,93
2,00
<2
2,00
2,71
2,83
2,77
2,32
3,85
3,85
4,04
3,85
D
<1
<1
<2
<2
1,98
1,90
<2
2,32
2,91
2,91
2,77
2,85
3,89
3,95
4,08
4,18
E
<1
<1
<2
<2
2,04
2,11
<2
2,00
2,93
2,93
2,65
2,52
3,93
3,99
3,76
3,66
F
<1
<1
<2
<2
1,88
1,95
2,32
2,00
2,83
2,90
3,18
2,04
3,94
3,93
3,84
3,86
G
<1
<1
<2
<2
1,98
2,11
2,52
2,00
2,80
2,90
2,93
2,86
3,85
3,77
4,04
3,98
H
<1
<1
<2
<2
2,00
1,78
<2
<2
2,77
2,82
2,76
2,65
3,89
3,95
3,92
3,90
I
<1
<1
<2
<2
2,08
1,95
2,32
<2
2,86
2,95
2,51
2,95
3,93
3,94
4,11
3,81
J
<1
<1
<2
<2
1,81
1,85
<2
2,32
3,04
2,90
3,11
3,00
3,85
3,87
4,00
3,76
K
<1
<1
<2
<2
1,98
1,85
2,00
2,00
2,90
2,91
2,77
3,04
3,89
3,95
4,04
3,85
L
<1
<1
<2
<2
2,04
1,93
<2
<2
2,92
2,97
2,77
2,85
3,96
4,00
4,26
4,08
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bioMérieux
Comparaison des caractéristiques de justesse et de fidélité
de la méthode de référence et de la méthode alternative
Les valeurs statistiques sont résumées ci-après :
Niveau
Médiane
Ecart-type de
répétabilité
Ecart-type de
reproductibilité
Médiane
Ecart-type de
répétabilité
Ecart-type de
reproductibilité
1
1,971
0,082
0,104
1,926
0,202
0,198
2
2,909
0,066
0,077
2,960
0,125
0,134
3
3,229
0,039
0,049
4,060
0,151
0,191
Contrôle de la cohérence des résultats de mesurage
Des graphiques de cohérence ont été appliqués pour identifier les résultats
incohérents par rapport à l’ensemble des résultats : il s’agit des statistiques
robustes h (cohérence interlaboratoire) et k (cohérence intralaboratoire) de
Mandel.
Le nombre de valeurs situées au-dessus des seuils pour h et K est donné
dans le tableau ci-après :
Nombre de valeurs observées au-dessus du seuil
Valeurs de Mandel
h>1%
Labo G
Niveau 3
Labo J
Niveau 1
Labo C
Niveau 2
Niveau 3
Labo J
Niveau 1
Labo G
Niveau 3
Labo K
Niveau 1
Labo H
Labo K
Niveau 2
Niveau 1
h>5%
k> 1 %
/
k>5%
Labo I
Niveau 1
Tous les résultats ont été conservés pour l’analyse statistique.
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22 octobre 2013
bioMérieux
Comparaison des caractéristiques de justesse et de fidélité
de la méthode de référence et de la méthode alternative
 Biais de la méthode alternative
Afin d’estimer le biais de la méthode alternative par rapport à la méthode de
référence pour chaque niveau, Dij et t sont calculés selon les équations suivantes :


Dij  Y ij , Alt  Y ij , Ref
t
median i ( Dij )
 / (2 p)  Diff
Si la valeur de t est supérieure à 2, la méthode alternative est significativement
biaisée par rapport à la méthode de référence.
Les valeurs obtenues sont données dans le tableau 16.
Tableau 16 – Valeurs de t obtenues par niveau
Niveau de contamination
D (biais)
t
Conclusion
Niveau 1
- 0,0515
1,26
Biais non significatif
Niveau 2
0,0791
2,15
Biais significatif
Niveau 3
0,1552
2,83
Biais significatif
Le biais est non significatif pour le niveau 1, et significatif pour les
niveaux 2 et 3, avec des valeurs correctes (0,08 et 0,16 log UFC/g).
 Comparaison des écarts-types de répétabilité
Si le rapport des écarts-types de répétabilité de la méthode alternative et de la
méthode de référence est supérieur à 2, la fidélité dans les conditions de
répétabilité de la méthode alternative est considérée inférieure à celle de la
méthode de référence. Si ce rapport est inférieur à 0,5, la fidélité de la méthode
alternative est considérée comme supérieure à celle de la méthode de référence.
43/45
22 octobre 2013
bioMérieux
Les valeurs de ces rapports sont données dans le tableau 17.
Tableau 17
Niveau
Ecart-type de
répétabilité
Limite de
répétabilité
Ecart-type de
répétabilité
Limite de
répétabilité
Ratio méthode
alternative / méthode
de référence
1
0,082
0,230
0,202
0,566
2,476
2
0,066
0,185
0,125
0,350
1,904
3
0,039
0,109
0,151
0,423
3,847
La fidélité dans les conditions de répétabilité de la méthode alternative
est équivalente à celle de la méthode de référence pour le niveau 2 ;
elle est inférieure à celle de la méthode de référence pour les
niveaux 1 et 3.
 Comparaison des écarts-types de reproductibilité
Si le rapport des écarts-types de reproductibilité de la méthode alternative et de la
méthode de référence est supérieur à 2, la fidélité dans les conditions de
reproductibilité de la méthode alternative est considérée inférieure à celle de la
méthode de référence. Si ce rapport est inférieur à 0,5, la fidélité de la méthode
alternative est considérée comme meilleure que celle de la méthode de référence.
Les valeurs de ces rapports sont données dans le tableau 18.
Tableau 18
Niveau
1
Ecart-type de
Limite de
reproductibilité
reproductibilité
0,104
0,291
Ecart-type de
Limite de
reproductibilité reproductibilité
0,198
0,554
Ratio méthode
alternative / méthode
de référence
1,906
2
0,077
0,216
0,134
0,375
1,753
3
0,049
0,137
0,191
0,535
3,923
Les rapports des écarts-types de reproductibilité pour les niveaux 2 et 3 sont
inférieurs à 0,5
La fidélité dans les conditions de reproductibilité de la méthode
alternative est équivalente à celle de la méthode de référence pour les
niveaux 1 et 2 ; elle est inférieure à celle de la méthode de référence
pour le niveau 3.
44/45
22 octobre 2013
bioMérieux
1.4.3.4 Conclusion
Le biais est non significatif pour le niveau 1, et significatif pour les niveaux 2
et 3, avec des valeurs correctes (0,08 et 0,16 log UFC/g).
La fidélité dans les conditions de répétabilité de la méthode alternative est
équivalente à celle de la méthode de référence pour le niveau 2 ; elle est
inférieure à celle de la méthode de référence pour les niveaux 1 et 3.
La fidélité dans les conditions de reproductibilité de la méthode alternative
est équivalente à celle de la méthode de référence pour les niveaux 1 et 2 ;
elle est inférieure à celle de la méthode de référence pour le niveau 3.
2
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Une recherche bibliographique a été réalisée dans les banques de données
internationales : FSTA3, Biosis4, Medline5 et Foodline6. 5 articles ont été
recensés :
Références
Stecanella de Oliveira CattaniI C., Pinheiro
FuchsI I., CiroliniI A., Werneck VieiraI C.R.,
2013
Alternative methods for the enumeration of
microorganisms in swine carcasses
Cienc. Rural 43 (6), Santa Maria June 2013 Epub
May 28,
http://dx.doi.org/10.1590/S010384782013005000072
3
4
5
6
Résumés
Des échantillons de carcasses de porc ont été collectés
dans les abattoirs et analysés par l’Inspection Fédérale de
l’état de Santa Catarina au Brésil.
La flore aérobie mésophile, les Enterobacteriaceae et les
Escherichia coli ont été dénombrés par les méthodes
TEMPO®, Petrifilm™, ainsi que les méthodes
conventionnelles sur boite.
Après analyses statistique, les auteurs concluent que
les méthodes alternatives peuvent être recommandées
pour analyser les prélèvements dans les abattoirs.
IFIS, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0051.html
Biosis, une filiale de Thomson Scientific, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0005.html
U.S. National Library of Medecine, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0154.html
Leatherhead Food Research Center, http://library.dialog.com/bluesheets/html/bl0053.html
45/45
22 octobre 2013
bioMérieux
Références
Jackson, Emily E.; Erten, Edibe S.; Maddi,
Neeraj; Graham, Thomas E.; Larkin, John W.;
Blodgett, Robert J.; Schlesser, Joseph E.;
Reddy, Ravinder M, 2012.
Detection and Enumeration of Four Foodborne
Pathogens in Raw Commingled Silo Milk in the
United States
Journal of Food Protection®, 75 (8), 1382-1393
U. Zitz, K. J. Domig, A. Hoehl, H. Weiss, P-Th.
Wilrich, W. Kneifel, 2011.
Evaluation of three applications of a semiautomated most-probable-number method for the
assessment of microbiological parameters in
dairy products
Accreditation and Quality Assurance, 16 (6), 299309
Katase M, Tsumura K, 2011.
Enumeration of micro-organisms in processed
soy products with an automated most probable
number method compared with standard plate
method.
Lett Appl Microbiol, 53(5), 539-45.
Line JE, Stern NJ, Oakley BB, Seal BS., 2011.
Comparison of an automated most-probablenumber technique with traditional plating methods
for estimating populations of total aerobes,
coliforms, and Escherichia coli associated with
freshly processed broiler chickens.
Food Prot. 74(9), 1558-1563.
Résumés
Une étude a été menée pour déterminer les taux de
contamination des laits crus et pasteurisés. Les
dénombrements de flore totale aérobie, coliformes totaux,
Enterobacteriaceae, Escherichia coli et Staphylococcus aureus
ont été effectués avec le système TEMPO.
Il s’agit ici d’une simple utilisation des méthodes, sans aucune
conclusion sur les performances.
Les performances des méthodes TEMPO ont été évaluées par
comparaison avec les méthodes ISO correspondantes.
Des fromages à pâtes molles contaminés par du matériel de
référence avec E. coli ont été dénombrés par les méthodes
TEMPO EC, TEMPO TC et TEMPO TVC, ainsi que les
méthodes ISO.
TEMPO® EC apparaît être plus précis que TEMPO TC,
TEMPO TVC montrant le plus de variations. Les trois
méthodes apparaissent toutefois fiables et justes.
Le système TEMPO montre une praticabilité certaine.
Une étude de vérification a été menée sur des produits de soja
artificiellement contaminés, tels que les protéines de soja, du
soja hydrosoluble, des laits de soja, et des aliments processés à
base de soja.
Cinq types de micro-organismes ont été analysés par les
méthodes ISO et avec l’automate TEMPO : la flore aérobie
mésophile, coliformes totaux, Enterobacteriaceae, levures et
moisissures, ainsi que les Staphylococcus aureus.
Les résultats des méthodes correspondantes sont
fortement corrélés (r > 0·95).
Des échantillons naturellement contaminés ont également
été analysés, et aucun résultat discordant n’a été observé.
Les auteurs concluent que les méthodes TEMPO sont
équivalentes aux méthodes ISO pour l’analyse des produits
à base de soja, et offrent une meilleure praticabilité.
Les tests TEMPO et Petrifilm, ainsi que les méthodes sur boite,
ont été comparés pour le dénombrement de la flore aérobie
mésophile, des coliformes totaux et d’Escherichia coli au sein
de carcasses de poulets (120 échantillons), et d’échantillons de
poulet avant (36) et après l’étape de raidissage (40)
La corrélation entre TEMPO TVC et les méthodes
traditionnelles est élevée pour les échantillons préraidissage (0.972), avec des valeurs de dénombrements
variant entre 3.09 and 3.02 Log UFC/g. La corrélation est
plus faible pour les échantillons post-raidissage (0.710), les
niveaux de contamination étant plus faibles et moins
significatifs après transformation en log (entre 1.53 and
1.31 Log UFC/g). Les coefficients de corrélation sont
respectivement de 0.812 et 0.880 pour TEMPO TC et TEMPO
EC.
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bioMérieux
Annexe 1 – Méthode de référence NF ISO 4832
Suspension mère (produit solide)
Echantillon pour essai (produit liquide)
 et dilutions décimales en tryptone NaCl
1 ml par boîte

Ajout de 15 ml de milieu sélectif solide : gélose lactosée biliée au cristal violet
et au rouge neutre VRBL

Solidification

Ajout de 4 ml de VRBL (double couche)

Incubation 24 h  2 h à 30°C  1

Comptage des colonies caractéristiques
(violacées, d'un diamètre de 0,5 mm ou plus,
parfois entourées d'une zone rougeâtre)
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Rapport de synthèse BIO 12(17((12(05 (fr) - NF VALIDATION

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