TEMPO® EC - Adria Développement

Transcription

ACCREDITATION
n° 1-0144
PORTEE
COMMUNIQUEE
SUR DEMANDE
SOCIETE BIOMERIEUX
Service Recherche &
Développement Industrie
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
Validation AFNOR 16140
de la méthode TEMPO® pour le dénombrement
des Escherichia coli (TEMPO® EC)
Rapport de synthèse
Ce rapport comprend 36 pages dont 3 annexes.
La reproduction de ce rapport n’est autorisée que sous sa forme intégrale.
25 mai 2005
ADRIA DEVELOPPEMENT
Creac’h Gwen - F. 29196 QUIMPER Cedex - Tél. (33) 02.98.10.18.18 - Fax (33) 02.98.10.18.99
E-mail : [email protected] - Site web : http://www.adria.tm.fr - Site réservé adhérents : http://www.clubiaa.net
ASSOCIATION LOI DE 1901 - N° SIRET 306 964 271 00036 - N° EXISTENCE 532900006329 - N°TVA FR4530696427100036
Société BIOMERIEUX
Avant Propos
L’accréditation du COFRAC atteste de la compétence des laboratoires
pour les seuls essais couverts par l’accréditation qui sont identifiés par le
symbole .
L’ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des
analyses est tenu à la disposition de la Société BIOMERIEUX.
Les résultats sont synthétisés au sein de tableaux et interprétés selon la
norme NF EN ISO 16140.
ADRIA Développement
(Rapport de synthèse TEMPO® EC)
25 mai 2005
Sommaire
1
INTRODUCTION ________________________________________________ 2
2
PRESENTATION DES METHODES________________________________ 2
2.1 Méthode TEMPO EC _______________________________________ 2
2.2 Méthode de référence ______________________________________ 4
3
ETUDE COMPARATIVE DES METHODES __________________________ 4
3.1 Etude de linéarité _________________________________________ 4
3.1.1
Définition ________________________________________________ 4
3.1.2
Protocole ________________________________________________ 5
3.1.3
Résultats de l’étude de linéarité _______________________________ 5
3.2 Exactitude relative ________________________________________ 6
3.2.1
Définition ________________________________________________ 6
3.2.2
Protocole ________________________________________________ 6
3.2.3
Résultats ________________________________________________ 7
3.3 Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)_______ 9
3.3.1
Définitions _______________________________________________ 9
3.3.2
Protocole _______________________________________________ 10
3.3.3
Résultats _______________________________________________ 10
3.4 Sensibilité relative et détermination d’échantillons inconnus ____ 11
3.4.1
Définition _______________________________________________ 11
3.4.2
Résultats _______________________________________________ 11
3.5 Etude de spécificité et sélectivité ___________________________ 12
3.5.1
Définitions ______________________________________________ 12
3.5.2
Protocole _______________________________________________ 12
3.5.3
Résultats _______________________________________________ 12
3.6 Praticabilité _____________________________________________ 13
3.6.1
Temps réel de manipulation et flexibilité de la technique par rapport au
nombre d’échantillons à analyser_____________________________ 13
3.6.2
Délai d’obtention des résultats _______________________________ 14
3.6.3
Traçabilité des résultats ____________________________________ 14
3.6.4
Maintenance par le laboratoire_______________________________ 15
25 mai 2005
4
ETUDE INTERLABORATOIRE ___________________________________ 16
4.1 Protocole _______________________________________________ 16
4.2 Résultats _______________________________________________ 16
4.2.1
Exactitude relative ________________________________________ 17
4.2.2
Répétabilité _____________________________________________ 17
4.2.3
Reproductibilité __________________________________________ 18
4.2.4
Dispersion entre les laboratoires _____________________________ 19
5
DISCUSSION ________________________________________________ 20
6
CONCLUSION _______________________________________________ 21
Annexe 1 - Fiche technique TEMPO® EC __________________________________ 23
Annexe 2 - Résultats de l’étude de spécificité et de sélectivité__________________ 28
Annexe 3 - Liste des laboratoires collaborateurs _____________________________ 31
25 mai 2005
o Fabricant :
Chemin de l’Orme
69280 MARCY L’ETOILE
o Laboratoire expert :
ZA Creac’h Gwen
29196 QUIMPER Cedex
o Méthode à valider :
Méthode TEMPO® EC pour le dénombrement
des Escherichia coli
o Référentiel de validation : Norme NF EN ISO 16140 (octobre 2003) :
protocole pour la validation des méthodes
alternatives
o Méthode de référence♦ : NF EN ISO 16649-2 (juillet 2001) : Méthode
horizontale pour le dénombrement des
Escherichia coli β-glucuronidase positive Partie 2 : technique de comptage des colonies à
44°C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
β-glucuronate
o Etendue de la validation : Tous produits d’alimentation humaine et
alimentation pour animaux de compagnie à
l’exclusion du lait cru, des boissons et des
produits d’alimentation du bétail.
♦
NF ISO 16649-2 : essai réalisé dans le cadre de l’accréditation par le laboratoire expert
1
25 mai 2005
1
INTRODUCTION
La Société BIOMERIEUX a développé une méthode automatisée de
dénombrement basée sur la méthode NPP associée à la technologie des
cartes TEMPO.
Le système TEMPO interprète la croissance des micro-organismes et calcule
les résultats des numérations (UFC/g).
La Société BIOMERIEUX a obtenu la validation de la méthode
TEMPO EC pour le dénombrement des Escherichia coli dans les produits
d’alimentation humaine et dans les produits pour animaux de compagnie,
selon la norme ISO 16140.
L’étude a porté sur les points suivants :
-
linéarité,
exactitude relative,
limites de détection et de quantification,
sensibilité relative,
spécificité,
praticabilité,
étude interlaboratoire.
2
PRESENTATION DES METHODES
2.1
Méthode TEMPO EC
La fiche technique TEMPO EC est présentée en annexe 1.
TEMPO est une solution automatisée qui permet de réaliser le
dénombrement des germes indicateurs de la qualité en 24 h dans les
produits alimentaires tels que les produits laitiers, les volailles, les viandes,
les plats préparés, les confiseries, les surgelés et les aliments divers.
La numération des micro-organismes est basée sur la méthode NPP :
Nombre le Plus Probable associée à la technologie des cartes TEMPO.
2
25 mai 2005
Le système TEMPO réalise l’interprétation de la croissance microbienne de
chaque carte TEMPO et calcule le résultat des numérations (UFC/g).
TEMPO est composé de deux postes d'activité distincts :
- poste de préparation de TEMPO pour réaliser l’ensemencement, avec
distribution d'un échantillon alimentaire dilué dans un flacon de milieu,
puis le remplissage et le scellage des cartes TEMPO au moyen d'un
instrument : TEMPO Filler.
- poste de lecture de TEMPO pour effectuer la lecture et l’interprétation
des cartes TEMPO par l'intermédiaire d'un instrument : TEMPO Reader.
Le protocole détaillé est présenté ci-après :
Préparation échantillon 1/10ème en sac TEMPO
Diluant : peptone-sel
dilution 1/40ème
dilution 1/400ème
3 ml eau distillée stérile
en flacon TEMPO EC
1 ml suspension dans flacon
(une carte)
3,9 ml eau distillée stérile
en flacon TEMPO EC
0,1 ml dilution -2 dans flacon
(une carte)
↓
Incubation 24h - 27h à 37°C ± 1°C
↓
Lecture
La dilution au 1/40ème permet une numération dans la gamme 10 à
49 000 ufc/g.
La dilution au 1/400ème permet une numération dans la gamme 100 à
490 000 ufc/g.
3
25 mai 2005
2.2
Méthode de référence
La méthode de référence utilisée est la méthode NF ISO 16649-2 (juillet
2001) présentée ci-après :
Suspension mère et dilutions décimales en peptone-sel
↓
1 ml par boîte (2 boîtes par dilution)
↓
Ajout du milieu TBX
Micro-organismes stressés
↓
Incubation 4 h à 37°C ± 1°C
↓
Incubation 18 à 24 h à 44°C ± 1°C
(incubation maximale : 24 h)
Micro-organismes non stressés
↓
Incubation 18 à 24 h à 44°C ± 1°C
(incubation maximale : 24 h)
Dénombrement des colonies bleues
3
ETUDE COMPARATIVE DES METHODES
3.1
Etude de linéarité
3.1.1
Définition
La linéarité est définie comme l’aptitude de la méthode, pour une matrice
donnée, à fournir des résultats proportionnels à la quantité d’analyte
présente dans l’échantillon, c’est-à-dire qu’à une augmentation de l’analyte
correspond une augmentation linéaire ou proportionnelle des résultats.
4
25 mai 2005
3.1.2
Protocole
Cinq catégories de produits ont été analysées (une matrice par catégorie),
cinq niveaux de contamination ont été testés et deux répétitions ont été
réalisées par échantillon. Les niveaux d’inoculation sont environ :
-
≤ 50 UFC/g
100 UFC/g
500 UFC/g
1 000 UFC/g
5 000 UFC/g
La souche utilisée est Escherichia coli 1, souche isolée d’une matrice
alimentaire (saucisse de Toulouse).
Les matrices suivantes ont été utilisées :
3.1.3
steak haché,
croquettes pour chat,
carottes râpées,
crème pâtissière,
filet de poisson cru congelé.
Résultats de l’étude de linéarité
Un récapitulatif est donné dans le tableau 1.
Tableau 1 - Récapitulatif de l’étude de linéarité
Tests statistiques
Matrice
Régression
Non-linéarité
P%
Steak haché
OLS 1
3
Croquettes pour chat
OLS 1
4
Carottes râpées
OLS 1
9
Crème pâtissière
GMFR
3
Filet de poisson cru congelé
GMFR
100
Interprétation statistique :
P>5%
:
0,1 % < P < 1 % :
pas significatif
très significatif
1%<P<5%:
P < 0,1 %
:
5
significatif
hyper significatif
25 mai 2005
- Les valeurs de P sont supérieures à 5% pour les matrices suivantes :
carottes râpées et filet de poisson cru congelé.
Le test de non-linéarité apparaît non significatif, permettant de
conclure ainsi à la linéarité de la méthode TEMPO pour ces produits.
- Le test de non-linéarité apparaît significatif, au risque de 5% et non
significatif au risque de 1%, pour les matrices : steak haché,
croquettes pour chat et crème pâtissière.
Il est reconnu que le test de non-linéarité « lack of fit » utilisé est non
seulement très sévère, mais perd de sa robustesse lorsque le
coefficient de corrélation r est élevé (> 0.90). Or, le coefficient r est
supérieur à 0,96 pour les matrices suivantes : steak haché, croquettes
pour chat et crème pâtissière.
La méthode TEMPO EC montre une linéarité relative satisfaisante sur
l’ensemble des catégories testées.
3.2
Exactitude relative
3.2.1
Définition
L’exactitude est l’étroitesse de l’accord entre le résultat d’essai et la valeur de
référence acceptée.
3.2.2
Protocole
Cinq catégories de produits ont été testées, avec une répartition des produits
sur trois types différents (ex : frais, congelés, cuisinés, déshydratés, fumés,
etc ).
Dix résultats exploitables par catégorie ont été obtenus. Les analyses ont été
réalisées en double, à la fois, par la méthode TEMPO EC et la méthode
NF ISO 16649-2. Des produits naturellement contaminés et artificiellement
ont été analysés pour cette étude.
Pour les contaminations artificielles, des stress ont été appliqués aux
souches avant inoculation. L’intensité du stress a été déterminée par
différence de dénombrements entre milieux TSYEA et TBX.
6
25 mai 2005
3.2.3
Résultats
3.2.3.1 Mesure du stress
Les souches utilisées, les modes de stress appliqués, ainsi que l’évaluation
du stress figurent dans le tableau 2 (en fonction des numéros d’échantillons).
Tableau 2 - Souches utilisées, modes de stress appliqués
et évaluation du stress
N°
éch.
240
241
242
243
264
244
245
250
251
252
253
254
255
Souche
Origine
Contamination par
contact avec des laits
crus naturellement
contaminés
Stress appliqué
∆ log
(TSYE/TBX)
Congélation
/
E. coli 108
Bouchée
à la reine
Traitement thermique
56°C - 15 min
0,44
E. coli 144
Paella
56°C - 15 min
0,77
E. coli 19
Carottes
râpées
Congélation - 20°C
1 mois
1,45
271
E. coli 108
Bouchée à
la reine
272
E. coli 123
Foie de veau
273
E. coli 21
Poitrine de porc
demi-sel
274
E. coli 13
Steak haché
275
E. coli 13
Steak haché
276
E. coli 21
Poitrine de porc
demi-sel
277
E. coli 123
Foie de veau
278
E. coli Ad 228
Poisson
56°C - 15 min
56°C - 15 min
56°C - 15 min
56°C - 15 min
2 mois
2 mois
2 mois
Stress osmotique
(solution 35 °/°° NaCl)
Stress osmotique
(solution 35 °/°° NaCl)
279
280
293
294
E. coli 93
E. coli 19
Cabillaud aux
petits légumes
Dés de pommes
déshydratés
Dessiccation
1,09
0,39
0,47
0,78
3,5
1,49
1,84
0,36
> 3,15
(1)
(2)
(1) La contamination a été réalisée par contact avec une suspension bactérienne à 105/ml ;
le produit a ensuite été laissé à température ambiante pendant 24 h.
(2) Même protocole, mais analyse directement après contact.
7
25 mai 2005
3.2.3.2 Dénombrements
L’exploitation des données a été effectuée par catégorie d’une part, et sur
l’ensemble des résultats, d’autre part.
Le nombre d’échantillons analysés par catégorie et le nombre d’échantillons
exploités figurent dans le tableau 3.
Tableau 3 - Nombre d’échantillons analysés par catégorie
et nombre d’échantillons exploités
Catégorie
Nombre d’échantillons analysés
Nombre d’échantillons exploités
Produits carnés
11
10
Aliments pour animaux
de compagnie
10
10
Fruits et végétaux
26
10
Produits laitiers
11
10
Produits de la mer
17
10
Au total, 75 échantillons ont été analysés et 50 résultats ont été exploités.
Les échantillons non exploités présentent des résultats hors gamme
(<10 UFC/g).
Le récapitulatif est donné dans le tableau 4.
Tableau 4 - Récapitulatif de l’exactitude relative
Tests statistiques
Catégorie
Régression
Produits carnés
OLS1
Aliments pour
animaux de compagnie
Fruits et végétaux
OLS1
Equation de la droite
log TEMPO EC =
1,17 log ISO - 0,18
log TEMPO EC =
1,00 log ISO + 0,60
log ISO =
0,77 log TEMPO
0,31
log TEMPO EC =
0,93 log ISO + 0,46
log TEMPO EC =
0,81 log ISO + 0,65
log TEMPO EC =
0,99 log ISO + 0,35
OLS2
Produits laitiers
GMFR
Produits de la mer
OLS1
Tous produits
OLS1
Interprétation statistique :
P>5%
:
pas significatif
0,1 % < P < 1 % :
très significatif
1%<P<5%:
P < 0,1 %
:
8
EC+
Pente à 1
P%
Ordonnée à 0
P%
16
60
99
20
3
23
75
38
10
4
95
6
significatif
hyper significatif
25 mai 2005
Le biais entre les deux méthodes sur tous produits est de 0,26. Les limites de
répétabilité sont respectivement de 0,176 pour la méthode de référence et de
0,352 pour la méthode TEMPO EC.
La pente n’est pas significativement différente de 1,
- au risque de 1% pour toutes les catégories de produits testées
(P > 1%),
- au risque de 5% pour toutes les catégories testées, à l’exception des
fruits et végétaux (P = 3%).
L’ordonnée à l’origine n’est pas significativement différente de 0,
- au risque de 1% pour toutes les catégories de produits testés
(P > 1%),
- au risque de 5% pour toutes les catégories testées, à l’exception des
produits de la mer (P = 4%).
La méthode TEMPO EC présente une exactitude relative acceptable visà-vis de la méthode de référence ISO 16649-2.
3.3
Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)
3.3.1
Définitions
LIMITE DE DETECTION (LOD) :
La limite de détection est définie comme le niveau supérieur au niveau
critique. Le niveau critique étant la plus petite quantité qui peut être
détectée (non nulle), mais non quantifiée comme une valeur exacte. En
dessous de cette valeur, il ne peut pas être assuré que la valeur vraie est
non nulle.
LIMITE DE QUANTIFICATION (LOQ) :
La limite de quantification est définie comme la plus petite quantité
d’analyte (c’est-à-dire le plus petit nombre réel d’organismes) qui peut être
mesurée et quantifiée avec une exactitude et une fidélité définies dans les
conditions expérimentales de la méthode en cours de validation.
9
25 mai 2005
3.3.2
Protocole
La limite de détection a été réalisée à l’aide d’une culture de E. coli 1.
Plusieurs niveaux d’inoculation ont été testés, à raison de six réplicats par
niveau. Les dénombrements des suspensions ont été effectués en inoculant
30 fois 1 ml de chaque suspension en milieu PCA.
Six mesures indépendantes de diluant peptone-sel ont également été
réalisées afin de déterminer le bruit de fond.
3.3.3
Résultats
Les valeurs obtenues pour déterminer le bruit de fond sont : < 0,25 UFC/ml.
Pour l’interprétation statistique (calcul du LOD et LOQ), les données « < à »
ont été remplacées par la limite : soit 0,25 pour < 0,25.
Les valeurs obtenues sont alors les suivantes :
Taux
d’inoculation
UFC/ml
0,27
[0 2]
0,8
[0 3]
1,6
[0 4]
TEMPO EC
Moyenne
Médiane
SD
SD robuste
0,255
0,255
0,005
0,012
0,72
0,53
0,294
0,000
1,823
1,650
1,074
1,646
LOD
0,02
0,04 (rob)
0,97
0,00 (rob)
3,53
5,42 (rob)
LOQ
0,05
0,12 (rob)
2,94
0,00 (rob)
1,074
16,46 (rob)
La plage obtenue varie donc de 0,00 à 0,97 pour la limite de détection et de
0,00 à 2,94 pour la limite de quantification. Ces plages peuvent être
transformées en « taux d’inoculation » par régression linéaire à l’aide des
équations suivantes :
- équation de la droite obtenue avec les moyennes :
- équation de la droite obtenue avec les médianes :
y = 0,926x- 0,100
y = 0,950x - 0,037
Les plages obtenues sont :
⇒
⇒
LOD : 0,04 à 0,94 UFC/g
LOQ : 0,04 à 3,07 UFC/g
LOD = 0,49 UFC/g
LOQ = 1,55 UFC/g
Les valeurs de limite de détection et de limite de quantification
obtenues sont satisfaisantes.
10
25 mai 2005
3.4
Sensibilité relative et détermination d’échantillons inconnus
3.4.1
Définition
La sensibilité relative est définie comme la capacité de la méthode alternative
à détecter deux quantités différentes d’analytes qui ont été mesurées avec la
méthode de référence en utilisant une matrice donnée sur toute l’étendue de
mesure. C’est la variation de quantité minimale (accroissement de la
concentration d’analyte x) qui donne une variation significative du signal
mesuré (réponse y).
3.4.2
Résultats
Les profils de précision CV (< x (y) >) par rapport à x (y) pour les différentes
matrices testées sont les suivants :
Profils de précisions obtenus pour les différentes m atrices
80,0%
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
M ét ho de de r éf ér e n c e ( uf c / g)
St eak haché
Cr oquet t es pour chat
Carot t es r âpées
Crème pat issièr e
Filet de poisson cru congelé
Pour des dénombrements supérieurs à 100 UFC/g, les profils de
précision sont très satisfaisants.
Les écarts s’avèrent plus importants lors du dénombrement de
population de l’ordre de 10 UFC/g, mais sont corrects.
11
25 mai 2005
3.5
Etude de spécificité et sélectivité
3.5.1
Définitions
SPECIFICITE :
La spécificité est définie comme la capacité de la méthode à mesurer,
avec exactitude, un analyte donné ou sa quantité, dans l’échantillon, sans
qu’il y ait d’interférence avec les composants non ciblés, tels un effet de la
matrice ou un bruit de fond.
SELECTIVITE :
3.5.2
La sélectivité est définie comme la mesure du degré de non-interférence
en présence d’analytes non ciblés.
Protocole
Après décongélation et culture en bouillon BHI, 30 souches cibles et
20 souches non cibles ont été testées en double par la méthode alternative
et en simple par la méthode de référence.
Un dénombrement des suspensions a été également réalisé sur gélose PCA.
3.5.3
Résultats
Toutes les souches E. coli se développant par formation de colonies bleues
sur gélose TBX (β-glucuronidase positive) sont détectées par la méthode
TEMPO EC.
Pour la plupart des souches testées, le dénombrement est supérieur par la
méthode TEMPO EC que par la méthode ISO 16649-2 ; le dénombrement
TEMPO est davantage en accord avec le résultat obtenu sur gélose PCA.
Aucune souche non-cible n’a été détectée par la méthode TEMPO EC. Les
résultats sont en accord avec ceux de la méthode de référence.
La méthode TEMPO EC est spécifique et sélective.
12
25 mai 2005
3.6
Praticabilité
3.6.1
Temps réel de manipulation et flexibilité de la technique par rapport au
nombre d’échantillons à analyser
Temps en minutes
Etape
Prélèvement
Ajout diluant
Broyage
Préparation
1
des boîtes ( )
Dilutions
Ensemencements
Lecture
Temps total
Temps pour
1 échantillon
Méthode NF ISO 16649-2
1 échantillon 20 échantillons
4
45
Méthode TEMPO EC
1 échantillon 20 échantillons
4
45
2
15
2
15
0,3
13
/
/
4
64
2
20
2,5
12,8
90
227
0,45
8,45
2
82
12,8
11,4
8,45
4,1
Les temps indiqués ne tiennent pas compte de la préparation des milieux qui
vient s’ajouter uniquement pour la méthode de référence. La méthode
TEMPO utilise le milieu TEMPO EC qui est prêt à l’emploi.
L’utilisation de la méthode TEMPO EC réduit considérablement les temps de
manipulation, en particulier au niveau du poste de lecture. Il faut trois fois
moins de temps pour réaliser la méthode TEMPO EC que la méthode NF
ISO 16649-2 lors de l’analyse d’une grande série (20 échantillons).
Il faut souligner également le gain de temps au niveau de la gestion des
déchets.
Le volume des consommables par la méthode TEMPO EC est négligeable
par rapport au volume des consommables nécessaires pour la méthode NF
ISO 16649-2. Pour un échantillon, il faut :
- pour la réalisation de la méthode TEMPO :
* 90 ml de diluant,
* 1 carte EC,
* 1 flacon EC,
(1)
3 dilutions x 2 boîtes
13
25 mai 2005
- pour la réalisation de la méthode NF 16649-2 :
* 90 ml de diluant,
* 2 tubes de TS de 9 ml,
* 6 boîtes de TBX.
L’espace d’incubation nécessaire pour la
particulièrement restreint par rapport à celui de
Un portoir de 20 cartes TEMPO (20 tests EC)
pour la méthode NF ISO 16649-2 (analyse
120 boîtes, soit 20 piles de 6 boîtes de Pétri.
3.6.2
méthode TEMPO EC est
la méthode NF ISO 16649-2.
mesure 22,5 cm x 10,5 cm ;
de 20 échantillons), il faut
Délai d’obtention des résultats
Etape
Prélèvement
Broyage
Analyse
Lecture
Méthode NF ISO 16649-2
Méthode TEMPO EC
J0
J0
J1
J1
Le délai d’obtention des résultats est identique pour les deux méthodes.
3.6.3
Traçabilité des résultats
Une traçabilité complète est assurée au niveau du TEMPO Filler et du
TEMPO Reader, à savoir :
- identification de l’échantillon,
- heure de réalisation du test,
- manipulateur ayant réalisé le test,
- lots de réactifs et consommables utilisés,
- durée d’incubation écoulée ou restant avant lecture des cartes,
- heure de lecture des cartes,
- nombre de lecture réalisée pour chaque carte
- manipulateur ayant réalisé la lecture,
- édition des résultats, associant le résultat (UFC/g) à l’échantillon, au
paramètre testé et à la date d’analyse,
- transfert possible vers un LIMS (Laboratory Information Management
System).
14
25 mai 2005
3.6.4
Maintenance par le laboratoire
Les performances du TEMPO Reader sont contrôlées une fois par mois à
l’aide du kit TEMPO QC qui est composé de :
-
3 flacons TEMPO QC 8 µM,
2 flacons TEMPO QC 20 µM,
3 cartes TEMPO QC 8 µM,
2 cartes TEMPO QC 20 µM,
1 notice.
Ce kit permet de vérifier que le niveau de fluorescence donné par le TEMPO
Reader se situe bien dans la plage de valeurs attendues, signifiant que
l’appareil est conforme.
L’intérêt majeur de la méthode TEMPO EC réside :
- dans le gain
et de la lecture,
de
temps
important
au
niveau
de
l’analyse
- dans le gain de place à l’incubation des cartes TEMPO EC
et la gestion facilitée des déchets.
15
25 mai 2005
4
ETUDE INTERLABORATOIRE
4.1
Protocole
La matrice utilisée est du lait pasteurisé demi-écrémé.
Douze laboratoires ont participé à l’étude ; la liste est donnée en annexe 3.
4.2
Résultats
Le taux de contamination en flore aérobie mésophile de la matrice est de
1,2.106 UFC/ml.
Les résultats obtenus par les laboratoires collaborateurs sont récapitulés
dans le tableau 5.
Tableau 5 - Synthèse des résultats obtenus par
la méthode TEMPO EC (en UFC) et la méthode NF ISO 16649-2
Niveau 0
Laboratoires Méthode de
référence
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
Méthode
Méthode de
Méthode
Méthode de
Méthode
Méthode de
Méthode
TEMPO EC
référence
TEMPO EC
référence
TEMPO EC
référence
TEMPO EC
A
<10
<10
<10
<10
70
50
100
45
660
630
630
570 4300 3500 15000 6000
B
<10
<10
<10
<10
80
85
89
100
530
740
810
830 4700 3700 15000 7800
C
<10
<10
<10
<10
70
75
99
59
600
560
710
950 3400 3400 12000 11000
D
<10
<10
<10
<10
80
45
86
45
730
690
530
900 4400 4100 12000 11000
E
65
<10
<10
<10
<10
85
32
86
560
630
830
710 4800 4200 9100 6000
F
<10
<10
<10
<10
73
68
68
83
550
610
690 1100 7000 7100 6700 9000
G
<10
<10
<10
<10
35
80
68
33
650
690
930
570 4400 3000 12000 7800
H
<10
<10
<10
<10
65
45
73
21
590
470
710
570 5000 6900 11000 9100
I
<10
<10
<10
<10
45
65
71
71
700
510
830 1200 5300 4700 6100 7800
J
<10
<10
<10
<10
95
30
100
130
530
570
730 1100 7100 13000 15000 12000
K
<10
<10
<10
<10
55
70
71
33
360
490
790
810 4700 4600 7800 6000
L
<10
<10
<10
<10
45
65
89
33
430
620
930
830 1700 2300 7800 6000
16
25 mai 2005
4.2.1
Exactitude relative
L’exactitude est l’étroitesse de l’accord entre un résultat d’essai et la valeur
de référence acceptée.
Pour chaque niveau, la différence des moyennes des réplicats (di) obtenues
par la méthode alternative et la méthode de référence est calculée : di =
(Mi,alt - Mi, réf).
La médiane (MED {di} des di permet de déterminer le biais D
(MED{di} = biais D).
Le biais D et l’écart-type robuste S {di} = K1Sn donnent une statistique de
t (t(d) = MED{di} n /S{di}). Cette valeur de t obtenue est comparée à une
valeur critique trouvée
t critique = 2,201).
dans
la
table
de
Student
(pour
n=12,
Les valeurs de t(d) obtenues par niveau sont reportées dans le tableau 6.
Tableau 6 - Valeurs de t(d) obtenues par niveau
Niveau
Biais D
t(d)
t critique
Conclusion
0
/
/
/
/
1
0,02
1,011
2,229
Biais D
pour n = 11
non significatif
2
0,14
3,921
2,201
Biais D
pour n = 12
significatif
3
0,31
4,222
2,201
Biais D
pour n = 12
significatif
Niveau critique : t(d) < t critique
4.2.2
Répétabilité
La répétabilité est l’étroitesse d’accord entre des résultats successifs et
indépendants obtenus avec la même méthode en utilisant un matériau d’essai
identique, dans des conditions identiques (appareillage, opérateur,
laboratoires et intervalles de temps courts, c’est-à-dire des conditions de
répétabilité).
17
25 mai 2005
La limite de répétabilité (r) est la valeur inférieure ou égale à laquelle la
différence absolue entre deux résultats d’essai obtenus dans des conditions
de répétabilité est attendue avec une probabilité de 95 %.
Les valeurs obtenues pour la limite de répétabilité, ainsi que les valeurs
obtenues pour le test F sont données dans le tableau 7.
Tableau 7 - Valeurs obtenues pour la limite de répétatibilité
et valeurs pour le Test F
Limite de répétatibilité
Niveau
F
F
calculé
critique
0,82
3,06
2,82
3,8 %
0,15
0,32
4,84
2,69
0,5 %
0,22
0,32
2,15
2,69
10,0 %
Méthode
Méthode
de référence
alternative
1 (n = 11)
0,47
2 (n = 12)
3 (n = 12)
P%
Interprétation statistique
P > 5% : non significatif
1 % < P < 5 % : significatif
0,1 % < P < 1 % : très significatif
P < 0,1 % : hyper significatif
4.2.3
Reproductibilité
La reproductibilité est l’étroitesse d’accord entre des résultats d’essai
individuels effectués sur un matériau d’essai identique en utilisant la même
méthode et obtenus par des opérateurs de différents laboratoires utilisant un
équipement différent (c’est-à-dire dans des conditions de reproductibilité).
La limite de reproductibilité (R) est la valeur inférieure ou égale à laquelle la
différence absolue entre deux résultats d’essai obtenus dans des conditions
de reproductibilité est attendue avec une probabilité de 95 %.
Les valeurs obtenues pour la limite de reproductibilité, ainsi que les valeurs
obtenues pour le test F (comparaison des reproductibilités) sont données
dans le tableau 8.
18
25 mai 2005
Tableau 8 - Valeurs obtenues pour la limite de reproductibilité
et valeurs pour le Test F
Limite de reproductibilité
Niveau
F calculé
F critique
P%
0,72
3,91
2,97
2,1 %
0,18
0,29
2,57
2,82
6,6 %
0,39
0,41
1,11
2,82
43,5 %
donnés
dans
Méthode
Méthode
de référence
alternative
1 (n = 11)
0,37
2 (n = 12)
3 (n = 12)
Interprétation statistique
P > 5% : non significatif
1 % < P < 5 % : significatif
0,1 % < P < 1 % : très significatif
P < 0,1 % : hyper significatif
Les rapports
tableau 9.
répétabilité
/
reproductibilité
sont
le
Tableau 9 - Rapports répétatibilité / reproductibilité
Répétabilité/ reproductibilité
Limite de répétabilité
Niveau
Niveau 1
Niveau 2
Niveau 3
4.2.4
Méthode de référence
Méthode alternative
0,776
1,244
1,777
0,877
0,907
1,274
Dispersion entre les laboratoires
Ce test permet de vérifier que les différences entre laboratoires sont
inférieures à la dispersion interne typique de détermination :
F = 2 (Sb / Sr )2 avec ddl = n - 1 et ddl = n
variance des laboratoires : SL2 = Sb 2 −
Sr 2
2
Les résultats du test dont donnés dans le tableau 10.
19
25 mai 2005
Tableau 10 - Dispersion entre les laboratoires
Méthode de
Méthode
F critique
référence
alternative
(0, 0,5 ; n-1 ; n)
F calculé
F calculé
Niveau 3
4,88
1,87
2,86
Niveau 2
2,10
1,55
2,72
Niveau 1
5,32
2,25
2,72
La dispersion des résultats entre laboratoires est davantage homogène pour
la méthode TEMPO que pour la méthode de référence, quel que soit le
niveau.
5
DISCUSSION
Il apparaît que les dénombrements obtenus par la méthode TEMPO EC sont
légèrement supérieurs à ceux obtenus par la méthode de référence. Cette
observation avait d’ores et déjà été formulée dans le cadre de l’étude
préliminaire, plus particulièrement lors de l’étude de spécificité et de
sélectivité : les dénombrements des cultures pures obtenus par méthode
TEMPO EC étaient davantage en accord avec les dénombrements obtenus
sur gélose non sélective que ceux obtenus sur gélose TBX. Aucun résultat
faux positif n’est annoté par la méthode TEMPO sur le niveau 0 exempt d’E.
coli. La méthode TEMPO EC permet un meilleur recouvrement des
cellules E. coli.
Toutefois, les écarts de dénombrement observés entre la méthode de
référence et la méthode TEMPO EC sont rarement supérieurs à
0,5 log UFC/g. Ces observations permettent d’appréhender les biais
observés entre la méthode de référence et la méthode TEMPO EC lors du
calcul d’exactitude relative pour les niveaux 2 et 3.
La limite de répétabilité de la méthode TEMPO EC ne diffère pas de celle de
la méthode de référence pour le niveau 3. Elle n’apparaît pas
significativement différente au risque de 3,8 % pour le niveau 1. Elle diffère
pour le niveau 2 mais reste satisfaisante avec une valeur de 0,32.
20
25 mai 2005
La limite de reproductibilité de la méthode TEMPO EC ne diffère pas de celle
de la méthode de référence pour les niveaux 2 et 3. Elle n’apparaît pas
significativement différente au risque de 2,1 % pour le niveau 1.
Il est à noter que la méthode de référence et la méthode TEMPO EC, qui
sont comparées dans le cadre de cette validation, sont basées sur des
principes différents. Ces derniers sont respectivement le dénombrement
des colonies sur boîtes et le principe du Nombre le plus probable (NPP).
Ainsi, pour chaque grand puits positif supplémentaire dans une carte
TEMPO utilisée à la dilution 1/40ème, 14 à 15 UFC/g sont incrémentés
aux résultats. Au contraire, la méthode de référence s’appuie sur des
moyennes pondérées permettant de lisser les écarts présents sur les faibles
nombres. Les niveaux d’inoculation utilisés ont permis un dénombrement à
partir d’un faible nombre de dilutions successives (~2).
Ces observations permettent d’appréhender les différences entre les limites
de répétabilité et de reproductibilité observées entre les deux méthodes.
Toutefois, ces limites montrent des valeurs satisfaisantes pour la méthode
TEMPO EC.
La valeur du rapport « répétabilité/reproductibilité », souhaitée selon la
norme ISO 16140, est systématiquement observée pour tous les
niveaux testés par la méthode TEMPO EC.
Enfin, la dispersion des résultats entre laboratoires est meilleure par la
méthode TEMPO EC que par la méthode de référence pour l’ensemble des
niveaux testés.
6
CONCLUSION
L’intérêt majeur de la méthode TEMPO EC réside dans le gain de temps
important au niveau de l’analyse et de la lecture, dans le gain de
place à l’incubation des cartes TEMPO EC et la gestion facilitée des
déchets et dans la simplicité de mise en œuvre (les laboratoires
collaborateurs ont été formés en moins d’une journée).
La méthode TEMPO EC est spécifique et sélective. Lors de l’étude de
spécificité et sélectivité, les dénombrements des suspensions de cultures
pures sont apparus supérieurs par la méthode TEMPO EC que par la
21
25 mai 2005
méthode de référence ISO 16649-2, étant ainsi davantage en accord avec
les dénombrements obtenus sur gélose non sélective.
Les valeurs de limite de détection et de limite de quantification
obtenues apparaissent satisfaisantes.
La linéarité de la méthode TEMPO EC sur l’ensemble des catégories
testées ne peut être réfutée.
Les résultats de l’étude de sensibilité sont satisfaisants.
La méthode TEMPO EC présente une exactitude relative acceptable
vis-à-vis de la méthode de référence ISO 16649-2.
La méthode TEMPO EC permet un meilleur recouvrement des cellules
E. coli que la méthode de référence. Toutefois, les écarts de
dénombrement observés entre la méthode de référence et la méthode
TEMPO EC sont rarement supérieurs à 0,5 log UFC/g.
Les limites de répétabilité et de reproductibilité de la méthode TEMPO EC
sont équivalentes à celles de la méthode de référence pour certains
niveaux considérés au cours de ces essais. Ces limites restent
satisfaisantes, offrant systématiquement un rapport « répétabilité /
reproductibilité » inférieur ou égal à 2.
Enfin, la dispersion des résultats entre laboratoires est meilleure par la
méthode TEMPO EC que par la méthode de référence pour tous les
niveaux testés.
Fait à Quimper, le 25 mai 2005
Danièle SOHIER
Responsable de l’Unité IDEA
Interactions et Dynamique
des Ecosystèmes microbiens des Aliments
Département Recherche Innovation
22
25 mai 2005
Annexe 1 Fiche technique TEMPO® EC
23
25 mai 2005
24
25 mai 2005
25
25 mai 2005
26
25 mai 2005
27
25 mai 2005
Annexe 2 Résultats de l’étude de spécificité
et de sélectivité
28
25 mai 2005
Souches cibles
Référence
souche
Origine
PCA
ISO 16649-2
log ufc/ml
log ufc/ml
log 1
E.coli 1
log 2
Saucisse de Toulouse
8,87
8,89
8,89
9,08
E.coli 9
Rillettes d’oie
9,23
8,68
9,18
9,04
E.coli 12
Viande fibrée de dinde
9,08
<6
<6
8,88
TEMPO EC
colonies blanches
E.coli 13
Steak haché
9,15
8,70
9,23
9,18
E.coli 14
Lait cru
9,28
8,70
9,08
9,08
E.coli 17
Eau de source
9,28
8,53
9,48
9,32
E.coli 18
Eau
9,91
8,96
8,89
9,23
E.coli 19
Carottes râpées
8,76
8,34
9,04
8,89
E.coli 21
Poitrine demi-sel
8,96
8,61
8,87
8,53
E.coli 2B
Saucisse
8,81
8,76
8,96
8,96
E.coli 70
VSM
9,28
8,64
9,23
8,96
E.coli 91
Tomate farcie
9,36
6,65
6,32
6,52
E.coli 94
Bethmal
9,23
8,76
9,23
9,18
E.coli 96
Escalope de dinde
8,77
8,30
8,89
8,96
E.coli 97
Bleu de Causse
9,04
8,64
9,32
9,18
E.coli 101
Cervelle de porc
9,15
9,08
8,78
9,04
8,96
8,83
8,83
8,96
8,96
<6
<6
7,81
colonies à centre bleu pâle
E.coli 108
Bouchée à la reine
9,32
8,66
E.coli 143
Mayonnaise
9,20
colonies blanches contour
7,96
bleuté
8,76
E.coli 144
Paella
9,15
colonies blanches contour
bleuté
E.coli ATCC 43888
8,93
8,04
colonies blanches
E.coli Ad 217
E.coli Ad 222
Coule d’oeuf
E.coli Ad 223
E.coli Ad 228
9,20
8,63
9,32
8,96
9,20
8,76
9,18
9,04
9,18
8,71
9,18
9,04
9,11
8,26
8,89
8,96
E.coli CIP 54127
9,15
8,18
9,08
8,83
E.coli CIP 54117
9,28
8,56
9,23
9,04
E.coli CIP 7624
9,26
8,72
9,40
9,32
Poisson
29
25 mai 2005
Souches non cibles
Référence
souche
Origine
PCA
ISO 16649-2
TEMPO EC
log ufc/ml
log ufc/ml
log 1
log 2
Bacillus subtilis 630
Produit laitier
7,78
<6
<4
<4
Citrobacter diversus 140
Lait cru
9,11
<6
<4
<4
Citrobacter freundii 23
Saucisse de Toulouse
8,96
<6
<4
<4
Enterobacter aerogenes CIP 6086
8,45
<6
<4
<4
Enterobacter cloacae 10
8,48
<6
<4
<4
Enterobacter sakazakii D7
9,30
<6
<4
<4
9,04
<6
<4
<4
Enterococcus faecalis 25
Produit laitier
Erwinia carotovora CIP 103762
8,62
<6
<4
<4
Escherichia hermanii 395
Matière première viande
9,11
<6
<4
<4
Escherichia vulneris 127
Lait cru fermier
8,36
<6
<4
<4
Escherichia vulneris 132
Foie de veau
8,32
<6
<4
<4
Hafnia alvei 111
9,04
<6
<4
<4
Klebsiella oxytoca CIP 7932
8,70
<6
<4
<4
Klebsiella pneumoniae 47
8,90
<6
<4
<4
Kluyvera ascorbata CIP 8295T
8,75
<6
<4
<4
Proteus vulgaris 56
8,74
<6
<4
<4
8,72
<6
<4
<4
Alimentaire
Providencia stuartii 46
Rhanella aquatilis 69
Coquillages
8,38
<6
<4
<4
Serratia liquefaciens 26
Œuf
8,81
<6
<4
<4
8,57
<6
<4
<4
Shigella flexneri CIP 8248
30
25 mai 2005
Annexe 3 Liste des laboratoires collaborateurs
31
25 mai 2005
Nom du laboratoire
ACM VAL DE LOIRE
Contact
Monsieur PETAT
Adresse
30-32 Av. du 21 août 1994
45270 BELLEGARDE
Rue Drs Calmette & Guérin
ASEPT
Madame COIGNARD
BP 2047
53020 LAVAL Cedex 09
La Chantrerie
IDAC
Monsieur Th. VALLEE
Rte de Gachet - BP 80603
44306 NANTES Cedex 03
Domaine du Certia
INSTITUT PASTEUR DE LILLE - SERMHA
Madame EWE
369 Rue Jules Guesdes - BP 39
59651 VILLENEUVE D'ASCQ
Laboratoire Départemental
d'Hygiène du Tarn
Laboratoire Départemental Frank DUNCOMBE
LDA 01
Monsieur VIALA
Madame DIEULEVEUX
Monsieur DOREY
Madame DARBON
Monsieur BAROUX
LDV 19
Madame VERON
LDV 43
Monsieur FILLETON
N.Q.A.C. CERGY-NESTLE
Laboratoire de Microbiologie
32 rue Gustave Eiffel
81011 ALBI Cedex 9
1, Rte de Rosel
14280 SAINT CONTEST
Plateforme Alimentec
Rue Henri de Boissieu
01000 BOURG EN BRESSE
Le Treuil
19012 TULLE Cedex
16, rue de Vienne - BP 81
43000 LE PUY EN VELAY
Allée du Promenoir
Monsieur DEBERGHES
BP 8418
95806 CERGY POINTOISE CEDEX
Laboratoire R&D
ROQUEFORT, Société des Caves
Monsieur REVERBEL
Avenue de la gare
12250 ROQUEFORT S/SOULZON
SILLIKER
Madame GRAZIANA
Monsieur BARLET
32
Lab. Microbiologie
70 Mail Marcel Cachin 38600 FONTAINE
25 mai 2005

TEMPO® EC - Adria Développement

Transcription

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