Untersuchungen zur ebony Mutation der Taufliege Drosophila

Transcription

Untersuchungen zur ebony Mutation der Taufliege
Drosophila melanogaster
Dissertation zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie
der Ruhr-Universität Bochum
Angefertigt am
Lehrstuhl für Neurobiochemie
in der
Arbeitsgruppe von Professor Dr. Hovemann
Vorgelegt von
Arnd Richardt
aus
Bochum, Deutschland
Bochum, 2003
Mein Dank gilt Professor Dr. Hovemann für das anspruchsvolle Thema, sein Interesse an
meiner Arbeit und seine Diskussionsbereitschaft.
Professor Dr. Heumann danke ich für die Übernahme des Co-Referats.
Privatdozent Dr. habil. Klemens F. Störtkuhl danke ich für die vielen guten Ratschläge.
Stefanie Wagner gilt mein besonderer Dank für ihre hervorragende technische Assistenz.
Allen Mitgliedern der AG Hovemann möchte ich für das hervorragende, freundschaftliche
Arbeitsklima und die konstruktiven Diskussionen danken.
Den Mitgliedern der AG von Professor Dr. Marahiel (Philipps-Universität Marburg),
insbesondere Dr. Dirk Schwarzer, sowie der Arbeitsgruppe von Dr. Ian Meinertzhagen
(Dalhousie Universiät, Halifax, Kanada) danke ich für die gelungene Zusammenarbeit.
Der AG von Professor Dr. Feigel (Ruhr-Universität Bochum) danke ich für die Synthese der
Referenzsubstanzen.
Meiner Familie danke ich für die Unterstützung und das Interesse an meiner Arbeit.
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht, bzw. zur Veröffentlichung eingereicht:
Richardt, A., et al.; "Ebony protein in the Drosophila nervous system: Optic neuropile expression in glial cells";
J Comp Neurol (2002); 452 (1)
Richardt, A. et al; ”Ebony: a novel nonribosomal peptide synthetase for β-alanine conjugation with biogenic
amines in Drosophila”;
Eingereicht bei: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Für Denise
Inhalt
INHALT
1. EINLEITUNG
1
1.1 Die ebony Mutation
1
1.2 Lokalisierung und Charakterisierung des ebony Gens
3
1.3 Nichtribosomale Peptidsynthetasen
5
1.4 Phosphopantethein-Transferasen
8
1.5 Die Cuticula der adulten Drosophila melanogaster
8
1.6 Der Aufbau des visuellen Systems der adulten Drosophila melanogaster
11
1.7 Die visuelle Signaltransduktion
16
1.8 Zielsetzung
20
2. MATERIAL UND METHODEN
21
2.1 Material
21
2.1.1 Chemikalien, Seren und Antibiotika
21
2.1.2 Enzyme
22
2.1.3 Kits
22
2.1.4 Antikörper
23
2.1.5 Radioisotope
23
2.1.6 Verbrauchsmaterialien
24
2.1.7 Bakterienstämme
24
2.1.8 Fliegenstämme
25
2.1.9 Plasmide
26
2.1.10 Oligonukleotide
26
2.1.11 Häufig verwendete Puffer
26
2.1.12 Medien und Kulturplatten
27
I
Inhalt
2.2 Methoden
28
2.2.1 Methoden zur Untersuchung von Genexpression
28
2.2.1.1 Antikörper-Färbung auf Cryoschnitten
28
2.2.1.2 Antikörperfärbung von Embryonen
29
2.2.1.3 Antikörperfärbung von S2-Zellen
30
2.2.1.4 Detektion von β-Galaktosidase-Aktivität durch X-Gal-Färbung (Brand und Perrimon, 1993)
30
2.2.2 Molekularbiologische Methoden (Sambrook et al., 1989)
31
2.2.2.1 Restriktion von DNA
31
2.2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten
31
2.2.2.3 Ligation von DNA
32
2.2.2.4 Herstellung kompetenter Bakterien
32
2.2.2.4.1 Herstellung von Hitze-Schock kompetenten C600-Bakterien nach der CaCl2-Methode
33
2.2.2.4.2 Herstellung von Bakterien für die Elektroporation (DH 10B-Bakterien)
33
2.2.2.5 Transformation kompetenter Bakterien
33
2.2.2.5.1 Transformation von C600, TOP10 und BL21 durch Hitze-Schock
33
2.2.2.5.2 Transformation von DH10B durch Elektroporation
33
2.2.2.6 Plasmidaufreinigung aus E.coli (Birnboim und Doly, 1979)
34
2.2.2.6.1 Isolierung im kleinen Maßstab zur qualitativen Analyse
34
2.2.2.6.2 Präparative Isolierung im mittleren Maßstab
34
2.2.2.7 Isolierung von genomischer DNA aus adulten Drosophila Fliegen
35
2.2.2.8 PCR-Experimente (Saiki et al., 1985), modifiziert
35
2.2.3 Drosophila Schneider S2-Zellkultur (Schneider, 1972)
36
2.2.3.1 Haltung der S2-Kultur
36
2.2.3.2 Aufnahme eine Hygromycin B Titrationskurve
36
2.2.3.3 Transfektion von Schneider S2-Zellen
37
2.2.4 Proteinchemie
38
2.2.4.1 SDS-PAGE (Laemmli, 1970), modifiziert
38
2.2.4.2 Semi-Dry Western-Blot (Khyse-Anderson, 1984)
39
2.2.4.3 Proteinexpression in Drosophila Schneider S2-Zellen
40
2.2.4.4 Proteinexpression in E.coli BL21-pREP4-Gsp und C600
40
2.2.4.4.1 Auswahl eines Expressionsklons durch Western Blot Analyse
40
2.2.4.4.2 Optimierung der IPTG Konzentration
41
2.2.4.4.3 Optimierung der Induktionszeit
41
2.2.4.4.4 Präparative Expression mit optimierten Bedingungen
41
2.2.4.5 Proteinaufreinigung über Affinitätschromatographie
42
2.2.4.6 ATP-PPi-Austauschassay (Gevers et al., 1968; Lee und Lipmann, 1975)
43
2.2.4.7 Beladung mit radioaktivem [3H]-β-Alanin (Stachelhaus et al., 1996a)
43
2.2.4.8 Bestimmung von möglichen 2.Substraten
44
2.2.4.9 Identifizierung gebildeter Produkte durch Massenspektroskopie
44
2.2.5 Mikroinjektion von DNA in Drosophila-Embryonen (Steller und Pirrotta, 1984)
45
II
Inhalt
3. ERGEBNISSE
46
3.1 Vergleich der Anti-Ebony Färbung in Wildtyp-Fliegen mit der β-Galaktosidase Lokalisation
in der Transformande 120
46
3.2 Untersuchung der Ebony-Expression im Verlauf der Entwicklung von Drosophila
melanogaster
47
3.2.1 Ebony-Expression in Embryonen
47
3.2.2 Ebony-Expression in Larven
48
3.2.3 Ebony-Expression in der Puppe
49
3.2.4 Ebony-Expression in den optischen Loben der Imago
50
3.3 Bestimmung des Ebony exprimierenden Zelltyps in den optischen Loben von Drosophila
melanogaster
52
3.4 Untersuchungen zum Enhancer des ebony-Gens
54
3.4.1.1 Ergebnisse der Transformation
56
3.4.1.2 Lokalisation der Enhancer-Aktivität
58
3.5 Expression und Isolierung des Ebony-Proteins
59
3.5.1 Expression und Aufreinigung von Ebony aus S2-Zellen
60
611
3.5.2 Expression und Aufreinigung von Ebony und Ebony Ser -Ala aus BL21-pREP4-Gsp
62
3.5.2.1 Optimierung der bakteriellen Proteinexpression
64
3.5.2.1.1 Auswahl des Expressionsklons
64
3.5.2.1.2 Optimierung der IPTG-Konzentration und der Induktionszeit
64
3.5.2.2 Präparative Expression und Aufreinigung der Proteine
65
3.6 In vitro Charakterisierung der Ebony Reaktion
67
3.6.1 Aktivität und Spezifität der Adenylierungsdomäne
67
3.6.1.1 Bestimmung des Km Werts für die Adenylierung von β-Alanin
69
3.6.1.2 Einfluss von zweiwertigen Kationen auf die Adenylierungsreaktion
69
3.6.2 Die Thiolierungsreaktion
71
3.6.2.1 Beladung des Zellkultur-Proteins mit Ppant
71
3.6.2.2 Beladung der T-Domäne mit β-Alanin
72
3.6.3 Untersuchungen zur Produktbildung
73
3.6.4 Untersuchungen zur Spezifität der β-Alanylierungsreaktion
75
3.7 Identifizierung und Klonierung einer putativen PPT aus Drosophila melanogaster
79
3.8 Homologe Proteine zu Ebony und EAP in Anopheles gambiae
82
III
Inhalt
4. DISKUSSION
87
4.1 Ebony wird in Gliazellen der optischen Loben exprimiert
87
4.2 Ebony verwendet einen zu NRPS analogen Mechanismus, um biogene Amine mit β-Alanin
zu verknüpfen
88
4.3 Die Funktion von Ebony beim Aufbau der Cuticula
91
4.4 Die Funktion von Ebony in den optischen Loben
92
4.5 Mögliche weitere Funktionen von Ebony
94
4.6 Untersuchungen zum Enhancer von ebony
95
5. ZUSAMMENFASSUNG
98
6. ANHANG
100
6.1 Abbildungsverzeichnis
100
6.2 Literaturverzeichnis
102
6.3 Abkürzungsverzeichnis
111
6.4 Aminosäure-Kürzel
112
6.5 EAP-Sequenz
113
6.6 Hygromycin Titratrionskurve
114
6.7 Lebenslauf
115
IV
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Die ebony Mutation
Die Drosophila melanogaster Mutante ebony zeigt gegenüber dem Wildtyp eine Vielzahl von
Veränderungen, die sich auf die Cuticula, die optische Signalverarbeitung und das Verhalten
auswirken.
Auffälligstes Merkmal der ebony Mutation (Bridges und Morgan, 1923) ist die dunkel
gefärbte Cuticula der adulten Fliege, die auch die Grundlage für die Bezeichnung (in deutsch
„ebenholz“) bildet. Im Gegensatz zur dunkleren Cuticula der adulten Fliege ist die
Puppenhülle heller als bei der wildtypischen Fliege. Biochemische Untersuchungen zeigten,
dass sich in den Puppen der Mutante β-Alanin und Dopamin in doppelt so hoher
Konzentration wie in wildtypischen Fliegen anreichern (Hodgetts, 1972; Hodgetts und
Konopka, 1973). Gleichzeitig ist der Einbau von β-Alanin in die Puppenhülle jedoch reduziert
(Jacobs und Brubaker, 1963; Jacobs, 1966; Hodgetts, 1972). Elektronenmikroskopische
Aufnahmen der Cuticula adulter Fliegen zeigen bei der Mutante Störungen in der
Ultrastruktur der Chitinfasern, die durch in vitro Applikation von β-Alanin behoben werden
können (Jacobs, 1980; Jacobs, 1985). Zudem stellte sich bei Untersuchungen der
Catecholamin-Zusammensetzung heraus, dass neben der erhöhten Konzentration von βAlanin und Dopamin, das Konjugat β-Alanyldopamin kaum vorhanden ist (Wright, 1987;
Walter et al., 1996). Dies führte zu der Annahme, dass es sich bei Ebony um eine βAlanyldopamin Synthetase handelt, ohne dass ein direkter biochemischer Nachweis dieser
enzymatischen Aktivität bisher erbracht werden konnte.
Neben dem Defekt im Dopamin Stoffwechsel und der daraus resultierenden CuticulaFärbung, zeigen Mutanten auch eine Störung in der visuellen Wahrnehmung. Mutanten
reagieren verzögert in phototaktischen Experimenten (Dürrwächter, 1957; Hotta und Benzer,
1969; Heisenberg, 1972) und weisen einen interessanten Unterschied zu wildtypischen
Fliegen im Elektroretinogramm (ERG: elektrophysiologische Ableitung vom Auge der
Fliege) auf. Bei ebony Mutanten fehlen die charakteristischen „an“ und „aus“ Transienten (a
und b in Abbildung1), die man in wildtypischen Fliegen findet (Hotta und Benzer, 1969).
1
Einleitung
Abbildung1: ERG-Aufnahmen
von Wildtyp (links) und der
ebony Mutante (rechts)
Die Dauer des Lichtimpulses
beträgt eine Sekunde. Das ERG
der Wildtyp-Fliege zeigt die
typischen „an“(a)- und „aus“(b)Transienten. Diese fehlen bei der
ebony
Null-Mutante
(aus
(Hovemann et al., 1998;,
modifiziert).
Durch Aufspalten des ERGs in einzelne Komponenten konnte Heisenberg zeigen, dass die
Signalgenerierung in den Photorezeptorzellen der Mutante normal erfolgt, es dann jedoch zu
einer Störung der Signalweiterleitung von den Photorezeptorzellen zu den nachgeschalteten
Neuronen L1-L5 in der Lamina kommt (Heisenberg, 1971). Dies könnte an einem Defekt im
Histamin-Metabolismus liegen, da ebony Mutanten einen verringerten Histamingehalt
aufweisen (Borycz et al., 2002). Zufüttern von Carcinin (β-Alanylhistamin (Arnould und
Frentz, 1975) führt zur deutlichen Erhöhung des Histamingehalts im Kopf der Fliegen, der
nach der Fütterung fast das 20-fache des normalen wildtypischen Wertes zeigte. In der
Fleischfliege Sarcophaga bullata konnte an Kopfpräparaten gezeigt werden, dass Histamin zu
Carcinin umgesetzt wird (Borycz et al., 2002). Somit wäre es möglich, dass ebony nicht nur
Dopamin, sondern auch Histamin mit β-Alanin konjugieren kann. Ein direkter biochemischer
Nachweis dieser Reaktion fehlt jedoch auch hier.
Der Verhaltensdefekt von ebony-Fliegen äußert sich auf verschiedenen Ebenen. In
Untersuchungen zum Paarungsverhalten wurde festgestellt, dass die Erfolgsquote bei der
Paarung im Vergleich zu Wildtyp reduziert ist (Rendel, 1951; Jacobs, 1960; Crossley und
Zuill, 1970). Im Dunkeln gleichen sich die Quoten jedoch an (Kyriacou et al., 1978;
Kyriacou, 1981). Diese Beobachtung lässt sich auf den visuellen Phänotyp zurückführen, der
zu häufigerem Abbruch des Balzrituals führt. Zusätzlich wurde aber auch festgestellt, dass
ebony Männchen ein verändertes Balzlied, welches durch Vibrationen der Flügel erzeugt
wird, spielen (Kyriacou et al., 1978).
Untersuchungen zur circadianen Aktivitäts-Rhythmik von ebony Populationen zeigten
ebenfalls Störungen. Demnach sind die Bewegungsaktivitäten von Ebony deutlich
ungeordneter als beim Wildtyp. Interessanterweise scheint jedoch das Schlüpfen der adulten
Fliege, welches ebenfalls einer Rhythmik unterliegt, nicht gestört zu sein (Newby und
2
Einleitung
Jackson, 1991). Es bleibt unklar, ob diese Verhaltensstörungen durch fehlerhafte visuelle
Informationen, bedingt durch den Defekt in der Signalübertragung, hervorgerufen werden.
Auch eine Beeinträchtigung durch die erhöhten Konzentrationen an Dopamin und β-Alanin
ist möglich. Vor kurzem konnte für die Expression von ebony eine circadiane Rhythmik
gezeigt werden, so dass ein direkter Einfluss des Enzyms auf den Tag-Nacht-Rhythmus nicht
ausgeschlossen werden kann (Claridge-Chang et al., 2001).
1.2 Lokalisierung und Charakterisierung des ebony Gens
Das ebony Gen liegt in der Nähe des Hitze-Schock Locus 93D in der Region 93D1
(D`Alessandro, 1977; Mohler und Pardue, 1984; Walldorf et al., 1984). RestriktionsAnalysen und Northern Blot Experimente, die eine genauere Eingrenzung des Gen-Locus
ermöglichten (Caizzi et al., 1987), führten schließlich zur Klonierung und Charakterisierung
des Gens und des Genproduktes (Hovemann et al., 1998):
S
0
E
1
Exon:
2
3
4
XK
S E
5
6
I
X E
7
8
EE
9
B S
10
2xE
11
II
III
B
12
IV
V
13
E
X
14
15 kB
VII
VI
Abbildung 2: Das ebony-Gen
Dargestellt ist die genomische Region, die für die Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps benötigt wird
(Hovemann et al., 1998). S: Sal I; E: Eco I; X: Xho I; B: Bgl II; K: Kpn I
Das Gen (siehe Abbildung 2) erstreckt sich über einen genomischen Bereich von 7,3 kb und
besteht aus sieben Exons, wobei das erste Exon nicht translatiert und von einem 3,7 kb Intron
von den restlichen Exons getrennt wird. In Experimenten zur Rettung des ebony –Phänotyps
zeigte ein Fragment, das von 5,5 kb stromaufwärts bis zur ersten BglII-Restriktionsstelle im
3.Exon reicht, ebony-spezifisch Aktivität (Hovemann et al., 1998). In Expressionsstudien
konnte das ebony Transkript in allen Entwicklungsstufen von Drosophila melanogaster
nachgewiesen werden, wobei die Expression im Puppenstadium herausragt (Hovemann et al.,
1998). Durch Kombination des bakteriellen Gens für β-Galaktosidase lacZ mit dem
Leserahmen von ebony und anschließendem Nachweis des Fusionsproteins über die βGalaktosidase-Aktivität konnte gezeigt werden, dass Ebony nicht nur in der Cuticula, sondern
unter anderem auch in den optischen Loben der adulten Fliege, dem Thorakalganglion und im
Gehirn der Larve exprimiert wird (Hovemann et al., 1998). Dabei lässt das Färbemuster der
Zellen in den optischen Loben eine Expression in Gliazellen vermuten.
3
Einleitung
Der Leserahmen des Ebony-Proteins startet mit dem zweiten Exon und erstreckt sich bis
200bp vor Ende des 7. Exons. Das kodierte Protein besteht aus 879 Aminosäuren, woraus sich
ein Molekulargewicht von knapp 99 kDa errechnet. Im N-terminalen Teil weist es hohe
Homologie zu Proteinen aus der Familie der Peptidsynthetasen auf (Hovemann et al., 1998),
die wiederum zu einer Super-Familie von Adenylat bildenden Enzymen gehören, wie auch
die Luziferasen und Acyl-CoA Ligasen (Conti et al., 1996). Peptidsynthetasen sind modular
aufgebaute
Enzyme,
die
in
der
Lage
sind,
unabhängig
von
der
ribosomalen
Proteinbiosynthese Peptide zu synthetisieren. Sie werden daher auch als nichtribosomale
Peptidsynthetasen bezeichnet (NRPS; siehe 1.3: Nichtribosomale Peptidsynthetasen auf Seite
5).
0
Peptidsynthetasen
100
core 1
200
300
400
500
3
2
600
5
4
700
6
KAXXAYXPXD
AYVIYTSG
XTGXPKG
YXTGD
GRXDXQVKIR
GXRIEXXEIE
NGKVD
FFXXGGXS
KAGGAYLPID
AIVLYTSG
STGVPKG
YRTGD
GRTDSQVKIR
GHRVDLSEVE
NGKVD
NFYELGGNS
Ebony
core 1
0
100
3
2
200
300
400
4
5
500
6
600
700
800
Abbildung 3: Homologie zwischen Ebony und Peptidsynthetasen
Gezeigt ist der Vergleich von sechs hochkonservierten Regionen (core-Sequenzen) (Stachelhaus et al., 1996b)
der Adenylierungs- (grün) und der Thiolierungsdomäne (blau) der Peptidsynthetasen mit Ebony. Für die
Peptidsynthetasen wurde die Consensus-Sequenz der einzelnen Module folgender Enzyme verwendet:
Cylcosporin Synthetase aus Tolypocladium niveum (Weber et al., 1994), Bacitracin Synthetase aus Bacillus
licheniformis (Konz et al., 1997), Surfactin Synthetase aus B. subtilis (Cosmina et al., 1993) und Tyrocidin
Synthetase aus B. brevis (Mootz und Marahiel, 1997). X steht dabei für eine beliebige Aminosäure,
übereinstimmende Aminosäuren sind fett gedruckt. Die rot markierten Aminosäuren sind charakteristisch für die
Superfamilie der adenylierenden Enzyme (Conti et al., 1996) (aus Hovemann et al., 1998, modifiziert).
Die hohe Homologie (siehe Abbildung 3) zu den Adenylierungs- und Thiolierungsdomänen
der Peptidsynthetasen führte zu der Modellvorstellung, dass die Aktivierung der Aminosäure
β-Alanin nach ähnlichem Mechanismus wie bei Peptidsynthetasen ablaufen könnte. Diese
Aktivierung könnte von den putativen A- und T-Domänen von Ebony katalysiert werden. Der
carboxyterminale Teil von Ebony, der keine Homologie zu Peptidsynthetasen zeigt (in
Abbildung 3 orange unterlegt), katalysiert vermutlich die Verknüpfung der Aminosäure mit
Dopamin. Nach der Modellvorstellung sollte ein nukleophiler Angriff der Aminogruppe des
Dopamins auf die aktivierte Aminosäure zur Bildung einer Peptidbindung und Freigabe des
Konjugats führen (Hovemann et al., 1998).
4
Einleitung
1.3 Nichtribosomale Peptidsynthetasen
Die nichtribosomale Peptidsynthese ist bisher nur aus Bakterien und Pilzen bekannt
(Kleinkauf und von Döhren, 1990) und produziert eine Vielzahl biologisch aktiver
Substanzen, zu denen Antibiotika, Toxine und Immunsuppressiva gehören (Marahiel, 1992).
Im Gegensatz zum ribosomalen Proteinbiosyntheseapparat verwenden nichtribosomale
Peptidsynthetasen (NRPS) dabei auch eine Vielzahl nicht proteinogener Substanzen wie DAminosäuren und Hydroxy-Säuren. Zusätzlich können diese Substrate einer Vielzahl von
Modifikationen, z.B. N-Methylierung, Acylierung oder Glykosylierung unterzogen werden,
so dass mittlerweile über 300 verschiedene Bausteine dieser Peptide bekannt sind.
Trotz der Vielseitigkeit in der Zusammensetzung und Struktur ihrer Produkte sind sich NRPS
in ihrem Aufbau sehr ähnlich. Alle setzen sich aus funktionalen Untereinheiten (Modulen)
zusammen (Stachelhaus und Marahiel, 1995; Marahiel et al., 1997). Per Definition ist ein
Modul die Einheit, die alle katalytischen Aktivitäten enthält, die zum spezifischen Einbau
eines Substrates in das Produkt gebraucht werden. Jedes Modul erkennt spezifisch sein
Substrat und konjugiert es über eine Peptidbindung mit dem Substrat des vorhergehenden
Moduls, mit Ausnahme des Start-Moduls. Diesem ersten Modul am N-terminalen Ende der
NRPS fehlt die Kondensationsdomäne (s.u.), die die Bildung der Peptidbindung mit dem
Substrat im vorhergehenden Modul katalysiert. Die Peptidsynthese erfolgt gerichtet: Nach
Initiation am Start-Modul erfolgt die Elongation in Richtung des letzten Moduls, wo das
fertige Peptid durch Hydrolyse oder Zyklisierung abgespalten wird. So bestimmen die Anzahl
und die Reihenfolge der einzelnen Module der NRPS die Sequenz des Produktes.
Die katalytischen Untereinheiten eines Moduls werden als Domänen bezeichnet. Ein Modul,
das nur aus einer Adenylierungs(A)- und einer Thiolierungsdomäne (T) besteht, wird als
Minimalmodul bezeichnet, da diese beiden Domänen ausreichen, ein Substrat vollständig zu
aktivieren und für die Verknüpfung zur Verfügung zu stellen. Die A-Domäne bildet unter
ATP-Verbrauch und in Abhängigkeit von Magnesium-Ionen das Adenylat ihres Substrates
(siehe Abbildung 4), welches mit dem Enzym assoziiert bleibt. Sie zeigt hohe Homologie zur
Superfamilie der adenylierenden Enzyme (Conti et al., 1996), wobei acht Aminosäuren für
die Spezifität der Adenylierungsreaktion verantwortlich zu sein scheinen (Stachelhaus et al.,
1999; Challis et al., 2000).
5
Einleitung
Abbildung 4: Von der A-Domäne katalysierte reversible Adenylierung des Substrats
Die Aminoacylgruppe des Adenylats wird auf die Sulfhydrylgruppe des an der T-Domäne
gebundenen Co-Faktors 4’-Phosphopantethein (Ppant) transferiert, wo sie als Thioester
kovalent gebunden wird (Pfeifer et al., 1995; Stachelhaus et al., 1996a) (siehe Abbildung 5).
Der Co-Faktor wird durch Phosphopantethein Transferasen (PPT) (Lambalot et al., 1996) an
den OH-Rest eines invarianten Serins der T-Domäne gebunden (Gocht und Marahiel, 1994;
Stein et al., 1994).
-AMP
Abbildung 5: Bindung des Substrats in der T-Domäne
Die Bindung erfolgt kovalent als Thioester an den Co-Faktor Ppant. Dabei wird AMP freigesetzt.
Die in den T-Domänen gebundenen Substrate werden von den Kondensationsdomänen (K)
mit den Substraten der folgenden Module verknüpft (siehe Abbildung 6). Es wird
angenommen, dass die K-Domäne den nukleophilen Angriff der freien Aminogruppe des
Aminoacyl-S-Ppant-Akzeptors auf das elektrophile Carboxy-C-Atom des Aminoacyl- oder
Peptidyl-S-Ppant Donors katalysiert (Stachelhaus et al., 1998). Diese Reaktion läuft weiter in
Richtung C-Terminus der Peptidsynthetase ab, bis das fertige Endprodukt schließlich durch
eine Acyl-Thioester spaltende Terminationsdomäne (Te) vom Protein abgespalten wird.
6
Einleitung
T-Domäne 1
T-Domäne 2
T-Domäne 2
Abbildung 6: Bildung der Peptidbindung
Zusätzlich zu A-, T- und K-Domänen, die zur Peptidsynthese ausreichen würden, weisen
einige Module noch Modifikationsdomänen auf. Bisher sind Epimerisierungs (E)-, NMethylierungs (M)-, Reduktions (R)- und Heterozyklisierungsdomänen (Z) identifiziert
worden (Konz und Marahiel, 1999). Die modifizierenden Domänen erhöhen die strukturelle
Vielfalt der Produkte deutlich. Abbildung 7 fasst den Aufbau eines einzelnen Moduls
zusammen. Neben den A- und T-Domänen des Minimalmoduls, sind alle anderen Domänen
variabel. Eine Kondensationsdomäne findet sich in allen verlängernden Modulen. Eine
Thioesterasedomäne charakterisiert das letzte Modul.
Abbildung 7: Die verschiedenen möglichen Domänen eines Moduls
Gezeigt sind die einzelnen möglichen Domänen mit ihren relativen Positionen zueinander. Die
durchnummerierten Sequenzen in den einzelnen Domänen kennzeichnen die hoch konservierten Regionen.
7
Einleitung
1.4 Phosphopantethein-Transferasen
Ein notwendiger Schritt für die Aktivität von NRPS ist die Beladung des invarianten Serins
der Thiolierungsdomäne mit dem Co-Faktor Ppant. Dieser Schritt wird von Enzymen der
Familie der PPT katalysiert. Diese Enzyme zeichnen sich durch zwei konservierte Regionen
aus. Diese sind GXD und (F,W)XXKE(A,S)XXK,wobei X für eine beliebige Aminosäure
steht (Lambalot et al., 1996).
Abbildung 8: Die Umwandlung von apo-NRPS zu holo-NRPS durch PPT
Es wird angenommen, dass jede Peptidsynthetase eine spezifische PPT besitzt, die sie posttranslational modifiziert. Es hat sich jedoch auch gezeigt, dass einige PPT neben ihrer
natürlichen NRPS auch andere Synthetasen akzeptieren. Sfp (Nakano et al., 1992; Quadri et
al., 1998), ein Protein, das normalerweise die Surfactin Synthetase aus Bacillus subtilis
belädt, zeigt eine so hohe Unspezifität, dass sie sogar die apo-Untereinheiten der FettsäureSynthasen akzeptiert (Lambalot et al., 1996). Die Verwendung solcher unspezifischer PPT
ermöglicht die Untersuchung von Peptidsynthetasen, deren spezifische Transferase noch nicht
bekannt ist.
1.5 Die Cuticula der adulten Drosophila melanogaster
Die hohe Homologie des Ebony Proteins zu den NRPS legt nahe, dass die Aminosäure βAlanin über einen analogen Mechanismus aktiviert und anschliessend mit Dopamin verknüpft
wird. Das Produkt β-Alanyldopamin gilt als wichtiger Bestandteil der Cuticula von
Drosophila melanogaster (Hodgetts und Choi, 1974). Die Cuticula bildet das Exo-Skelett der
Insekten und dient nicht nur dem mechanischen Schutz, sondern auch zur Verankerung der
Muskeln und der Vermeidung von Flüssigkeitsverlust. Sie setzt sich aus verschiedenen
Komponenten zusammen. Neben Struktur-Proteinen und Chitin (ein Polymer des N8
Einleitung
Acetylglucosamins), findet man die an dem Aufbau beteiligten Enzyme, sowie verschiedene
Derivate des Brenzcatechins (Dihydroxy-Benzol; Catechol). Der Aufbau der Cuticula erfolgt
durch zwei zeitlich leicht versetzte Prozesse (Bodenstein, 1950). Dies ist zum einen die
Sklerotisierung, die der Cuticula die nötige mechanische Stabilität durch Quervernetzung des
Chitins und der Strukturproteine verleiht, zum anderen die Melanisierung, in deren Verlauf
die typischen Pigmentmuster angelegt werden. Diese sind unter anderem für die Partnerwahl,
die Thermoregulation und die Tarnung von großer Bedeutung.
Die zugrunde liegenden Mechanismen der Sklerotisierung und Melanisierung sind
weitestgehend bekannt, wenn auch bisher nicht alle beteiligten Gene in Drosophila
identifiziert werden konnten (siehe Abbildung 9, (Wright, 1987; Sugumaran, 1988)).
Abbildung 9: Mögliche Synthese und Modifikation von Phenol- und Catecholaminen
Gezeigt sind mögliche Synthesewege und Modifikationen bis hin zur Bildung von Sklerotin oder Melanin, die
bisher nur teilweise in Drosophila gezeigt werden konnten. Der Übersicht halber wurde auf einige mögliche
Modifikationen, z.B. die Verknüpfung der Amine mit Sulfaten, verzichtet. Die vermutliche β-Alanyldopamin
Synthetase Funktion von Ebony ist eingerahmt (modifiziert aus Wright, 1987).
Sowohl an der Sklerotisierung, als auch an der Melanisierung sind Catecholamine beteiligt,
die hauptsächlich aus Tyrosin synthetisiert werden. Diese sind wenig reaktiv und daher weder
zur Quervernetzung noch zur Polymerisierung geeignet. Durch Oxidation erhält man jedoch
die entsprechenden Chinone, die sehr reaktionsfreudig sind. Bei der Melanisierung lagern sich
die Chinone zu entsprechenden Indolen um, die nach erneuter Oxidation zu hochmolekularen
Melaninen polymerisieren.
9
Einleitung
Die Sklerotisierung läuft vermutlich durch zwei unabhängige Mechanismen ab. Pryor schlug
1940 einen ähnlichen Mechanismus wie bei der Melanisierung vor. Dabei findet jedoch keine
Indol-Umlagerung der Chinone statt, sondern es erfolgt ein nukleophiler Angriff (z.B. durch
die Seitenkette eines Proteins, oder aber Chitin) auf den Ring. Durch erneute Oxidation
können so mehrere Struktur-Komponenten über den Ring des Catecholamins miteinander
quervernetzt werden (Pryor, 1940b; Pryor, 1940a; Pryor, 1962). Mit der Entdeckung von
Andersen, dass es auch zu nukleophilen Angriffen auf den β-Kohlenstoff des Catechols
kommen kann, wurde klar, dass ein zweiter Mechanismus der Quervernetzung möglich sein
müsse. Dieser wurde von Andersen als β-Sklerotisierung bezeichnet (Andersen, 1974). In
dieser Reaktion ist das reaktive Zwischenprodukt nicht das einfache Chinon, sondern ein
Chinon Methid (Lipke et al., 1983), das entweder direkt durch Oxidation des Amins oder aus
dem Chinon durch eine Isomerase gebildet wird (Saul und Sugumaran, 1988). Das Methid
besitzt am β-Kohlenstoffatom ein elektrophiles Zentrum, über das die Quervernetzung der
Struktur-Komponenten erfolgen kann.
Da beide Prozesse, Melanisierung und Sklerotisierung, dieselben Catecholamine als
Vorstufen verwenden, ist eine genaue enzymatische Regulierung nötig. Wie in Abbildung 9
zu sehen ist, gelten N-Acetyldopamin (NADA) und N-β-Alanyldopamin (NBAD) als
Vorläufer für die Sklerotisierung, während die Chinone von Dopamin und Dopa zur
Pigmentierung beitragen (Karlson und Sekeris, 1962; Hopkins et al., 1982; Aso et al., 1984).
Dies liegt vor allem an der schnellen und spontanen Umlagerung der Chinone von Dopamin
und Dopa zum Indol und der nachfolgenden Polymerisierung zum Pigment. Bei den
Chinonen von NADA und NBAD findet die Indolisierung ca. 40x langsamer statt, so dass
diese Substanzen zur Quervernetzung von Struktur-Komponenten bevorzugt werden (Aso et
al., 1984). Daher gilt die Bildung von NADA und NBAD durch die entsprechenden Enzyme
als Wegbereiter für die Sklerotisierung bei gleichzeitiger Inhibierung der Melanisierung. In
neueren Arbeiten wurde herausgefunden, dass in Drosophila in der Tat der Expressionslevel
verschiedener Enzyme von Bedeutung für die Pigmentierung ist. Es wurde gezeigt, dass
Ebony homogen in der Epidermis des Abdomens exprimiert wird, während Yellow, ein
Enzym, das die Pigmentierung begünstigt, in den stark pigmentierten Regionen mit Ebony coexprimiert wird (Wittkopp et al., 2002). Somit könnte das Muster der Pigmentierung der
Cuticula von der räumlich und/oder zeitlich kontrollierten Expression der beteiligten Enzyme
abhängig sein.
10
Einleitung
1.6 Der Aufbau des visuellen Systems der adulten Drosophila melanogaster
Neben der auffälligen Pigmentierung der Cuticula, manifestiert sich die ebony Mutation auch
in einem visuellen Defekt, der zu stark reduziertem Sehvermögen führt. Die Rolle des Ebony
Proteins im visuellen System ist dabei noch weitestgehend unerforscht.
A
C
Cornea
Ter. Pigmentzelle
Sek. Pigmentzelle
Rhabdomer
Borste
R7Rhabdomer
Konische Zelle
Prim. Pigmentzelle
B
Fortsatz der
konischen
Zelle
R8Rhabdomer
Abschluss
der konischen
Zelle
Axone
Abbildung 10: Das visuelle System von Drosophila melanogaster
In A ist die rasterelektronemikroskopische Aufnahme des linken Auges von Drosophila melanogaster zu sehen.
Zu erkennen ist die hexagonale Anordnung der ca. 800 Ommatidien, aus denen die Retina zusammengesetzt ist.
Zwischen den Ommatidien liegen Borsten, die als mechanische Sensoren dienen (aus Montell, 1999). In B ist
schematisch ein horizontaler Schnitt durch die linke Kopfhälfte zu sehen. Zur besseren Darstellung sind die
Photorezeptorzellen R1-6, R7 und R8 in verschiedene Ommatidien der Retina (Re) eingezeichnet. La: Lamina;
Me: Medulla; Lo: Lobula; Lp: Lobula Platte; OOC: Äußeres optisches Chiasma; IOC: Inneres optisches
Chiasmata (aus Pflugfelder und Heisenberg, 1995; modifiziert). In C ist der Aufbau eines einzelnen
Ommatidiums der Retina gezeigt, links in einer Längsansicht, rechts Querschnitte in unterschiedlichen Ebenen,
die die Lage der Zellen zu einander verdeutlichen sollen. Cornea und Kristallkegel werden von den konischen
Zellen sekretiert, die Pigmentzellen schirmen die einzelnen Ommatidien voneinander ab, um Streueffekte zu
vermeiden. Die Photorezeptorzellen R1-R6 sind um die zentralen R7 und R8 angeordnet und erstrecken sich
über die gesamte Länge des Ommatidiums. R7 und R8 liegen in der distalen bzw. proximalen Hälfte (aus (Wolff
und Ready, 1993; modifiziert).
11
Einleitung
Das visuelle System der adulten Drosophila melanogaster besteht aus dem Komplexauge und
den optischen Loben Lamina, Medulla und Lobula Komplex (siehe Abbildung 10).
Die Retina des Komplexauges ist modular aufgebaut. Sie setzt sich aus ca. 800 Ommatidien
zusammen, von denen jedes als ein einzelnes Auge betrachtet werden kann. Unterhalb der
Retina und von dieser durch die Basalmembran abgetrennt, liegt der erste optische Lobus, die
Lamina. Proximal davon befindet sich die Medulla, der zweite optische Lobus. Den
Abschluss bildet der Lobula Komplex, der sich aus Lobula und Lobula Platte zusammensetzt
(siehe Abbildung 10 B).
Das einzelne Ommatidium ist ein Zusammenschluss von ca. 20 Zellen, darunter die acht
Photorezeptorzellen R1-R8 und weitere Zellen, die nicht direkt an der Signalperzeption
beteiligt sind (Wolff und Ready, 1993). Die Cornea und der Kristallkegel dienen zur
Fokussierung des einfallenden Lichts, sind aber keine eigenständigen Zellen, sondern werden
während der Entwicklung des Auges von den darunter liegenden konischen Zellen und den
Pigmentzellen sekretiert (Wolff und Ready, 1993). Zusätzliche Aufgabe der Pigmentzellen ist
es, die einzelnen Ommatidien gegeneinander abzuschirmen, um Streulichteffekte zu
vermeiden. Die konischen Zellen erstrecken sich über das gesamte Ommatidium und bilden
einen Fuß mit einer Öffnung für die Axone der Rezeptorzellen im proximalen Bereich aus.
Im Inneren des Ommatidiums liegen die eigentlichen Photorezeptorzellen, die in den
Rhabdomeren (siehe 1.7: Die visuelle Signaltransduktion; Seite 16) die Komponenten der
Lichtperzeption tragen. Die Photorezeptorzellen werden auf Grund der Lage ihrer
Rhabdomere, dem exprimierten Rhodopsin und ihres Projektionsortes in den optischen Loben
in drei Gruppen unterteilt: Die Rhabdomere der Zellen R1-R6 liegen ringförmig um die
zentralen Photorzeptorzellen R7 und R8 und erstrecken sich über die gesamte Länge des
Ommatidiums.
Sie
exprimieren
ein
einziges
Rhodopsin
Rh1,
das
ein
breites
Absorptionsspektrum mit einem Maximum bei 478nm (Zuker et al., 1985) hat. Die Axone
von R1-R6 enden in der Lamina (Braitenberg, 1967; Fischbach und Dittrich, 1989; Shaw et
al., 1989) siehe Abbildung 11). Das Rhabdomer von R7 liegen im Zentrum der proximalen
Hälfte des Ommatidiums und verwendet eins von zwei möglichen Rhodopsinen, Rh3 oder
Rh4, mit Absorptionsmaxima bei 345nm bzw. 375nm (Huber et al., 1997; Chou et al., 1999;
Salcedo et al., 1999). Das Rhabdomer von R8 liegt im Zentrum der distalen Hälfte des
Ommatidiums und benutzt ebenfalls eins von zwei möglichen Rhodopsinen, Rh5 oder Rh6,
mit Absorptionsmaxima bei 437nm und 508nm (Fryxell und Meyerowitz, 1987; Montell et
al., 1987). Die Axone der Zellen R7 und R8 enden gemeinsam in einer Säule der Medulla,
12
Einleitung
dort jedoch in unterschiedlichen Schichten (Braitenberg, 1967; Fischbach und Dittrich, 1989;
Shaw et al., 1989); siehe Abbildung 11).
Lamina
Serpentinenschicht
Medulla
Abbildung 11: Organisation der
neuronalen Zellen der Lamina
Gezeigt sind Lamina und Medulla,
sowie die neuronalen Zellen, die in der
Lamina enden oder sie durchqueren.
L1-L5: Große Monopolare Zellen, die
ihre Zellkörper im Lamina-Cortex
haben und von dort durch die Lamina
in die Medulla projizieren; C2, C3 und
T1: Neurone, die ihre Zellkörper im
Bereich des Medulla-Cortex haben und
deren Axone in der Lamina enden. Die
Medulla wird durch die Serpentinenschicht in einen distalen (äußeren) und
einen proximalen (inneren) Abschnitt
getrennt (Strausfeld und Nässel, 1981).
Zahlen neben der Medulla bezeichnen
die unterschiedlichen Schichten
(aus Fischbach und Dittrich, 1989).
Analog zum modularen Aufbau der Retina, sind auch Lamina und Medulla in Modulen
organisiert.
Die Module der Lamina werden als Cartridges bezeichnet und setzen sich aus insgesamt 15
neuronalen Komponenten zusammen (Strausfeld und Campos-Ortega, 1977; Shaw, 1981).
Dazu gehören die synaptischen Endigungen der R1-R6 Zellen, die Axone von R7 und R8, die
Axone und Dendriten der nachgeschalteten monopolaren Zellen L1-L5 und die Endigungen
dreier Zelltypen mit Somata in der Medulla (C2, C3 und T1; siehe Abbildung 11). Weitere
Zellen der Lamina sind verschieden Arten von Gliazellen, die in sechs morphologisch
unterscheidbaren Schichten angeordnet sind (Saint Marie und Carlson, 1983). Direkt im
Anschluss an die Basalmembran findet man die Gliazellen der fenestrierten Schicht. Die
Fortsätze dieser Zellen umhüllen die austretenden Axone und dringen bis in die Retina vor. In
der folgenden Schicht bilden die Axone eine den Cartridges ähnelnde Struktur aus, in der die
Axone der R1-R6 Rezeptorzellen kreisförmig um die Axone von R7 und R8 angeordnet sind.
Daher werden die Gliazellen dieser Schicht als pseudocartridge Gliazellen bezeichnet. Mit
den Zellen der Satelliten Glia beginnt der Lamina-Cortex, in dem sich die Zellkörper der
Monopolaren Zellen L1-L5 befinden (Trujillo-Cenoz, 1965). Die Axone dieser Zellen ziehen
in das Lamina-Neuropil, wo vor allem L1-L3 in den Cartridges mehrere synaptische
Verknüpfungen mit den Axonen der R1-R6 Zellen eingehen. R7 und R8 durchqueren die
13
Einleitung
Cartridges ohne synaptische Verbindung. Die Projektion der Rezeptorneurone R1-R6 in die
Cartridges erfolgt nach dem Prinzip des Superpositionsauges (Kirschfeld, 1967; Kirschfeld,
1969). Dabei wird ein einzelnes Modul nicht von den Neuronen eines einzelnen
Ommatidiums innerviert, sondern durch sechs verschiedene Rezeptorzellen aus sechs
benachbarten Ommatidien. Die Zusammensetzung der in den Cartridges terminierenden
Photorezeptoren ist daher ebenfalls R1-R6, es werden jedoch diejenigen zusammengefasst,
die auf Grund ihrer Lage denselben Punkt im Sichtfeld sehen (siehe Abbildung 12 B).
Erreicht wird diese Verschaltung durch die Verdrehung und Aufspaltung der Rezeptor-Axone
nach dem Verlassen der fenestrierten Glia (siehe Abbildung 12 A) (Trujillo-Cenoz, 1965;
Melamed und Trujillo-Cenoz, 1966; Braitenberg, 1967; Kirschfeld, 1967; Meinertzhagen und
Hanson, 1993).
Abbildung 12: Gliazellen der Lamina
und Projektionsmodell der Rezeptorneurone R1-R6 in die Lamina
Cartridges
In A sind die einzelnen morphologisch
unterscheidbaren Gliazellschichten gezeigt: bm: Basalmembran; fg: fenestrierte
Glia in der fenestrierten Schicht (fl); pg:
pseudocartidge Glia; sg: SatellitenGliazellen im Lamina Cortex (nl); eg:
ephiteliale Glia im Lamina Neuropil (pl);
mg: marginale Glia (aus Saint Marie und
Carlson, 1983). Durch die Verdrillung
und Aufspaltung der einzelnen Rezeptoraxone (ra) eines Ommatidiums in verschiedene Cartridges der Lamina wird eine „Sortierung“ der
Rezeptorneurone mit selbem Blickwinkel auf die Cartridges erreicht (Trujillo-Cenoz, 1965; Braitenberg, 1967;
Kirschfeld, 1967). Der Einfachheit halber sind in B nur jeweils drei Rezeptorzellen pro Ommatidium
eingezeichnet (nach Braitenberg, 1967) .
Die einzigen Zellen mit Zellkörper im Lamina-Neuropil sind die epithelialen Gliazellen.
Diese sind säulenförmig aufgebaut und ziehen sich durch das gesamte Neuropil hindurch,
wobei sie die einzelnen Cartridges voneinander isolieren. Die proximale Grenze der Lamina
14
Einleitung
wird durch eine Schicht marginaler Gliazellen gebildet (Trujillo-Cenoz, 1965). Diese ist für
die Entwicklung der optischen Loben wichtig, da sie das Wachstum der R1-R6 Axone stoppt
(Winberg et al., 1992). Sie wird nur von den Axonen der R7 und R8 Rezeptorzellen, sowie
der Monopolaren Zellen durchdrungen, die von dort über das äußere optische Chiasma in die
Medulla eindringen.
Auch die Medulla ist modular aufgebaut, wobei die einzelnen Module auf Grund ihrer
Struktur als Säulen bezeichnet werden. Im Vergleich zu den Cartridges der Lamina sind die
Säulen der Medulla in Bezug auf Zelltypen, Zellzahl und Verschaltung deutlich komplexer
aufgebaut. Daher sind sie auch noch nicht erschöpfend untersucht (Meinertzhagen und
Hanson, 1993). In einer Säule der Medulla terminieren die Axone der monopolaren Zellen
L1-L5 einer Cartridge, sowie der Photorezeptorzellen R7 und R8, die denselben Bereich im
Sichtfeld sehen und im Gegensatz zur oben erwähnten Aufteilung von R1-R6 aus demselben
Ommatidium stammen. Dabei dringen die Endigungen unterschiedlich tief in die Medulla ein,
terminieren jedoch alle vor der Serpentinenschicht (siehe Abbildung 11). Jede Säule erhält so
Informationen von genau einem Punkt im Sichtfeld, direkt durch R7 und R8 und indirekt von
R1-R6 über die Monopolaren Zellen der Lamina. In der Medulla finden sich auch die ersten
Verschaltungen zu höheren Bereichen des Gehirns, sowie direkte Verbindungen zu den
Muskeln. Über die Zusammensetzung der Gliazellen in der Medulla ist nur wenig bekannt,
auch scheinen sie nicht in geordneten Schichten zu liegen, wie dies bei der Lamina der Fall
ist. Identifiziert werden konnten Satelliten Gliazellen und Medulla-Neuropil Gliazellen (Eule
et al., 1995; Tix et al., 1997). Die Satelliten Zellen liegen, wie die Zellen der Lamina, im
Cortex zusammen mit den Zellkörpern der Medulla-Neurone. Die Zellkörper der NeuropilGliazellen liegen zwischen Cortex und Neuropil der Medulla und senden lange Fortsätze in
das Neuropil. Ihre Position ist dabei nicht auf den distalen Bereich der Medulla beschränkt,
sondern es werden auch Zellkörper im Cortex proximal der Serpentinenschicht gefunden
(Eule et al., 1995).
Proximal der Medulla liegt der Lobula Komplex, der sich aus der anterioren Lobula und der
posterioren Lobula Platte zusammensetzt. Lobula, Lobula Platte und Medulla sind über das
innere optische Chiasmata miteinander verbunden. Der Lobula Komplex selber erhält kein
direktes Signal von Photorezeptorzellen, sondern nur indirekt durch Neurone aus der Medulla
(Fischbach und Dittrich, 1989). Wie die Medulla ist auch der Lobula Komplex direkt mit
Muskeln
verbunden,
was
darauf
hindeutet,
dass
er
Funktionen
in
der
Bewegungswahrnehmung und -steuerung hat (Frye und Dickinson, 2001). Auch über die
Gliazellen des Lobula Komplexes ist wenig bekannt. Eule (1995) konnte jedoch in Lobula
15
Einleitung
und Lobula Platte Neuropil-Gliazellen nachweisen, die zwischen Cortex und Neuropil
angeordnet sind und Fortsätze in das Neuropil aussenden
1.7 Die visuelle Signaltransduktion
Rezeptorzelle
Rhabdomer
1µm
Phosphoinositid
Stoffwechsel
Abbildung 13: Signaltransduktion im Rhabdomer der Photorzeptorzelle
Oben links ist der Querschnitt durch eine Photorezeptorzelle zu sehen, darunter die elektronenmikroskopische
Vergrößerung des Rhabdomers. Zu erkennen sind die Microvilli, die ca. 1000 Rhodopsinmoleküle pro
Mikrovillus, sowie den Großteil der benötigten Komponenten für die Signaltransduktion beinhalten. Die
schematische Zeichnung ist eine Vergrößerung des im Bild eingekreisten Bereichs und stellt die bei
Lichtaktivierung ablaufenden Reaktionen dar. Rot markiert sind die Namen der bekannten Gene, die die
einzelnen Komponenten kodieren. Für weitere Details siehe Text; modifiziert aus (Hardie, 2001; Hardie und
Raghu, 2001).
16
Einleitung
Ort der Lichtaufnahme sind die Rhabdomere, eng gepackte Membraneinstülpungen der
Photorezeptorzellen, die dem Inneren des Ommatidiums zugewandt sind (siehe Abbildung
13). Die Signalkaskade wird bei Lichteinfall mit der Photoisomerisierung von Rhodopsin
(Rh) zu Metarhodopsin (M) gestartet (Abbildung 13: Schritt 1). Dies führt zur Aktivierung
des G-Proteins Gq durch GDP-GTP-Austausch und der Abspaltung der Gqα-GTP
Untereinheit. In Schritt 2 aktiviert die α-Untereinheit das Enzym Phospholipase C (PLC),
welche dann Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Inositoltrisphosphat (IP3) und
Diacylglycerin (DAG) spaltet (Bloomquist et al., 1988; Scott et al., 1995). Es ist noch
unbekannt, auf welche Weise IP3 und DAG schließlich zu der in Schritt 3 gezeigten Öffnung
zweier unabhängiger lichtsensitiver Kationen-Kanäle, TRP und TRPL, führen (Niemeyer et
al., 1996; Putney und McKay, 1999). Da jedoch Mutanten des einzig bekannten IP3-Rezeptors
keinen Defekt in der visuellen Transduktion aufweisen (Acharya et al., 1997; Raghu et al.,
2000), scheint DAG der auslösende Botenstoff zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass
sowohl mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA; das mögliche Produkt einer DAG Lipase)
als auch DAG alleine in situ in der Lage sind, TRP und TRPL zu öffnen (Chyb et al., 1999;
Estacion et al., 2001). Eine DAG Lipase wurde bisher jedoch nicht in Eukaryonten
nachgewiesen (Hardie, 2001). Eine weitere wichtige Komponente des Signal-Komplexes ist
das Protein INAD, das über PDZ Domänen TRP, PLC und die Protein Kinase C (PKC)
komplexiert (Tsunoda et al., 1997; Montell, 1998).
Das Öffnen der Kationen-Kanäle führt zum Einstrom von Kationen in die Photorezeptorzelle.
Die resultierende Depolarisierung löst die Ausschüttung des Neurotransmitters Histamin aus,
der die postsynaptischen Zellen inhibiert (s.u.). Somit entsteht das weiterführende Signal nicht
durch Bindung des Neurotransmitters an den postsynaptischen Rezeptor, sondern durch die
Verringerung des Neurotransmitters. Daher sind ein schnelles Beenden der Ausschüttung und
ein zügiges Entfernen des Transmitters aus dem synaptischen Spalt für eine effektive
Signaltransduktion notwendig.
Zur Beendigung der Neurotransmitter-Ausschüttung muss jede Komponente der PhotoSignalkaskade effektiv inaktiviert werden. Dies geschieht in mehreren Schritten. Das aktive
Metarhodopsin wird durch Bindung an Arrestin deaktiviert (Dolph et al., 1993). Eine
zusätzlich stattfindende Phosphorylierung scheint im Gegensatz zu Vertebraten keine
essentielle Funktion zu haben (Chen et al., 1995; Vinos et al., 1997). Weiterer Unterschied zu
Vertebraten ist die Möglichkeit, Rhodopsin nicht ausschließlich enzymatisch, sondern durch
Re-Isomerisierung von Metarhodopsin bei Absorption von längerwelligem Licht zu
17
Einleitung
regenerieren. Die von Gqα-GTP aktivierte PLC bewirkt, dass das gebundene GTP zu GDP
hydrolysiert wird, was die Deaktivierung und Trennung der beiden Proteine bewirkt (Cook,
2000). Die Ionenkanäle TRP und TRPL werden beide durch Ca2+-Ionen deaktiviert (Reuss et
al., 1997). Dies könnte durch Calmodulin vermittelt werden, da sowohl TRP als auch TRPL
Bindungsstellen für Calmodulin aufweisen. Ihre Deletion resultiert in einer verzögerten
Inaktivierung (Warr und Kelly, 1996; Chevesich et al., 1997; Scott et al., 1997). Eine weitere
wichtige Komponente der Signalinaktivierung scheint das Enzym PKC zu sein, da Mutanten
des PKC kodierenden Gens inaC Defekte in Signaltermination und Adaptation aufweisen
(Smith et al., 1991; Hardie et al., 1993). Bereits identifizierte Substrate der PKC sind TRP
und INAD (Huber et al., 1998). Die genaue Auswirkung der Phosphorylierung auf die
Signalkaskade ist jedoch unbekannt.
Der Botenstoff DAG wird zunächst in der Membran der Submicrovillaren Zisternen (SMC)
durch die DAG Kinase phosphoryliert (PA) (Masai et al., 1993)(Schritt 5; Abbildung 13) und
dann durch die CDP-DAG Synthase in CDP-DAG umgewandelt (Wu et al., 1995). CDPDAG wird zu Phosphatidylinositol (PI) umgesetzt und zurück in die Membran der Microvilli
transportiert (Hotta und Benzer, 1970; Vihtelic et al., 1991; Vihtelic et al., 1993). Neben der
Umwandlung von DAG könnte die Lagerung und Ausschüttung von Ca2+-Ionen eine weitere
Aufgabe der Zisternen sein (Schritt 4 in Abbildung 13), da die Membran mit IP3-Rezeptoren
und Ca2+-ATPasen bestückt ist (Hardie, 2001).
Sowohl immunhistochemisch (Nässel et al., 1988b; Pirvola et al., 1988; Pollack und
Hofbauer, 1991; Sarthy, 1991) als auch elektrophysiologisch (Hardie, 1987; Hardie, 1989;
Schlemermeyer et al., 1989) konnte gezeigt werden, dass Histamin der wichtigste
Neurotransmitter in den optischen Loben der Arthropoden ist (Hardie, 1987; Callaway und
Stuart, 1989; Stuart, 1999). Es wird direkt aus Histidin durch die Histidin Decarboxylase
(HDC) synthetisiert (Burg et al., 1993; Morgan et al., 1999). Adulte Drosophila melanogaster
hdc-Mutanten, bei denen die Funktion dieses Enzyms gestört ist, weisen visuelle und
motorische Defekte auf, die sich durch Zufütterung von Histamin beheben lassen (Burg et al.,
1993; Melzig et al., 1996; Melzig et al., 1998). Der Neurotransmitter aktiviert Cl-Ionenkanäle der postsynaptischen Zellen, was zum Einstrom von Cl--Ionen und zur
Inhibierung der Zellen durch Hyperpolarisierung führt (Hardie, 1989; Skingsley et al., 1995).
Diese Kanäle konnten kürzlich auch in den optischen Loben von Drosophila melanogaster
nachgewiesen werden (Gisselmann et al., 2002; Zheng et al., 2002).
18
Einleitung
Für die sensitive Signalübertragung ist es erforderlich, den Neurotransmitter schnell aus dem
synaptischen Spalt zu entfernen oder aber zu inaktivieren, um so die postsynaptische
Inhibierung aufzuheben. Inaktivierung kann durch Abbau, wie zum Beispiel beim
Acetylcholin, das durch die Acetylcholinesterase gespalten wird (Massoulie et al., 1993a;
Massoulie et al., 1993b), erfolgen. Viele Neurotransmitter werden jedoch auch direkt aus dem
synaptischen Spalt entfernt, vor allem bei Synapsen mit hoher Ausschüttung an
Neurotransmitter, wie dies auch bei Photorezeptoren der Fall ist. Tatsächlich wurde für die
Photorezeptoren von Balanus nubilus nachgewiesen, dass der Neurotransmitter Histamin aus
dem synaptischen Spalt zurückgewonnen wurde (Stuart et al., 1996). Auf Grund der
langsamen de novo Synthese scheint sogar ein Großteil des Histamins über Wiederaufnahme
in die Synapsen zu gelangen (Morgan et al., 1999). Zudem stellte sich heraus, dass sich
Histamin bei Dunkelheit in Gliazellen anreichert, während es in den Photorezeptorzellen
verringert vorzuliegen scheint (Stuart et al., 1996). Eine Beteiligung der Gliazellen am
Rückführungsprozess ist demnach nicht ausgeschlossen. Auch für Drosophila konnte ein
solcher Aufnahme-Prozess in die Rezeptorzellen indirekt durch Fütterungsexperimente mit
Histamin nachgewiesen werden (Melzig et al., 1998).
19
Einleitung
1.8 Zielsetzung
Die ebony-Mutante zeigt eine Vielzahl von Defekten, die auf eine multifunktionelle Rolle des
Ebony Proteins in der Fliege Drosophila melanogaster hindeuten. Besonders der visuelle
Phänotyp der ebony Mutante wurde lange diskutiert. Es gilt als gesichert, dass Histamin als
Neurotransmitter in der visuellen Signaltransduktion von Drosophila fungiert (Hardie, 1987;
Stuart, 1999). Hinzu kommt, dass Dopamin in der Lamina nicht nachgewiesen werden konnte
(Nässel et al., 1988a). Ob Ebony als putative β-Alanyldopamin Synthetase direkt an der
visuellen Signaltransduktion beteiligt ist oder aber der visuelle Defekt durch einen
Nebeneffekt, z.B. erhöhte Dopamin-Konzentrationen hervorgerufen wurde, blieb lange
unklar. Erste Hinweise auf eine direkte Beteiligung des Ebony Proteins an der visuellen
Signaltransduktion lieferte der Nachweis eines β-Galktosidase-Fusionskonstruktes in den
optischen Loben von Drosophila melanogaster (Hovemann et al., 1998).
Ein Ziel meiner Arbeit ist es daher, das Ebony Protein direkt mit Hilfe eine Antiserums
(Ryseck, 1987) im Nervensystem und insbesondere in den optischen Loben der adulten Fliege
nachzuweisen und dort den Typ der ebony exprimierenden Zellen zu bestimmen. Sollte
Ebony tatsächlich in den optischen Loben exprimiert werden, stellt sich die Frage nach der
Funktion des Proteins, da eine β-Alanyldopamin Synthetase Funktion in der Lamina auf
Grund des fehlenden Dopamins unwahrscheinlich wäre. Daher sollen im Rahmen dieser
Arbeit mögliche Substrate identifiziert und der zu Grunde liegende Mechanismus aufgeklärt
werden. Dazu sollte das Protein aufgereinigt werden, um es unter definierten Bedingungen in
vitro untersuchen zu können. Da das Ebony Protein als sehr instabil bekannt ist und daher
eine Aufreinigung direkt aus der Fliege bisher scheiterte (Black et al., unveröffentlichte
Daten;Perez et al., 2002), sollten als Alternative Expressionssysteme etabliert werden, die
eine schnelle Aufreinigung des Proteins über Affinitätschromatographie ermöglichen.
20
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien, Seren und Antibiotika
Substanz
5-bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphat (BCIP)
Hersteller
Roche
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-Galaktosid (X-Gal)
Roth
Rotiphorese Gel 30
Roth
Agar-Agar
Roth
Agarose
Roth
Albumin aus Rinderserum (BSA)
Serva
Alkylphenylpolyethylenglykol
(Triton X-100)
Serva
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Merck
Ampicillin
Sigma
Bromphenolblau
Serva
Butanol
Baker
Dithiothreitol (DTT)
Serva
dNTPs
MBI Fermentas
Ethidiumbromid
Serva
Ethylendiaminotetraacetat (EDTA)
Merck
Ethylenglykol-bis-(aminoethylether)-tetraacetat
(EGTA)
Serva
Fötales Rinderserum
Sigma
Glutamin
Gibco
Glycerin
Merk
Hygromycin B
Roche
Ipegal
Sigma
21
Isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosid (IPTG)
Sigma
Kanamycin
Sigma
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Merck
Nitro Blue Tetrazolium Salz (NBT)
Roche
Normalserum aus Esel
Sigma
Normalserum aus Pferd
Vector
Normalserum aus Ziege
Alexis
Paraformaldehyd
Merck
Penicillin/Streptomycin-Lösung
Sigma
Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20)
Serva
Ponceau S
Sigma
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
BRL
Voltalef Öl 10 S
Atochem
Xylencyanol FF
Serva
Pyrokohlensäurediethylester (DEPC)
Aldrich
Coenzym A (CoA)
Sigma
Nicht aufgeführte Chemikalien wurden von den Firmen Baker, Biomol, Fluka, Merck, Riedel de Haen und Roth
bezogen.
2.1.2 Enzyme
Enzym
Hersteller
Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP)
MBI-Fermentas
Restriktionsendonukleasen
MBI-Fermentas
T4 – DNA-Ligase
MBI-Fermentas
Taq-Polymerase
MBI-Fermentas
2.1.3 Kits
Kit
Hersteller
Expand High Fidelity PCR System
Roche
Expand Long Template PCR System
Roche
High Pure PCR Purification Kit
Roche
22
Nucleobond NX 100
Macherey-Nagel
TOPO-Cloning Kit
Invitrogen
Drosophila Expression System (DES)
Invitrogen
T7-Transkriptionskit
MBI-Fermentas
2.1.4 Antikörper
Antiköper
Maus Anti-β-Galaktosidase (monoklonal)
Kaninchen Anti-Ebony (4.Serum)
Maus Anti-Penta-His (monoklonal)
Hersteller
Roche
AG Hovemann
(Ryback, 1987)
Qiagen
AG Fischbach, (Albert-Ludwigs-
Ratte Anti-ELAV
Universität, Freiburg)
(Robinow und White, 1991)
2
Esel Anti-Maus-Cy
Rockland
Ziege Anti-Kaninchen-Cy3
Jackson Immuno Research
Ziege Anti-Kaninchen-AP
Dianova
Ziege Anti-Maus- AP
Dianova
Pferd Anti-Maus-Biotin
Vector
2.1.5 Radioisotope
Radioaktive Substanz / Aktivität
[3H]-β-Alanin // 60Ci/mmol
[32P]-Pyrophosphat // 50Ci/mmol
Hersteller
American Radiolabeled Chemicals
Inc.
Perkin Elmer
23
2.1.6 Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterial
Hersteller
Blot-Papier
Schleicher & Schuell
Nitrocellulose
Sterile Kulturschalen (6er, 24er, 96er)
Sarstedt
Sterile Einwegpipetten (5ml,10ml ,25ml)
Sarstedt
Sterile Zentrifugenröhrchen (15ml, 50ml)
Sarstedt
Sterile Kryo-Röhrchen (2ml)
Roth
Sterile Kulturflaschen (25ml)
Sarstedt
Sterile Kulturflaschen (260ml)
Nunc
Sterilfilter
Sarstedt
Filterpapier
2.1.7 Bakterienstämme
Bakterienstamm
C 600
Genotyp
F-, thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, supE44
F-, mcrA, ∆(mvr-hsdRMS-mcrBC),
DH 10 B
φ80dlacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, endA1,
(Gibco)
araD139, ∆(ara,leu)7697, galU, galK, λ-, rpsL,
nupG
F-, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC),
Top 10
φ80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, araD139,
(Invitrogen)
∆(ara,leu)7697, galU, galK, rpsL, (StrR), endA1,
nupG,
BL21(DE3) pREP4-Gsp
(Stratagene; AG Marahiel, PhillipsUniversität, Marburg)
E. coli, B, F-, dcm+, Hte, ompT, hsdS(rB- mB-),
gal, λ(DE3), endA, Tetr,
mit pREP4-Gsp Helperplasmid
24
2.1.8 Fliegenstämme
Soweit nicht anders angegeben, stammen die Linien aus der Stammsammlung der AG Hovemann.
Fliegenstamm und Genotyp
Beschreibung
Canton S
Wildtyp
120
+ P(ebony − lacZ ; ry + ) ry 506
;
; 506
+
CyO
ry
Ebony-β-Galaktosidase Fusionstransformande
(Hovemann et al., 1998)
eAFA
AFA
+ + In(3R )e
; ;
+ + In(3R )e AFA
ebony-Null-Mutante (Caizzi et al., 1987)
w1118-eAFA
Deletion eines Teils des white Gens (Hazelrigg et
AFA
w + In(3 R )e
; ;
w + In(3 R )e AFA
al., 1984) und ebony Null-Mutante
3-66
+ + P(lacZ ; rsy + )
; ;
+ +
TM 2
Gliamarker
AG
Fischbach,
(Albert-Ludwigs-Universität,
Freiburg)
(Tix et al., 1997)
Balancer 2.Chromosom
CyO: curly, nach Oster
AFA
w Cyo In ( 3R ) e
;
;
w Sco In ( 3R ) e AFA
Sco: scutoid
Balancer 3.Chromosom
Sb: Stubbled
eAFA: ebony Null-Mutante
CxD: CxD-Inversion (3LR) Crossover Supressor
w + Sb
; ;
w + CxD
Dichaete
UAS-lacZ
+
w + p (UAS − lacZ ; w )
; ;
w + p (UAS − lacZ ; w + )
β-Galaktosidase-Expressionslinie
AG Technau (Universität Mainz)
25
2.1.9 Plasmide
Vektor
Lieferant
pBluescript (pBS) KS II +
Stratagene
pCR4-Topo
Invitrogen
pMT-V5-His
Invitrogen
AG Knust
P221-4
Universität Düsseldorf
∆2-3wc-Helferplasmid
AG Walldorf
Universität Hohenheim, Stuttgart
Ebony genomischer Klon 8
AG Hovemann
Ebony genomischer Klon 10
AG Hovemann
pCoHygro
Invitrogen
2.1.10 Oligonukleotide
Name
BamHI-3’-putDrPPT
Sequenz
5’-CTGGATCCTGATCGCTTGTAGGGCTTAAGAAGAGC-3’
KpnI-3’-Ebony-Intron I 5’-GGTACCTCTAGGCACGAAGTCTTGC-3’
NcoI-5’-putDrPPT
5’-AACCATGGGTATGAGCAAACACATCTGCACCCGCTG-3’
5’-KpnI-Ebony
5’-CCAAGTAAAGCGGTACCAATGC-3’
KpnI-5’-Ebony-cDNA
5’- GGTACCATGGGTTCGCTGCCACAATTGTCG-3’
AgeI-3’-Ebony-cDNA
5’- ACCGGTTTTGCCCACCTCCTTCCAATGGAC-3’
XhoI-5'-putDrPPT
5’-AACTCGAGGTATGAGCAAACACATCTGCACCCGCTG-3’
BamHI-Ebony
5’- GGATCCTTTGCCCACCTCCTTCCAATG-3’
Primer 41
5’-TTCCACTGTCGAATACCGTGGTC-3’
2.1.11 Häufig verwendete Puffer
TE:
TBS:
10mM Tris/ HCl (pH 7.9)
100mM Tris / HCl (pH 7.4)
1mM EDTA
150mM NaCl
26
TBST-20:
0,2% Tween 20 in TBS
PBST-20:
0,2% Tween 20 in BBS
TBST-100:
0,1% Triton X-100 in TBS
PBS:
PBST-100:
0,1% Triton X-100 in PBS
137mM NaCl
3mM KCl
10mM Na2HPO4
2mM KH2PO4
pH 7.2
2.1.12 Medien und Kulturplatten
LB-Medium:
Amp-Medium:
10g Pepton (Baktotrypton)
100µg/ml Ampicillin
10g NaCl
in Medium
5g Hefe-Extrakt
pro Liter
Kan-Medium:
50µg/ml Kanamycin
SOB:
in Medium
20g Pepton
5g Hefe-Extrakt
Bakterienplatten:
8,6mM NaCl
1,5% Agar
2,5mM KCl
in Medium
10mM MgCl2
pH 7.0
Eiablageplatten:
8g Agar-Agar
SOC:
300ml H2O
20mM Glukose
100ml Apfelsaft
in SOB
1ml Ethylacetat
27
Fliegen-Futter:
Zellkultur Medium:
300g inaktive Hefe
10% fötales Rinderserum
300g Maismehl
18mM Glutamin
300g Zucker
50u/ml Penicillin G
55g Agar
50µg/ml Streptomycin
30ml Propionsäure
in SFM-Medium (Gibco)
40ml Nipaginlösung (0,25 g/ml in
Ethanol)
in 6 l Wasser
2.2 Methoden
2.2.1 Methoden zur Untersuchung von Genexpression
2.2.1.1 Antikörper-Färbung auf Cryoschnitten
Fixierlösung (pH7.2):
Drosophila-Ringer:
4%-Paraformaldehyd
46mM NaCl
25mM Na2HPO4
182mM KCl
12,5mM KH2PO4
3mM CaCl2
10mM Tris / HCl (pH 7.2)
Um die Ebony-Expression über den Zeitraum der Entwicklung zu untersuchen, wird das AntiEbony Serum aus Kaninchen (Ryseck et al., 1987) auf Cryoschnitten von Larven, Puppen und
adulten Fliegen eingesetzt. Für die Untersuchung verschiedener Puppenstadien werden frisch
verpuppte Larven als weiße Puppen (0-4 Stunden nach Verpuppung (APF)) gesammelt und in
Petrischalen bis zur Präparation gehalten. Ein effektives Eindringen der Fixierlösung wird bei
adulten Fliegen durch Entfernen der Proboscis, bei Puppen durch Entfernen der Hülle
gewährleistet. Bei Larven wird ein kleiner Schnitt am Abdomen angebracht. Die Fixierung
erfolgt für 3 Stunden bei 4°C, anschließend werden die Präparate über Nacht bei 4°C in
Drosophila Ringer mit 25%-Sucrose entwässert. Nach dem Einbetten in Cryomedium
28
(Microm) werden sie in flüssigem Stickstoff eingefroren, im Mikrotom (HM 500, Microm)
für 10 Minuten bei –20°C äquilibriert und dann horizontal geschnitten. Die Schnitte werden
auf beschichtete Objektträger (Super Frost plus, Menzel-Gläser) aufgenommen und entweder
bei –20°C eingefroren oder direkt für die Antikörper-Färbung verwendet. Dazu wird zunächst
mit TBST-100 für 20 Minuten gewaschen, bevor 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem
geeigneten Serum geblockt und anschließend für eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei
4°C mit dem ersten Antikörper in Blockserum inkubiert wird. Nach zweimaligem Waschen
für 20 Minuten mit TBST-100 bei 37 °C, einer Stunde Inkubation mit dem zweiten
Antikörper und erneutem zweimaligem Waschen werden die Präparate in Glycergel (Dako
Corporation) eingebettet. Bei Doppelfärbungen erfolgt die Auswertung mit einem Axioplan
(Zeiss) und dem Filtersatz 24 (Anregung: 485nm und 546nm; Emission: 515nm-540nm und
610nm; Zeiss). Einzelfärbungen mit Cy3 werden mit dem Filter 15 von Zeiss (Anregung:
546nm; Emission: 580nm, Zeiss) oder mit einem konfokalen Mikroskop (LSM 510 META,
Zeiss) ausgewertet.
2.2.1.2 Antikörperfärbung von Embryonen
PEMS-Puffer (pH 6.9):
Fixierlösung:
100mM Pipes
4% Paraformaldehyd
2mM MgSO4
40% n-Heptan
1mM EGTA
in PEMS-Puffer
in ddH2O
Nach Eiablage über Nacht werden die Embryonen kurz mit Wasser gewaschen und dann mit
3%-Hypochlorid dechorioniert. Zur Fixierung werden die Embryonen für 20 Minuten in
Fixierlösung geschüttelt, die wässrige Phase abgenommen, 2 Volumen Methanol zugegeben
und erneut für 30 Sekunden geschüttelt. Nach der Phasentrennung wird möglichst viel
Flüssigkeit entfernt, zweimal mit Methanol und zweimal mit TBST-100 gewaschen. Geblockt
wird für 30 Minuten mit geeignetem Blockserum, bevor der erste Antikörper in Blockserum
zugegeben und entweder 2 Stunden bei 37°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert wird. Nach
fünf mal Waschen für zehn Minuten mit TBST-100 wird der zweite Antikörper in
Blockserum zugegeben, eine Stunde bei 37°C inkubiert, erneut fünf mal gewaschen und in
Glycergel eingebettet. Die Detektion erfolgt mit einem Axioplan wie oben angegeben.
29
2.2.1.3 Antikörperfärbung von S2-Zellen
NTBST:
Fixierlösung:
1% Triton-X100
3,7%-Formaldehyd
10% Normalserum
in TBS-Puffer
in TBS-Puffer
3ml Expressionskultur mit 4-6·106 Zellen/ml werden in einer Zellkultur-Schale ausplattiert, in
die vorher ein mit 70%-Ethanol desinfiziertes Deckglas gelegt wurde und mit 15µl 100mM
CuSO4-Lösung (Endkonzentration 0,5mM) induziert. Nach 24 Stunden Inkubation wird der
Überstand abgenommen, die Zellen auf dem Deckglas für 12 Minuten fixiert und dreimal mit
TBS fünf Minuten gewaschen. Das Blocken erfolgt für eine Stunde mit NTBST, bevor der
erste Antikörper (1:300 in NTBST) zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert wird. Nach
zweimaligem Waschen mit TBST-100 für fünf Minuten wird mit dem zweiten Antikörper
(1:200 in NTBST) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, erneut zweimal mit TBST100 gewaschen und eingebettet. Die Färbung wird an einem Axioplan mit geeigneten Filtern
ausgewertet.
2.2.1.4 Detektion von β-Galaktosidase-Aktivität durch X-Gal-Färbung (Brand und
Perrimon, 1993)
Färbelösung:
150mM NaCl
1mM MgCl2
3,1mM K3Fe(CN)6
3,1mM K4Fe(CN)6
0,03% Triton-X100
0,26% X-Gal
in 10mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 6.9
Die Präparate werden für eine Minute in Ethanol entwässert, bevor sie eingebettet,
geschnitten und für 15 Minuten mit 1% Glutaraldehyd in PBS fixiert werden. Nach
dreimaligem Waschen für 10 Minuten mit PBS werden die Schnitte bei 37°C in einer
feuchten Kammer bis zur erwünschten Intensität mit Färbelösung inkubiert, erneut dreimal
30
gewaschen und eingebettet. Anschließend erfolgt die Auswertung bei normalem Durchlicht
mit Interferenzkontrast an einem Axioplan.
2.2.2 Molekularbiologische Methoden (Sambrook et al., 1989)
2.2.2.1 Restriktion von DNA
Die Restriktion von DNA erfolgte nach den Angaben des Enzym-Herstellers. Für
Doppelrestriktionen wird ein Puffer gewählt, der eine möglichst hohe Aktivität beider
Enzyme gewährleistet. Für Partialverdaue wird nur 1/10 der normalen Enzymmenge
eingesetzt und es werden nach 5 und 15 Minuten Aliquots aus dem Reaktionsgefäß
entnommen. Für anschließende Ligationen wird nach dem Verdau Phosphatase aus
Kälberdarm mit 1u/pmol 5’-Enden direkt zum Restriktionsansatz gegeben und weitere 30
Minuten bei 37°C inkubiert.
2.2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten
50x TAE:
5x DNA-Pobenpuffer:
2M Tris-Acetat (pH 8.0)
7,5% Ficoll
0,05M EDTA
0,1% Bromphenolblau
0,1% Xylencyanol FF
Laufpuffer:
in ddH2O
1x TAE
0,5µg/ml Ethidiumbromid
Je nach gewünschtem Auftrennungsbereich erfolgt die Elektrophorese mit 0,8%-1,5%
Agarosegele bei einer Spannung von 15-20 V/cm für 15 Minuten bis zu zwei Stunden. Zur
Isolierung von Fragmenten aus präparativen Gelen wird das PCR-Purification Kit von Roche
verwendet. Dabei wird sich an die Vorschrift des Herstellers gehalten, mit der Ausnahme,
dass die Elution in drei Schritten (25µl, 12,5µl, 12,5µl) mit 10mM Tris/HCl pH 8.2 erfolgt.
31
2.2.2.3 Ligation von DNA
Standard-Ligationen werden bei RT für 3h oder bei 16°C über Nacht durchgeführt. Für die
Ligation sehr großer Fragmente wird zur Verbesserung der Effizienz die „Temperatur-CycleMethode“ (Lund et al., 1996) nach folgendem Programm eingesetzt:
5x:
10 Minuten 22°C
10 Minuten 16°C
50x:
30 Sekunden 4°C
30 Sekunden 27°C
30 Sekunden 13°C
30 Sekunden 4°C
1x:
1 Stunde 16°C
1 Stunde 22°C
3 Stunden 18°C
Zum Abstoppen der Ligation werden die Ansätze für 20 Minuten auf 60°C aufgeheizt, bevor
sie transformiert werden.
2.2.2.4 Herstellung kompetenter Bakterien
CaCl2-Lösung:
50mM CaCl2 in ddH2O
autoklaviert
Bakterien (C600 für Hitze-Schock oder DH 10 B für Elektroporation) werden auf einer LBPlatte ausgestrichen und über Nacht im Inkubationsschrank bei 37 °C wachsen gelassen. Mit
einer Kolonie von dieser Platte werden 2ml LB-Medium angeimpft, im Inkubationsschüttler
für 3 Stunden bei 37 °C und 180 rpm geschüttelt, bevor mit 1ml aus dieser Kultur 250ml LBMedium angeimpft und bei 37 °C und 130 rpm bis zu einer OD600 von 0,6 hochgezogen
32
werden. Die Bakterien werden in einem vorgekühlten Tube abzentrifugiert (15 Minuten, 4 °C,
4100g). Je nach Bakterienstamm wird danach wie folgt verfahren:
2.2.2.4.1 Herstellung von Hitze-Schock kompetenten C600-Bakterien nach der CaCl2Methode
Das Bakterienpellet wird mit 125ml eiskalter CaCl2-Lösung gewaschen, pelletiert und in
4,25ml CaCl2-Lösung aufgenommen. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis und Zugabe von
4,25ml CaCl2-Lösung mit 40% Glycerin werden 200µl Aliquots abgefüllt und in flüssigem
Stickstoff eingefroren.
2.2.2.4.2 Herstellung von Bakterien für die Elektroporation (DH 10B-Bakterien)
Die pelletierten Bakterien werden einmal mit 250ml, 125ml und 20ml eiskaltem Wasser
gewaschen. Anschließend werden sie mit 0,5ml 10%-Glycerin in Wasser aufgenommen,
aliquotiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
2.2.2.5 Transformation kompetenter Bakterien
2.2.2.5.1 Transformation von C600, TOP10 und BL21 durch Hitze-Schock
Der halbe Ligationsansatz wird zu einem Aliquot Bakterien gegeben, eine 30 Minuten auf Eis
inkubiert, für 45 Sekunden auf 42°C geheizt und nach Zugabe von 800µl eiskaltem SOCMedium für 45 Minuten bei 37°C geschüttelt. Anschließend werden 200µl auf einer
vorgewärmten Kulturplatte mit geeignetem Antibiotikum ausgestrichen. Der Rest wird bei
1700g fünf Minuten zentrifugiert, der Überstand bis auf 200µl abgenommen, das Pellet
resuspendiert und auf einer weiteren Platte ausgestrichen, bevor beide Platten über Nacht bei
37°C inkubiert werden.
2.2.2.5.2 Transformation von DH10B durch Elektroporation
Der Ligationsansatz wird mit dem 2,5-fachen Volumen Ethanol, 1/10 Volumen 2,5M
Natriumacetat (pH 5.2) und 1µl Glycogen (Roche) bei -20°C gefällt, das Pellet mit 500µl
70%- Ethanol gewaschen und in 5µl Wasser aufgenommen. Ein Aliquot kompetenter DH10B
33
wird zugegeben und der gesamte Ansatz in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette
überführt. Die Elektroporation erfolgt in einem E.coli TransPorator (BTX). Nach dem
Strompuls (5ms, 1350V) werden die Bakterien mit 1ml eiskaltem SOC-Medium aus der
Küvette gespült, 45 Minuten bei 37°C mit 170rpm geschüttelt und dann wie oben beschrieben
ausplattiert und inkubiert.
2.2.2.6 Plasmidaufreinigung aus E.coli (Birnboim und Doly, 1979)
Puffer I:
Puffer II:
50mM Tris/HCl 10mM EDTA
200mM NaOH
100µg/ml RNAse (DNAse frei)
1% SDS
pH 8.0
Puffer III:
3M Kaliumacetat, pH 5.5
2.2.2.6.1 Isolierung im kleinen Maßstab zur qualitativen Analyse
2ml Medium mit geeignetem Antibiotikum werden mit einer Einzelkolonie angeimpft und
über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Die pelletierten Bakterien werden in 300µl Puffer I
resuspendiert und nach Zugabe von 300µl Puffer II 5 Minuten inkubiert, bevor 300µl Puffer
III und 100µl Chloroform zugegeben werden. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei 20800g in
einer Tischzentrifuge wird die wässrige Phase abgenommen, die enthaltene DNA mit 600µl
Isopropanol gefällt, mit 500µl 70%-Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50µl TE
aufgenommen. 10µl dieser DNA-Lösung werden für Testrestriktionen eingesetzt.
2.2.2.6.2 Präparative Isolierung im mittleren Maßstab
PEG-Lösung
40% PEG-6000
30mM MgCl2
50ml Medium werden mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Das Bakterienpellet wird in 4ml Puffer I resuspendiert, nach Zugabe von 4ml Puffer II fünf
Minuten bei Raumtemperatur und nach Zugabe von 4ml Puffer III 15 Minuten auf Eis
34
inkubiert. Nach Filtration durch einen Falten-Filter werden 7,2ml Isopropanol zugegeben, es
wird 30 Minuten bei 19800g zentrifugiert, das Pellet einmal mit 70%-Ethanol gewaschen und
in 400µl TE aufgenommen. Nach Phenol-Chloroform Extraktion (Sambrook et al., 1989)
wird mit 80µl Ammoniumacetat und 1ml Ethanol gefällt, das Pellet mit 500µl 70% Ethanol
gewaschen, in 1ml Wasser aufgenommen und mit 500µl PEG-Lösung bei 4°C erneut gefällt.
Nach zweimaligem Waschen mit 70%-Ethanol wird das Pellet in 200µl geeignetem Puffer
aufgenommen und Konzentration sowie Reinheit im Photometer (Ultrospec 2000, Pharmacia)
bestimmt.
2.2.2.7 Isolierung von genomischer DNA aus adulten Drosophila Fliegen
Homogenisierungspuffer:
0,1M Tris (pH 9.0)
0,1M EDTA
1% SDS
Je 40 Fliegen werden in 100µl eiskaltem Puffer homogenisiert. Nach Zugabe von weiteren
400µl Puffer wird für 30 Minuten bei 70 °C inkubiert. Es werden 70µl 8M Kaliumacetat
zugegeben und nach einer Inkubation für 30 Minuten auf Eis unlösliche Bestandteile 15
Minuten bei 20800g abzentrifugiert. Die genomische DNA wird aus dem Überstand mit
300µl Isopropanol gefällt, mit 70% Ethanol gewaschen und in 50 µl TE aufgenommen.
2.2.2.8 PCR-Experimente (Saiki et al., 1985), modifiziert
PCR-Ansatz:
5µl 10x Puffer
1,5mM – 4mM MgCl2
200µM dNTPs
Template DNA
1µM je Primer
ad 50µl mit ddH2O
0,75µl Enzym-Mix bzw. 1µl Taq-Polymerase
35
Die präparativen PCR-Experimente werden mit den High-Fidelity und Long Template Kits
der Firma Roche nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Für qualitative PCR wird
der Enzym-Mix gegen Taq-Polymerase (MBI-Fermentas) ausgetauscht. Alle PCRExperimente laufen nach folgendem Programm ab, wobei die Annealing-Temperatur vom
verwendeten Primer und die Verlängerungsphase von der Größe des zu amplifizierenden
Fragments abhängig sind.
Vorbehandlung:
3 Minuten
95 °C
30-40 Zyklen mit:
30 Sekunden 95 °C
30 Sekunden Annealing Temperatur
1 Minute pro 1,5kb 72°C
Nachbehandlung:
10 Minuten
72 °C
Bei Fragmenten über 3kb wird die Elongationstemperatur auf 68°C erniedrigt. Zusätzlich
wird die Elongationszeit jeweils um 15 Sekunden pro Zyklus verlängert.
2.2.3 Drosophila Schneider S2-Zellkultur (Schneider, 1972)
2.2.3.1 Haltung der S2-Kultur
Die S2-Zellen werden ohne zusätzliches CO2 bei normaler Luftfeuchtigkeit und 23°C in S2Zellkulturmedium gehalten. Beim Erreichen einer Zelldichte von 1·107 Zellen/ml wird die
Kultur umgesetzt und dabei auf 0,5-1·106 Zellen/ml verdünnt. Alle Arbeiten mit der Zellkultur
erfolgen unter sterilen Bedingungen.
2.2.3.2 Aufnahme eine Hygromycin B Titrationskurve
Bei der Selektion sollen resistente Zellen in knapp einer Woche heranwachsen. Die nötige
Konzentration von Hygromycin B wird in einer Titrationskurve bestimmt. Dazu werden
jeweils 3ml Zellkultur mit einer Zelldichte von 5·106 Zellen pro ml in Kulturschalen
ausplattiert und steigenden Konzentrationen von Hygromycin B (im Bereich von 200-800
µg/ml) ausgesetzt. Die Erfassung der Zellpopulation erfolgt täglich und wird gegen die Zeit
aufgetragen. Es wird die Konzentration gewählt, die ein Absterben eines Großteils der nichtresistenten Zellen nach einer Woche gewährleistet.
36
2.2.3.3 Transfektion von Schneider S2-Zellen
Transfektionsansatz:
2xHBS:
20µg Expressionsvektor
50mM HEPES
240mM CaCl2
1,5mM NaHPO4
in 300 µl sterilem H2O
280mM NaCl
pH 7.1
Cryomedium:
45% frisches Zellkultur-Medium
45% konditioniertes ZellkulturMedium
10% DMSO
Der Transfektionsansatz wird in 15µl-Schritten zu 300µl 2xHBS gegeben und für 30 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe zu 3ml ausplattierten S2-Zellen (4-6•106
Zellen/ml) wird 24h inkubiert, einmal mit 3ml Medium gewaschen, in 3ml ausplattiert und die
Proteinexpression nach 48h durch Zugabe von 500µM Kupfersulfat (Endkonzentration)
induziert. Die Transfektionsrate wird über Antikörperfärbung mit dem Anti-Ebony Serum
nach
24h
Induktion
bestimmt.
Zum
Erhalt
einer
stabilen
Zelllinie
wird
dem
Transfektionsansatz 1µg Selektionsvektor pCoHygro (Invitrogen) hinzugefügt. An Stelle der
Induktion erfolgt dann die Selektion in Selektionsmedium (Zellkulturmedium mit 500µg/ml
Hygromycin B; Titrationskurve siehe Anhang). Die stabilen Zelllinien werden ebenfalls auf
ihre Proteinexpression hin überprüft, in 1ml Aliquots mit einer Zelldichte von 1•107 Zellen/ml
in Cryomedium bei –75°C eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Zum Auftauen
wird ein Aliquot schnell bei 37°C aufgetaut und mit 5ml frischem Selektionsmedium in
Zellkulturflaschen ausplattiert.
37
2.2.4 Proteinchemie
2.2.4.1 SDS-PAGE (Laemmli, 1970), modifiziert
Upper-Tris:
SDS-Probenpuffer (5x) :
0,5M Tris/HCl, pH6,8
60mM Tris/HCl, pH 6,8
0,4% SDS
25% Glycerin
in ddH2O
2% SDS
14,4mM β-Mercaptoethanol
Lower Tris :
1,5M Tris/HCl, pH 8,8
0,1% Bromphenolblau
in ddH2O
0,4% SDS
in ddH2O
Sammelgel (4%):
4ml Rotiphorese Gel 30
SDS-Laufpuffer :
5ml Upper-Tris
0,025M Tris/HCl, pH 8,6
21ml ddH2O
0,192M Glycin
100µl 10% APS
0,1% SDS
10 µl TEMED
in ddH2O
Trenngel (X%):
Coomassie-Färbelösung:
Xml Rotiphorese Gel 30
0,125% Coomassie blue R250
5ml Lower-Tris
10% Essigsäure
25-Xml ddH2O
45% Methanol
300µl 10% APS
in ddH2O
30µl TEMED
Es werden diskontinuierliche Gele mit einem 4%-igen-Sammelgel und je nach
Auftrennungsbereich mit einem 8-15%igen Trenngel verwendet. Die Proben werden vor dem
Auftragen 5 Minuten in Lämmli-Puffer bei 95°C gekocht, auf Eis abgekühlt und und
unlösliche Bestandteile abzentrifugiert. Die Spannung beträgt im Sammelgel 60V, im
Trenngel 100V.
38
Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Trenngel entweder mit Coomassie-Färbelösung
gefärbt (Bennett und Scott, 1971) oder geblottet und anschliessend gefärbt. Die Entfärbung
der Gele erfolgt in 10%iger Essigsäure.
2.2.4.2 Semi-Dry Western-Blot (Khyse-Anderson, 1984)
Blot-Puffer I:
Ponceau S-Färbelösung:
20% Methanol
1% Ponceau S
in 25mM Tris pH 10.4
50% Essigsäure
in ddH2O
Blot-Puffer II:
20% Methanol
in 300mM Tris pH 10.4
Blot-Färbelösung:
0,1M NaCl
50mM MgCl2
Blot-Puffer III:
40mM Norleucin
in 25mM Tris pH9.4
0,1% Tween 20
0,45% NBT-Stocklösung
0,35% BCIP-Stocklösung
in 0,1M Tris/HCl, pH 9.5
Blockserum:
1% Normalserum aus Ziege
in TBST-20
Das Trenngel wird in Blot-Puffer I zusammen mit der Nitrocellulose gewaschen. Sechs Lagen
Blot-Papier getränkt in Puffer II und drei Lagen getränkt in Puffer I werden auf die Anode
aufgebracht und darauf die Nitrocellulose und das Gel platziert. Zum Abschluss werden sechs
Lagen Blotpapier mit Puffer III aufgelegt. Es wird 45 Minuten bis eine Stunde bei 0,8mA/cm2
Gel-Fläche geblottet. Der Blot wird zur Markierung des Markers mit Ponceau S für 30
Minuten gefärbt. Die folgenden Schritte des immunologischen Nachweises finden alle bei
Raumtemperatur auf dem Schüttler statt. Es wird zwei mal zehn Minuten mit TBST-20
gewaschen und 30 Minuten mit Blockserum geblockt, bevor der erste Antikörper in
Blockserum zugegeben und für eine Stunde inkubiert wird. Nach zweimaligem Waschen für
15 Minuten mit TBST-20 wird der zweite Antikörper in Blockserum zugegeben und erneut
39
eine Stunde inkubiert, bevor der Blot nach zweimaligem Waschen mit Färbelösung entwickelt
wird.
2.2.4.3 Proteinexpression in Drosophila Schneider S2-Zellen
S2-Lyse-Puffer:
300mM NaCl
10mM Imidazol
1% Ipegal (Sigma)
in 50mM Natrium-Phosphat-Puffer pH 7.9
Für die Proteinaufreinigung werden 400ml Selektionsmedium in einem 3l-Fernbachkolben
mit 3•108 Zellen angeimpft und bis zu einer Dichte von 4-6•106 Zellen/ml bei 100 rpm
wachsen gelassen bevor die Proteinexpression mit 500µM Kupfersulfat (Endkonzentration)
induziert wird. Nach 48h wird die Zelldichte bestimmt, die Zellen durch zehn Minuten
Zentrifugation bei 1000g pelletiert, zweimal mit 100ml PBS gewaschen und mit 10ml LysePuffer eine Stunde auf Eis inkubiert. Nach 15 Minuten Zentrifugation bei 19800g wird der
Überstand abgenommen, durch einen Sterilfilter
filtriert
und über
Nickel-NTA-
Affinitätschromatographie aufgereinigt.
2.2.4.4 Proteinexpression in E.coli BL21-pREP4-Gsp und C600
2.2.4.4.1 Auswahl eines Expressionsklons durch Western Blot Analyse
Mit Einzelkolonien der BL-21 Expressionsklone werden 2ml LB-Kanamycin-Ampicillin
Kulturen angeimpft und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. 100µl dieser Kulturen
werden zum Animpfen frischer, auf 30°C vorgewärmter 2ml Kulturen verwendet, die nach
Erreichen einer OD600 von 0,6 mit 1mM IPTG (Endkonzentration) versetzt werden, um die
Proteinexpression zu starten. Nach vier Stunden Induktion werden 1,5ml abgenommen, die
Bakteriendichte bestimmt, die Bakterien pelletiert, in 100µl Lämmli-Puffer gekocht und mit
Western Blots analysiert. Der Klon mit der höchsten Expression wurde für die Optimierung
der Induktionszeit und der IPTG-Konzentration verwendet.
40
2.2.4.4.2 Optimierung der IPTG Konzentration
Mit 1,5ml einer 3ml LB-Kanamycin-Ampicillin über Nacht Kultur werden 30ml auf 30°C
vorgewärmtes Medium angeimpft. Bei Erreichen einer OD600 von 0,6 wird die Kultur auf 2ml
Aliquots aufgeteilt und jedes Aliquot mit einer anderen IPTG-Konzentration versetzt. Nach
4h Induktion wird von jedem Aliquot die Bakteriendichte bestimmt und das Bakterienpellet in
Lämmli-Puffer gekocht. Durch Western Blot Analyse wird die beste IPTG Konzentration
identifiziert.
2.2.4.4.3 Optimierung der Induktionszeit
Mit 1,5ml einer 3ml LB-Kanamycin-Ampicillin über Nacht Kultur werden 30ml auf 30°C
vorgewärmtes Medium angeimpft. Bei Erreichen einer OD600 von 0,6 wird mit der
optimierten IPTG-Konzentration induziert. In regelmäßigen Abständen werden 1,5ml
abgenommen, die Bakteriendichte bestimmt und nach Zentrifugation das Bakterienpellet in
Lämmli-Puffer gekocht. Nach Entnahme der letzten Probe erfolgt die Analyse der
Expressionstärke über Western Blot.
2.2.4.4.4 Präparative Expression mit optimierten Bedingungen
Mit einer Einzelkolonie der positiven Expressions-Klone wird eine 25ml Kultur mit
geeignetem Selektionsmedium angeimpft und über Nacht bei 200 rpm und 30°C inkubiert.
20ml werden auf 400ml mit frischem Medium verdünnt, bis zu einer OD600 von 0,6 wachsen
gelassen und durch Zugabe von 0,4mM IPTG (Endkonzentration) wird die Proteinexpression
induziert. Nach 3h Induktion werden die Bakterien 10 Minuten bei 6000g pelletiert, in 10ml
HEPES A (siehe Affinitätschromatographie) resuspendiert und bei –20°C mindestens über
Nacht eingefroren.
Die Lyse erfolgt in einer gekühlten French-Press-Apparatur durch drei KompressionsDekompressionszyklen bei 1000ips. Unlösliche Bestandteile werden durch 30 Minuten
Zentrifugation bei 27000g und 4°C pelletiert und das Protein aus dem Überstand über NickelNTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt.
41
2.2.4.5 Proteinaufreinigung über Affinitätschromatographie
Hepes A
Na-Phosphat-Puffer
50mM Hepes
50mM NaH2PO4
300mM NaCl
100mM NaCl
pH 8.0
pH 7.0
Hepes B
Dialysepuffer
Hepes A
Na-Phosphat-Puffer
250mM Imidazol
150mg DTT/l
Die mit einem His6-Peptid fusionierten Expressionsproteine werden bei 4°C durch
Affinitätschromatographie mit Ni-NTA (Qiagen) aufgereinigt. Das Säulenvolumen beträgt
dabei 1-2ml. Um unspezifische Bindungen zu mindern, erfolgt die Auftragung der Proben mit
8%-Hepes B bei 1ml/min. Vor der Elution wird mit 12ml 8%-Hepes B gewaschen (1ml/min).
Das Zellkulturprotein wird direkt mit 50% Hepes B eluiert. Zur Elution des bakteriellen
Proteins wird ein Konzentrationsgradient angelegt, um höhere Reinheit zu gewährleisten. Der
Gradient wird nach folgendem Programm bei einer Geschwindigkeit von 1ml/min aufgebaut:
30 Milliliter 8%-40% Hepes B
10 Milliliter 100% Hepes B
Vom Durchlauf werden 4ml, von der Waschung 2ml, und der Elution 1ml Fraktionen
gesammelt, jeweils 10µl im Bradford-Test (Bradford, 1976) auf ihren Proteingehalt getestet.
Die positiven Elutions-Fraktionen werden vereinigt und gegen Dialyse-Puffer dialysiert. Vor
dem Einfrieren bei –75°C wird die Protein-Konzentration im Photometer bestimmt und eine
Glycerinkonzentration von 10% eingestellt.
42
2.2.4.6 ATP-PPi-Austauschassay (Gevers et al., 1968; Lee und Lipmann, 1975)
Reaktionsansatz:
Terminationslösung :
1µM Enzym
100mM Natriumpyrophosphat
2mM Substrat
560mM Perchlorsäure
50mM MgCl2
1,2% Aktivkohle (Norit A, Sigma)
in 50mM Natrium-Phosphat-Puffer
in ddH2O
pH 7.0
Radioaktiv-Mix:
2mM ATP
0,1mM Natriumpyrophosphat
0,5µCi Natriumpyrophosphat
25mM MgCl2
in 50mM Natrium-Phosphat-Puffer
pH 7.0
Nach fünf Minuten Vorinkubation bei 37°C wird zu einem Volumen Reaktionsansatz das
gleiche Volumen an Radioaktivmix zugegeben. Nach 15 Minuten bei 37°C wird der Ansatz
zu 500 µl eiskalter Terminationslösung gegeben, gemischt und für zehn Minuten auf Eis
inkubiert. Nach Zentrifugation wird das Aktivkohle-Pellet zweimal mit 1ml Wasser
gewaschen, in 500 µl Wasser resuspendiert und in 5ml Szintillationsflüssigkeit (Rotiszint Eco
Plus,
Roth)
überführt,
bevor
die
gebundene
Radioaktivität
für
1
Minute
im
Szintillationszähler (LS 6000 TA, Beckmann) bestimmt wird. Als Kontrolle wird der Assay
ohne Substrat durchgeführt.
2.2.4.7 Beladung mit radioaktivem [3H]-β-Alanin (Stachelhaus et al., 1996a)
Reaktionsansatz:
500nM holo-Enzym
0,5-1µM [3H]-β-Alanin (60Ci/mmol)
1mM ATP
25mM MgCl2
in Natrium-Phosphat-Puffer pH 7.0
43
Das Zellkultur-Protein wird vor dem eigentlichen Assay durch Inkubation mit Sfp in vitro mit
Ppant beladen, um eine nachfolgende Beladung mit β-Alanin zu ermöglichen. Dazu werden
50pmol apo-Enzym mit 25pmol Sfp und 20nmol CoA für 5 Minuten in Assay-Puffer
präinkubiert, bevor die radioaktive Aminosäure zugegeben wird. Nach 15 minütiger
Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37°C wird durch Zugabe von 15µl BSA-Lsg.
(25mg/ml) und 800µl eiskalter 10%-TCA-Lösung präzipitiert, das Pellet zweimal mit 1ml
eiskalter TCA-Lösung gewaschen und mit 200µl Ameisensäure in 5ml Szintilationsflüssigkeit
überführt. Die co-präzipitierte Radioaktivität wird für 2 Minuten im Szintillationszähler
gemessen. Als Kontrolle dienen Ansätze ohne ATP, bzw. mit mutierter oder unbeladener
Thiolierungsdomäne (Ser611-Mutante bzw. Zellkultur-Protein).
2.2.4.8 Bestimmung von möglichen 2.Substraten
Reaktionsansatz:
500nM holo-Enzym
0,5-1µM [3H]-β-Alanin (60Ci/mmol)
1mM 2.Substrat
1mM ATP
25mM MgCl2
in Natrium-Phosphat-Puffer pH 7.0
Einem Standard-Beladungsansatz werden nach 15 Minuten Beladung zwei Aliquots von
100µl entnommen, von denen eins sofort gefällt wird, um den Beladungszustand zu
bestimmen. Das andere wird bis zur Beendigung der Messreihe weiter bei 37°C inkubiert. Der
restliche Ansatz wird mit 1mM 2.Substrat (Endkonzentration) versetzt, 100µl Aliquots nach
15, 30, 60, 120 und 600 Sekunden bei 37°C entnommen und wie oben angegeben, die
präzipitierbare Radioaktivität bestimmt. Nach Abschluss aller Messungen wird das vorher
entnommene zweite Kontroll-Aliquot gefällt, um den Beladungszustand nach Ablauf aller
Messungen zu bestimmen.
2.2.4.9 Identifizierung gebildeter Produkte durch Massenspektroskopie
Zur Identifizierung von Produkten wird der Reaktionsansatz aus 2.2.4.8 in zehnfachem
Maßstab durchgeführt. Das radioaktive β-Alanin wird durch unmarkiertes ersetzt, wobei die
44
Endkonzentration auf 1mM erhöht wird. Entweder nach 2 Stunden oder über Nacht
Inkubation bei 37°C, wird die Reaktion mit 500µl n-Butanol/Chloroform (4:1) gestoppt und
im Vakuum eingedampft. Die Rückstände werden mittels Massenspektroskopie auf gebildete
Produkte untersucht. Als Kontrolle werden die Ansätze mit der Ser611-Ala-Mutante
wiederholt.
2.2.5 Mikroinjektion von DNA in Drosophila-Embryonen (Steller und Pirrotta,
1984)
Injektionspuffer:
5mM KCl
100mM Natriumphosphat-Puffer (pH 6.8)
Die zu injizierende DNA sowie das Helfer-Plasmid werden in Injektionspuffer gelöst
(Injektionskonzentration 750 ng/µl (DNA) bzw. 300 ng/µl (Helper)) und in bis zu 45 Minuten
alte Embryonen injiziert. Nach 72h Stunden werden die geschlüpften Larven gesammelt und
in Zuchtröhrchen überführt. Geschlüpfte Fliegen werden in Einzelkreuzungen auf
Transposoninsertion getestet und positive Transformanden anschliessend über Kreuzung mit
geeigneten Balancer-Stämme balanciert.
45
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Vergleich der Anti-Ebony Färbung in Wildtyp-Fliegen mit der βGalaktosidase Lokalisation in der Transformande 120
In früheren Arbeiten wurde nach Fusion des ebony-Leserahmens mit lacZ nicht nur in der
Cuticula, sondern auch in den optischen Loben der Fliegen β-Galaktosidase-Aktivität
gefunden, was auf eine mögliche Funktion von Ebony in den optischen Loben hindeutete
(Hovemann et al., 1998). Dieses Ergebnis sollte durch den direkten Nachweis des
unveränderten Proteins überprüft und möglichst verifiziert werden. Dazu wurde mit einem
Anti-Ebony Serum (Ryseck, 1987) die Ebony-Expression in Cryoschnitten vom Kopf adulter
Wildtypfliegen und eAFA-Mutanten untersucht und die resultierende Färbung mit den
bisherigen Ergebnissen aus der Anti-β-Galaktosidase-Färbung der Transformande 120
verglichen (Abbildung 14).
Abbildung 14: Lokalisation des Ebony-Proteins
im Wildtyp (A) und der Mutante eAFA (C) im Vergleich zum Ebony-β-Galaktosidase-Fusionsprotein in der
Transformande 120 (B; aus Hovemann et al., 1998). La: Lamina; Me: Medulla. Vergrößerung: A, B und C 500x
Das Muster der Ebony exprimierenden Zellen in der wildtypischen Fliege (A) gleicht dem
Muster der Zellen in der Transformande 120 (B), die das Fusionsprotein exprimieren
(Hovemann et al., 1998). Starke Färbung zeigt sich in der Lamina und in einzelnen Zellen des
Medulla Cortex (Pfeilspitzen), von denen Fortsätze in das Medulla-Neuropil hinein ziehen.
Demnach bestätigt die Färbung mit dem Antiserum, dass Ebony nicht nur in der Cuticula,
sondern auch in den optischen Loben der Fliege exprimiert wird. Die eAFA Null-Mutante (C),
zeigt weder in der Medulla, noch in der Lamina Färbung, woraus geschlossen werden kann,
46
Ergebnisse
dass das Antiserum spezifisch das Ebony Protein erkennt und daher für den direkten
Nachweis verwendet werden kann.
3.2 Untersuchung der Ebony-Expression im Verlauf der Entwicklung von
Drosophila melanogaster
Northern Blot Untersuchungen zeigten, dass ebony-mRNA nicht nur in adulten Fliegen,
sondern auch in früheren Entwicklungsstadien nachweisbar ist (Ryseck, 1987). Mit dem lacZFusions-Protein konnte β-Galaktosidase Aktivität nicht nur in der adulten Fliege, sondern
auch im Gehirn von Larven des dritten Larvenstadiums detektiert werden (Hovemann et al.,
1998). Um einen vollständigen Überblick über den zeitlichen Ablauf der Ebony Aktivität zu
bekommen, wurde unter Verwendung des Antiserums die Ebony-Expression in sämtlichen
Entwicklungsstadien bis zur adulten Fliege untersucht.
3.2.1 Ebony-Expression in Embryonen
Zum Nachweis der embryonalen Expression von Ebony wurden ganze wildtypische
Embryonen mit dem Anti-Ebony Serum gefärbt. Als Kontrolle wurden Embryonen der eAFANull-Mutante unter denselben Bedingungen eingesetzt. Das Ergebnis für Embryonen des
Wildtyps ist in Abbildung 15 zu sehen.
Abbildung 15: Ebony-Expression in Abdominal-Segmenten des Embryos
Links ist ein Embryo des 13. Stadiums (Campos-Ortega und Hartenstein, 1985) im Durchlicht mit
Interferenzkontrast abgebildet. Die rechte Aufnahme zeigt denselben Embryo mit Fluoreszenzfilter. In den
Abdominal-Segmenten wird jeweils eine einzelne Zelle auf jeder Seite gefärbt. Vergrößerung 250x.
Das Ebony Protein lässt sich zum ersten Mal in Stadium 12 (Campos-Ortega und Hartenstein,
1985) nachweisen. Man findet jeweils zwei Zellen in den Abdominal-Segmenten A1 bis A7,
47
Ergebnisse
die Ebony-Expression zeigen. Sie befinden sich mittig auf den gegenüberliegenden Seiten der
Segmente (siehe Pfeile in Abbildung 15). Die starke Hintergrundfärbung findet man auch in
Embryonen der Null-Mutante eAFA (nicht gezeigt). Sie tritt generell bei der Färbung von
ungeschnittenem Gewebe mit dem Antiserum auf. Die Zellen der Abdominal-Segmente
werden in der Null-Mutante jedoch nicht gefärbt, so dass sie als spezifisch angesehen werden
kann. Bis zum Schlüpfen der Larve sind keine weiteren Ebony-positiven Zellen zu
detektieren, wobei nicht ausgeschlossen werden kann, dass die hohe Hintergrundfärbung
mögliche weitere Ebony exprimierende Zellen überstrahlt.
3.2.2 Ebony-Expression in Larven
Von Larven des 1., 2. und 3. Stadiums wurden 10µm Kryo-Schnitte angefertigt und auf
Ebony-Expression untersucht. Es stellte sich heraus, dass alle drei Stadien des Wildtyps
dasselbe Expressionsmuster zeigen. Es ist in Abbildung 16 A am 2. Larvenstadium
exemplarisch gezeigt.
Ebony wird in den Hemisphären und dem Ventralganglion aller drei Larvenstadien
exprimiert. Die Zellen der Hemisphären liegen in einem kreisförmigen Muster vor und zeigen
Zellfortsätze, die besonders im dritten Stadium gut zu erkennen sind (B). Im Ventralganglion
erstrecken sich die Ebony exprimierenden Zellen in zwei Reihen über die gesamte Länge des
Ganglions. Anzahl und Muster der Zellen deuten dabei auf die Zellen der lateralen Glia hin
(Granderath und Klämbt, 1999), die das Neuropil des Ventralganglions umschließen. In
einem separaten Projekt sollten zur genauen Bestimmung Marker hinzugezogen werden, um
den Zelltyp genau zu identifizieren. Zusätzlich zu den Zellen im Nervengewebe werden die
Öffnungen der Tracheen am posterioren und anterioren Ende der Larven stark angefärbt. Im
Gegensatz zu der Neuropil-Färbung, zeigt sich diese Färbung auch in eAFA Null-Mutanten und
kann deshalb nicht spezifisch sein.
48
Ergebnisse
A
B
C
Abbildung 16: Ebony-Expression in Larven des 2. und 3. Larvenstadiums
A: Expression im 2. Larvenstadium; Pfeilspitzen: Ebony-Expression im Ventralganglion und den Hemisphären
des Larven-Gehirns; Pfeile: Expression in den anterioren und posterioren Öffnungen der Tracheen. B:
Expressionsmuster in den Hemisphären des Gehirns einer Larve des 3. Stadiums. C: Ebony exprimierende
Zellen in den Hemisphären (Pfeile) und dem Ventralganglion (Pfeilspitzen) des 2. Larvenstadiums.
Vergrößerung: A 80x; B 200x; C 220x.
3.2.3 Ebony-Expression in der Puppe
Zum Zeitpunkt der Verpuppung (0-4 Stunden APF (after pupal formation), siehe Abbildung
17 A) entspricht das Muster der Ebony exprimierenden Zellen noch dem des 3.
Larvenstadiums, wie man in der Vergrößerung des Ventralganglions in Abbildung 17 A sehen
kann. Zwischen 24 und 60 Stunden nach der Verpuppung lässt sich Ebony nicht mehr im ZNS
nachweisen (gezeigt für die optischen Loben 48 Stunden APF in Abbildung 17 B). Ab 60
Stunden APF findet man ein mit der Imago vergleichbares Expressions-Muster (siehe
Abbildung 17 C), mit starker Expression in der Lamina und in Zellen der Medulla sowie des
Lobula Komplexes. Im ZNS findet man Ebony positive Zellen aber auch in den AntennalLoben und weiteren, nicht genauer bestimmten Regionen (nicht gezeigt). Bis zum Schlüpfen
49
Ergebnisse
der Fliege ändert sich das Muster der Ebony exprimierenden Zellen nicht mehr. In Puppen der
Null-Mutante eAFA desselben Alters lässt sich Ebony nicht nachweisen (Abbildung 17 D).
A
B
Re
La
Me
Lo
P
C Re
Lo
D
La
Lo
Me
Lo
P
La
Lo
Me
LoP
Re
Abbildung 17: Ebony-Expression in der Puppe von Drosophila melanogaster
A: Ebony-Expression in der frisch verpuppten Fliege (0-4h APF). Die Vergrößerung zeigt die Ebony
exprimierenden Zellen des Ventralganglions. B: 48h nach der Verpuppung (48h APF) zeigen die optischen
Loben keine Ebony-Expression. C: Mit der adulten Fliege vergleichbares Expressionsmuster 60h APF. D: 60h
APF der eAFA-Null-Mutante. La: Lamina, Me: Medulla, Lo: Lobula, LoP: Lobula-Platte; Re: Retina;
Vergrößerung: A 40x (Ausschnitt 70x); B,C und D 350x
3.2.4 Ebony-Expression in den optischen Loben der Imago
Das charakteristische Expressionsmuster in den optischen Loben der adulten Wildtyp-Fliege
zeigt Ebony exprimierende Zellen in der Lamina, in der Medulla und im Lobula-Komplex
(Abbildung 18 A).
Hochauflösende Aufnahmen von Laminaschnitten mit einem Konfokalmikroskop (Abbildung
18 B) zeigen, dass die Ebony positiven Zellen die Lamina in Kompartimente aufzuteilen
scheinen und sich über das gesamte Neuropil erstrecken. Dies deutet auf eine Expression in
den Zellen der epithelialen Glia hin, die als einzige Zellen ihren Zellkörper im Neuropil der
Lamina haben. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Ian Meinertzhagen (Dalhousie
Universität, Halifax, Kanada) konnte dieses Ergebnis bestätigt und ausgeweitet werden.
Durch Verwendung eines Markers für die Axone der Photorezeptorzellen wurde
50
Ergebnisse
nachgewiesen, dass die Ebony exprimierenden Zellen die Cartridges der Lamina umschließen
(Richardt et al., 2002), ein weiteres Kriterium, das nur für die Epithelial-Glia gilt.
Charakteristikum dieser Gliazellen sind auch Einstülpungen der Membran. Diese konnten in
EM-Aufnahmen ebenfalls für die Ebony positiven Zellen gezeigt werden (Richardt et al.,
2002).
Abbildung 18: EbonyExpression
in
den
optischen Loben der
adulten Fliege
A zeigt eine Übersicht
über die Färbung in den
optischen Loben. Neben
der starken Färbung der
Lamina (La), lässt sich
Ebony in der Peripherie
der Medulla (Me; Pfeile)
und
des
Lobula
Komplexes (Lo und LoP;
Pfeilspitzen) nachweisen.
Re: Retina; *: Äußeres
optisches Chiasmata.
B und C: Hochauflösende Aufnahmen der
Lamina (B) und der
Medulla (C) mit einem
konfokalen
Mikroskop
(gegenüber A jeweils um
90°
gegen
den
Uhrzeigersinn gedreht).
Ebony positve Zellen
finden sich nicht nur in
der distalen (Pfeile),
sondern auch in der
anterioren
und
posterioren (Pfeilspitze)
Peripherie der Medulla.
Vergrößerung: A 550x; B
und C 750x.
In Konfokal-Aufnahmen der Medulla (Abbildung 18 C) erkennt man, dass sich Ebony
ausschließlich im Cytoplasma der Zellen befindet. Der Zellkern erscheint ungefärbt und hebt
sich vom Cytoplasma ab (Pfeile in C). Neben den Zellen in der distalen Peripherie der
Medulla, werden auch Zellen im posterioren und anterioren Bereich gefärbt (Pfeilspitze in A).
Die Zellkörper der Ebony exprimierenden Zellen im Lobula Komplex liegen ebenfalls in der
51
Ergebnisse
Peripherie des Neuropils (Pfeilspitzen in A). Wie die Zellen der Medulla senden sie Fortsätze
in das Neuropil aus. Diese Charakteristika deuten insgesamt auf eine Expression in Neuropil
Gliazellen hin (Eule et al., 1995)
Muster und Form der Ebony exprimierenden Zellen lassen darauf schliessen, dass Ebony in
den epithelialen Gliazellen der Lamina und den Neuropil-Gliazellen der Medulla und des
Lobula-Komplexes exprimiert wird. Um zu bestätigen, dass es sich um Gliazellen handelt,
wurden die Ebony exprimierenden Zellen mit Neuronen und Gliazellen verglichen.
3.3 Bestimmung des Ebony exprimierenden Zelltyps in den optischen
Loben von Drosophila melanogaster
Zum Vergleich der Ebony positiven Zellen mit neuronalen Zellen wurde ein Antikörper gegen
das neuronal exprimierte ELAV-Protein (Robinow et al., 1988; Robinow und White, 1991)
zusammen mit dem Anti-Ebony Serum auf Kopf-Schnitten von adulten wildtypischen Fliegen
verwendet. Als Kontrollexperiment wurde die gleiche Färbung an Kryoschnitten der NullMutante durchgeführt. Zum Nachweis einer eventuellen Expression in Gliazellen, wurde die
Enhancer-Trap-Linie 3-66 verwendet (Tix et al., 1997). Diese Fliegen exprimieren unter
Einfluss eines Enhancers β-Galaktosidase gekoppelt an eine Zellkern-Transportsequenz,
wodurch die β-Galaktosidase-Aktivität auf den Zellkern von Gliazellen der optischen Loben
beschränkt ist. Die Fliegen zeigen keine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit oder im
Aufbau des Nervensystems. Zum Vergleich wurden Kopfschnitte der Linie 3-66 mit Anti-βGalaktosidase und dem Anti-Ebony Serum gefärbt.
Abbildung 19 zeigt die ELAV(grün)-/Ebony(rot)-Doppelfärbung im Wildtyp (A und B) und
der Null-Mutante (C). Es ist zu sehen, dass sich die neuronale Färbung im peripheren Bereich
der Medulla (Me) von den Ebony-positiven Zellen deutlich abhebt (A und Vergrößerung in B;
Pfeile). Auch die Zellen der Lobula und Lobula-Platte zeigen keine Co-Expression von Ebony
und ELAV (Abbildung 19 A, Pfeilspitzen). Eine Co-Lokalisation von ELAV und Ebony und
damit eine Expression von Ebony in Neuronen der optischen Loben ist demnach nicht
gegeben. Im Vergleich von Null-Mutante und Wildtyp sieht man, dass sich das Muster der
ELAV-positiven Zellen nicht unterscheidet. Da die optischen Loben der Null-Mutante zudem
nicht wesentlich in Größe, Struktur und Lage verändert scheinen, sind Unterschiede in der
Abbildung eher auf leicht unterschiedliche Schnittebenen bzw. individuelle Unterschiede
52
Ergebnisse
einzelner Fliegen zurückzuführen. Das bestätigt, dass es sich bei dem visuellen Phänotyp
nicht um einen durch morphologische Veränderungen hervorgerufenen Defekt handelt.
Abbildung 19: Doppelfärbung von Wildtyp und Mutante mit Anti-Ebony Serum und Anti-ELAV
Antikörper
A und B: Doppelfärbung von Wildtyp-Fliegen mit dem Anti-Ebony Serum (2.Antikörper Cy3 gekoppelt: rot) und
Anti-ELAV Antikörper (2.Antikörper Cy2 gekoppelt: grün). C: Gleiche Färbung bei eAFA. La: Lamina, Me:
Medulla, Lo: Lobula, LoP: Lobula-Platte. Vergrößerung A und C: 350x; B: 700x.
Die Doppelfärbung der Linie 3-66 mit Anti-β-Galaktosidase und Anti-Ebony zeigt, dass es zu
partialen Überlappungen der Färbungen im Bereich des Medulla Cortex kommt (Abbildung
20).
Abbildung 20: Co-Lokalisation von
Ebony und β-Galaktosidase in der
Glia-Marker-Linie 3-66
Ebony exprimierende Zellen sind rot,
β-Galaktosidase exprimierende Zellen
grün gefärbt. B und C zeigen
Vergrößerungen der in A als Rechteck
eingezeichneten
Bereiche.
Me:
Medulla, La: Lamina; Vergrößerung:
A 450x; B und C 2000x.
Während in den großen Gliazellen der inneren und äußeren Chiasmata nur β-Galaktosidase
nachweisbar ist (Pfeilspitzen in A, Vergrößerung B), exprimieren Gliazellen des Medulla
Cortex sowohl Ebony als auch β-Galaktosidase (Pfeile in A, Vergrößerung C). In der
Vergrößerung ist zu erkennen, dass sich in der Zelle die Ebony-Färbung von der grünen
53
Ergebnisse
Zellkernfärbung abhebt. Dies bestätigt, dass Ebony cytosolisch und nicht im Zellkern
lokalisiert ist.
Die Untersuchung der zeitlichen Expression von Ebony zeigt, dass Ebony ab dem zwölften
Embryonalstadium bis zur Verpuppung exprimiert wird. Im Laufe der Puppenentwicklung
setzt die Expression für knapp 60h aus. Danach findet man in den optischen Loben das
Expressionsmuster der adulten Fliege. Durch Vergleich mit neuronalen und Glia Markern
konnten die Ebony exprimierenden Zellen als Gliazellen der optischen Loben identifiziert
werden. Dies bestätigt, dass Ebony nicht nur an Prozessen des Cuticula-Aufbaus sondern auch
des visuellen Systems beteiligt ist. Interessanterweise wird es dabei jedoch nicht neuronal,
wie man auf Grund des Defekts in der Signaltransduktion hätte vermuten können, sondern in
Gliazellen exprimiert.
Aus der Untersuchung der Ebony-Expression ergeben sich zwei Fragen, die in den folgenden
Abschnitten untersucht werden sollen. Zum einen deutet die Anwesenheit von Ebony in
verschiedenen Entwicklungsstadien und in verschiedenen Geweben auf eine komplexe
Genregulierung hin, wie sie auch von ähnlich exprimierten Genen, z.B. der Dopa
Decarboxylase ddc bekannt ist (Dewhurst et al., 1972; Bray et al., 1988; Scholnick et al.,
1991). Der Enhancer der DDC ist in funktionelle Bereiche aufgeteilt, die unabhängig
voneinander die gewebespezifische Expression von ddc kontrollieren. Vergleichbare Bereiche
könnten auch für ebony existieren und daher wurde im folgenden Abschnitt die EnhancerAktivität verschieden großer Fragmente aus dem 5’-Bereich von ebony getestet.
Die zweite Frage ergibt sich aus dem Typ der ebony exprimierenden Zellen. Es konnte
eindeutig bewiesen werden, dass Ebony in Gliazellen der optischen Loben, aber nicht in den
Neuronen lokalisiert ist. Daraus resultiert die Frage, welche Funktion Ebony in den Gliazellen
hat und wie sich diese auf Signaltransduktion und Neurotransmitter-Metabolismus auswirkt.
Da nicht auszuschließen war, dass Ebony neben Dopamin auch Histamin mit β-Alanin
konjugiert, wurde beschlossen, dass Protein aufzureinigen, um seine Substratspezifität und
den Reaktionsmechanismus unter definierten Bedingungen in vitro zu untersuchen.
3.4 Untersuchungen zum Enhancer des ebony-Gens
In Vorarbeiten wurde gezeigt, dass ein 5,5kb großes genomisches Fragment vor Exon 1
zusammen mit dem ebony Gen ausreicht, um die Ebony-Funktion in eAFA-Mutanten wieder
herzustellen. In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, den Enhancer von ebony in
seine funktionellen Bereiche aufzutrennen, um sowohl den für die Cuticula als auch das
54
Ergebnisse
Nervensystem verantwortlichen Teil zu identifizieren. Das würde die Möglichkeit eröffnen,
Cuticula und Nervensystem Phänotyp getrennt voneinander zu untersuchen, da man
ausgehend von einer eAFA-Nullmutante gezielt einen Teil des Ebony Phänotyps retten könnte.
So kann z.B. über den Cuticula-spezifischen Anteil des ebony Enhancers das Ebony Protein in
der Cuticula von Null-Mutanten exprimiert werden, während im Nervensystem kein Ebony
gebildet wird. Die resultierende Fliege sollte also eine wildtypische Cuticula, aber eine
defekte visuelle Signaltransduktion aufweisen. Somit kann dann der visuelle Defekt
unabhängig von dem Cuticula Defekt untersucht werden.
Um Hinweise auf die Aktivität vermittelnden Regionen des ebony Enhancers zu bekommen,
wurden drei unterschiedlich große genomische Fragmente in den Gal4-Transfektionsvektor
p221-4 kloniert und in Fliegen transformiert. Die resultierenden Fliegen wurden mit einem
UAS-lacZ Reporterstamm gekreuzt und die Enhancer-Aktivität über X-Gal Färbung
bestimmt.
S
E
0
XK
S E
5
Exon:
X E
EE
B S
2xE
B
E
10
I
X
15
II
III
IV
V
kb
VII
VI
6,3kb-Transformationskonstrukt
9,9kb-Transformationsklon
11,1 kb-Transformationsklon
lacZ
LacZ-Fusionsklon
(Hovemann et al. 1998)
Abbildung 21: Übersicht über die drei klonierten und transformierten Klone
Dargestellt ist das Ebony Gen mit 5,5kb zusätzlicher genomischer Sequenz und den Positionen der sieben Exons
(I-VII), die drei Transformationsklone und im Vergleich dazu das Ebony-β-Galaktosidase Fusionskonstrukt.
Ausgewählte Restriktions-Stellen: B: BglII; E: EcoRI; K: KpnI; S: SalI; X: XhoI
Das kürzeste Konstrukt besteht aus dem 6,3kb großen SalI Fragment. Dieses wurde über
EcoRI und KpnI (partial) aus einem genomischen Bluescript(BS)-Klon (AG Hovemann,
Ruhr-Universität Bochum) geschnitten und gerichtet vor das 5’-Ende des HSP70 Promotors
des Gal4-Vektors p221-4 ligiert. Die richtige Orientierung wurde über Sequenzierung und
Testrestriktion überprüft.
Für die zweite Transformation wurde das erste Konstrukt um das Intron 1 und einen kleinen
Teil des Exons 2 erweitert. Dazu wurde das Intron 1 mit den Primern 5’-KpnI-Ebony und
KpnI-3’-Ebony-Intron 1 aus dem genomischen BS-Klon 10 (AG Hovemann, Ruhr-Universität
Bochum) amplifiziert. Dabei wurde eine synthetische KpnI-Schnittstelle am 3’-Ende
eingefügt. Nach Subklonierung im pCR4-Topo Vektor wurde das Fragment über KpnI in das
55
Ergebnisse
kurze Konstrukt eingefügt und die Orientierung durch Testrestriktion und Sequenzierung
kontrolliert.
Das längste Konstrukt erstreckt sich bis zur ersten BglII-Schnittstelle und damit über die
gleiche genomische Region, die auch für ein lacZ-Fusionskonstrukt (Hovemann et al., 1998)
verwendet wurde und die zur wildtypischen Expression des Fusionsproteins in der Cuticula
und den optischen Loben führte. Um es zu klonieren, wurde das 6,3kb-Konstrukt mit dem
KpnI-BglII-Fragment aus dem genomischen Klon 10 erweitert. Als Akzeptor des 3’-BglIIEndes diente dabei die BamHI-Schnittstelle des p221-4-Vektors, so dass das Fragment über
KpnI-BamHI gerichtet kloniert werden konnte. Nach Fertigstellung wurden die Konstrukte in
Embryonen injiziert und transgene Linien etabliert.
3.4.1.1 Ergebnisse der Transformation
Die Ergebnisse der Transformationen für die einzelnen Konstrukte sind in
Tabelle 1 dargestellt.
Konstrukt
Embryonen
6,3kb
177
9,9kb
690
11,1kb
1555
Larven
Puppen
Adulte
Transformanden
65
27
22
4
(36,7%)
(41,5%)
(81,5%)
(18,18%; 2,3%)
112
82
76
8
(16,2%)
(73,2%)
(92,7%)
(10,53%; 1,3%)
135
100
96
2
(8,7%)
(74,1%)
(96%)
(2,08%; 0,1%)
Tabelle 1: Ergebnisse der Transformation
Angegeben ist die Anzahl der injizierten Embryonen, der geschlüpften Larven, der Puppen, der geschlüpften
Fliegen und der erhaltenen Transformanden. Die Prozentzahlen geben das Verhältnis zu der vorhergegangenen
Entwicklungsstufe an. Bei den Transformanden bezeichnet die erste Prozentzahl das Verhältnis zu den adulten
Fliegen, die zweite das Verhältnis zu den injizierten Embryonen.
56
Ergebnisse
Die Injektionsserien lieferten insgesamt 14 unabhängige transgene Tiere. Diese hatten zum
Teil mehrere Nachkommen, die als einzelne Linien (abhängige Transformanden) aufgezogen
wurden (Tabelle 2).
Konstrukt
Unabhängige
Transformande
Injektionsstamm
w1118
A 13
3
w1118
A 14
3
w1118
A 15
3
w1118
A 16
3
w1118
A 17
3
w1118
A 18
3
w1118
A 19
2
w1118
A 20
2
w1118
A 21
2
w1118
A 22
2
w1118
II.9
A 23
2
yellow, w1118
II.13
A 24
3
yellow, w1118
A 25
2
yellow, w1118
A 26
2
yellow, w1118
A 27
2
yellow, w1118
A 28
2
yellow, w1118
A 29
2
yellow, w1118
A 30
2
yellow, w1118
A 31
2
yellow, w1118
A 32
2
yellow, w1118
A 33
2
yellow, w1118
A 34
3
yellow, w1118
A 35
3
yellow, w1118
A 36
3
yellow, w1118
V.7
A 37
3
white-AFA
V.7
A 38
2
white-AFA
IV.2
V.2
III.14
III.18
IV.8
IV.11
11,1kb
Chromosom
3
V.1
9,9kb
Insertions-
A 12
III.13
6,3kb
Linien
Tabelle 2: Liste der aus den Injektionsserien erhaltenen Transformations-Linien
Das Insertionschromosom wurde über Balancer-Kreuzungen bestimmt und die Linien werden
balanciert gehalten, um Rekombinationen zu vermeiden. Die Linien A34-A36 sind
homozygot letal.
57
Ergebnisse
Um die Enhancer-Aktivität der einzelnen Transformanden zu bestimmen, wurden sie mit
einem UAS-lacZ Reporter-Stamm gekreuzt und die Nachkommen mit X-Gal-Färbung auf
Enhancer spezifische β-Galaktosidase-Aktivität getestet.
3.4.1.2 Lokalisation der Enhancer-Aktivität
Abbildung 22 zeigt das Ergebnis für ausgewählte Linien der drei verschiedenen Konstrukte.
Abbildung 22: Enhancer kontrollierte β-Galaktosidase Aktivität der drei verschiedenen Konstrukte
X-Gal-Färbung von Kryoschnitten: A und B: Linie A16 (6,3kb Fragment); C und D: Linie A23 (9,9kb
Fragment), E und F: Linie A38 (11,1kb Fragment). Vergrößerung: A, C und E: 62,5x; B,D und F: 100x.
Alle drei Konstrukte zeigen spezifische Aktivität in der Cuticula des Abdomens (A, C, E) und
des Kopfes (B, D, F). Bei größerer Vergrößerung zeigt sich, dass die starke Färbung im
Gehirn der Linie A16 (B) und die leichtere Gehirn-Färbung in der Linie A38 (F) keine
58
Ergebnisse
spezifische Färbung von Zellen darstellt (Pfeile). Vermutlich wird sie durch Färbeartefakte
hervorgerufen. Im Gegensatz zu Untersuchungen mit dem ebony-lacZ Fusionsprotein konnte
keines der getesteten Konstrukte eine Expression in den optischen Loben bewirken.
Die Cuticula-Aktivität der Enhancer führte jedoch tatsächlich zu einer ebony-spezifischen
Expression. Dies konnte für das mittlere Konstrukt in Rettungs-Experimenten gezeigt werden.
Kreuzungen mit einer UAS-ebony-cDNA Linie führen bei homozygotem eAFA-Hintergrund
zur Wiederherstellung der wildtypischen Cuticula-Färbung. Der visuelle Defekt bleibt dabei
aber erhalten (Kemme, 2001). Es ist denkbar, dass eine Fusion des Gal4-Leserahmens mit
dem ebony Gen notwendig ist, um wie beim ebony-lacZ-Fusionskonstrukt zusätzlich zur
Cuticula Expression auch eine Expression in den optischen Loben zu bewirken. Da die
Herstellung transgener Tiere sehr zeitaufwendig ist, konnten weitere Experimente im Rahmen
dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden.
Die folgenden Abschnitte beschäftigen sich mit der Frage nach der Spezifität und dem
Reaktionsmechanismus des Ebony Proteins. Da eine Proteinisolierung aus Drosophila als
äußerst schwierig bekannt war (Black et al., unveröffentlichte Daten; Perez et al., 2002),
wurde als Alternative die Aufreinigung des Proteins aus einem bakteriellen und einem
Zellkulturexpressionssystem gewählt. Dies sollte die schnelle Aufreinigung des instabilen
Proteins über His-Tag Affinitätschromatographie ermöglichen.
3.5 Expression und Isolierung des Ebony-Proteins
Für Ebony als potentielle Peptidsynthetase wäre es essentiell, dass es mit dem Co-Faktor
Ppant beladen wird. Dies geschieht in NRPS durch spezifische PhosphopantetheinTransferasen (PPT). Für Drosophila melanogaster war ein solches Enzym nicht bekannt, so
dass bei der Aufreinigung zwei Strategien gewählt wurden, um sicherzustellen, dass holoEbony in den biochemischen Untersuchungen eingesetzt werden kann.
Drosophila melanogaster Schneider S2-Zellen (Schneider, 1972) wurden als homologes
System zur Expression verwendet, um zu testen, ob ein endogenes Protein der S2-Zellen in
der Lage ist, das exprimierte Protein ausreichend mit Ppant zu beladen. Falls die Funktion
nicht in S2-Zellen zur Verfügung steht, sollte das aufgereinigte apo-Protein in vitro mit der
PPT Sfp aus Bacillus subtilis (Nakano et al., 1992; Quadri et al., 1998) in die holo-Form
überführt werden. Sfp weist eine geringe Substratspezifität auf (Lambalot et al., 1996) und
59
Ergebnisse
wird daher standardmäßig für den Ppant Transfer auf solche Peptidsynthetasen verwendet, bei
denen die spezifische PPT unbekannt ist.
Als Alternative wurde ein bakterielles Expressionssystem gewählt. Der verwendete
Bakterien-Stamm BL21-pREP4-Gsp exprimiert die PPT Gsp aus Bacillus brevis (Borchert et
al., 1994) konstitutiv. Gsp weist ebenfalls eine geringe Substratspezifität auf, so dass eine co-
exprimierte Peptidsynthetase in vivo von der apo-Form in die holo-Form überführt wird
(Stachelhaus et al., 1998).
3.5.1 Expression und Aufreinigung von Ebony aus S2-Zellen
Der Leserahmen von ebony wurde aus dem UAS-ebony-cDNA Konstrukt (Kemme, 2001) mit
den Primern KpnI-5’-Ebony-cDNA und AgeI-3’-Ebony-cDNA amplifiziert und über KpnI
und AgeI in den Transfektionsvektor pMT-V5/His-A (Invitrogen) kloniert. Dabei wird das
V5-Epitop des Vektors entfernt und die kodierende Sequenz von ebony mit dem Leserahmen
eines carboxyterminalen His-Tags fusioniert. Der Leserahmen des fertigen Konstruktes wurde
vollständig sequenziert, um Unversehrtheit der Sequenz zu gewährleisten. Der fertige
Transfektionsvektor ist in Abbildung 23 dargestellt.
Beta-Lactamase
Metallothionein Promotor
Kpn I(854)
Nco I(854)
Zellkultur Expressionskonstrukt
Abbildung 23: Der Ebony-Transfektionsvektor für die S2-Zellkultur
Ausgewählte Schnittstellen sind mit
ihrer Position angegeben. Die Leserahmen der β-Lactamase (vermittelt die
Resistenz gegen Ampicillin) und von
Ebony sind in schwarz in Transkriptionsrichtung dargestellt.
6055 bp
Nco I(2366)
His-Tag
Age I(3493)
Bsu 36I(2570)
Eco RI(2691)
Eco RI(2749)
Eco RV(2997)
Nach Transfektion und Selektion mit 500µg/ml Hygromycin B wurde eine stabile
Zellpopulation erhalten, die nach 24 Stunden Induktion mit Kupfersulfat zu etwa 40% mit
dem Ebony Antiserum angefärbt wird (siehe Abbildung 24 A). Eine Western Blot Analyse
mit dem Anti-Penta-His Antikörper (Qiagen) zeigt, dass das gebildete Protein tatsächlich die
60
Ergebnisse
Größe des Ebony Proteins aufweist. Induktionszeiten über 24h scheinen keinen deutlichen
Einfluss auf die Expressionsstärke zu haben. Der Nachweis des His-Tags bestätigt weiterhin,
dass das Protein erfolgreich mit dem His6-Peptid fusioniert wurde (Abbildung 24 B).
B
A
Abbildung 24: Nachweis
der Ebony-Expression nach
24h Induktion
A: Färbung der Zellkultur
mit dem Anti-Ebony Serum.
B: Nachweis des His6Fusionierten Proteins im
Western Blot. 1-3: 24,48 und
96h Induktion.
Die
Aufreinigung
aus
einer
400ml
Großkultur
erfolgte
über
Nickel-Säulen-
Affinitätschromatographie, deren Verlauf in Abbildung 25 und Abbildung 26 dokumentiert
ist.
60%
1,2
D1 D2
D3
W1
50%
W2
E7 E8
W3
E9 E10
W4
Bradford O.D.
40%
E11
W5
E12E13
E6
W6
E14E15
E1
E2
E3
E4
30%
E16E17E18E19E20
E5
%-Hepes B
0,8
20%
0,4
10%
0%
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Fraktion
Abbildung 25: Elutions-Diagramm der FPLC des Zellkultur-Proteins
Aufgetragen ist die OD aus dem Bradford-Test gegen die Fraktionsnummer. Die gestrichelte Linie verdeutlicht
die Hepes-B Konzentration. D: Durchlauf, W: Waschung, E: Elution
61
Ergebnisse
1
2
3
4
5
M
7
8
9
1
2
3
4
5
M
7
8
9
250kDa
150kDa
100kDa
75kDa
50kDa
38kDa
Abbildung 26: SDS-PAGE und Western Blot ausgewählter Fraktionen der Aufreinigung
Auftragung: 1: „Zell-Lysat“, 2: Pellet, 3: D1, 4: W2, 5: W6, M: Marker, 7: E6, 8: E8, 9: E10. Der in der Mitte
aufgetragene Marker gilt für beide Abbildungen.
Die O.D. Werte des Bradford-Test für die Elutions-Fraktionen E6 bis E15 lassen auf die
Präsenz von Protein schließen. Die Coomassie-Färbung des SDS-PAGE Gels mit
ausgewählten Fraktionen der Aufreinigung zeigt in den Elutions-Fraktionen neben einigen
kleineren Proteinen eine deutliche Bande mit einem Molekulargewicht im Bereich von 75100kDa. Ein Western Blot mit Anti-Ebony Serum bestätigt, dass es sich dabei tatsächlich um
das Ebony Protein handelt.
Für die nachfolgenden Untersuchungen wurden die Elutions-Fraktionen E6-E13 vereinigt und
dialysiert. Aus der Konzentrationsbestimmung ergab sich eine Konzentration von 1µg/µl. Es
wurden insgesamt 8mg Protein aus der Zellkultur gewonnen. Das Protein wurde nach der
Konzentrationsbestimmung eingefroren oder aber sofort verwendet.
3.5.2 Expression und Aufreinigung von Ebony und Ebony Ser611-Ala aus BL21pREP4-Gsp
Der ebony Leserahmen wurde über die NcoI und die BamHI Restriktionsstellen in den
Expressions-Vektor pQE60 (siehe Abbildung 27) einkloniert. Dazu wurde ein Fragment
zunächst aus dem UAS-ebony-cDNA Klon (Kemme, 2001) mit den Primern 41 und EbonyBamHI über die interne NcoI-Schnittstelle bis zum Translations-Ende amplifiziert, wobei der
Translationsstop entfernt und eine synthetische BamHI-Schnittstelle eingefügt wurde. Dieses
Fragment wurde über NcoI und BamHI in den pQE60 Vektor kloniert und mit dem NcoIFragment des Zellkultur-Transfektionsklons (siehe Abbildung 23 auf Seite 60) am 5’ Ende
vervollständigt.
62
Ergebnisse
Um die Analogie des Ebony Reaktionsmechanismus zu NRPS zu untersuchen, wurde
zusätzlich zum wildtypischen Protein eine Mutante aufgereinigt. Bei dieser ist das Ser611, das
über Homologien als Bindungsstelle für den Co-Faktor Ppant identifiziert wurde, durch
Alanin ersetzt. In in vivo Experimenten zeigt diese Mutante keine Funktionalität mehr
(Kemme, 2001). Da in vivo nur Aussagen zur generellen Funktionalität möglich sind, soll in
vitro die Aktivität der einzelnen Domänen der Mutante untersucht und so der
Funktionsverlust aufgeklärt werden. Um die Mutation durch den Ser-Ala-Austausch in den
Leserahmen einzubringen, wurde das Bsu36I-EcoRV-Fragment gegen ein Bsu36I-EcoRVFragment mit der Mutation (Kemme, 2001) ausgetauscht. Beide Klone wurden über
Sequenzierung und Testverdau kontrolliert, bevor sie in den Expressionsstamm BL21-pREP4Gsp transformiert wurden.
XhoI(2)
T5 Promotor/Lac Operator
EcoRI(89)
NcoI(114)
Beta-Lactamase
Bakterielle
Expressionsklone
6062 bp
NcoI(1626)
Bsu36I(1830)
EcoR I(1951)
EcoR I(2009)
His6-Tag
T gegen G Austausch (1945)
Eco R I (2009)
Eco RV (2257)
Abbildung 27: Die bakteriellen Expressionskonstrukte
Zum Erhalt des mutierten Ser611-Ala-Poteins wurde das wildtypische Bsu36I/EcoRV-Fragment gegen das
mutierte Fragment ausgetauscht. Der Austausch ist in der Abbildung dargestellt. Die unterstrichene EcoRISchnittstelle an der Position 1951 ist im mutierten Fragment durch eine stille Mutation entfernt worden und ist
daher nur im Klon mit der wildtypischen Sequenz vorhanden.
63
Ergebnisse
3.5.2.1 Optimierung der bakteriellen Proteinexpression
3.5.2.1.1 Auswahl des Expressionsklons
Vor der Optimierung von IPTG-Konzentration und Induktionszeit wurden Einzelkolonien auf
die Stärke der Expression untersucht, um einen möglichst gut exprimierenden Klon zu
identifizieren. Abbildung 28 zeigt das Ergebnis.
1
2 3 4
5 6 7 8 9 10 11
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
116kDa
97kDa
66kDa
116kDa
97kDa
66kDa
45kDa
45kDa
Abbildung 28: Western-Blot Analyse der Koloniereihe mit Anti-Penta-His
Auf der linken Seite ist die Koloniereihe für die Bakterien des wildtypischen Proteins zu sehen, auf der rechten
Seite die Reihe für das mutierte Ser611-Ala-Protein. Die Markergrößen sind jeweils rechts vom Blot angegeben.
Bei den Klonen, die das wildtypische Protein exprimieren zeigen sich deutliche Unterschiede
in der Stärke der Expression. Die größte Proteinmenge wird von den Kolonien 5 und 7
produziert, wo allerdings auch eine Reihe von weiteren Proteinen mit dem Antikörper
detektiert wird. Trotzdem wurde Klon 5 zur weiteren Optimierung verwendet, da das Signal
in der richtigen Größe am stärksten ist. Bei den Expressionsklonen der Ser611-Ala-Mutante
zeigen sich kaum Unterschiede in der Menge des gebildeten Proteins. Für die Aufreinigung
wird der Klon 7 benutzt. Die Optimierung der Expression wird in den folgenden
Experimenten für das wildtypische Protein durchgeführt.
3.5.2.1.2 Optimierung der IPTG-Konzentration und der Induktionszeit
Abbildung 29 zeigt den Einfluss der Induktionszeit und unterschiedlicher IPTGKonzentrationen auf die Expressionsstärke von Klon 5.
64
Ergebnisse
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
1 2 3 4
5 M 7 8
116kDa
97kDa
9 10 11 12
116kDa
97kDa
66kDa
45kDa
Abbildung 29: Zeitreihe und IPTG-Konzentrationsreihe
Der linke Western-Blot zeigt das Ergebnis der Zeitreihe: Spur 1:0; Spur2-Spur9: jeweils +30 Minuten
Expressionszeit; Spur 10: 24h. Der rechte Teil zeigt die abnehmende IPTG-Konzentrationsreihe: IPTGEndkonzentrationen: Spur 1: 0mM; Spur 2-Spur 5: 1-0,7mM; Spur7-Spur12:0,6-0,1mM. M: Marker. Der
Größenstandard ist rechts vom jeweiligen Blot angegeben.
Bei der Zeitreihe sieht man, dass das Protein 30 Minuten nach Induktionsbeginn schon
nachweisbar ist. Bis zur dritten Induktionsstunde nimmt die Menge an gebildetem Protein zu,
danach ist keine Steigerung mehr feststellbar. Daher wird eine Induktionszeit von drei
Stunden gewählt. Beim Test mit abnehmender IPTG-Konzentration zeigen sich kaum größere
Unterschiede in der Expressionsstärke. Das Signal bei der Endkonzentration von 0,4mM
IPTG ist jedoch am besten ausgeprägt. Daher wird diese Konzentration für die Induktion der
Großkultur verwendet.
3.5.2.2 Präparative Expression und Aufreinigung der Proteine
Im Gegensatz zur Konzentrationsstufe bei der Aufreinigung des Proteins aus der Zellkultur
wurden die bakteriellen Proteine über einen Imidazol-Gradienten aufgereinigt. Dies
ermöglichte eine Abtrennung von kontaminierenden Proteinen, besonders eines Threonin
adenylierenden Proteins, das in den Adenylierungs-Assays detektiert wurde (Daten nicht
gezeigt).
Der Verlauf der Affinitätschromatographie ist in Abbildung 30 und Abbildung 31
dokumentiert.
65
Ergebnisse
1,8
D5
40%
D10
D11
D2
1,5
30%
D1
W1
0,9
20%
W2
W3
0,6
W4
W5
W6
E1 E2
E3 E4
E5 E6
E7 E8 E9 E10E11E12E13E14E15
E16
E17E18
E19E20
E21E22
%-Hepes B
Bradford O.D.
1,2
10%
0,3
0
0%
0
5
10
15
20
25
30
35
Fraktion
Abbildung 30: Elutions-Diagramm der FPLC des bakteriellen Proteins
Aufgetragen ist die OD aus dem Bradford-Test gegen die Fraktionsnummer. Die gestrichelte Linie verdeutlicht
die Hepes-B Konzentration. D: Durchlauf, W: Waschung, E: Elution.
1 2 3 4
5
6
7 8 9 10 11 12 M 14
116kDa
97kDa
66kDa
Abbildung 31: Western Blot ausgewählter
Fraktionen der Proteinaufreinigung
Auftragung von links: 1: Bakterien-Kultur, 2:
Lysat, 3: Durchlauf D1, 4: Waschung W1, 5:
W6, 6: Elution E3, 7: E18, 8: E5, 9: E7, 10: E9,
11: E12, 12: E14, 13: E16, M: Marker, 14:
vereinigte Fraktionen E5-E17 nach der Dialyse.
Die Markergrößen sind rechts neben dem Blot
angegeben.
Das Elutionsprofil zeigt im Vergleich zur Zellkultur einen deutlich flacheren Peak. Die
Western-Blot Analyse der Fraktionen mit einem Anti-Penta-His Antikörper zeigt, dass ab
Fraktion E5 Ebony-His6-Protein in den Elutions-Fraktionen vorhanden ist. Für die Dialyse
wurden die Fraktionen E5-E17 vereinigt.
Insgesamt wurden mit dem bakteriellen Expressionssystem jeweils 1,2mg des wildtypischen
und des mutierten Proteins erhalten. Die Konzentration betrug jeweils 0,1µg/µl. Das Protein
wurde nach der Konzentrationsbestimmung bei -75°C eingefroren oder sofort getestet.
66
Ergebnisse
3.6 In vitro Charakterisierung der Ebony Reaktion
Die Tests für die Charakterisierung der von Ebony katalysierten Reaktion gliedern sich in drei
Abschnitte. Im ersten Teil wird die A-Domäne auf ihre Aktivität und ihre Spezifität bei der
Auswahl einer Aminosäure untersucht. Von Peptidsynthetasen ist bekannt, dass die
Adenylierungsreaktion von zweiwertigen Kationen abhängig ist. Daher wird auch für die von
Ebony katalysierte Adenylierung von β-Alanin getestet, welchen Einfluss zweiwertige
Kationen haben.
Im zweiten Teil werden die Eigenschaften der T-Domäne charakterisiert. Es wird getestet, ob
dort Ppant gebunden wird und ob das Aminosäure-Adenylat aus der A-Domäne auf die TDomäne übertragen wird.
Im letzten Teil wird der produktbildende Reaktionsschritt, die Verknüpfung der aktivierten
Aminosäure mit Aminen untersucht. Dieser Schritt wird vermutlich von den letzten knapp
200 Aminosäuren katalysiert, die hinter der T-Domäne liegen und keine Homologie zu
Peptidsynthetasen aufweisen.
3.6.1 Aktivität und Spezifität der Adenylierungsdomäne
Um die Aktivität der Adenylierungsdomänen zu überprüfen, wurden alle Proteine in ATPPPi-Austauschassays
eingesetzt.
Der
Austauschassay
beruht
auf
der
reversiblen
Adenylatbildung (siehe 1.3). Durch Zugabe von radioaktivem Pyrophosphat entsteht so bei
der Rückreaktion radioaktives ATP. Im Gegensatz zu Pyrophosphat wird ATP von
Aktivkohle adsorbiert und kann selektiv aus dem Gemisch entfernt werden. Über die
Bestimmung der gebundenen Radioaktivität kann somit auf eine stattgefundene
Adenylierungsreaktion geschlossen und diese quantitativ ausgewertet werden.
Um die generelle Aktivität und die Substratspezifität der Adenylierungsdomäne der
aufgereinigten Enzyme zu testen, wurden PPi-ATP-Austausch-Assays mit verschiedenen
Substraten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 32 dargestellt. Zusätzlich zu βAlanin wurden Aminosäure(AS)-Mixe, die um eine Methylgruppe längere γ-Aminobutylsäure
(GABA), Propionsäure und Propylamin eingesetzt.
67
Ergebnisse
100%
rel. cpm
80%
60%
40%
20%
-A
S
Al
an
in
β-
-A
la
in
/β
äu
re
Pr
o
py
la
m
io
ns
in
op
Pr
AB
A
py
la
m
Pr
o
/β
4
ix
M
G
la
-A
5
ix
M
M
ix
4
3
ix
M
M
ix
2
1
ix
M
-A
S
β-
Al
an
in
0%
Abbildung 32: Substratspezifität der Adenylierungsdomäne des wildtypischen und mutierten Proteins
Auf der linken Seite sind die Ergebnisse für das wildtypische bakterielle Protein aufgetragen. Die relativen
Werte für das Protein aus der Zellkultur sind identisch. Die höchste Aktivität wurde für die Adenylierung von βAlanin gemessen und als 100% aufgetragen. Im abgetrennten rechten Teil ist das Ergebnis für die Mutante
gezeigt, die ebenfalls in der Lage ist, β-Alanin zu adenylieren. Mix1: L-Ala, Gly, Thr, Ser; Mix2: Pro, Leu, Val;
Mix3: Asp, Asn, Phe, His; Mix4: Lys, Arg, Cys, Met, Tyr, Ile; Mix 5: Gln, Trp, Glu.
Für die Untersuchung der Substratspezifität wurden nur die wildtypischen Proteine
untersucht. Die Ser611-Ala-Mutante wurde mit β-Alanin nur auf generelle Aktivität der
Adenylierungsdomäne getestet.
Alle drei Proteine zeigen Adenylierungs-Aktivität bei der Verwendung von β-Alanin. Andere
Aminosäuren, sowie die strukturverwandten Substanzen Propylamin, Propionsäure und
GABA zeigen gegenüber der Kontrolle (ohne Substrat: -AS) keine signifikante Erhöhung der
Radioaktivität. Durch Zusatz von β-Alanin (Mix4/β-Alanin; Propylamin/β-Alanin) wird die
für β-Alanin typische Stärke der Adenylierungs-Aktivität wieder erreicht. Da die Relationen
der einzelnen Messwerte zueinander identisch sind, werden nur die Werte für das bakterielle
Protein gezeigt. Der Ansatz mit der Ser611-Ala-Mutante zeigt, dass die Adenylierungsdomäne
von der Mutation unbeeinträchtigt geblieben ist.
68
Ergebnisse
3.6.1.1 Bestimmung des Km Werts für die Adenylierung von β-Alanin
Durch Variation der β-Alanin Konzentration unterhalb der Sättigungsgrenze und Bestimmung
der Reaktionsgeschwindigkeit lässt sich der Km-Wert für β-Alanin aus der doppeltreziproken
Auftragung von Konzentration und Geschwindigkeit bestimmen (Kittelberger et al., 1982).
Diese Auftragung ist für das wildtypische Ebony aus Bakterien in Abbildung 33 gezeigt.
Abbildung 33: Bestimmung des KmWerts
Die Reaktionsgeschwindigkeit (in cpm
pro pmol Enzym und Sekunde) ist
reziprok gegen den Umkehrwert der
Substratkonzentration
(mM)
aufgetragen. Die gestrichelten Linien
stellen Ausgleichsgeraden dar, die aus
den Schwankungen der Messung
resultieren.
pmol·s/cpm
0,25
0,2
1/v
0,15
0,1
1/v
0,05
0
0
5
10
15
20
25
1/[S]
1/[S]
1/mM
Aus der Auftragung ergeben sich ein Km-Wert von 0,23±0,08mM und ein vMax von 54±2
cpm·pmol-1·s-1. Dieser Wert ist vergleichbar mit Km-Werte für A-Domänen der TyrocidinSynthetase aus Bacillus brevis oder von EntF aus Escherichia .coli. Diese liegen im Bereich
von 0,08±0,05 bis 0,85±0,2 mM für die wildtypisch aktivierten Aminosäuren (Reichert et al.,
1992; Mootz und Marahiel, 1997).
Aus der spezifischen Aktivität des eingesetzten Pyrophosphats und der Menge des
eingesetzten Enzyms ergibt sich eine Zerfalls-Rate von 0,037 ± 0,001 min-1. Dieser Wert
spiegelt die Geschwindigkeit der Rückreaktion bei Substratsättigung wieder und ist damit ein
Maß für die Stabilität des Enzym-Adenylat-Komplexes. In Messungen einer A-Domäne der
Yersiniabactin Synthetase aus Yersinia pestis wurde eine Zerfalls-Rate von 0,24 pro Minute
festgestellt (Keating et al., 2000). Ebony scheint somit das Adenylat deutlich stabiler halten
zu können.
3.6.1.2 Einfluss von zweiwertigen Kationen auf die Adenylierungsreaktion
Von Peptidsynthetasen ist bekannt, dass der Adenylierungsmechanismus von Mg2+-Ionen
abhängig ist. In Arbeiten über ein niger-Mutante der Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis
capitata, bei der ebenfalls eine β-Alanyldopamin Synthetase betroffen zu sein scheint, konnte
69
Ergebnisse
gezeigt werden, dass die in Zellextrakten untersuchte Reaktion ebenfalls von Mg2+-Ionen
abhängig ist. Diese konnten durch andere zweiwertige Ionen ersetzt werden. Für Cobalt
wurde bei höheren Konzentrationen eine inhibierende Wirkung festgestellt (Perez et al.,
2002). Das in dieser Arbeit aufgereinigte Protein ermöglicht die direkte Untersuchung der
Ionenabhängigkeit der Adenylierungsreaktion unter definierten Bedingungen. Dazu wurde die
Adenylierungsreaktion bei unterschiedlichen Konzentrationen von Mg2+, Co2+ und Mn2+Ionen durchgeführt und die ermittelte Aktivität gegen die steigende Konzentrationen
aufgetragen.
120000
100000
cpm
80000
60000
40000
20000
0
0
2
4
6
8
10
12
14
mM
MgCl2
CoCl2
MnCl2
Abbildung 34: Abhängigkeit der Adenylierungsreaktion von zweiwertigen Metallionen
Die Ionenkonzentration ist in mM gegen die gemessene Radioaktivität in cpm für Mg2+, Co2+ und Mn2+
aufgetragen.
Wie man in Abbildung 34 sehen kann, sind sowohl Mangan- als auch Cobalt-Ionen in der
Lage, die Magnesium-Ionen zu ersetzen. Die Werte sind für den Ansatz mit
Magnesiumchlorid jedoch am höchsten. Interessant ist die Abnahme der Radioaktivität bei
steigenden Co2+-Konzentrationen. Während bei einer Konzentration von 12,5mM die Ansätze
mit Mg2+ und Mn2+ noch über 60% der maximalen Aktivität zeigen, liegt die Aktivität des
Co2+-Ansatzes nur noch knapp über dem Nullwert.
Mit den ATP/PPi-Austauschassays konnte gezeigt werden, dass die A-Domänen der
wildtypischen Proteine aus S2 und BL21 Zellen, sowie des mutierten Proteins aktiv sind.
Dabei zeigt sich eine hohe Spezifität für β-Alanin. Alle anderen getesteten Substanzen zeigen
keine signifikanten Werte in den Tests. Eine Abhängigkeit der Adenylierungsreaktion von
70
Ergebnisse
zweiwertigen Kationen konnte nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse bekräftigen das
Modell, dass Ebony in einem zu Peptidsynthetasen homologen Reaktionsweg sein Substrat
zunächst adenyliert, bevor es in der T-Domäne kovalent gebunden wird. In den folgenden
Experimenten wird daher der zweite Schritt der Reaktion, die Thiolierung, d.h. die
Übertragung des Aminosäure-Adenylats auf die T-Domäne, untersucht.
3.6.2 Die Thiolierungsreaktion
3.6.2.1 Beladung des Zellkultur-Proteins mit Ppant
Die T-Domäne von Peptidsynthetasen muss zur Funktionsfähigkeit mit dem Co-Faktor
Phosphopantethein (Ppant) beladen werden. Dies geschieht durch Phosphopantetheintransferasen. Da sich in massenspektroskopischen Analysen herausstellte, dass das Ebony
Protein aus der Zellkultur in vivo nicht mit Ppant beladen worden war (H. Prinz, MPI
Dortmund), wurde in einem Vorexperiment zu den eigentlichen Beladungstests mit β-Alanin
untersucht, ob die T-Domäne von Ebony von der unspezifischen PPT Sfp aus Bacillus subtilis
als Substrat für den Ppant-Transfer akzeptiert wird. Dazu wurde das apo-Ebony aus der
Zellkultur mit Sfp und radioaktivem CoA inkubiert. Bei Akzeptanz der T-Domäne durch Sfp
sollte ein Teil des Ebony-Proteins durch den radioaktiven Ppant-Rest des CoAs markiert
werden. Nach erfolgter Inkubation werden die Proteine mit TCA selektiv gefällt, während das
radioaktive CoA in Lösung bleibt. Das Resultat der Beladung ist in Abbildung 35 gezeigt.
Abbildung 35: Beladung des ZellkulturProteins mit [3H]-CoA
Die höchste gemessene Radioaktivität findet
sich im Beladungsansatz (+) und wird mit
100% angegeben. Als Kontrollen wurden
Ansätze ohne Sfp oder MgCl2 gemessen.
100%
rel. dpm
80%
60%
40%
20%
0%
+
-Sfp
-MgCl 2
Die präzipitierbare Radioaktivität nimmt bei Einsatz von Sfp im Vergleich zu den NegativKontrollen (ohne Sfp oder ohne essentielle Mg2+-Ionen (Reuter et al., 1999)) deutlich zu. Die
T-Domäne von Ebony wird demnach von der bakteriellen PPT Sfp akzeptiert. Aus dieser
71
Ergebnisse
erfolgreichen in vitro Phosphopantetheinylierung von Ebony durch eine bakterielle PPT kann
mit
großer
Wahrscheinlichkeit
geschlossen
werden,
dass
auch
im
bakteriellen
Expressionssystem in vivo eine Beladung der T-Domäne mit Ppant durch Gsp erfolgt. Damit
wäre es möglich, die fehlende PPT aus Drosophila melanogaster durch bakterielle PPT mit
geringer Substratspezifität zu ersetzen. Dies zeigt, dass sich die hohe Homologie der
Aminosäure-Sequenz von Ebony zu Peptidsynthetasen offensichtlich auch in der SekundärStruktur widerspiegelt.
3.6.2.2 Beladung der T-Domäne mit β-Alanin
Die Beladung der T-Domäne aller drei Proteine mit β-Alanin wurde ebenfalls über TCAPräzipitation untersucht. Hierbei wird radioaktiv markiertes β-Alanin verwendet, das durch
die kovalente Bindung an Ppant in der T-Domäne zusammen mit dem Protein co-präzipitiert
werden sollte. Eine erfolgreiche Beladung zeigt sich daher in einer Steigerung der
präzipitierbaren Radioaktivität.
In den Ansätzen wurden die bakteriellen Proteine nach der Aufreinigung direkt eingesetzt, da
sie durch das co-exprimierte Gsp bereits in der holo-Form vorliegen sollten, bzw. im Falle der
Mutante nicht mit Ppant beladen werden können (Kemme, 2001). Das Zellkultur-Protein
wurde zunächst durch Prä-Inkubation mit Sfp und CoA in die holo-Form überführt. Die
Ergebnisse der Beladung mit β-Alanin sind in Abbildung 36 dargestellt.
Abbildung 36: Beladung
der Ebony-Proteine mit βAlanin
Die Werte der bakteriellen
Proteine
(Wildtyp
bzw.
Ser611-Ala-Mutante) sind als
schwarze Säulen dargestellt,
die des Zellkultur Proteins als
weiße. Das wildtypische
bakterielle Protein zeigt die
höchste Beladung und wird
daher mit 100% angegeben.
100%
rel. dpm
80%
60%
40%
20%
0%
Bakt. Wildtyp
Bakt. Mutante
Bakt. Wildtyp;
- ATP
Zellkultur
+Sfp;+ATP
Zellkultur
-Sfp;+ATP
Zellkultur +Sfp;
- ATP
Sowohl das wildtypische Protein aus der Bakterienkultur, als auch das holo-Zellkultur-Protein
sind in der Lage, das radioaktive β-Alanin kovalent zu binden, wie man an dem Anstieg der
72
Ergebnisse
präzipitierbaren Radioaktivität im Vergleich zu den Negativ-Kontrollen (Ansätze ohne ATP,
keine in vitro Modifikation des apo-Zellkultur-Enzyms mit Sfp) sehen kann. Die T-DomänenMutante Ser611-Ala zeigt keine Zunahme an präzipitierbarer Radioaktivität. Sie ist also
tatsächlich nicht in der Lage, trotz aktiver Adenylierungsdomäne, die Aminosäure kovalent an
das Protein zu binden. Auch das Zellkultur-Protein bindet ohne Prä-Inkubation mit Sfp kein
β-Alanin. Damit wird bestätigt, dass es in vivo nicht durch eine endogene PPT beladen wurde.
Die quantitative Auswertung der Beladung der wildtypischen Proteine ergibt, dass 7-10% des
bakteriellen Proteins und knapp 2% des Zellkultur-Proteins beladen wurden. Die höhere
Aktivität des bakteriellen Proteins könnte dabei aus der in vivo Beladung des Proteins
resultieren, die eventuell eine höhere Stabilität bewirkt. Normalerweise liegt die Beladung
von aufgereinigten Modulen von NRPS im Bereich von 25% (D. Schwarzer, AG Marahiel,
Phillips-Universität Marburg). Da Variationen der Versuchsbedingungen, z.B. längere
Beladung mit Ppant oder Aminosäure, keine Steigerung der Beladbarkeit der Proteine
brachten, muss davon ausgegangen werden, dass ein Teil des aufgereinigten Proteins
zumindest die Aktivität der T-Domäne verloren hat. Die Ursache hierfür könnte die geringe
Stabilität des Proteins sein. Diese wurde von Black (unveröffentlichte Daten) und von Perez
für das vermutlich homologe Niger Protein aus Ceratitis capitata beschrieben (Perez et al.,
2002) und vereitelte bis zu dieser Arbeit eine Aufreinigung des Proteins. Da sich die hier
gemessenen Beladungswerte jedoch signifikant von den Kontrollen abhoben, wird von
weiteren Optimierungen der Aufreinigung abgesehen. Da das bakterielle Protein eine höhere
Aktivität zeigt, werden die folgenden Versuche, soweit nicht anders angegeben, damit
durchgeführt.
3.6.3 Untersuchungen zur Produktbildung
In der Modellvorstellung des Reaktionsmechanismus für Ebony wird davon ausgegangen,
dass das aktivierte, als Thioester in der T-Domäne gebundene β-Alanin auf ein Substrat
übertragen und das Produkt vom Enzym abgespalten wird. Um dieses Modell zu verifizieren,
wird das Enzym zunächst ohne 2.Substrat mit radioaktiv markiertem β-Alanin beladen und
der Beladungszustand bestimmt. Anschliessend werden mögliche Konjugationspartner hinzu
gegeben. Erfolgt die Verknüpfung mit β-Alanin, sollte dies in einer Abnahme der mit TCA
präzipitierbaren Radioaktivität resultieren, da die radioaktive Aminosäure mit dem Produkt
vom Enzym freigesetzt wird. Wird die Substanz nicht als Reaktionspartner akzeptiert, bleibt
die Radioaktivität am Enzym gebunden und man sieht keine Veränderung zum beladenen
73
Ergebnisse
Zustand. Hauptaugenmerk bei der Bestimmung von möglichen β-Alanin Akzeptoren liegt auf
Dopamin und Histamin, zusätzlich wurden Octopamin, Serotonin und Tyramin getestet, da sie
die relevanten biogenen Amine in Drosophila darstellen.
100%
80%
rel. dpm
60%
40%
20%
0%
Beladen
Dopamin
Histamin
Octopamin
Serotonin
Tyramin
-ATP
Beladen
Dopamin
Histamin
-ATP
Abbildung 37: Abnahme der präzipitierbaren Radioaktivität bei Zugabe von biogenen Aminen
Die Reaktion wurde für das bakterielle Protein (schwarz) mit allen fünf, für das Zellkultur Protein (weiß) mit
Dopamin und Histamin durchgeführt. Die Aktivität des beladenen Proteins vor Zugabe des zweiten Substrats
wird mit 100% angegeben.
Wie man in Abbildung 37 an der deutlichen Abnahme präzipitierbarer Radioaktivität sieht,
dienen alle fünf Amine in vitro als Reaktionspartner für die Konjugation mit β-Alanin. Mit
dem Zellkultur Protein kann dieses Ergebnis für Dopamin und Histamin bestätigt werden.
Dort zeigt sich ebenfalls eine Verringerung der präzipitierbaren Radioaktivität.
Um zu verifizieren, dass die Abnahme der Radioaktivität tatsächlich auf eine Produktbildung
zurückzuführen ist, wurden massenspektroskopische Produktanalysen vorgenommen. Als
Kontrolle diente die Ser611-Ala-Mutante, da sie nicht in der Lage ist, die aktivierte
Aminosäure zu binden und daher auch kein Produkt bildet. Die Ansätze wurde mit einem
Qstar Pulsar i ESI-Q-TOF Hybridmassenspektrometer von Applied Biosystems im Labor von
Professor Marahiel (Philipps-Universität, Marburg) ausgewertet. Es zeigte sich, dass das
wildtypische Ebony in vitro tatsächlich alle fünf biogenen Amine mit β-Alanin verknüpft. In
den Ansätzen der Mutante finden sich nur die Massen der Substrate, ein Signal mit der Masse
des Produktes fehlt (U. Linne, AG Marahiel, Phillips-Universität, Marburg).
74
Ergebnisse
Im Gegensatz zur hohen Spezifität der A-Domäne für β-Alanin scheint die Spezifität des
produktbildenden Schrittes deutlich geringer zu sein. Im Experiment konnte gezeigt werden,
dass nicht nur Dopamin und Histamin, sondern auch anderen biogene Amine als Akzeptoren
des β-Alanins dienen können. Unter dem Gesichtspunkt, dass Ebony in verschiedenen
Entwicklungsstadien und Geweben exprimiert wird, die nicht immer dopaminerge Neuronen
enthalten, erscheint das Ergebnis einer breiteren Akzeptanz von 2.Substraten passend.
Gleichzeitig stellt sich aber auch die Frage nach den Faktoren, die darüber entscheiden, ob
eine Substanz mit β-Alanin konjugiert wird. Um die strukturellen Kriterien zu identifizieren,
die über eine β-Alanylierung durch Ebony entscheiden, wurden Substrat ähnliche Substanzen
auf ihre Konjugation mit β-Alanin getestet.
3.6.4 Untersuchungen zur Spezifität der β-Alanylierungsreaktion
Die biogenen Amine werden aus Aminosäuren synthetisiert, dabei entstehen Tyramin und
Histamin direkt aus der Decarboxylierung der Aminosäuren Tyrosin bzw. Histidin. Das
bedeutet, dass sich Tyramin und Histamin nur durch eine Carboxylgruppe von Tyrosin und
Histidin unterscheiden. Wegen dieser hohen Ähnlichkeit wurden daher diese Aminosäuren
zuerst getestet. Zusätzlich wurde Lysin wegen seiner isolierten Aminogruppe am Seitenarm
eingesetzt.
Abbildung 38: Test verschiedener Aminosäuren auf
Akzeptanz als 2.Substrat
120%
rel. dpm
100%
80%
60%
40%
20%
in
D
op
am
-A
TP
sk
on
tro
lle
Be
la
du
ng
Ly
si
n
os
in
Ty
r
Hi
st
id
in
Be
la
de
n
0%
Wie man in Abbildung 38 erkennen kann, werden weder die Vorstufen der biogenen Amine,
noch die Aminogruppen der Lysin-Seitenkette für die Verknüpfung mit β-Alanin akzeptiert.
Die Werte bleiben auf dem Niveau des beladenen Enzyms. Zusätzlich wurde in diesem
Experiment eine Beladungskontrolle durchgeführt, indem ein Aliquot des Proteins über die
75
Ergebnisse
gesamte Versuchsphase ohne Zugabe von 2.Substrat inkubiert wurde. Wie man sieht, bleibt
die Beladung konstant, bzw. nimmt scheinbar leicht zu. Eine Entladung ohne passendes
2.Substrat ist somit ausgeschlossen.
Das Ergebnis für die Vorstufen zeigt, dass das Einbringen einer Carboxylgruppe die
Verknüpfung mit β-Alanin verhindert. Während Histamin und Tyramin als Akzeptoren
dienen, zeigen Tyrosin und Histidin keinen Effekt. Um den Einfluss der Carboxylgruppe
näher zu untersuchen, wurden Aminosäuren mit zunehmendem Abstand zwischen Aminound Carboxy-Funktion eingesetzt und die Werte in Relation zueinander gesetzt. Das Ergebnis
zeigt Abbildung 39.
120%
100%
rel. dpm
80%
60%
40%
20%
0%
Beladen
Glycin
β-Alanin
GABA
5-AVA
Abbildung 39: Zunehmende
Entladung des Proteins mit
Erhöhung des Abstandes
zwischen
Carboxylund
Aminogruppe
Die
Radioaktivität
des
beladenen Proteins ist mit 100%
angegeben. Der Abstand von
Carboxyl- und Aminogruppe
nimmt von Glycin bis 5Aminovaleriansäure (5-AVA)
jeweils
um
eine
Methylengruppe zu. GABA: γAminobutylsäure.
Während die Zugabe von Glycin und β-Alanin keine Reduzierung des gebundenen β-Alanins
bewirkt, wird die Beladung von Ebony bei Zugabe von GABA und 5-AVA um knapp 30%
verringert. Die Produktbildung ist allerdings noch deutlich geringer im Vergleich zu den 9095% die man für die untersuchten biogenen Amine erhält.
Alle untersuchten und akzeptierten biogenen Amine weisen Ringstrukturen am aliphatischen
Rest auf. Um deren Einfluss auf die Akzeptanz zur β-Alanylierung ebenfalls zu untersuchen,
wurden Ethylaminderivate des Imidazols (Histamin), des Benzols (Phenylethylamin), des
Pyridins (2-(2-Aminoethyl)-Pyridin) und des Indols (Tryptamin) im Test verwendet. Um den
Einfluss des Abstands zwischen Ring und Aminogruppe zu untersuchen, wurde zusätzlich
Anilin eingesetzt, bei dem die Aminogruppe direkt am Ring positioniert ist.
76
Ergebnisse
Abbildung 40: Einfluss der
Ringstruktur auf die Produktbildung
100%
rel. dpm
80%
60%
40%
20%
An
ilin
Tr
yp
ta
m
in
-A
m
in
oe
th
yl)
-P
yr
id
in
hy
la
m
in
2-
(2
Ph
en
yle
t
Hi
st
am
in
Be
la
de
n
0%
Wie man sieht, resultieren alle Ethylaminderivate in einer starken Abnahme des gebundenen
β-Alanins. Größe und Zusammensetzung des Ringes scheinen in diesem Rahmen keine
Auswirkung auf die katalysierte Kopplungsreaktion zu haben. Der Wert für Anilin zeigt keine
signifikante Abnahme an gebundener Aminosäure. Damit zeigt sich wieder, dass die Länge
der aliphatischen Komponente und damit der Abstand von Aminogruppe und Ringstruktur ein
limitierendes Kriterium zu sein scheint.
Um den Einfluss der aliphatischen Komponente genauer zu untersuchen, wurden Amine mit
einer Kohlenstoffkette von zwei (Ethylamin) bis zu fünf (Pentylamin) Kohlenstoffatomen
eingesetzt. Die resultierenden Aktivitätswerte sind in Abbildung 41 dargestellt.
Abbildung 41: Verknüpfung
von β-Alanin mit primären
Aminen
unterschiedlicher
Länge
100%
rel. dpm
80%
60%
40%
20%
0%
Beladen
Ethylamin
Propylamin
Butylamin
Pentylamin
77
Ergebnisse
Während Ethylamin eine Reduktion der präzipitierbaren Radioaktivität von ca. 20% bewirkt,
scheinen die längerkettigen Amine Propyl-, Butyl- und Pentylamin deutlich besser für die
Verknüpfung mit β-Alanin geeignet zu sein. Die für diese Substanzen gemessene
Restbeladung von Ebony mit radioaktivem β-Alanin ist deutlich verringert und erreicht mit
10% für Pentylamin einen mit den biogenen Aminen vergleichbaren Wert.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Ebony in einem zu NRPS analogen Mechanismus
β-Alanin adenyliert und als Thioester kovalent an die T-Domäne bindet. Der erste
Reaktionsschritt zeigt dabei eine hohe Spezifität für β-Alanin.
Im Gegensatz dazu ist der zweite Reaktionsschritt, die Verknüpfung des β-Alanins mit einem
Amin, deutlich weniger streng in der Auswahl von Reaktionspartnern. Ausschlaggebend für
die β-Alanylierung scheint die Beschaffenheit des aliphatischen Restes des Amins zu sein.
Alle Substanzen mit einem aliphatischen Rest in der Größe des Ethylamins werden
erfolgreich für die Produktbildung akzeptiert. Wie man an den Werten für Octopamin sehen
kann, stört eine Hydroxygruppe am Ethylamin-Rest die Reaktion nicht. Im Gegensatz dazu
haben Carboxylgruppen einen inhibierenden Einfluss. Dabei scheint die Inhibierung vom
Abstand zwischen Carboxyl- und Aminogruppe abhängig zu sein, da im Gegensatz zu Glycin
und β-Alanin, GABA und 5-AVA geringe Produktbildung zeigten. Im Vergleich mit den
akzeptierten Aminen zeigt sich jedoch, dass diese Produktbildung immer noch stark
eingeschränkt ist. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass eine vorhandene
Carboxylgruppe die Produktbildung deutlich inhibiert. Dies erscheint auch sinnvoll, da die
zellinternen Proteine und Aminosäuren vor einer unspezifischen β-Alanylierung geschützt
werden müssen. Ein weiteres Kriterium, das Einfluss auf die Verknüpfung von Aminen mit βAlanin hat, ist die Länge des aliphatischen Anteils. Mit zunehmender Kettenlänge erhöht sich
auch die Akzeptanz zur Konjugation mit β-Alanin. Dabei ist der Anstieg sprunghaft. Während
bei Verwendung von Ethylamin kaum Produkt gebildet wird, liegen die Werte für Propyl-,
Butyl- und Pentylamin im Bereich der biogenen Amine. Dieser sprunghafte Anstieg in der
Akzeptanz zur Konjugation zeigt sich auch im Vergleich von Anilin mit den
Ethylaminderivaten verschiedener Aromaten und Heterocyclen. Während Anilin nicht mit βAlanin verknüpft wird, zeigen Ringgröße und Zusammensetzung im untersuchten Rahmen
keinen Einfluss. Alle Ethylaminderivate werden akzeptiert und zeigen mit den biogenen
Aminen vergleichbare Werte. Somit scheint das Vorhandensein einer Ethylaminogruppe
gekoppelt mit einem ungeladenen Rest entscheidend für den letzten Reaktionsschritt zu sein.
78
Ergebnisse
Es ist bekannt, dass Peptidsynthetasen Phosphopantethein-Transferasen zur Überführung in
die aktive holo-Form benötigen. Auch für Ebony wurde gezeigt, dass die Reaktion von der
Beladung durch bakterielle PPT in vivo und in vitro abhängig ist. Dies bedeutet, dass auch in
Drosophila melanogaster ein zu PPT homologes Protein existieren muss, dass in vivo den
Transfer von Ppant auf die T-Domäne von Ebony katalysiert. Um dieses Protein und das
zugehörige Gen zu identifizieren, wurde die genomische Datenbank von Drosophila (Adams
et al., 2000) mit den Aminosäure-Sequenzen von Gsp und Sfp nach homologen Proteinen
durchsucht (WU-Blast 2.0; Gish, W., Persönliche Mitteilung).
3.7 Identifizierung und Klonierung einer putativen PPT aus Drosophila
melanogaster
Die Suche in der Datenbank lieferte die 1104 bp lange cDNA GH12334, die im Kopf der
adulten Fliege exprimiert wird. Das kodierte Protein GH12334-Tr ist zu 25% identisch mit
Gsp und zu 31% Identisch mit Sfp. Es besitzt die Konsensus-Motive I GXD und II
WXXKE(A/S)XXK der PPT (Lambalot et al., 1996) (siehe Abbildung 42).
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
M S K H I C T R W A
M I E M L F V K V P
~ M K I Y G I Y M D
F D L G S W R P T L
N E I D . . R H V F
R P L S . . Q E E N
P Q L S Q A V A S I
N F L S S N V S . .
E R F M T F I S . .
Q P E E R A R L M K
. K E K Q Q A F V R
. P E K R E K C R R
40
35
34
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
F H F I D D F L S S
Y V N V K D A Y R S
F Y H K E D A H R T
L I G R L F M R K Y
L L G E L L I R K Y
L L G D V L V R S V
V S T C S G L P S A
L I Q V L N I P N E
I S R Q Y Q L D K S
E V K F A R D V R G
N I L F R K N E Y G
D I R F S T Q E Y G
80
75
74
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
K P Y W V K G E D Y
K P F V D . . . . .
K P C I P D L . . .
D G P P L S F N V S
. . F D I H F N I S
. . P D A H F N I S
H Q G S L V L L A G
H S D E W V V C A I
H S G R W V I G A F
I A G E S S D P D F
S N . . . . H P . .
D S . . . . Q P . .
120
102
103
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
G I G T D V M K I E
. V G I D I E R I S
. I G I D I E K T K
Y N G G K P L S E F
E I D . . . . . . .
P I S . . . . . . .
F G L M K S K F S A
I K I A E Q F F H E
L E I A K R F F S K
E E W S Y I G R P H
N E Y I W L Q S K A
T E Y S D L L A K D
160
134
135
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
H D E R E Q V K A F
Q N S . . Q V S S F
K D E . . Q T D Y F
M R H W C L K E A Y
F E L W T I K E S Y
Y H L W S M K E S F
V K E L G V G I T V
I K A I G K G M Y I
I K Q E G K G L S L
D L Q K I S F S V D
P I N S F W I D K N
P L D S F S V R L H
200
172
173
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
T T R S L E T D V S
Q . . . . . . . . .
Q D . . . . . . . .
P L I G T S L R C H
. . T Q T V I Y K Q
. . G Q V S I E L P
D Q P M D N W H F E
N K K E P V T I Y E
D S H S P C Y I K T
E H L L Q E D Y C A
P E L F E G Y K C S
Y E V D P G Y K M A
240
201
203
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
A I A F R N C L P Q
C C S L F S S V T N
V C A A H P D F P .
E R G K F K F L Q V
. . L S I T K L Q V
. . E D I T M V S Y
E E L L V K S E D S
Q E L C N L F L D S
E E L L ~ ~ ~ ~ ~ ~
E L E E V I S Y C Q
T F S E N N N F ~ ~
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
280
237
224
GH12334-Tr
Gsp
Sfp
K A L L K P Y K R S
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
290
237
224
Abbildung 42: Sequenzvergleich der putativen Drosophila PPT mit Sfp aus Bacillus subtilis und Gsp aus
Bacillus brevis
Schwarz unterlegte Aminosäuren sind in allen drei Proteinen konserviert. Die konservierten Regionen der PPT
sind mit I und II gekennzeichnet.
79
Ergebnisse
Ein Vergleich von GH12334 mit der Proteindatenbank des Drosophila Genom-Projektes
(BDGP, Berkley, USA) zeigt, dass GH12334 mit dem Computer generierten CG32099 Gen
identisch ist. CG32099 liegt auf dem Chromosom 3 an der Position 68F6 im 2.Intron des
Neurexin Gens Nrx. Die genaue Lage des Gens ist in Abbildung 43 dargestellt.
Nrx A
Nrx B
CG32099
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
kB
Abbildung 43: Position des putativen PPT Gens CG32099
Die beiden Varianten von Nrx sind mit Nrx A und Nrx B gekennzeichnet.
Der Translations-Start des Exons liegt an Position 96. Das Stopp-Signal befindet sich 137bp
vor dem 3’-Ende der mRNA. Um die Funktion des Proteins zu untersuchen, wurde der
Leserahmen mit den Primern NcoI-5’-putDrPPT und BamHI-3’-putDrPPT aus genomischer
DNA amplifiziert und über NcoI und BamHI in den Expressionsvektor pQE60 einkloniert
(siehe Abbildung 44).
Xho I (2)
T5 Promotor/lac Operator Element
R I (89)
Nco I (114)
Eco R I (536)
Beta-Lactamase
putDrPPT
PutDrPPT-pQE60
4301 bp
Abbildung
44:
Expressionskonstrukt zur Aufreinigung der
putativen Drosophila PPT
Ausgewählte Schnittstellen sind
mit ihrer Position angegeben. Die
Leserahmen sind mit Orientierung
in schwarz eingezeichnet. Der
Promotor ist in grau angegeben.
Nco I (789)
BamHI (992)
His6-Tag
Das Expressionsplasmid wurde in C600-Bakterien transformiert. Proteinexpression und
Aufreinigung erfolgten nach dem optimierten Protokoll der bakteriellen Ebony Proteine.
Das Ergebnis der Aufreinigung zeigt Abbildung 45:
80
Ergebnisse
Abbildung 45: Coomassie gefärbtes
SDS-PAGE Gel der aufgereinigten
putativen Drosophila PPT :
Aufgetragen sind zunehmende Mengen
der Proteinlösung, um die Reinheit zu
beurteilen. Die Markergrößen (M) sind
neben dem Gel angegeben.
M 5µl 10µl20 µl
67 kDa
45 kDa
36 kDa
29 kDa
24 kDa
Das aufgereinigte Protein zeigt das aus dem Leserahmen abgeleitete Molekulargewicht von
knapp 35kDa. Verunreinigende Proteine sind auch bei der größten aufgetragenen Menge nicht
zu erkennen. Insgesamt wurden 6 mg Protein erhalten.
Um seine Funktion als PPT zu bestätigen, wurde getestet, ob das von GH12334 kodierte
Protein in der Lage ist, das apo-Ebony aus der Zellkultur in die holo-Form zu überführen.
Dazu müsste es in der Lage sein, in einem Standard-Beladungsansatz Sfp zu ersetzen.
Abbildung 46 zeigt das Ergebnis der Tests.
Abbildung
46:
Vergleich
zwischen
Sfp
und
der
putativen Drosophila PPT
Die Beladungsansätze mit Sfp
(schwarz) bzw. der putativen
Drosophila PPT (weiß) wurde
jeweils mit 100% relativer
Aktivität angegeben (siehe
Text). Als Kontrolle wurde kein
CoA, keine Transferase oder
kein ATP zugegeben.
100%
80%
rel. dpm
60%
40%
20%
0%
Beladen
-CoA
-PPT
-ATP
Da weder für die putative Drosophila PPT noch Sfp die Möglichkeit bestand, die Aktivität
quantitativ zu bestimmen, wurde die erhaltene Beladung mit Ppant für beide Proteine mit
jeweils 100% angegeben. Dies ermöglicht den qualitativen Vergleich der Relationen zu den
Kontrollen.
Beide Beladungsansätze weisen einen deutlich höheren Anteil an präzipitierbarer
Radioaktivität auf als die Kontrollen. Die Abnahme der Radioaktivität in den Ansätzen ohne
CoA, ohne PPT oder ohne ATP zeigt für beide Proteine die gleichen Relationen. Das
81
Ergebnisse
Drosophila Protein ist genau wie Sfp in der Lage, Ppant auf Ebony zu übertragen. Da es
damit die Produktbildung durch Ebony erst ermöglicht, wird es im Folgenden als Ebony
aktivierendes Protein (EAP) bezeichnet, wobei anzumerken ist, dass es sich dabei nicht
zwingend um die PPT handeln muss, die auch in vivo Ebony mit Ppant belädt (siehe
Diskussion).
3.8 Homologe Proteine zu Ebony und EAP in Anopheles gambiae
Mehrere Arbeiten deuten darauf hin, dass die Konjugation mit β-Alanin eine verbreitete
Reaktion bei Arthropoden ist. Im Nervensystem der Strandkrabbe Carcinus maenas wurde die
Synthese von β-Alanylhistamin (Carcinin) nachgewiesen (Arnould und Frentz, 1975;
Arnould, 1985; Arnould, 1987a; Arnould, 1987b). In Zellextrakten der Mittelmeerfruchtfliege
Ceratitis capitata wurde neben der Synthese von β-Alanyldopamin auch die Synthese von β-
Alanylnorepinephrin festgestellt. Beide Reaktionen könnten dabei von einem Enzym
katalysiert werden (Perez et al., 2002). In keiner der Arbeiten konnte jedoch bisher das
verantwortliche Enzym isoliert werden.
Es ist denkbar, dass Ebony homologe Proteine in verschiedenen Arten verschiedene Substrate
mit β-Alanin konjugieren. Dazu müssten die verantwortlichen Enzyme oder ihre Gene
charakterisiert werden. Da neben Drosophila melanogaster auch das Genom von Anopheles
gambiae vollständig sequenziert vorliegt, wurden mit den Aminosäure-Sequenzen von Ebony
und EAP homologe Proteine und die dazugehörigen Gene gesucht. Tatsächlich konnte sowohl
für Ebony als auch für EAP ein homologes Protein identifiziert werden. Das EbonyHomologe agCP14835 hat 58% Identität und wird von dem putativen computergenerierten
Gen agCG49920 kodiert. Das zu EAP Homologe agCP3252 hat 46% Identität und wird von
agCG57180 kodiert. Der Vergleich von Ebony und agCP14835 ist in Abbildung 47
dargestellt.
82
Ergebnisse
Ebony
agCP14835
MGS L P QL S I V
MGT L P QL A V V
K GL QQD F V P R
K GK L CP L QP T
A L H R I F E E . Q
L L H R T F E S N V
QL R H A D K V A L
D K F CGT D T A L
39
40
Ebony
agCP14835
I Y QP S T T GQG
I Y N D E . . . D G
MA P S QS S Y R Q
R GE V QI N Y H A
MN E R A N R A A R
L N S T A N R L A T
L L V A E T H GR F
A ML H R I K E QA
79
77
Ebony
agCP14835
L Q. P N S D GD F
R S QP N T D GD Y
I V A V C MQP S E
I V A V C MH P T D
GL V T T L L A I W
R L V T T L L A I W
K A GGA Y L P I D
K A GA A Y L P I D
118
117
Ebony
agCP14835
P S F P A N R I H H
P T F P P N R I QH
I L L E A K P T L V
I L GE A K P A L V
I R D D D I D. A G
V Y D A D Y DN A A
R F QGT P T L S T
I F GK T P A V S Y
157
157
Ebony
agCP14835
T E L Y A K S L QL
A E L R K R A S D L
A GS N L L S E E M
S N A N I R P E A M
L R GGN D H I A I
L GK GE A QL A L
V L Y T S GS T GV
V L Y T S GS T GV
197
197
Ebony
agCP14835
P K GV R L P H E S
P K GV R L N H E T
I L N R L QWQWA
I L N R L QWQWG
T F P Y T A NE A V
R F P Y S A T E R I
S V F K T A L T F V
GV F K T A L T F V
237
237
MC GL A I L V V P
L N GMA I V I V P
K A V T K D P QR L
K R I T N N P E K L
V A L L E R Y K I R
V D L L E R Y R I E
277
277
L QI WV C S GE P
L R I WV C S GE P
1
Ebony
agCP14835
2
3
D S I A E L WGP L
D S V S E I WGP L
4
Ebony
agCP14835
R L V L V P T L L R
R L V L S . . . . .
S L L MY L K ME G
. . . . . . . . . .
GGA A QK L L Y N
. . GS T K L L Y H
Ebony
agCP14835
L S V S L A S S F F
L QI S L A R E F F
D Y F D E GV H R L
D Y F QE GV H QL
Y N F Y GS T E V L
CN F Y GS T E V M
Ebony
agCP14835
K K QL S L Y D N V
R K QL E GY E K V
P I GI P L S N T V
P I GY P L D N T T
Ebony
agCP14835
A S GL N L A A GY
V A GL N L A E GY
Ebony
agCP14835
7
5 6
8
317
300
GD V T Y F A CE S
GD V T Y F V CE S
357
340
V Y L L D A DY R P
I Y I MS P D L R P
V K N GE I GE I F
V R T E E I GE L Y
397
380
V N GR D P E R F L
V N GR D P D R F I
E N P L A V E K K Y
D N P L A I DP S F
A R L Y R T GD Y G
GR L Y K T GD Y A
437
420
S L K N G S I MY E
S V S K GCV Y Y Q
GR T D S QV K I R
GR MD S QI K I R
GH R V D L S E V E
GH R V D L S E V E
K N V A E L P L V D
A N L L GL A GV D
477
460
Ebony
agCP14835
K A I V L CY H A G
K GI V L CY R A G
QV D QA I L A F V
E I D QA L L GF V
K L R D D A P MV T
T L E QGA P F QT
E MQME A R L K D
GL QV E A A L GD
517
500
Ebony
agCP14835
K L A D Y MT P Q V
K L A H Y MI P Q V
V I L E H V P L L V
V L L E S I P L L V
N GK V D R QA L L
N GK I D R QT L L
K T Y E T A N N N E
K MY E S T N N N D
557
540
Ebony
agCP14835
GD S S I V L D F D
. D T QI E I E Y D
Y S QV P E D L K L
Y S D V P A GR L T
T A R D L F E T V G
V A K D L F E T V G
GV I GR S T R A T
QV I GR S T R A K
597
579
Ebony
agCP14835
L A P H S N F Y E L
I CL A S N F Y E L
GGN S L N S I F T
GGN S L N S I I T
V T L L R E K GY N
V T QL CGK GY P
I GI S E F I A A K
I S I T T F I GA K
637
619
Ebony
agCP14835
N L GE I I E K MA
N L GE I L D K I C
A N . . . H D A V Q
A D E R E L A K H Q
L E E E S L N A CP
L E S A N GN A E E
. . . . . H L K ME
GE F D Y R MQL T
669
659
Ebony
agCP14835
A V P L R L E H R Q
A Y P L A L E H K S
E V I D I I V A S F
D T I N I I T S S F
Y N K A D L E QWL
F E K A D L E QWL
K P GV L R T D Y S
K P QI H E T D Y R
709
699
Ebony
agCP14835
D I L N D I WN V L
D I L E D I WT V L
V E R D L S F V V Y
I E K GL S F I V K
D T N T D R I I GT
D . E T GR P V GV
A L N F D A R N E P
S L N F D A H D E P
749
738
Ebony
agCP14835
E V D I K S K L L I
E V T V T S K L I I
V F E F L E F CE G
V F E F L E F V E G
P I R D N Y L P K G
P I R D S QL P T G
L N QI L H S F MM
K N QI L H S F MM
789
778
Ebony
agCP14835
GT A E K L N P R E
GT CA E L S A QE
N I A C MH F ME H
N I E A MH F ME S
E V L R V A R E K Q
E V L K L A R R R N
F A GI F T T N T S
F A GI F T T N T N
829
818
Ebony
agCP14835
P L T QQL A D . V
P L T QQL GS N V
Y H Y K T L L N F Q
Y R Y QT ML D Y Q
V N E Y V H S . D G
V N QF V Y S A D G
S R P F GD A P D E
T R P F A A A P D S
867
858
Ebony
agCP14835
QR A I V H WK E V
QR A V V H WK D I
G K ~879
R C A 871
Abbildung 47: Vergleich von Ebony und dem Anopheles gambiae Homologen agCP14835
Die möglicherweise an der Substratspezifität beteiligten acht Aminosäuren der A-Domäne (Stachelhaus et al.,
1999; Challis et al., 2000) sind nummeriert. Identische Aminosäuren sind schwarz unterlegt.
83
Ergebnisse
AgCP14835 besitzt genau wie Ebony die konservierten Domänen der A- und T-Domäne
(siehe Tabelle 3 ).
Motiv
NRPS
agCP14835
Ebony
A1
L(TS)YxEL
-FEHLT-
LLVAET
A2
LKAGxAY(VL)P(LI)D
WKAGAAYLPID
WKAGGAYLPID
A3
LAYxxYTSG(ST)TGxPKG
LALVLYTSGSTGVPKG
IAIVLYTSGSTGVPKG
A4
FDxS
FVDS
FVDS
A5
NxYGPTE
NFYGSTE
NFYGSTE
A6
GELxIxGxG(VL)ARGYL
GELYVAGLNLAEGYV
GEIFASGLNLAAGYV
A7
Y(RK)TGDL
YKTGDY
YRTGDY
A8
GRxDxQVKIRGxRIELGEIE GRMDSQIKIRGHRVDLSEVE GRTDSQVKIRGHRVDLSEVE
A9
LPxYM(IV)P
LAHYMIP
LADYMTP
A10
NGK(VL)DR
NGKIDR
NGKVDR
T
DxFFxLGG(HD)S(LI)
SNFYELGGNSL
SNFYELGGNSL
Tabelle 3: Vergleich der konservierten Regionen der A- und T-Domänen von Ebony und agCP14835 mit
den Konsensus-Sequenzen der NRPS
Wie man sieht, sind bis auf die Region A1 alle Konsensus-Sequenzen auch in agCP14835
konserviert. Auch die in Abbildung 47 mit Nummern gekennzeichneten, möglicherweise an
der Substratspezifität beteiligten acht Aminosäuren, sind alle bis auf eine identisch. β-Alanin
könnte somit durch das Aminosäure Muster V D (A/S) V V S F G kodiert werden
(Stachelhaus et al., 1999; Challis et al., 2000).
Mit 871 Aminosäuren ist das Protein fast genauso groß wie Ebony und auch das Computer
generierte Gen agCG49920 zeigt Ähnlichkeit mit ebony. Tabelle 4 vergleicht den Aufbau von
ebony und agCG49920.
84
Ergebnisse
Exon
Länge (bp)
Intron
ebony
agCG49920
1
283
665
2
1123
3
Länge (bp)
Ebony
agCG 49920
1
3855
11771
198
2
67
3388
167
467
3
88
838
4
771
244
4
67
79
5
90
774
5
62
70
6
175
399
6
57
69
7
529
263
7
82
333
8
Tabelle 4: Vergleich der Intron-Exon Struktur von ebony und agCG49920
AgCG49920 hat ein Exon mehr als ebony. Bei beiden Genen liegt der Translations-Start im
2.Exon. Somit wird auch von agCG49920 das erste Exon nicht translatiert. Der untranslatierte
Bereich am 5’-Ende der mRNA ist mit 704bp deutlich länger als beim Transkript von ebony,
wo er nur 299 bp beträgt. Für den 3’-untranslatierten Bereich von agCG49920 gibt es keine
Daten, so dass ein Vergleich nicht möglich ist.
Das zweite gefundene Protein ist das zu EAP homologe agCP3252, das von agCG57180
kodiert wird. Der Vergleich des zu EAP homologen agCP3252 auf Proteinebene ist in
Abbildung 48 dargestellt.
EAP
agCP3252
~~MS K H I C T R
MS L R N GGH V R
WA F D L GS WR P
WA F D L A GWR P
T L P QL S QA V A
S L A DL L L A T S
S I QP E E R A R L
CI QP E E K L T L
38
40
EAP
agCP3252
MK F H F I D D F L
QR F V F R D D F N
S S L I GR L F MR
A S L I GR L MMR
K Y V S T CS GL P
R F V QL A T D L A
S A E V K F A R DV
Y DE I K F E R DS
78
80
EAP
agCP3252
R GK P Y WV K GE
K GK P F L K N . .
D Y D GP P L S F N
. . E GV A V D F N
V S H QGS L V L L
V S H QGR Y A V L
A GI A GE . . . .
A GMA T K R L E A
114
116
EAP
agCP3252
. . S S D P D F GI
T T T T S P T P K I
GT D V MK I E Y N
GV D V MK I E Y G
GGK P L S E F F G
GGK P L D E F F R
L MK S K F S A E E
L MT R N F S D D E
152
156
EAP
agCP3252
WS Y I GR P H H D
WR Y I . R GR D D
E R E QV K A F MR
A S A QL E A F MR
H WC L K E A Y V K
N WC L K E S Y V K
E L GV GI T V D L
N V GV GI T V D L
192
195
EAP
agCP3252
QK I S F S V D T T
R K I S F R I QT .
R S L E T DV S P L
. E V L AR DR V V
I GT S L R CH D Q
CD T T L R V N S E
P MD N WH F E E H
P MGN WR F E E S
232
233
EAP
agCP3252
L L QE D Y CA A I
L I D R D H CV A V
A F R N CL P QE R
S L E N V P A E QD
GK F K F L QV E E
L S GN CF E V I D
L L V K S E DS E .
F R T L V E HHR P
271
273
EAP
agCP3252
. L E E V I S Y CQ
L L A I D E N Y CE
K AL L K P Y K R S
GI I S K E Y K K S
~290
K 294
Abbildung 48: Sequenzvergleich zwischen EAP und agCP3252 aus Anopheles gambiae
Schwarz unterlegte Aminosäuren sind in beiden Proteinen identisch. Die konservierten Regionen der PPT sind
mit I und II gekennzeichnet.
85
Ergebnisse
Genau wie bei EAP sind auch in agCP3252 die Aminosäure-Motive GXD (I) und
WXXKE(A/S)XXK, die für PPT charakteristisch sind, konserviert. Das zugehörige Gen
agCG57180 ist 1106bp lang und damit nur 2bp länger, als das EAP Gen. Die ersten 60bp der
mRNA werden nicht translatiert. Die 3’-untranslatierte Region ist 162bp lang.
Der Homologievergleich deutet darauf hin, dass in Anopheles gambiae ein vergleichbares
System existiert. Die hohe Homologie lässt vermuten, dass die von agCP14835 und
agCP3252 katalysierten Reaktionen mit denen von Ebony und EAP identisch sind. Vor allem
die identische Sequenz der acht möglicherweise für die Spezifität verantwortlichen
Aminosäuren lässt vermuten, dass agCP14835 ebenfalls die β-Alanylierung von biogenen
Aminen katalysiert.
86
Diskussion
4. Diskussion
4.1 Ebony wird in Gliazellen der optischen Loben exprimiert
Der visuelle Phänotyp der ebony Mutante wurde lange diskutiert. Da es als gesichert
anzusehen ist, dass Histamin als Neurotransmitter in der visuellen Signaltransduktion von
Drosophila fungiert (Hardie, 1987; Stuart, 1999), blieb lange die Frage offen, wie eine
putative β-Alanyldopamin Synthetase Einfluss auf diesen Signalweg haben kann. Hinzu
kommt, dass Dopamin in der Lamina nicht nachgewiesen werden konnte. (Nässel et al.,
1988a) Es blieb unklar, ob Ebony direkt an der visuellen Signaltransduktion beteiligt ist oder
aber der visuelle Defekt durch einen Nebeneffekt, z.B. erhöhte Dopamin-Konzentrationen
hervorgerufen wird. Erste Hinweise auf eine direkte Beteiligung des Ebony Proteins an der
visuellen Signaltransduktion lieferte der Nachweis eines β-Galaktosidase Fusionskonstruktes
in den optischen Loben von Drosophila melanogaster (Hovemann et al., 1998). Zur direkten
Bestimmung der Ebony exprimierenden Zellen in den optischen Loben wurde hier ein
Antiserum aus Kaninchen gegen den carboxyterminalen Teil der Ebony Sequenz eingesetzt.
Der Vergleich der wildtypischen Färbung mit der Färbung der Null-Mutante eAFA verdeutlicht
die hohe Spezifität des Antiserums, da in Kopfschnitten der Mutante keine Zellen angefärbt
wurden. Somit konnte das Antiserum auch verwendet werden, um die Expression des Ebony
Proteins in anderen Entwicklungsstadien zu untersuchen.
Durch Konfokalmikroskopie und Doppelfärbungsexperimente konnte gezeigt werden, dass
ebony in den epithelialen Gliazellen der Lamina und den Neuropil Gliazellen der Medulla
exprimiert wird. Die Morphologie und Lage der Ebony positiven Zellen im Lobula-Komplex
lässt ebenfalls auf Neuropil Gliazellen schließen. Die Tatsache, dass Ebony in Gliazellen der
optischen Loben exprimiert wird und der visuelle Phänotyp der Mutante lassen sich schlecht
mit einer putativen β-Alanyldopamin Synthetase Funktion des Proteins vereinbaren. Daher
erschien es notwendig, die Substratspezifität und den Reaktionsmechanismus von Ebony
genauer zu untersuchen, um zu klären, ob eventuell auch Histamin für die Verknüpfung mit
β-Alanin akzeptiert wird.
87
Diskussion
4.2 Ebony verwendet einen zu NRPS analogen Mechanismus, um biogene
Amine mit β-Alanin zu verknüpfen
Um die Substratspezifität und den Reaktionsmechanismus von Ebony zu untersuchen, wurde
das Protein aus Bakterien und S2-Zellen aufgereinigt. Beide Expressionssysteme lieferten
genug aktives Protein, um es in vitro zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass sich die hohe
Homologie von Ebony zu NRPS (Hovemann et al., 1998) in einem analogen
Reaktionsmechanismus widerspiegelt. Ebony ähnelt in seinem Aufbau einem Startmodul der
NRPS. Diese besitzen A- und T-Domäne, jedoch keine Kondensationsdomänen. Es konnte
gezeigt werden, dass Ebony β-Alanin in Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen und ATP
spezifisch adenyliert. Dabei ist diese Reaktion losgelöst von der Funktionalität der TDomäne. Sowohl die Ser611-Ala-Mutante als auch das apo-Protein aus der Zellkultur zeigen
die Adenylierungsreaktion. Die hohe Spezifität von Ebony ist im Vergleich zu den NRPS
ungewöhnlich. Die Module der NRPS adenylieren in der Regel substratähnliche Substanzen
mit geringerer Aktivität (de Ferra et al., 1997; Doekel und Marahiel, 2000). Ähnliches konnte
für Ebony nicht gefunden werden, obwohl verschiedene substratähnliche Substanzen getestet
wurden.
In Analogie zu den NRPS wird auch bei Ebony das Adenylat auf den Co-Faktor Ppant, der an
das konservierte Serin der T-Domäne gebunden ist, übertragen und dort kovalent gebunden.
Die Notwendigkeit der Beladung mit Ppant konnte sowohl mit dem apo-Protein aus der
Zellkultur, als auch mit der Ser-611-Ala-Mutante gezeigt werden. Das apo-Protein ist trotz
stattfindender Adenylierungsreaktion nicht in der Lage, β-Alanin kovalent zu binden. Erst die
in vitro Beladung mit Ppant durch die PPT Sfp ermöglichte die Bindung von radioaktiver
Aminosäure. Die Akzeptanz von Ebony durch Sfp (und in vivo durch Gsp) bestätigt, dass sich
die hohe Homologie zu den NRPS in der Primärsequenz auch eine homologe
Sekundärstruktur bedingt. Genau wie das apo-Protein zeigt auch die Ser611-Ala-Mutante keine
Beladung mit β-Alanin, obwohl die Adenylierungsreaktion stattfindet. Dies verdeutlicht die
Notwendigkeit des konservierten Serins für die Funktionalität der T-Domäne und bekräftigt
die Ergebnisse von in vivo Experimenten (Kemme, 2001). Dort zeigten Konstrukte mit
mutiertem Serin im Gegensatz zu wildtypischen Konstrukten keine Rettung des ebony
Cuticula-Phänotyps. Somit kann das Ser611 in transgenen Tieren eindeutig als notwendig für
die Funktion des Ebony Proteins angesehen werden. Angesichts der Position des Serins in
einer Aminosäuresequenz, die hohe Homologie zu der Thiolierungsdomäne von NRPS zeigt,
88
Diskussion
ist es damit auch wahrscheinlich, dass es für die Beladung von Ebony mit dem Co-Faktor
Ppant notwendig ist.
Die Konjugation der in der T-Domäne gebundenen Aminosäure mit einem Substrat, wird bei
den NRPS durch die K-Domänen katalysiert. Die Te-Domäne des letzten Moduls bewirkt die
Abspaltung des Peptids. Ebony besitzt weder eine zu C- noch zu Te-Domänen homologe
Region. Der sich an die T-Domäne anschließende carboxyterminale Rest von knapp 200
Aminosäuren zeigt keinerlei Homologie zu NRPS. Es wurde vermutet, dass er die
Konjugation von β-Alanin mit Dopamin und die Freisetzung des Produktes katalysiert
(Hovemann et al., 1998). In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal direkt gezeigt werden, dass
Ebony die Bildung von β-Alanyldopamin katalysiert. Es stellte sich zudem heraus, dass dieser
Reaktionsschritt weniger spezifisch ist, als die Aktivierung des β-Alanins. Nicht nur Dopamin
wurde als Akzeptor des β-Alanins identifiziert, sondern unter anderem auch die physiologisch
relevanten Amine Histamin, Octopamin, Serotonin und Tyramin. Strukturelle Bedeutung für
die Auswahl als Reaktionspartner scheint dabei das Vorhandensein eines Ethylamin- bzw.
Hydroxyethylamin-Restes zu sein. Carboxylgruppen wirken sich negativ auf die
Produktbildung aus. Der negative Einfluss scheint jedoch mit zunehmendem Abstand zur
Aminogruppe leicht abzunehmen.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Ebony tatsächlich einen zu NRPS analogen Mechanismus
verwendet, um β-Alanin zu aktivieren. Bei NRPS werden jeweils zwei aktivierte
Aminosäuren, die in den T-Domänen benachbarter Module gebunden sind, über die
dazwischen liegende K-Domäne miteinander verknüpft. Es wird angenommen, dass dabei ein
konserviertes Histidin die Aminogruppe der einen Aminosäure deprotoniert, um so den
nukleophilen Angriff und die Bildung der Peptidbindung zu ermöglichen (Stachelhaus et al.,
1998). Dem Ebony Protein fehlt eine zur K-Domäne homologe Region, so dass nur vermutet
werden kann, dass der Rest, der keine Homologien zu NRPS zeigt, für die Bereitstellung des
Amins und die Bildung der Peptidbindung verantwortlich ist. Zur Bestätigung ist eine
genauere Untersuchung der Struktur des Ebony Proteins nötig, um eventuell an der Reaktion
beteiligte Aminosäuren zu identifizieren. Eventuell könnte auch die Fusion des
carboxyterminalen Restes mit einem Modul aus NRPS Aufschluss über die Funktion geben.
Wenn die Homologie zwischen Ebony und NRPS ausreichend hoch ist, sollten dann auch
andere Aminosäuren mit den von Ebony akzeptierten Aminen verknüpft werden.
Dass Ebony einen zu NRPS analogen Mechanismus verwendet, um β-Alanin für die
Verknüpfung mit einem Amin zu aktivieren, wird durch das Auffinden einer aktiven PPT aus
89
Diskussion
Drosophila melanogaster im Rahmen dieser Arbeit bekräftigt. Durch Homologievergleich
von Sfp und Gsp mit Sequenzen aus dem Drosophila Genom Projekt konnte EAP identifiziert
werden, das in vitro apo-Ebony aus der Zellkultur mit Ppant belädt. Der Vergleich der
Messwerte für EAP und Sfp zeigt, dass EAP ebenfalls in Abhängigkeit von CoA Ebony mit
Ppant belädt. Obwohl EAP auch im Kopf der Fliege vorkommen muss, da der identifizierte
cDNA Klon aus Kopf-RNA hergestellt wurde, bleibt zu klären, ob es sich bei EAP tatsächlich
um die spezifische PPT von Ebony handelt. Untersuchungen von Sfp und Gsp mit
spezifischeren PPT führten zu der Vermutung, dass die Länge der Sequenz zwischen der αHelix 5 und dem β-Faltblatt 7 der PPT für die Spezifität verantwortlich ist. Je kürzer diese
Sequenz ist, umso spezifischer erkennt die entsprechende PPT ihr Substrat (Reuter et al.,
1999). Interessanterweise ist die zu diesem Bereich homologe Sequenz von EAP, die etwa 10
Aminosäuren vor dem PPT-Motiv II beginnt und bei Sfp und Gsp ca. 65 Aminosäuren lang
ist, in EAP noch mal 10 Aminosäuren länger. Das könnte bedeuten, dass auch EAP eine
geringe Substratspezifität aufweist und somit nicht zwingend spezifisch für Ebony ist. Es
bleibt die Frage offen, ob es sich um die PPT handelt, die in vivo Ebony mit Ppant belädt.
Eine Mutagenese von EAP sollte, wenn es sich um das richtige Protein handelt, einen ebony
Phänotyp hervorrufen, sofern diese Mutation nicht letal ist. Die Lage im Neurexin Gen Nrx
erschwert ebenfalls eine Mutagenese, da eine Beeinträchtigung von Nrx Letalität zur Folge
hat. Eine weitere Möglichkeit wäre der Versuch, die Translation durch RNA-Inhibierung zu
stören. Dabei wäre die Verwendung eines Ebony Enhancers zur Expression der EAP antisense RNA sinnvoll und sollte in einem Ebony Phänotyp resultieren, wenn EAP tatsächlich
die PPT ist, die Ebony mit Ppant belädt. Um zumindest eine Co-Expression von Ebony und
EAP nachzuweisen, könnte auch ein Antikörper gegen EAP für Doppelfärbungsexperimente
mit dem Ebony Antiserum generiert werden.
Die Identifizierung von EAP komplettiert die funktionelle in vitro Untersuchung des Ebony
Proteins. Zum ersten Mal konnte ein zu NRPS homologer Mechanismus für höhere
Eukaryonten nachgewiesen werden. Gleichzeitig wurde der direkte biochemische Beweis
geführt, dass Ebony in vitro nicht nur β-Alanyldopamin, sondern β-Alanylkonjugate aller in
Drosophila relevanten biogenen Amine synthetisieren kann. Dies ermöglicht völlig neue
Erklärungsansätze für das breite Spektrum an Defekten, die die ebony Mutante aufweist.
Dabei ist zu beachten, dass bisher in vivo nur β-Alanyldopamin (Wright, 1987) und βAlanylhistamin (Borycz et al., 2002) nachgewiesen wurden.
90
Diskussion
4.3 Die Funktion von Ebony beim Aufbau der Cuticula
β-Alanyldopamin gilt als einer der Hauptbausteine der Cuticula und wird zur Sklerotisierung
verwendet (Hopkins et al., 1982; Sugumaran, 1988). Es wurde schon lange vermutet, dass
Ebony die Synthese von β-Alanyldopamin katalysiert und somit die Sklerotisierung
gegenüber der Melanisierung durch Dopamin begünstigt (Wright, 1987), da β-Alanyldopamin
in Null-Mutanten nicht nachweisbar ist, während die Konzentrationen an β-Alanin und
Dopamin erhöht vorliegen. Diese Vermutung wurde kürzlich durch den Nachweis des Ebony
Proteins in den Epidermalzellen der adulten Fliege unterstützt (Wittkopp et al., 2002). Diese
Zellen sekretieren die Bausteine der Cuticula ungefähr 48 Stunden nach der Verpuppung
(Bodenstein, 1950; Mitchell und Petersen, 1983). Zusammen mit dem Ergebnis dieser Arbeit,
dass Ebony tatsächlich in vitro β-Alanyldopamin aus β-Alanin und Dopamin synthetisiert, ist
es als gesichert anzusehen, dass Ebony auch in vivo diese Funktion ausübt. Die deutlich
stärkere Pigmentierung der Cuticula der Null-Mutante dürfte somit durch einen Überschuss
an Dopamin hervorgerufen werden. Im Gegensatz zu β-Alanyldopamin lagert sich Dopamin
nach der Oxidation zum Indol um, welches nach erneuter Oxidation zum Pigment Melanin
polymerisiert (Sugumaran, 1988). Durch die Konjugation mit β-Alanin wird dieser Prozess
verlangsamt und die Quervernetzung mit Strukturproteinen oder Chitin bevorzugt, was zur
Sklerotisierung führt (Aso et al., 1984; Sugumaran, 1988). Dieser Reaktionsweg ist in der
ebony Mutante gestört, was zur stärkeren Melanisierung durch überschüssiges Dopamin führt.
Dass die Mutante trotzdem eine sklerotisierte Cuticula besitzt, liegt an den zusätzlichen
Stoffwechselwegen, die ebenfalls Bausteine für die Sklerotisierung liefern. So konnte für
Drosophila die Präsenz einer Dopamin N-Acetyltransferase gezeigt werden (Maranda und
Hodgetts, 1977). Das Produkt N-Acetyldopamin dient ebenfalls als Vorstufe zur
Sklerotisierung (Wright, 1987). Somit ist trotz der ebony Mutation das Aushärten der Cuticula
gesichert. Interessant ist, dass Ebony in allen Epidermalzellen gefunden wurde. Dies führte zu
der Vermutung, dass in Bereichen stärkerer Pigmentierung der Ebony Antagonist Tan coexprimiert werden muss, um durch Umkehrung der von Ebony katalysierten Reaktion das
Gleichgewicht von der Sklerotisierung in Richtung Melanisierung zu verschieben (Wittkopp
et al., 2002).
91
Diskussion
4.4 Die Funktion von Ebony in den optischen Loben
In der vorliegenden Arbeit konnte Ebony mit Hilfe eines Antiserums (Ryseck, 1987) nicht nur
direkt in den optischen Loben nachgewiesen, sondern auch die ebony exprimierenden Zellen
durch Doppelfärbungsexperimente und Konfokalmikroskopie als Gliazellen identifiziert
werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das Ebony Protein in vitro in der Lage ist,
β-Alanin und Histamin zu β-Alanylhistamin zu verknüpfen. Hinweise, dass diese Reaktion
auch in vivo von Ebony katalysiert werden könnte, liefert die Arbeit von Borycz, in der die
Synthese von β-Alanylhistamin im Kopf von wildtypischen Drosophila nachgewiesen wurde.
Außerdem zeigte sich, dass in der ebony Mutante und erstaunlicherweise auch in der tan
Mutante der Histamingehalt reduziert ist (Borycz et al., 2002). Es ist daher anzunehmen, dass
Ebony neben dem Cuticula Aufbau auch am Histamin Metabolismus im Auge der Fliege
beteiligt ist.
Die de novo Synthese von Histamin verläuft in den Photorezeptorzellen äußerst langsam
(Morgan et al., 1999), so dass eine effiziente Signaltransduktion von einer effektiven
Rückgewinnung des Neurotransmitters abhängig ist. Dass ein solcher Aufnahmeprozess von
Histamin in die Photorezeptorzellen existiert, konnte bereits gezeigt werden (Stuart et al.,
1996; Melzig et al., 1998). Interessanterweise konnte für den Rankenfußkrebs Balanus
nubilus gezeigt werden, dass sich radioaktiv markiertes Histamin bei Lichteinstrahlung im
Photorezeptor, bei Dunkelheit jedoch in den benachbarten Gliazellen konzentriert (Stuart et
al., 1996). Im gleichen Experiment konnten keine metabolischen Produkte des radioaktiven
Histamins nachgewiesen werden. Die verwendete Dünnschichtchromatographie lässt aber bei
dem gewählten Laufmittel keine Trennung von β-Alanylhistamin und Histamin zu (Arnould
und Frentz, 1975). Somit war es in diesem Experiment nicht möglich, zwischen Histamin und
β-Alanylhistamin zu unterscheiden. Vieles deutet darauf hin, dass auch bei Drosophila die
umliegenden Gliazellen aktiv am schnellen Entfernen des Neurotransmitters aus dem
synaptischen Spalt beteiligt sind. Die epithelialen Gliazellen, die mit ihren Zellkörpern die
Cartridges der Lamina umgeben, haben stark gefaltete Membranen, die eine erhebliche
Oberflächenvergrößerung bewirken (Saint Marie und Carlson, 1983; Meinertzhagen und
O'Neil, 1991). Somit sind diese Zellen nicht nur optimal positioniert, sondern besitzen auch
gute strukturellen Möglichkeiten, Neurotransmitter effektiv aufzunehmen. Die MedullaNeuropil Gliazellen besitzen lange Fortsätze, die ähnlich wie bei den Astrozyten der
Vertebraten, ins Neuropil hineinziehen. Von den Astrozyten ist bekannt, dass sie an der
92
Diskussion
Aufnahme und dem Recycling von Neurotransmitter beteiligt sind (Deitmer, 2001) und es ist
wahrscheinlich, dass dies auch für die Medulla-Neuropil Gliazellen gilt.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Ebony sowohl in den epithelialen Gliazellen als
auch den Medulla-Neuropil Gliazellen exprimiert wird. Somit wird aufgenommenes Histamin
höchstwahrscheinlich zu β-Alanylhistamin umgewandelt und in dieser Form in den Gliazellen
gespeichert. Dazu muss β-Alanin in ausreichender Menge in den Gliazellen zur Verfügung
gestellt werden. Dies könnte durch das vom black Locus kodierte Protein geschehen, das
Homologien zu Glutamat-Decarboxylasen zeigt und Aspartat zu β-Alanin decarboxyliert.
Seine Expression konnte in den Gliazellen der Lamina gezeigt werden (Phillips et al., 1993;
Phillips et al., 2001). Die β-Alanylierung könnte mehreren Zwecken dienen. Von Astrozyten
ist bekannt, dass sie den Neurotransmitter Glutamat zu Glutamin umwandeln, bevor sie ihn in
die Neurone zurück transportieren (Deitmer, 2001). β-Alanylhistamin hat eine deutlich
geringere physiologische Aktivität als Histamin (Arnould und Frentz, 1977), so dass es sich
um eine inaktive Transportform des Neurotransmitters handeln könnte. Auch eine
Schutzfunktion ist denkbar, die den Abbau des Histamins über z.B. N-Acetylhistamin oder γGlutamylhistamin (Elias und Evans, 1983; Battelle und Hart, 2002) verhindert. Tatsächlich
wird in der black Mutante, die kein β-Alanin herstellen kann, verstärkt eine Substanz gebildet,
bei der es sich vermutlich um γ-Glutamylhistamin handelt und aus der kein oder nur sehr
langsam Histamin zurückgewonnen wird (Borycz et al., 2002). Da für β-Alanylhistamin eine
schnelle Hydrolyse nachgewiesen werden konnte, ist anzunehmen, dass es eine Speicherform
des Histamins darstellt, die eine schnelle Rückgewinnung des Histamins ermöglicht. Die
Hydrolyse wird vermutlich durch das vom Gen tan kodierte Protein katalysiert, das nicht nur
in der Cuticula (Wright, 1987), sondern auch im visuellen System (Borycz et al., 2002) ein
Antagonist von Ebony zu sein scheint. Bisher konnten die Tan exprimierenden Zellen in den
optischen Loben nicht genau bestimmt werden. Mosaik-Analysen lassen aber auf eine
Aktivität in den optischen Loben schließen (Hotta und Benzer, 1970), zumal tan Mutanten
auch einen visuellen Defekt aufweisen (Hotta und Benzer, 1969). Dass Tan die Hydrolyse
von β-Alanylhistamin katalysiert, würde auch den geringen Histamingehalt im Kopf der
Mutante erklären, da Histamin nicht aus β-Alanylhistamin zurückgewonnen werden kann.
Dies steht auch in gutem Einklang zu der im Vergleich mit Wildtyp Fliegen deutlich höheren
β-Alanylhistamin-Konzentration, die in tan Fliegen gemessen wurde (Borycz et al., 2002).
Der Histamingehalt in ebony Mutanten ist nicht so stark reduziert wie in den tan Fliegen,
beträgt jedoch ebenfalls weniger als 50% des wildtypischen Wertes. Dies könnte daran liegen,
93
Diskussion
dass das Histamin ohne β-Alanylierung entweder zu anderen Substanzen metabolisiert wird
oder aber aus dem Kopf diffundiert, da es nur als β-Alanylhistamin effektiv gespeichert
werden kann. Die Beobachtung, dass in ebony Mutanten Histamin stärker im synaptischen
Spalt konzentriert ist (I. Meinertzhagen, Dalhousie Universität, Kanada), weist ebenfalls auf
eine gestörte Aufnahme oder Speicherung des Histamins hin.
Wie könnte die Regeneration von Histamin durch Ebony und Tan in den optischen Loben
erfolgen? Eine Möglichkeit wäre, dass Tan ebenfalls in den Gliazellen lokalisiert ist, was
bedeuten würde, dass beide Proteine in Abhängigkeit von der neuronalen Aktivität reguliert
werden müssten. Bei Dunkelheit sollte Ebony die β-Alanylierung katalysieren, um Histamin
in den Gliazellen zu halten, bei neuronaler Aktivität müsste dann Histamin durch Tan aus βAlanylhistamin freigesetzt und zu den Neuronen transportiert werden. Dies würde eine
reziproke Regulierung von Ebony und Tan in Abhängigkeit der neuronalen Aktivität
erfordern. Denkbar ist auch, dass Tan im Gegensatz zu Ebony in den Photorezeptorzellen
exprimiert wird. Dann sollte das β-Alanylhistamin bei neuronaler Aktivität von den
Gliazellen zu den Neuronen transportiert werden, wo es dann von Tan zur Regeneration des
Histamins verwendet wird. Dieses Modell ist vergleichbar mit der Regeneration von Glutamat
bei den Vertebraten. Neuronal ausgeschüttetes Glutamat kann dort in den Astrozyten zu
Glutamin umgewandelt und nach Transport in die Neurone regeneriert werden. Dieser
Transport ist mit der neuronalen Aktivität verknüpft, d.h. der Rücktransport des Glutamins
findet nur statt, wenn das Neuron aktiv ist (Deitmer, 2001). Um zu bestimmen, welche
Mechanismen in Drosophila tatsächlich angewandt werden ist es notwendig, die zellulare
Position des Antagonisten Tan zu bestimmen und die beteiligten Transporter samt ihrer
Kontrollmechanismen aufzudecken.
4.5 Mögliche weitere Funktionen von Ebony
Neben Dopamin und Histamin konnten in der vorliegenden Arbeit weitere biogene Amine als
in vitro Substrate von Ebony identifiziert werden. Es bleibt zu klären, welche Reaktionen
tatsächlich in vivo katalysiert stattfinden, da es bisher keine Daten über β-Alanylderivate von
Octopamin,
Serotonin
oder
Tyramin
gibt.
Die
in
dieser
Arbeit
durchgeführte
Expressionsstudie zeigt, dass Ebony in allen Entwicklungsstadien von Drosophila exprimiert
wird. Dies ist äußerst interessant, da in einer Studie zum Catecholamin-Metabolismus weder
in Embryonen, noch in Larven des dritten Stadiums β-Alanyldopamin nachgewiesen werden
94
Diskussion
konnte (Wright, 1987). Es ist denkbar, dass die gebildete Menge an β-Alanyldopamin unter
der Nachweisgrenze der angewandten Messmethode gelegen hat, da vor allem in den
Embryonen nur sehr wenige Zellen Ebony zu exprimieren scheinen. Im Larvengehirn könnte
die kreisförmige Anordnung der Ebony exprimierenden Zellen in den Hemisphären und die
bilaterale Verteilung im Ventralganglion aber auch auf eine Verbindung zu den serotonergen
Interneuronen hindeuten. Diese sind in einem vergleichbaren Muster angeordnet und die
Positionen ändern sich im Verlauf der drei Larvenstadien nicht (Monastirioti, 1999), was auch
für die Ebony exprimierenden Zellen im larvalen Gehirn gilt. Weitere Neurone im
Larvengehirn verwenden Dopamin oder Octopamin als Neurotransmitter. Die dopaminergen
und octopaminergen Neurone liegen jedoch in linearer Form in der Mittellinie des
Ventralganglions vor, was eine Assoziation mit den Ebony exprimierenden Zellen
unwahrscheinlich macht. Zudem findet man in den Hemisphären keine octopaminergen
Zellen (Monastirioti, 1999). Eine Verbindung zu den dopaminergen und octopaminergen
Neuronen kann somit nicht ausgeschlossen werden, eine Verbindung zu den serotonergen
Zellen erscheint aber am wahrscheinlichsten. Auf Grund der hohen Ebony positiven Zellzahl,
die die Anzahl an serotonergen Neurone weit übersteigt, kann nicht ausgeschlossen werden,
dass es sich nicht um Neurone, sondern eventuell ebenfalls um Gliazellen handelt. Dies würde
einen zu den optischen Loben der adulten Fliege vergleichbaren Stoffwechselweg für den
Neurotransmitter-Metabolismus nahe legen. Dies muss jedoch durch den Nachweis der
entsprechenden β-Alanin-Konjugate und die Bestimmung der Ebony exprimierenden Zellen
bestätigt werden.
4.6 Untersuchungen zum Enhancer von ebony
Die Untersuchungen der Ebony-Expression im Verlauf der Entwicklung und in der adulten
Fliege zeigen, dass Ebony sowohl in verschiedenen Entwicklungsstadien, als auch in
verschiedenen Geweben exprimiert wird. Dies deutet auf eine komplexe Genregulierung hin.
Zur gezielten Untersuchung der Ebony Aktivität in vivo wäre es wünschenswert, spezifisch,
z.B. in Cuticula oder optischen Loben, durch reverse Genetik Störungen einzuführen und
deren
Auswirkungen
zu
untersuchen.
Dazu
ist
eine
detaillierte
Kenntnis
der
Steuerungssequenzen für die zellspezifische Expression von Ebony von großer Bedeutung.
Diese Kenntnis würde auch die Untersuchung einzelner Phänotypen von Ebony unabhängig
voneinander ermöglichen, z.B. könnte der Cuticula Phänotyp gerettet und gleichzeitig
95
Diskussion
spezifische Defekte des ZNS aufgedeckt werden. Damit wäre eine direkte Zuordnung der
Anomalien des Ebony Phänotyps zum Expressionsort möglich.
Um die Steuerungssequenzen von Ebony zu identifizieren, wurde die Enhancer-Aktivität
verschiedener genomischer Fragmente aus dem 5’ Bereich von ebony bestimmt. Alle
Konstrukte zeigten ausschließlich in der Cuticula Reporter-Aktivität. Dieses Ergebnis ist
unerwartet, denn das 11,1kb Konstrukt überspannt den gesamten genomischen Bereich, der
auch die Expression des Fusionsproteins in der Linie 120 kontrolliert (Hovemann et al.,
1998). Zudem wurde gezeigt, dass der Bereich 4,6kb vor dem Gen ausreicht, um sowohl den
Cuticula als auch den visuellen Ebony Phänotyp zu retten (Hovemann et al., 1998). Eine 3’Regulierung der Ebony-Expression scheidet aus, da auch in dem Fusionskonstrukt nach der
Fusionsstelle keine wildtypische Sequenz mehr vorliegt. Das bedeutet, dass alle regulierenden
Elemente im 5’-Bereich 4,6kb vor Exon 1 bis zur ersten BglII-Restriktionsstelle in Exon 3
liegen müssen. Dieser Bereich wird von dem in dieser Arbeit hergestellten 11,1kb EnhancerKonstrukt abgedeckt. Der einzige Unterschied zum Fusionskonstrukt besteht darin, dass das
als Reporter verwendete Gal4 nicht mit dem Leserahmen von ebony fusioniert wurde, sondern
unter der Kontrolle eines hsp70-Promotors steht, der nur durch Einfluss eines Enhancers
aktiviert werden kann. Offensichtlich reicht das nicht aus, um Gal4 in den optischen Loben zu
exprimieren. Ein störender Einfluss des kurzen ebony Leserahmens auf die Gal4-Expression
ist unwahrscheinlich, da in der Cuticula deutliche Aktivität gemessen werden konnte. Dabei
ist es auszuschließen, dass es sich bei der Cuticula Aktivität um Positionseffekte, d.h.
unspezifische Aktivität bedingt durch den Insertionsort des P-Elements handelt. Zum einen
zeigen alle unabhängigen Transformanden eines Konstruktes vergleichbare Ergebnisse, was
die Intensität und den Ort der Färbung angeht. Zum anderen konnte für das 9,9kb-Konstrukt
gezeigt werden, dass es in Verbindung mit einem UAS-ebony Konstrukt den Cuticula
Phänotyp der Null-Mutante rettet (Kemme, 2001). Bei einer unspezifischen Expression in der
Cuticula hätte man eine Störung des Pigmentierungsmusters erhalten, so wie es für die
ectopische Expression von Ebony gezeigt werden konnte (Wittkopp et al., 2002). Möglich ist
auch, dass bei der Klonierung regulatorische Elemente verloren gingen oder gestört wurden.
Bei der Größe der Konstrukte ist eine vollständige Sequenzierung nicht praktikabel, daher
wurden nur die Ligationsstellen sequenziert, um die Orientierung und die Identität der
Fragmente zu kontrollieren. Es ist allerdings unwahrscheinlich, dass durch StandardTechniken Mutationen eingefügt wurden. Das PCR-Fragment, das im mittleren Konstrukt
eingesetzt wurde, könnte Fehler aufweisen, da bei der Neusynthese des Doppelstranges
gelegentlich falsche Nukleotide durch die Taq-Polymerase eingebaut werden. Die PCR wurde
96
Diskussion
jedoch mit einem Mix durchgeführt, in dem neben der Taq-Polymerase die Pwo-Polymerase,
die Korrekturen einführen kann, eingesetzt wird. Daraus resultiert eine sehr geringe
Fehlerrate, die es unwahrscheinlich macht, dass in dem PCR-Fragment falsche Basen
eingesetzt wurden. Außerdem wurde das PCR-Fragment im 11,1kb-Konstrukt durch ein
genomisches Fragment ersetzt, ohne dass sich an der Enhancer-Spezifität etwas änderte.
Es ist denkbar, dass für ebony komplexe Regulationsmechanismen bestehen, die eine Fusion
des Reporters mit dem Leserahmen notwendig machen. Das Gen der Dopa-Decarboxylase
(DDC) zeigt eine mit ebony vergleichbare zeitliche und Gewebe spezifische Regulierung
(Dewhurst et al., 1972; McCaman et al., 1972; Scholnick et al., 1986). Es wurden mehrere
Faktoren gefunden, die auf diese Regulation Einfluss haben. Zum einen ist die Produktion des
Proteins von dem Hormon Ekdyson abhängig (Eveleth et al., 1986; Wright, 1987). Zum
anderen existieren abhängig vom Expressionsort, zwei Splice-Varianten. Im ZNS wird
ausschließlich ein 2,3kb großes Transkript gebildet, während das Transkript der an der
Cuticula-Bildung beteiligten Isoform nur 2,0kb groß ist. Das Protein im ZNS ist dadurch am
N-Terminus um 35 Aminosäuren länger als die epidermale Variante (Eveleth et al., 1986).
Scholnick (Scholnick et al., 1986) konnte zeigen, dass die neuronale Expression der DDC
durch Elemente im 5’-Bereich der mRNA gesteuert wird. Dies wurde von Bray und Hirsh
bestätigt, die fünf regulatorische Elemente identifizieren konnten, die für die wildtypische
Expression der DDC essentiell sind (Bray und Hirsh, 1986). Eine ähnlich komplexe
Regulierung ist für ebony wahrscheinlich und es sind weitere Untersuchungen nötig, um den
oder die regulierenden Mechanismen des ebony Gens vollständig zu charakterisieren. Zum
Beispiel könnte man die Aktivität des Fusionskonstruktes durch Deletionen modifizieren, um
regulatorische Elemente zu identifizieren. Eine andere Möglichkeit ist die Fusion von Ebony
mit Gal4 in Analogie zum β-Galaktosidase-Fusionskonstrukt. Dies müsste in der vollen
Aktivität des Ebony Enhancers resultieren. Auf Grund des Zeitaufwands, der für die
Herstellung von transgenen Tieren anfällt, wurden diese Experimente im Rahmen dieser
Arbeit nicht weiter verfolgt.
In der Cuticula wurde bei allen transgenen Fliegen Reporter-Aktivität gefunden. Sie können
für die Rettung des Cuticula Phänotyps eingesetzt werden und ermöglichen somit die
unabhängig Untersuchung der Funktion von Ebony, z.B. in den optischen Loben. Außerdem
können sie für Störungen des Cuticula Aufbaus verwendet werden, um weitere Informationen
über die beteiligten Prozesse zu liefern.
97
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Funktion des Ebony Proteins in der Fliege
Drosophila melanogaster, wobei besonders der visuelle Phänotyp von Interesse ist. Eine
umfassende Studie der Stadien und Gewebe spezifischen Expression zeigt, dass das Protein in
allen Entwicklungsstadien der Fliege gebildet wird. Dabei konnte Ebony vor allem in Larven,
älteren Puppen und adulten Fliegen im ZNS nachgewiesen werden. In den optischen Loben
konnte die Expression eindeutig Gliazellen der Lamina und der Medulla zugeordnet werden.
Dies warf die Frage nach der Spezifität von Ebony auf, da die Lamina nicht dopaminerg ist
und Histamin anerkanntermaßen als Neurotransmitter fungiert. Um zu untersuchen, ob Ebony
neben Dopamin auch andere biogenen Amine akzeptiert, wurde das Protein aufgereinigt und
charakterisiert. Nach Etablierung geeigneter Expressionssysteme konnte das Ebony-Protein
zum ersten Mal in aufgereinigter Form in vitro untersucht werden. Es zeigte sich, dass ein
bisher für höhere Eukaryonten unbekannter Mechanismus zur Aktivierung einer Aminosäure
eingesetzt wird, der mit dem Mechanismus von NRPS aus Mikroorganismen vergleichbar ist.
Dieser Mechanismus konnte durch die Charakterisierung einer Drosophila PPT bekräftigt
werden. Das Protein EAP ist in der Lage, die bakterielle PPT Sfp in vitro gleichwertig zu
ersetzen und Ebony mit Ppant zu beladen. Die Homologie von Ebony zu NRPS zeigt einige
weitere interessante Möglichkeiten auf. Die Module der NRPS bieten die Möglichkeit, durch
gezielte Fusionierung Peptide mit medizinisch relevanter Wirkung zu synthetisieren. Das βAlanin spezifische Modul könnte eine wertvolle Bereicherung des „Pools“ an schon
vorhandenen Modulen sein, da kein Modul mit Spezifität für β-Alanin bekannt ist. Auch der
hintere Teil, der keine Homologie zu Peptidsynthetasen zeigt, könnte mit Modulen von NRPS
fusioniert werden, um die Übertragung des gebildeten Peptids auf ein biogenes Amin zu
katalysieren.
Durch die geringe Spezifität bei der Auswahl von Konjugationspartnern für das gebundene βAlanin ist das Ebony Protein nicht nur in der Lage β-Alanyldopamin und β-Alanylhistamin
herzustellen, sondern auch β-Alanylderivate der anderen relevanten Neurotransmitter
Serotonin, Tyramin und Octopamin. Dies wirft ein neues Licht auf das breite Spektrum der
ebony Phänotypen, da die Erklärungen hierfür nicht mehr nur im Dopamin und β-Alanin
Stoffwechsel gesucht werden müssen. So deuten die hier präsentierten Ergebnisse zur
98
Zusammenfassung
Expression von Ebony in den optischen Loben kombiniert mit der in vitro gezeigten Synthese
von β-Alanylhistamin auf einen neuartigen Mechanismus in der Metabolisierung von
Histamin hin und es ist möglich, dass Ebony eine größere Rolle im Neurotransmitter
Metabolismus von Drosophila melanogaster spielt.
Das Auffinden zweier zu Ebony und EAP homologer Proteine in Anopheles gambiae im
Rahmen dieser Arbeit legt nahe, dass es sich bei der von Ebony katalysierten Reaktion um ein
bei Invertebraten verbreitetes Werkzeug zur Neurotransmitter Inaktivierung handelt. Bestätigt
wird diese Vermutung durch das Auffinden von β-Alanyldopamin und β-Alanylnorepinephrin
in der Mittelmeer Fruchtfliege Ceratitis capitata (Perez et al., 2002) sowie β-Alanylhistamin
in der Strandkrabbe Carcinus maenas (Arnould und Frentz, 1975) und der Fleischfliege
Sarcophaga bullata (Borycz et al., 2002).
99
Anhang
6. Anhang
6.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung1: ERG-Aufnahmen von Wildtyp und der ebony Mutante ......................................... 2
Abbildung 2: Das ebony-Gen..................................................................................................... 3
Abbildung 3: Homologie zwischen Ebony und Peptidsynthetasen ............................................ 4
Abbildung 4: Von der A-Domäne katalysierte reversible Adenylierung des Substrats ............. 6
Abbildung 5: Bindung des Substrats in der T-Domäne.............................................................. 6
Abbildung 6: Bildung der Peptidbindung .................................................................................. 7
Abbildung 7: Die verschiedenen möglichen Domänen eines Moduls........................................ 7
Abbildung 8: Die Umwandlung von apo-NRPS zu holo-NRPS durch PPT............................... 8
Abbildung 9: Mögliche Synthese und Modifikation von Phenol- und Catecholaminen ............ 9
Abbildung 10: Das visuelle System von Drosophila melanogaster ......................................... 11
Abbildung 11: Organisation der neuronalen Zellen der Lamina ............................................ 13
Abbildung 12: Gliazellen der Lamina und Projektionsmodell der Rezeptorneurone R1-R6 in
die Lamina Cartridges ............................................................................................................. 14
Abbildung 13: Signaltransduktion im Rhabdomer der Photorzeptorzelle ............................... 16
Abbildung 14: Lokalisation des Ebony-Proteins ..................................................................... 46
Abbildung 15: Ebony-Expression in Abdominal-Segmenten des Embryos.............................. 47
Abbildung 16: Ebony-Expression in Larven des 2. und 3. Larvenstadiums ............................ 49
Abbildung 17: Ebony-Expression in der Puppe von Drosophila melanogaster ...................... 50
Abbildung 18: Ebony-Expression in den optischen Loben der adulten Fliege........................ 51
Abbildung 19: Doppelfärbung von Wildtyp und Mutante mit Anti-Ebony Serum und AntiELAV Antikörper ...................................................................................................................... 53
Abbildung 20: Co-Lokalisation von Ebony und β-Galaktosidase in der Glia-Marker-Linie 366.............................................................................................................................................. 53
Abbildung 21: Übersicht über die drei klonierten und transformierten Klone........................ 55
Abbildung 22: Enhancer kontrollierte β-Galaktosidase Aktivität der drei verschiedenen
Konstrukte ................................................................................................................................ 58
Abbildung 23: Der Ebony-Transfektionsvektor für die S2-Zellkultur...................................... 60
Abbildung 25: Elutions-Diagramm der FPLC des Zellkultur-Proteins................................... 61
100
Anhang
Abbildung 26: SDS-PAGE und Western Blot ausgewählter Fraktionen der Aufreinigung..... 62
Abbildung 27: Die bakteriellen Expressionskonstrukte ........................................................... 63
Abbildung 28: Western-Blot Analyse der Koloniereihe mit Anti-Penta-His............................ 64
Abbildung 29: Zeitreihe und IPTG-Konzentrationsreihe......................................................... 65
Abbildung 30: Elutions-Diagramm der FPLC des bakteriellen Proteins................................ 66
Abbildung 32: Substratspezifität der Adenylierungsdomäne des wildtypischen und mutierten
Proteins .................................................................................................................................... 68
Abbildung 33: Bestimmung des Km-Werts................................................................................ 69
Abbildung 34: Abhängigkeit der Adenylierungsreaktion von zweiwertigen Metallionen........ 70
Abbildung 35: Beladung des Zellkultur-Proteins mit [3H]-CoA.............................................. 71
Abbildung 36: Beladung der Ebony-Proteine mit β-Alanin..................................................... 72
Abbildung 37: Abnahme der präzipitierbaren Radioaktivität bei Zugabe von biogenen Aminen
.................................................................................................................................................. 74
Abbildung 38: Test verschiedener Aminosäuren auf Akzeptanz als 2.Substrat ....................... 75
Abbildung 39: Zunehmende Entladung des Proteins mit Erhöhung des Abstandes zwischen
Carboxyl- und Aminogruppe.................................................................................................... 76
Abbildung 40: Einfluss der Ringstruktur auf die Produktbildung ........................................... 77
Abbildung 41: Verknüpfung von β-Alanin mit primären Aminen unterschiedlicher Länge .... 77
Abbildung 42: Sequenzvergleich der putativen Drosophila PPT mit Sfp aus Bacillus subtilis
und Gsp aus Bacillus brevis ..................................................................................................... 79
Abbildung 43: Position des putativen PPT Gens CG32099 .................................................... 80
Abbildung 46: Vergleich zwischen Sfp und der putativen Drosophila PPT ............................ 81
Abbildung 47: Vergleich von Ebony und dem Anopheles gambiae Homologen agCP14835 . 83
Abbildung 48: Sequenzvergleich zwischen EAP und agCP3252 aus Anopheles gambiae ...... 85
101
Anhang
6.2 Literaturverzeichnis
Acharya, J. K., et al.; "InsP3 receptor is essential for growth and differentiation but not for vision in
Drosophila"; Neuron (1997); 18 (6)
Adams, M. D., et al.; "The genome sequence of Drosophila melanogaster"; Science (2000); 287 (5461)
Andersen, S. O.; "Evidence for two mechanisms of sclerotization in insect cuticle"; Nature (1974); 251
Arnould, J. M.; "[Biosynthesis of carcinine (beta-alanyl-histamine) in vivo]"; Archives Internationales de
Physiologie et de Biochimie (1985); 93 (4)
Arnould, J. M.; "[Biosynthesis and metabolism of histamine in the central nervous system of Carcinus
maenas]"; Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie (1987a); 95 (1)
Arnould, J. M.; "[Demonstration of carcinine synthetase, a new enzyme catalysing the metabolism of histamine
in the central nervous system of Carcinus maenas]"; Journal of Neurochemistry (1987b); 48 (4)
Arnould, J. M. und Frentz, R.; "[Presence, isolation and chemical structure of a substance characteristic of
cardiac tissue in Carcinus maenas (L.): beta-alanylhistamine]"; Comparative Biochemistry & Physiology C:
Comparative Pharmacology (1975); 50 (1)
Arnould, J. M. und Frentz, R.; "[Carcinine (beta-alanyl-histamine): rapid synthesis and action on vertebrate
blood pressure]"; Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie (1977); 85 (2)
Aso, Y., et al.; "Properties of tyrosine and dopa quinone immine conversion factor from pharate pupal cuticle of
Manduca Sexta"; Insect Biochem (1984); 14
Battelle, B. A. und Hart, M. K.; "Histamine metabolism in the visual system of the horseshoe crab Limulus
polyphemus"; Comp Biochem Physiol (2002); 133
Bennett, J. und Scott, K. J.; "Quantitative staining of fraction I protein in polyacrylamide gels using
Coomassie brillant blue"; Anal Biochem (1971); 43 (1)
Birnboim, H. C. und Doly, J.; "A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid
DNA"; Nucleic Acids Res (1979); 7 (6)
Bloomquist, B. T., et al.; "Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in
phototransduction"; Cell (1988); 54 (5)
Bodenstein, D.; "The postembryonic development of Drosophila"
in M. Demerec: "Biology of Drosophila", 1950
Borchert, S., et al.; "Induction of surfactin production in Bacillus subtilis by gsp, a gene located upstream of the
gramicidin S operon in Bacillus brevis"; J Bacteriol (1994); 176 (8)
Borycz, J., et al.; "tan and ebony Genes Regulate a Novel Pathway for Transmitter Metabolism at Fly
Photoreceptor Terminals"; J Neurosci (2002); 22 (24)
Bradford, M. M.; "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding"; Anal Biochem (1976); 72
Braitenberg, V.; "Patterns of projection in the visual system of the fly. I. Retina- lamina projections"; Exp
Brain Res (1967); 3 (3)
Brand, A. H. und Perrimon, N.; "Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating
dominant phenotypes"; Development (1993); 118 (2)
102
Anhang
Bray, S. J. und Hirsh, J.; "The Drosophila virilis dopa decarboxylase gene is developmentally regulated when
integrated into Drosophila melanogaster"; Embo J (1986); 5 (9)
Bray, S. J., et al.; "A cis-acting element and associated binding factor required for CNS expression of the
Drosophila melanogaster dopa decarboxylase gene"; Embo J (1988); 7 (1)
Bridges, C. B. und Morgan, T. H.; Carnegie Inst. Wash. (1923); 327
Burg, M. G., et al.; "Genetic and molecular identification of a Drosophila histidine decarboxylase gene
required in photoreceptor transmitter synthesis"; Embo J (1993); 12 (3)
Caizzi, R., et al.; "Characterization of the ebony locus in Drosophila melanogaster"; Molecular and General
Genetics (1987); 206
Callaway, J. C. und Stuart, A. E.; "Biochemical and physiological evidence that histamine is the transmitter of
barnacle photoreceptors"; Vis Neurosci (1989); 3 (4)
Campos-Ortega, J. A. und Hartenstein, V.; "The Embryonic Development of Drosophila melanogaster";
1985
Challis, G. L., et al.; "Predictive, structure-based model of amino acid recognition by nonribosomal peptide
synthetase adenylation domains"; Chem Biol (2000); 7 (3)
Chen, J., et al.; "Mechanisms of rhodopsin inactivation in vivo as revealed by a COOH- terminal truncation
mutant"; Science (1995); 267 (5196)
Chevesich, J., et al.; "Requirement for the PDZ domain protein, INAD, for localization of the TRP storeoperated channel to a signaling complex"; Neuron (1997); 18 (1)
Chou, W. H., et al.; "Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and
default cell-fate specification"; Development (1999); 126 (4)
Chyb, S., et al.; "Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL";
Nature (1999); 397 (6716)
Claridge-Chang, A., et al.; "Circadian regulation of gene expression systems in the Drosophila head"; Neuron
(2001); 32 (4)
Conti, E., et al.; "Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming
enzymes"; Structure (1996); 4 (3)
Cook, B.; "Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo"; Nature Cell Biol (2000);
2
Cosmina, P., et al.; "Sequence and analysis of the genetic locus responsible for surfactin synthesis in Bacillus
subtilis"; Mol Microbiol (1993); 8 (5)
Crossley, S. und Zuill, E.; "Courtship behaviour of some Drosophila melanogaster mutants"; Nature (1970);
225
D`Alessandro, A.; "Cytological localization of the "ebony" locus in Drosophila"; Dros. Inf. Serv. (1977); 52
de Ferra, F., et al.; "Engineering of peptide synthetases. Key role of the thioesterase-like domain for efficient
production of recombinant peptides"; J Biol Chem (1997); 272 (40)
Deitmer, J. W.; "Strategies for metabolic exchange between glial cells and neurons"; Respir Physiol (2001);
129 (1-2)
Dewhurst, S. A., et al.; "Metabolism of biogenic amines in Drosophila nervous tissue"; Comp Biochem Physiol
B (1972); 43 (4)
103
Anhang
Doekel, S. und Marahiel, M. A.; "Dipeptide formation on engineered hybrid peptide synthetases"; Chem Biol
(2000); 7 (6)
Dolph, P. J., et al.; "Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo"; Science
(1993); 260 (5116)
Dürrwächter, G.; "Untersuchung über Phototaxis und Geotaxis einiger Drosophila-Mutanten nach Aufzucht in
verschiedenen Lichtbedingungen"; Z. Tierpsychol (1957); 14
Elias, M. S. und Evans, P. D.; "Histamine in the insect nervous system: distribution, synthesis and
metabolism"; J Neurochem (1983); 41 (2)
Estacion, M., et al.; "Regulation of Drosophila transient receptor potential-like (TrpL) channels by
phospholipase C-dependent mechanisms"; J Physiol (2001); 530 (Pt 1)
Eule, E., et al.; "Glial Cells in the Optic Lobe of Drosophila melanogaster"
in "Flybrain poster acession no. PP00004", 1995
Eveleth, D. D., et al.; "Sequence and structure of the dopa decarboxylase gene of Drosophila: evidence for
novel RNA splicing variants"; Embo J (1986); 5 (10)
Fischbach, K.-F. und Dittrich, A. P. M.; "The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of
wild-type structure"; Cell and Tissue Research (1989); 258
Frye, M. A. und Dickinson, M. H.; "Fly flight: a model for the neural control of complex behavior"; Neuron
(2001); 32 (3)
Fryxell, K. J. und Meyerowitz, E. M.; "An opsin gene that is expressed only in the R7 photoreceptor cell of
Drosophila"; Embo J (1987); 6 (2)
Gevers, W., et al.; "The activation of amino acids for biosynthesis of gramicidin S"; Proc Natl Acad Sci U S A
(1968); 60 (1)
Gisselmann, G., et al.; "Two cDNAs coding for histamine-gated ion channels in D. melanogaster"; Nature
Neuroscience (2002); 5 (1)
Gocht, M. und Marahiel, M. A.; "Analysis of core sequences in the D-Phe activating domain of the
multifunctional peptide synthetase TycA by site-directed mutagenesis"; J Bacteriol (1994); 176 (9)
Granderath, S. und Klämbt, C.; "Glia development in the embryonic CNS of Drosophila"; Curr Opin
Neurobiol (1999); 9 (5)
Hardie, R. C.; "Is histamine a neurotransmitter in insect photoreceptors?" J Comp Physiol [A] (1987); 161 (2)
Hardie, R. C.; "A histamine-activated chloride channel involved in neurotransmission at a photoreceptor
synapse"; Nature (1989); 339 (6227)
Hardie, R. C.; "Phototransduction in Drosophila melanogaster"; J Exp Biol (2001); 204 (Pt 20)
Hardie, R. C., et al.; "Protein kinase C is required for light adaptation in Drosophila photoreceptors"; Nature
(1993); 363 (6430)
Hardie, R. C. und Raghu, P.; "Visual transduction in Drosophila"; Nature (2001); 413 (6852)
Hazelrigg, T., et al.; "Transformation of white locus DNA in Drosophila: dosage compensation, zeste
interaction, and position effects"; Cell (1984); 36 (2)
Heisenberg, M.; "Separation of receptor and lamina potentials in the electroretinogram of normal and mutant
Drosophila"; J Exp Biol (1971); 55 (1)
104
Anhang
Heisenberg, M.; "Comparative behavioral studies on two visual mutants of Drosophila"; J. comp. Physiol.
(1972); 80
Hodgetts, R. und Choi, A.; "Beta alanine and cuticle maturation in Drosophila"; Nature (1974); 252 (5485)
Hodgetts, R. B.; "Biochemical characterization of mutants affecting the metabolism of - alanine in
Drosophila"; J Insect Physiol (1972); 18 (5)
Hodgetts, R. B. und Konopka, R. J.; "Tyrosine and catecholamine metabolism in wild-type Drosophila
melanogaster and a mutant, ebony"; J Insect Physiol (1973); 19 (6)
Hopkins, T. L., et al.; "N-β-Alanyldopamine: Major role in insect cuticle tanning"; Science (1982); 217
Hotta, Y. und Benzer, S.; "Abnormal electroretinograms in visual mutants of Drosophila"; Nature (1969); 222
(191)
Hotta, Y. und Benzer, S.; "Genetic dissection of the Drosophila nervous system by means of mosaics"; Proc
Natl Acad Sci U S A (1970); 67 (3)
Hovemann, B. T., et al.; "The Drosophila ebony gene is closely related to microbial peptide synthetases and
shows specific cuticle and nervous system expression"; Gene (1998); 221
Huber, A., et al.; "The TRP Ca2+ channel assembled in a signaling complex by the PDZ domain protein INAD
is phosphorylated through the interaction with protein kinase C (ePKC)"; FEBS Lett (1998); 425 (2)
Huber, A., et al.; "Molecular cloning of Drosophila Rh6 rhodopsin: the visual pigment of a subset of R8
photoreceptor cells"; FEBS Lett (1997); 406 (1-2)
Jacobs, M. E.; "Influence of light on mating of Drosophila melanogaster"; Ecology (1960); 41
Jacobs, M. E.; "Deposition of labeled beta-alanine in ebony and non-ebony Drosophila melanogaster with
notes on other amino acids"; Genetics (1966); 53 (4)
Jacobs, M. E.; "Influence of beta-alanine on ultrastructure, tanning, and melanization of Drosophila
melanogaster cuticles"; Biochem Genet (1980); 18 (1-2)
Jacobs, M. E.; "Role of Beta-Alanine in Cuticular Tanning, Scerotization, and Temperature Regulation in
Drosophila Melanogaster"; Journal of Insect Physiology (1985); 31 (6)
Jacobs, M. E. und Brubaker, K. K.; "Beta-alanine utilization of ebony and non-ebony Drosophila
melanogaster"; Science (1963); 139
Karlson, P. und Sekeris, C. E.; "N-Acetyl-dopamine as sclerotizing agent of the insect cuticle"; Nature (1962);
188
Keating, T. A., et al.; "Selectivity of the yersiniabactin synthetase adenylation domain in the two-step process
of amino acid activation and transfer to a holo- carrier protein domain"; Biochemistry (2000); 39 (9)
Kemme, T.; "Untersuchung zum Funktionsmechanismus des Ebony Proteins von Drosophila melanogaster";
Diplomarbeit; AG Hovemann, Ruhr-Universität Bochum
Khyse-Anderson, J.; "Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer
of protein from polyacrylamide to nitrocellulose"; Biochem Biophys Methods (1984); 10
Kirschfeld, K.; "[The projection of the optical environment on the screen of the rhabdomere in the compound
eye of the Musca]"; Exp Brain Res (1967); 3 (3)
Kirschfeld, K.; "Optics of the compound eye"
in W. Reichardt: "Processing of optical data by organisms and by machines", 1969
105
Anhang
Kittelberger, R., et al.; "Kinetics of Amino Acid Activation in Gramicidin S Synthesis."
in H. Kleinkauf und H. von Döhren: "In Peptide Antibiotics, Biosynthesis and Function." 1982
Kleinkauf, H. und von Döhren, H.; "Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics"; Eur J Biochem
(1990); 192 (1)
Konz, D., et al.; "The bacitracin biosynthesis operon of Bacillus licheniformis ATCC 10716: molecular
characterization of three multi-modular peptide synthetases"; Chem Biol (1997); 4 (12)
Konz, D. und Marahiel, M. A.; "How do peptide synthetases generate structural diversity?" Chem Biol (1999);
6 (2)
Kyriacou, C. P.; "The relationship between locomotor activity and sexual behaviour in ebony strains of
Drosophila melanogaster"; Anim. Behav. (1981); 29
Kyriacou, C. P., et al.; "The behavioural basis of overdominance in competitive mating success at the ebony
locus of Drosophila melanogaster"; Anim. Behav. (1978); 26
Laemmli, U. K.; "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4"; Nature
(1970); 227 (259)
Lambalot, R. H., et al.; "A new enzyme superfamily - the phosphopantetheinyl transferases"; Chem Biol
(1996); 3 (11)
Lee, S. G. und Lipmann, F.; "Tyrocidine synthetase system"; Methods Enzymol (1975); 43
Lipke, H., et al.; "Mechanisms of sclerotization in dipterans"; Adv. Insect Physiol. (1983); 17
Lund, A., et al.; "Increased cloning efficiency by temperature-cycle ligation"; Nucleic Acids Research (1996);
24 (4)
Marahiel, M. A.; "Multidomain enzymes involved in peptide synthesis"; FEBS Lett (1992); 307 (1)
Marahiel, M. A., et al.; "Modular Peptide Synthetases Involved in Nonribosomal Peptide Synthesis"; Cem.
Rev. (1997); 97
Maranda, B. und Hodgetts, R.; "A characterization of dopamine acetyltransferase in Drosophila
melanogaster"; Insect Biochem. (1977); 7
Masai, I., et al.; "Drosophila retinal degeneration A gene encodes an eye-specific diacylglycerol kinase with
cysteine-rich zinc-finger motifs and ankyrin repeats"; Proc Natl Acad Sci U S A (1993); 90 (23)
Massoulie, J., et al.; "Molecular and cellular biology of cholinesterases"; Prog Neurobiol (1993a); 41 (1)
Massoulie, J., et al.; "Structure and functions of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase"; Prog Brain
Res (1993b); 98
McCaman, M. W., et al.; "Liquid cation exchange--a basis for sensitive radiometric assays for aromatic amino
acid decarboxylases"; Anal Biochem (1972); 45 (1)
Meinertzhagen, I. A. und Hanson, T. E.; "The development of the optic lobe"
in B. M. H. Bush und A. Martinez-Arias: "The development of Drosophila melanogaster", 1993
Meinertzhagen, I. A. und O'Neil, S. D.; "Synaptic organization of columnar elements in the lamina of the wild
type in Drosophila melanogaster"; J Comp Neurol (1991); 305 (2)
Melamed, J. und Trujillo-Cenoz, O.; "The fine structure of the visual system of Lycosa (Araneae: Lycosidae).
I. Retina and optic nerve"; Z Zellforsch Mikrosk Anat (1966); 74 (1)
Melzig, J., et al.; "Genetic depletion of histamine from the nervous system of Drosophila eliminates specific
visual and mechanosensory behavior"; J Comp Physiol [A] (1996); 179 (6)
106
Anhang
Melzig, J., et al.; "Selective histamine uptake rescues photo- and mechanoreceptor function of histidine
decarboxylase-deficient Drosophila mutant"; J Neurosci (1998); 18 (18)
Mitchell, H. K. und Petersen, N. S.; "Gradients of differentiation in wild-type and bithorax mutants of
Drosophila"; Dev Biol (1983); 95 (2)
Mohler, J. und Pardue, M. L.; "Mutational analysis of the region surrounding the 93D heat shock lockus of
Drosophila melanogaster"; Genetics (1984); 106
Monastirioti, M.; "Biogenic amine systems in the fruit fly Drosophila melanogaster"; Microscopy Research &
Technique (1999); 45 (2)
Montell, C.; "TRP trapped in fly signaling web [In Process Citation]"; Curr Opin Neurobiol (1998); 8 (3)
Montell, C.; "Visual transduction in Drosophila"; Annu Rev Cell Dev Biol (1999); 15
Montell, C., et al.; "A second opsin gene expressed in the ultraviolet-sensitive R7 photoreceptor cells of
Drosophila melanogaster"; J Neurosci (1987); 7 (5)
Mootz, H. D. und Marahiel, M. A.; "The tyrocidine biosynthesis operon of Bacillus brevis: complete
nucleotide sequence and biochemical characterization of functional internal adenylation domains"; J Bacteriol
(1997); 179 (21)
Morgan, J. R., et al.; "Uptake of precursor and synthesis of transmitter in a histaminergic photoreceptor"; J
Neurosci (1999); 19 (4)
Nakano, M. M., et al.; "Isolation and characterization of sfp: a gene that functions in the production of the
lipopeptide biosurfactant, surfactin, in Bacillus subtilis"; Mol Gen Genet (1992); 232 (2)
Nässel, D. R., et al.; "Dopamine-immunoreactive neurons in the blowfly visual system: light and electron
microscopic immunocytochemistry"; J Chem Neuroanat (1988a); 1 (6)
Nässel, D. R., et al.; "Histamine-like immunoreactivity in photoreceptors of the compound eyes and ocelli of
the flies Calliphora erythrocephala and Musca domestica"; Cell Tissue Res (1988b); 253 (3)
Newby, L. M. und Jackson, F. R.; "Drosophila ebony mutants have altered circadian activity rhythms but
normal eclosion rhythms"; J Neurogenet (1991); 7 (2-3)
Niemeyer, B. A., et al.; "The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and
TRPL"; Cell (1996); 85 (5)
Perez, M., et al.; "Catecholamine-beta-alanyl ligase in the medfly Ceratitis capitata"; Insect Biochem Mol Biol
(2002); 32 (6)
Pfeifer, E., et al.; "Characterization of tyrocidine synthetase 1 (TY1): requirement of posttranslational
modification for peptide biosynthesis"; Biochemistry (1995); 34 (22)
Pflugfelder, G. O. und Heisenberg, M.; "Optomotor-blind of Drosophila melanogaster: a neurogenetic
approach to optic lobe development and optomotor behaviour"; Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol
(1995); 110 (3)
Phillips, A. M., et al.; "A neurological role for the product of the black gene?" T. Bellen; "Neurobiology of
Drosophila"; 2001
Phillips, A. M., et al.; "A neural gene from Drosophila melanogaster with homology to vertebrate and
invertebrate glutamate decarboxylases"; J Neurochem (1993); 61 (4)
Pirvola, U., et al.; "Distribution of histamine in the cockroach brain and visual system: an immunocytochemical
and biochemical study"; J Comp Neurol (1988); 276 (4)
107
Anhang
Pollack, I. und Hofbauer, A.; "Histamine-like immunoreactivity in the visual system and brain of Drosophila
melanogaster"; Cell Tissue Res (1991); 266 (2)
Pryor, M. G. M.; "On the hardening of cuticle of insects"; Proc. R. Soc. Lond. B. (1940a); 128
Pryor, M. G. M.; "On the hardening of the ootheca of Blatta orientalis"; Proc. R. Soc. Lond. B. (1940b); 128
Pryor, M. G. M.; "Sclerotization"
in M. Flörkin und H. S. Mason: "Comparative Biochemistry, Vol.4: Constituents of Life", 1962
Putney, J. W., Jr. und McKay, R. R.; "Capacitative calcium entry channels"; Bioessays (1999); 21 (1)
Quadri, L. E., et al.; "Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl
carrier protein domains in peptide synthetases"; Biochemistry (1998); 37 (6)
Raghu, P., et al.; "Normal phototransduction in Drosophila photoreceptors lacking an InsP(3) receptor gene";
Molecular & Cellular Neurosciences (2000); 15 (5)
Reichert, J., et al.; "Characterization of EntF as a serine-activating enzyme"; Protein Sci (1992); 1 (4)
Rendel, J.; "Mating of ebony, vestigal and wild type D.melanogaster in light and dark"; Evolution (1951); 5
Reuss, H., et al.; "In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL"; Neuron (1997);
19 (6)
Reuter, K., et al.; "Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'phosphopantetheinyl transferase superfamily"; Embo J (1999); 18 (23)
Richardt, A., et al.; "Ebony protein in the Drosophila nervous system: Optic neuropile expression in glial
cells"; J Comp Neurol (2002); 452 (1)
Robinow, S., et al.; "The elav gene product of Drosophila, required in neurons, has three RNP consensus motifs
published erratum appears in Science 1989 Jan 6;243(4887):12]"; Science (1988); 242 (4885)
Robinow, S. und White, K.; "Characterization and spatial distribution of the ELAV protein during Drosophila
melanogaster development"; J Neurobiol (1991); 22 (5)
Ryseck, R. P.; "Untersuchung der Struktur des Hitzschockgns 93D von Drosophila melanogaster und des
benachbarten ebony-Gens"; Dissertation; Ruprecht-Karls Universität Heidelberg
Ryseck, R. P., et al.; "Heat shock loci 93D of Drosophila melanogaster and 48B of Drosophila hydei exhibit a
common structural and transcriptional pattern"; Nucleic Acids Res (1987); 15 (8)
Saiki, R. K., et al.; "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia"; Science (1985); 230 (4732)
Saint Marie, R. L. und Carlson, S. D.; "The fine structure of neuroglia in the lamina ganglionaris of the
housefly, Musca domestica "; J Neurocytol (1983); 12 (2)
Salcedo, E., et al.; "Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and
physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins"; J Neurosci
(1999); 19 (24)
Sambrook, J., et al.; "Molecular Cloning A Laboratory Manual"; 1989
Sarthy, P. V.; "Histamine: a neurotransmitter candidate for Drosophila photoreceptors"; J Neurochem (1991);
57 (5)
Saul, S. und Sugumaran, M.; "A novel quinone: quinone methide isomerase generates quinone methides in
insect cuticle"; FEBS Lett (1988); 237 (1-2)
108
Anhang
Schlemermeyer, E., et al.; "Immunohistochemical and electrophysiological evidence that locust ocellar
photoreceptors contain and release histamine"; Neurosci Lett (1989); 99 (1-2)
Schneider, I.; "Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster"; J Embryol Exp
Morphol (1972); 27 (2)
Scholnick, S. B., et al.; "CNS and hypoderm regulatory elements of the Drosophila melanogaster dopa
decarboxylase gene"; Science (1986); 234 (4779)
Scholnick, S. B., et al.; "Mutations within the Ddc promoter alter its neuron-specific pattern of expression";
Dev Biol (1991); 146 (2)
Scott, K., et al.; "Gq alpha protein function in vivo: genetic dissection of its role in photoreceptor cell
physiology"; Neuron (1995); 15 (4)
Scott, K., et al.; "Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates
termination of the light response in vivo"; Cell (1997); 91 (3)
Shaw, S. R.; "Anatomy and physiology of identified non-spiking cells in the photoreceptor-lamina complex of
the compund eye of insects, especially diptera"
in A. Roberts und B. M. H. Bush: "Neurones without impulses", 1981
Shaw, S. R., et al.; "Direct connections between the R7/8 and R1-6 photoreceptor subsystems in the dipteran
visual system"; Cell Tissue Res (1989); 257 (2)
Skingsley, D. R., et al.; "Properties of histamine-activated chloride channels in the large monopolar cells of the
dipteran compound eye: a comparative study"; J Comp Physiol [A] (1995); 176
Smith, D. P., et al.; "Photoreceptor deactivation and retinal degeneration mediated by a photoreceptor-specific
protein kinase C"; Science (1991); 254 (5037)
Stachelhaus, T., et al.; "Biochemical characterization of peptidyl carrier protein (PCP), the thiolation domain of
multifunctional peptide synthetases"; Chem Biol (1996a); 3 (11)
Stachelhaus, T. und Marahiel, M. A.; "Modular structure of peptide synthetases revealed by dissection of the
multifunctional enzyme GrsA"; J Biol Chem (1995); 270 (11)
Stachelhaus, T., et al.; "Peptide bond formation in nonribosomal peptide biosynthesis. Catalytic role of the
condensation domain"; J Biol Chem (1998); 273 (35)
Stachelhaus, T., et al.; "The specificity-conferring code of adenylation domains in nonribosomal peptide
synthetases"; Chem Biol (1999); 6 (8)
Stachelhaus, T., et al.; "Engineered biosynthesis of peptide antibiotics"; Biochem Pharmacol (1996b); 52 (2)
Stein, T., et al.; "Detection of 4'-phosphopantetheine at the thioester binding site for L-valine of gramicidinS
synthetase 2"; FEBS Lett (1994); 340 (1-2)
Steller, H. und Pirrotta, V.; "Regulated expression of genes injected into early Drosophila embryos"; Embo J
(1984); 3 (1)
Strausfeld, N. J. und Campos-Ortega, J. A.; "Vision in insects: pathways possibly underlying neural
adaptation and lateral inhibition"; Science (1977); 195 (4281)
Strausfeld, N. J. und Nässel, D. R.; "Neuroarchitecture of brain regions that subserve the compound eye of
crustacea and insects"
in "Handbook of sensory physiology", 1981
109
Anhang
Stuart, A. E.; "From fruit flies to barnacles, histamine is the neurotransmitter of arthropod photoreceptors";
Neuron (1999); 22 (3)
Stuart, A. E., et al.; "Selective, activity-dependent uptake of histamine into an arthropod photoreceptor"; J
Neurosci (1996); 16 (10)
Sugumaran, M.; "Molecular Mechanisms for Cuticular Sclerotization"
in "Advances in Insect Physiology", 1988
Tix, S., et al.; "Glia in the chiasms and medulla of the Drosophila melanogaster optic lobes"; Cell Tissue Res
(1997); 289 (3)
Trujillo-Cenoz, O.; "Some aspects of the structural organization of the intermediate retina of dipterans"; J
Ultrastruct Res (1965); 13 (1)
Tsunoda, S., et al.; "A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G- proteincoupled cascade"; Nature (1997); 388 (6639)
Vihtelic, T. S., et al.; "Localization of Drosophila retinal degeneration B, a membrane- associated
phosphatidylinositol transfer protein"; J Cell Biol (1993); 122 (5)
Vihtelic, T. S., et al.; "Isolation and characterization of the Drosophila retinal degeneration B (rdgB) gene";
Genetics (1991); 127 (4)
Vinos, J., et al.; "A G protein-coupled receptor phosphatase required for rhodopsin function"; Science (1997);
277 (5326)
Walldorf, U., et al.; "Cloning of heat-shock locus 93D from Drosophila melanogaster"; Embo J (1984); 3 (11)
Walter, M. F., et al.; "Catecholamine metabolism and in vitro induction of premature cuticle melanization in
wild type and pigmentation mutants of Drosophila melanogaster"; Arch Insect Biochem Physiol (1996); 31 (2)
Warr, C. G. und Kelly, L. E.; "Identification and characterization of two distinct calmodulin-binding sites in
the Trpl ion-channel protein of Drosophila melanogaster"; Biochem J (1996); 314 (Pt 2)
Weber, G., et al.; "The peptide synthetase catalyzing cyclosporine production in Tolypocladium niveum is
encoded by a giant 45.8-kilobase open reading frame"; Curr Genet (1994); 26 (2)
Winberg, M. L., et al.; "Generation and early differentiation of glial cells in the first optic ganglion of
Drosophila melanogaster"; Development (1992); 115 (4)
Wittkopp, P. J., et al.; "Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development
and evolution of pigment patterns"; Development (2002); 129 (8)
Wolff, T. und Ready, D. F.; "Pattern formation in the Drosophila retina"
in M. Bates und A. Martinez-Arias: "The development of Drosophila melanogaster", 1993
Wright, T. R. F.; "The Genetics of Biogenic Amine Metabolism, Sclerotization, and Melanization in
Drosophila melanogaster"
in J. G. Scandalios und E. W. Caspari: "Advances in Genetics", 1987
Wu, L., et al.; "Regulation of PLC-mediated signalling in vivo by CDP-diacylglycerol synthase [see
comments]"; Nature (1995); 373 (6511)
Zheng, Y., et al.; "Identification of two novel Drosophila melanogaster histamine-gated chloride channel
subunits expressed in the eye"; Journal of Biological Chemistry (2002); 277 (3)
Zuker, C. S., et al.; "Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster"; Cell (1985); 40 (4)
110
Anhang
6.3 Abkürzungsverzeichnis
A
Ampere
A-Domäne
Adenylierungsdomäne
Amp
Ampicillin
AS
Aminosäure
ATP
Adenosintriphosphat
bp
Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
cm
Zentimeter
CoA
Coenzym A
cpm
gezählte Zerfälle pro Minute (counts per
minute)
Da
Dalton
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNAse
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxynuklosidtriphosphat
dpm
Zerfälle pro Minute (decays per minute)
FPLC
schnelle Flüssigchromatographie (fast
performance liquid chromatography)
h
Stunde
Kan
Kanamycin
kb
Kilobasenpaare
kb
Kilobasenpaare
K-Domäne
Kondensationsdomöne
l
Liter
LB
Luria-Bertani
M
molar
mRNA
Boten RNA (messenger RNA)
NRPS
Nicht ribosomale Peptidsynthetase
ODx
Optische Dichte bei x nm
PCR
PEG
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase
chain reaction)
Polyethylenglykol
111
Anhang
Ppant
4'-Phosphopantethein
PPi
anorganisches Pyrophosphat
PPT
Phosphopantethein Transferase
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
s
Sekunde
TCA
Trichloressigsäure
T-Domäne
Thiolierungsdomäne
Te-Domäne
Thioesterasedomäne
UAS
upstream activating sequence
V
Volt
wt
Wildtyp
APF
Nach Verpuppung (after pupal formation)
6.4 Aminosäure-Kürzel
Aminosäure
3-Buchstaben Code
1-Buchstaben Code
Alanin
Ala
A
Arginin
Arg
R
Asparagin
Asn
N
Aspartat
Asp
D
Cystein
Cys
C
Glutamat
Glu
E
Glutamin
Gln
Q
Glycin
Gly
G
Histidin
His
H
Isoleucin
Ile
I
Leucin
Leu
L
Lysin
Lys
K
Methionin
Met
M
Phenylalanin
Phe
F
Prolin
Pro
P
Serin
Ser
S
112
Anhang
Threonin
Thr
T
Tryptophan
Trp
W
Tyrosin
Tyr
Y
Valin
Val
V
6.5 EAP-Sequenz
1
ATCACAATAG CGAATTAAAA ACAACATTGC AAAGCGAAAA CGCCCTGAAA
M
51
ACAATGATTA TAAAAGCAAT TAGATAGTTA CAAAACGCAT TGAAATGAGC
K
101
H
P
S
L
G
S
W
R
P
T
A
V
A
S
I
Q
P
E
E
R
A
H
F
I
D
D
F
L
S
S
L
I
R
K
Y
V
S
T
C
S
G
L
P
S ·
F
A
R
D
V
R
G
K
P
Y
W
V
K
Y
D
G
P
P
L
S
F
N
V
S
H
Q
V
L
L
A
G
I
A
G
E
S
S
D
P
D ·
I
G
T
D
V
M
K
I
E
Y
N
G
G
K
P
S
E
F
F
G
L
M
K
S
K
F
S
A
E
E
CTCTGTCGGA ATTCTTTGGC CTGATGAAGA GCAAATTTTC GGCGGAGGAA
S
Y
I
G
R
P
H
H
D
E
R
E
Q
V
K
A ·
TGGAGTTATA TTGGAAGACC GCATCATGAT GAACGGGAGC AGGTGAAGGC
M
R
H
W
C
L
K
E
A
Y
V
K
E
L
G
V·
CTTTATGCGT CACTGGTGTC TCAAGGAGGC GTACGTCAAG GAGCTGGGTG
I
T
V
D
L
Q
K
I
S
F
S
V
D
T
T
TTGGCATCAC TGTAGATCTG CAAAAGATCA GCTTCTCAGT GGACACTACT
S
L
E
T
D
V
S
P
L
I
G
T
S
L
R
C ·
CGCAGTTTGG AGACAGATGT TTCCCCTCTG ATCGGTACTA GTCTGCGTTG
. H
751
D
CTTTGGAATC GGCACAGATG TCATGAAGAT CGAGTACAAT GGTGGCAAGC
R
701
Q
F
M
K
D
L
G
.. G
651
F
GGAAGCCTGG TACTTCTAGC GGGCATTGCA GGAGAGAGCA GTGATCCCGA
. F
601
A
AAGGGGAGGA CTACGATGGG CCACCTCTCA GCTTCAATGT CTCCCATCAG
W
551
S
K
F
V
E
.. L
501
L
M
L
E
. F
451
W
GGCCGAAGTG AAGTTCGCCC GGGATGTGAG GGGTAAACCT TACTGGGTGA
G
401
R
GGTCGTCTTT TCATGCGAAA ATATGTGAGC ACGTGCAGCG GATTGCCGTC
.. G
351
Q
L
R
. A
301
T
CTCGGCTTAT GAAGTTCCAC TTTATCGATG ACTTTCTGTC CTCGCTAATT
G
251
C
ACTACCTCAA CTGAGCCAGG CGGTGGCCTC AATTCAACCG GAGGAACGAG
.. R
201
I
AAACACATCT GCACCCGCTG GGCCTTTGAC CTGGGCAGCT GGAGGCCCAC
L
151
S
D
Q
P
M
D
N
W
H
F
E
E
H
L
L
Q
E
CCACGACCAA CCCATGGACA ATTGGCATTT CGAGGAGCAT TTACTGCAGG
113
Anhang
.. D
801
Y
C
A
A
I
A
F
R
N
C
L
P
Q
E
R
AGGACTACTG TGCGGCCATT GCATTCCGGA ATTGCTTGCC ACAGGAGCGT
G
851
K
F
K
F
L
Q
V
E
E
L
L
V
K
S
E
D ·
GGAAAGTTCA AGTTTCTGCA AGTTGAGGAA CTTCTCGTGA AGAGTGAAGA
. S
901
E
L
E
E
V
I
S
Y
C
Q
K
A
L
L
K
P
TTCGGAACTT GAGGAAGTGA TCAGCTACTG CCAAAAGGCT CTTCTTAAGC
.. Y
K
R
S
951
CCTACAAGCG ATCATGATGT ATAGGAACTA TAAGGAATCT AAGCCAAGCA
1001
AACGTAGCTC CTAAAAATAG CGTTATCCCT AGAATAAACA TGCATTTATA
1051
TTTTCTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
1101
AAAA
6.6 Hygromycin Titratrionskurve
7
(x10 )
25
20
Zellen / ml
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tage
0
200
300
400
500
600
800
µg/ml Hygromycin B
114
Anhang
6.7 Lebenslauf
Name:
Arnd Richardt
Geburtstag und Ort:
07.10.1972, Marburg an der Lahn
Familienstand:
ledig
Schulausbildung
Juni
1979
Grundschule Bömberg, Iserlohn
Juni
1983
Juni
1983
Juni
Märkisches Gymnasium, Iserlohn
Abschluss: Abitur
1992
Wehrdienst
Juli
1992
Grundwehrdienst in der Fernspähkompanie 100, Braunschweig
Juli
1993
Hochschulausbildung
WS
1993
Bis
Studium der Biochemie an der Fakultät für Chemie der RuhrUniversität Bochum
SS
1998
Abschluss: Diplom
Nov.
1997
Diplomarbeit mit dem Thema: “Untersuchung der Expression
von FU12 in Drosophila melanogaster durch Epitope-Tagging“
bis
Aug.
1998
an der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum,
Lehrstuhl
Molekulare
Neurobiochemie,
AG
Molekulare
Zellbiochemie, Prof. Dr. Hovemann
115
Anhang
Sept.
1998
Besuch der Summerschool „A new approach to insect olfaction”,
Max-Planck-Institut für Verhaltensphysiologie, Seewiesen
Seit
Nov.
Promotion im Fach Chemie
Thema: „Untersuchungen zur ebony Mutation der Taufliege
1998
Drosophila melanogaster“ an der Fakultät für Chemie der Ruhr-
Universität Bochum, Lehrstuhl Biochemie II, AG Molekulare
Zellbiochemie, Prof. Dr. Hovemann
Weitere Tätigkeiten
Seit
Als
Apr.
1999
Nov.
1998
Apr.
1999
Okt.
1997
Dez
Wissenschaftlicher Mitarbeiter,
Wissenschaftliche Hilfskraft
und
Studentische Hilfskraft der AG Molekulare Zellbiochemie (Prof.
Dr. Hovemann) betraut mir der Betreuung von Praktikanten des
1997
biochemischen Vertiefungspraktikums I , des Praktikums
„Biochemie für Biologen“ und des Biochemie F-Praktikums.
Seit
Okt.
Betreuung und Wartung der Computer und des Netzwerkes der
1997
AG Molekulare Zellbiochemie
116
Anhang
Veröffentlichungen
Richardt, A., et al.; "Ebony protein in the Drosophila nervous system: Optic neuropile expression in glial cells";
J Comp Neurol (2002); 452 (1)
Richardt, A. et al; ”Ebony: a novel nonribosomal peptide synthetase for β-alanine conjugation with biogenic
amines in Drosophila”;
Eingereicht bei: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Abstracts
Richardt, A. ; Ryback, J.; Störtkuhl, K.F., Meinertzhagen, I.A.; Hovemann, B.T.
“The Ebony-protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells”
Proceedings of the 4th Meeting of the German Neuroscience Society 2001; Volume II:503
28th Göttingen Neurobiology Conference, Göttingen, Deutschland, Juni 2001
Kemme, T. ; Richardt, A. ; Hovemann, B. T.
“Functional Analysis of the Ebony-Protein of Drosophila”
Proceedings of the 4th Meeting of the German Neuroscience Society 2001; Volume II:502
28th Göttingen Neurobiology Conference, Göttingen, Deutschland, Juni 2001
Richardt, A., Stoertkuhl, K.F., Ryseck, R.P., Hovemann, B.T.
“The Drosophila ebony gene encodes a peptide synthetase and reveals expression in the optic neuropile of the
fly“
"Abstracts. Sixteenth European Drosophila Research Conference, Zurich, 1999." Europ.Dros.Res.Conf. 16 :116
Zürich, Schweiz, Sept. 1999
Richardt, A., Stoertkuhl, K.F., Ryseck, R.P., Hovemann, B.T.
“The Drosophila ebony gene encodes a peptide synthetase and reveals expression in the optic neuropile of the
fly“
“Abstracts of papers presented at the 1999 meeting on neurobiology of Drosophila”
Heberlein, Keshishian, 1999:171
Cold Spring Harbor, Okt. 1999
Richardt, A. ; Sehlmeyer, F. ; Hovemann, B.T.
“Drosophila Sn-1-Acylglycerol-3-Phosphate (Lysophopsphatidate) Acyltransferase, LPA-AT mutant is affected
in odor perception”
“Proceedings of the 26th Göttinger Neurobiology Conference 1998”, Vol. II:390
Göttingen, Deutschland, Apr. 1998
117

Untersuchungen zur ebony Mutation der Taufliege Drosophila

Transcription

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