Analyse wässriger Zwei-Phasen

Analyse wässriger Zwei-PhasenSysteme
Jörn Pluschke
Matrikelnr.:
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
3
Methoden
Konzentrationsbestimmung über optische Aktivität
4
Dichtebestimmung mit einem Pyknometer
5
Bestimmung des Brechungsindex n mit einem Refraktometer
6
Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration mit dem Biuret-Assay
7
Ergebnisse
Analyse der Stammlösungen
8
Analyse von Dextran /PEG -Systemen
11
Einfluss des pH-Wertes
13
Einfluss von Serumalbumin
14
Einfluss von Biomasse
16
Konstruktion der Binodalen mit der „Cloud Point“-Methode
18
Zusammenfassung und Ausblick
20
Literatur
21
Einleitung
Die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion ist eine weit verbreitete Methode zur
präperativen Proteinaufreinigung. Sobald ein System etabliert ist, lässt sich diese
Methode leicht und ohne komplexes Equipment durchführen. Es lassen sich mitunter
in einem Schritt Zelldebris abtrennen und das Zielprotein aufkonzentrieren.
Aufgrund dieser Eigenschaften sind viele Einsatzmöglichkeiten in der Literatur
hinreichend beschrieben [1]. So sind häufig Enzyme Ziele dieser Aufreinigungen,
aber auch andere Proteine wie Antikörper. Nichtsdestotrotz ist ein großer
kommerzieller Erfolg der wässrigen Zwei-Phasen-Extraktion verwährt.
Dies liegt hauptsächlich an den häufig noch ungeklärten Phänomenen, die bei der
Separation der Proteine auftreten. So werden vielfältige Versuche beschrieben, mit
denen das Verständnis der Verteilung im wässrigen Zwei-Phasen-System vergrößert
werden soll. Der Einsatz von chemisch modifizierten [2] oder floureszenz-markierten
Proteinen [3] wird hierzu herangezogen.
Grundlegende Studien zur Proteinseparation wurden häufig angefertigt und
mathematische Modelle entwickelt [4], [5]; jedoch sind aufgrund der Vielfalt der
möglichen Systeme, sowie der gewünschten Anwendungen eigenen Studien oft
unerlässlich.
Häufig beschriebene und zu untersuchende Parameter sind der Einfluß von pH-Wert
und Salzkonzentrationen [6], [7], das Ansetzen des Systemes aus den einzelnen
Komponenten [7], der Biomasse [8] aber auch der Separationsdauer und deren
Abhängigkeit von der Phasengrenzfläche[9]. Weiterhin wurden hydrophobe
Interaktionen der Proteine [2] und Protein-Polymer-Interaktionen [10] sowie
elektrostatische Potentiale und deren Einflüsse[11] untersucht. Auch sind Versuche,
denen statistische Versuchsplanungen vorausgehen beschrieben [12].
Ziel dieses Projektes ist zunächst analytische Methoden zu etablieren, mit denen
wässrige zwei-Phasen Systeme genau untersucht werden können. Die Einflüsse
einzelner Parameter auf zwei verwendete Systeme sollen ermittelt werden. Des
Weiteren soll ein empirisches Verfahren zur Aufnahme einer Binodale etabliert
werden.
3
Methoden
Konzentrationsbestimmung über optische Aktivität
Für eine genaue Bestimmung der Konzentration des Dextrans in den einzelnen
Phasen der wässrigen zwei Phasen Extraktion, sowie in der Stammlösung, bietet sich
die Messung der optischen Aktivität mit einem Polarimeter an
Gerade beim Ansetzen von Dextran-Stammlösungen ist gängiges Problem, trotz
genauer Einwaage, eine zu geringe Konzentration zu erzielen. Dies ist in einer leicht
hygroskopischen Wirkung des Dextrans begründet. Im Allgemeinen kann
angenommen werden, dass ca. 10 % Wasser eingelagert werden. Daher muss zum
Ansetzen der Dextran-Stammlösung dieser Wasseranteil ausgeglichen werden. Eine
genaue Konzentrationsbestimmung über ein Polarimeter ist daher unbedingt nötig.
Ein Polarimeter besteht aus einer monochromatischen Lichtquelle, z.B. einer
Natriumdampflampe, die Licht in einer Wellenlänge von 459 nm emittiert und deren
Licht in einem Nicolschen Prisma polarisiert wird. Das polarisierte Licht tritt durch
eine Küvette mit enthaltener Probe hindurch, wobei es bei optisch aktiven
Substanzen zur Drehung der Lichtachse kommt. Diese lässt sich mit Hilfe eines
zweiten, drehbaren Nicolschen Prismas detektieren und durch die Verbindung zu
einer graduierten Skala analysieren. Dabei muss das durch ein Okular beobachtete
dreiteilige Sichtfeld über die Drehung des Analysatorprismas auf gleichmäßige
Dunkelheit gebracht werden. Auf der Skala kann nun der Drehwinkel φ abgelesen
werden.
Abb. 1: Schematischer Aufbau und Messprinzip eines Polarimeters [15]
4
Aus dem gemessenen Winkel φ kann die Probenkonzentration [Pv] (in w/v) mit Hilfe
der optischen Weglänge l und der spezifischen Rotation des Dextran α bestimmt
werden.
[Pv ] =
φ
l⋅α
(1)
Eine genauere Methode ist die Bestimmung der Konzentration [Pw] als Massenkonzentration über die Dichte ρ,
ρ = 0 ,391 ⋅
[Pv ] + 0 ,997
(2)
100
und die Volumenkonzentration [Pv]
[Pw ] = [Pv ]
(3)
ρ
berechnet werden.
Durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor f, wird die Konzentration der
Stammlösung aus einer verdünnten Lösung Dextran bestimmt.
β( w / w ) = [Pw ] ⋅ f
(4)
Eine Bestimmung der Dichte, z.B. mit einem Pyknometer, kann ebenfalls für die
Berechnung verwendet werden. In diesem Fall würde der experimentell ermittelte
Wert der Dichte in Gleichung (3) benutzt [13].
Dichtebestimmung mit einem Pyknometer
Das Pyknometer dient zur Darstellung eines präzise wiederholbaren Volumens von
Flüssigkeiten. Nach Wägung des leeren und des gefüllten Pyknometers kann die
Dichte der Befüllung errechnet werden.
ρ=
m2 − m0
⋅ ρ H2O
m1 − m0
(5)
5
Hierbei ist m0 das Leergewicht, m1 und m2 das Gewicht des mit Wasser respektive
Analyten befüllten Pyknometers. Mit ρ H 2 O ist die Referenzdichte des Wassers bei
20°C gegeben.
Für alle Messungen ist die exakte Temperatur wichtig, das heißt alle Flüssigkeiten,
sowie das Pyknometer selbst, müssen eine Temperatur von 20 °C haben.
Nach der Aufnahme des Leergewichtes wird das Pyknometer mit dem Analyten bis
über die Schliffkante befüllt. Anschließend wird der Deckel mit der Kapillare
aufgesetzt, durch die das überflüssige Volumen heraustritt. Dieses muss entfernt
werden, danach kann das Pyknometer erneut gewogen werden.
Abb. 2: Ein Pyknometer mit einem definierten Volumen von 50 cm³ [16]
Bestimmung des Brechungsindex n mit einem Refraktometer
Mit einem Abbe-Refraktometer wird die Brechzahl n einer Flüssigkeit bestimmt, aus
der sich Rückschlüsse über eine lineare Beziehung zur Konzentration des zu
untersuchenden Stoffes ziehen lassen.
Die Brechzahl beschreibt die Brechung des Lichtes an der Phasengrenze zweier
Medien. Je höher die Brechzahl, desto stärker ist die Ablenkung des Lichtes. Eine
verstärkte Brechung des Lichtes tritt beim Übergang des Lichtstrahles in „optisch
dichteren“ Medien auf. Die Brechzahl von Wasser bei einer Temperatur von 20 °C
beträgt 1,33.
Der Zusammenhang zwischen Konzentration eines Stoffes in Lösung und der
Brechzahl kann mit Hilfe eines Abbe-Refraktometers ermittelt werden.
Das nach dem deutschen Physiker benannte optische Messgerät ist aus zwei
Kristallprismen, zwischen die ein dünner Flüssigkeitsfilm des Analyten aufgetragen
wird, einem Temperiersystem, sowie einer Lichtquelle und, sofern diese nicht
monochromatisch ist, einem optischen Filter aufgebaut.
6
Der Analyt wird wie schon beschrieben zwischen die 2 Prismen aufgetragen und
durch das Okular wird im Sichtfeld die Phasengrenze auf das Strichkreuz eingestellt.
Die Brechzahl kann somit abgelesen werden.
Abb. 3: Darstellung eines Abbe-Refraktometers mit dazugehörigem Sichtfeld [17]
Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration mit dem Biuret-Assay
Der Biuret-Assay ist ein einfacher Test zum Nachweis von Gesamtproteinkonzentrationen. Hierbei bilden Verbindungen mit mehreren Peptidbindungen einen
Komplex mit zweiwertigem Kupfer. Anschließend wird in einer weiteren Reaktion
zweiwertiges Kupfer durch ein alkalisches Reaktionsmedium, dem sogenannten
Enhancer, zu einwertigem Kupfer reduziert. Dies resultiert in einem pupurfarbenen
Farbumschlag durch den Kupferkomplex. Eine photometrische Bestimmung des
Proteingehaltes erfolgt somit bei einem Absorptionsmaximum von 503 nm.
Die Messung erfolgt gegen eine Standardkurve mit bovinen Serumalbumin (BSA) in
einem Konzentrationsbereich von 5 – 2000 µg∙mL-1.
Dieser Test ist relativ unspezifisch und eignet sich für eine große Bandbreite von
Proteinen.
Als Testkit wurde das Roti-Quant universal (Best. Nr. 0120.2) der Firma Carl-Roth
verwendet.
7
Ergebnisse
Analyse der Stammlösungen
Eine genaue Untersuchung der Stammlösungen für die wässrige Zwei-PhasenExtraktion ist unbedingt nötig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Sind
keine Informationen über das verwendete System bekannt, ist es wichtig definierte
Bedingungen zu haben, um das System genau beschreiben zu können.
Das Hauptaugenmerk der Analyse ist dabei das Dextran500, aufgrund der
Eigenschaft, leicht hygroskopisch zu sein und zusätzlich circa 10 % des eigenen
Gewichtes an Wasser einzulagern.
Zur Herstellung von 100 g einer 20 %igen (w/w) Stammlösung Dextran500 müssen
theoretisch 20 g Dextran eingewogen werden und in 80 g VE-H2O gelöst werden.
Die Analyse dieser Stammlösung führte, nach Verwendung der Messung am
Polarimeter mit einer 2 dm Messküvette und einer 1:4 Verdünnung, zu einem
Drehwinkel von 17,6°. Die spezifische optische Aktivität des Dextrans beträgt
1,99° /(dm∙g/100mL). Daraus ergibt sich eine volumetrische Konzentration von
4,42 g/100 mL.
[Pv ] =
g
φ
17 ,6°
=
= 4 ,42
°
l ⋅ α 2dm ⋅ 1,99
100 mL
(dm ⋅ g / 100 mL)
Mit dem Pyknometer konnte eine Dichte von 1,01419 g/mL bestimmt werden. Somit
kann die Massenkonzentration über
g
4 ,42
100 mL
[Pw ] = [Pv ] =
g
ρ
1,01419
= 4 ,36
g
100g
mL
berechnet werden. Es ergibt sich eine Massenkonzentration von 4,36 g/100g.
Durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor f, in diesem Fall betrug dieser 4,
wird die absolute Massenkonzentration errechnet.
β( w / w) = [Pw ] ⋅ f = 4 ,36
g
g
⋅ 4 = 17 ,44
100g
100g
8
In diesem Fall ist die Konzentration der Stammlösung deutlich zu niedrig. Dies ist
eine eindeutige Fehlerquelle bei der Verwendung von Dextran-Systemen.
Aufgrund dieses Ergebnisses werden Dextran-Stammlösungen schon von vornherein
um 10% aufgestockt, das heißt 22 g Dextran500 werden in 100 g VE-H2O gelöst.
Die Überprüfung dieses Vorgehens für die Messung einer unverdünnten DextranStammlösung brachte reproduzierbar folgendes Ergebnis:
[Pv ] =
g
φ
88 ,1°
=
= 22 ,135
°
l ⋅ α 2dm ⋅ 1,99
100 mL
(dm ⋅ g / 100 mL)
g
100 mL = 20 ,39 g
[Pw ] = [Pv ] =
g
ρ
100g
1,08559
mL
22 ,135
Hierbei zeigt sich eine deutlich verbesserte Genauigkeit für die Herstellung einer
20 %igen Dextran500 Stammlösung. Anhand der oben beschriebenen Stammlösung
wurde
eine
Verdünnungsreihe
angefertigt
und
diese
hinsichtlich
des
Brechungsindex im Refraktometer analysiert. Dabei ist ein linearer Zusammenhang
zwischen Konzentration und Brechungsindex zu erkennen.
Abb. 4: Darstellung des linearen Zusammenhanges von der Massenkonzentration des Dextran500 und dem
Brechunsindex ∆n
9
Im Vergleich zu Dextran-Stammlösungen neigen Polyethylenglykol-Lösungen nicht
zu einer Einlagerung von Wasser. Daher müssen die Konzentrationen in den
Stammlösungen nicht weiter überprüft werden. Jedoch ist es für die Analytik von
wässrigen 2-Phasen-Systemen mit PEG hilfreich, wenn eine Kennlinie für die
Konzentrationen und die dazugehörigen Brechungsindices vorliegt.
Abb. 5: Darstellung des linearen Zusammenhanges von der Massenkonzentration des PEG1500 und dem
Brechunsindex ∆n
Anhand der sehr ähnlichen Werte für die Steigung und den Achsenabschnitt lässt
sich eine Konzentrationsberechnung für Dextran500 bzw. Polyethylenglykol 1500
aus einer Mischlösung der beiden Komponenten praktisch nicht durchführen.
10
Analyse von Dextran/PEG - Systemen
Die Verwendung von Dextran/PEG-Systemen ist weit verbreitet. Dieses ZweiPolymer-System eignet sich hervorragend zur Abtrennung von Zellen und
Zelldebris.
Das
Ziel
dieser
Analytik
war
eine
möglichst
genaue
Beschreibung
des
Dextran500/PEG1500-Systemes, da detaillierte Angaben über die Vermischung der
Phasen nicht vorliegen. Diese Angaben sind von großer Wichtigkeit um eine
optimale Trennung der Phasen und damit verbunden, eine optimale Verteilung des
Zielproteins zu erreichen.
Zur Analyse wurden ein 15% PEG1500 / 8% Dextran500 (System 1) und ein 20%
PEG1500 / 8% Dextran500 (System 2) herangezogen. Diese Systeme sind jeweils so
gewählt, dass die Phasenkomposition ausreichend von der Binodale entfernt ist und
sich somit eine gute Phasentrennung ausbildet.
Eine stärkere Vermischung der einzelnen Komponenten in den Phasen des 15%
PEG1500 / 8% Dextran500 - System ist dabei zu erwarten, was sich unter anderem
auch aus der Tie-Line-Länge ablesen lässt. Je kürzer die Tie-Line ist, desto stärker ist
die Vermischung der Phasen im System.
Die zu untersuchenden Parameter sind zum einen die Dextrankonzentration in Topund Bottom-Phase, bestimmt über die optische Aktivität, sowie die Dichte und zum
anderen die Brechungsindices der Phasen.
Um ein solches System herzustellen, müssen die Einwaagen der einzelnen
Komponenten berechnet werden. Als Stammlösungen lagen 20% Dextran500 und
40% PEG1500 vor.
Für die Herstellung eines 50g 15% PEG1500 / 8% Dextran500 - Systems wird
zunächst die nötige Masse an Dextran500 berechnet.
m Dx 500 =
β Dx 500 w ⋅ m System
β Dx 500Stammlsg
=
8% ⋅ 50g
= 20g
20%
Dabei ist βDX500w die gewünschte Konzentration im System, βDX500Stammlsg die
Massenkonzentration der Stammlösung, mDx500 die Einwaage in Gramm und mSystem
die Masse des Gesamtsystems.
11
Anschließend wird die Einwaage des PEG1500 ermittelt.
m PEG1500 =
β PEG1500 w ⋅ m System
β PEG1500Stammlsg
=
15% ⋅ 50g
= 18 ,75g
40%
In der Summe wiegen diese beiden Komponenten 38,75g. Die restlichen 11,25g
werden mit 0,1M K2HPO4/KH2PO4 Puffer aufgefüllt.
Nach Vermischung der Phasen durch starkes Vortexen des Falcontubes, wird das
System bei 20°C für 20 Minuten bei 2500 x g zentrifugiert.
Analog ist das Vorgehen für das 20% PEG1500 / 8% Dextran500 – System; die
Einwaagen betragen:
mDX500
= 20g
mPEG1500
= 25g
mPuffer
= 5g
Anschließend wird zunächst die volumetrische Verteilung der Phasen betrachtet.
Hier lassen sich schon erste Rückschlüsse ziehen, wie stark die Phasen voneinander
getrennt sind. Ist die Bottom-Phase relativ groß, wird eine weniger ausgeprägte
Phasentrennung vorliegen und eine stärkere Vermischung mit PEG1500 kann
erwartet werden. Im Vergleich kann leicht erkannt werden, dass die Bottom Phase
im Sysem 1 ein deutlich größeres Volumen aufweist als Selbige im System 2.
Die weitere Analytik, insbesondere die Untersuchung mit dem Polarimeter gibt
einen deutlichen Aufschluss über die Verteilung von Dextran im Gesamtsystem.
Hierbei ist in der Bottom Phase des System 2 mit 26,48%(w/w) Dextran deutlich
niedriger konzentriert als die Bottom Phase des System 1 (32,99%(w/w)). Ein
umgekehrtes Verhalten der Dextran-Konzentration ist in der Top-Phase der Systeme
zu erkennen, was die stärkere Vermischung im System 1 deutlich macht.
Tabelle 1: Phasenzusammensetzungen nach Durchmischung und Zentrifugation eines 15% PEG1500/8%
Dextran500-Systems
Top Phase
15% PEG 1500/
8% Dextran 500
Bottom Phase
35
Volumen [mL]
11.7
1.3599
Brechungsindex n
1.3895
0.65°
Optischer Drehwinkel
12.05°
1.0304
Dichte
1.11434
0.16
βDextran500 (w/w) [%]
26.48
12
Tabelle 2: Phasenzusammensetzungen nach Durchmischung und Zentrifugation eines 20% PEG1500/8%
Dextran500-Systems
20% PEG 1500/
Top Phase
Bottom Phase
8% Dextran 500
39
Volumina [mL]
8
1.3679
Brechungsindex n
1.406
0.25°
Optischer Drehwinkel
15.65°
1.04
Dichte
1.1919
0.06
βDextran500 (w/w) [%]
32.99
Einfluss des pH-Wertes
In diesem Versuch sollte der Einfluss vom pH-Wert auf ein PEG/Dextran-System
makroskopisch untersucht
werden.
Ein
Einfluss dieses Parameters ist
in
PEG/Phosphat- und PEG/Dextran-Systemen in der Literatur hinreichend beschrieben
[6], [7]. Wie stark Einfluss des pH-Wertes auf ein PEG/Dextran-System mit jeweils
geringeren Molekulargewichten ist, geht dabei nicht hervor. Hierfür wurden zu
einem 15% PEG1500 / 8% Dextran500-System Pufferlösungen mit verschiedenen pHWerten von pH 3 bis pH 9 hinzugegeben.
Einen makroskopischen Einfluss kann man jedoch dabei nicht erkennen.
Wenn die Volumina der einzelnen Phasen ins Verhältnis zum Gesamtvolumen der
Systeme gebracht werden, werden die Ergebnisse noch deutlicher.
Tabelle 3: Volumetrische Zusammensetzung eines 15% PEG1500/8% Dextran500-Systems mit verschiedenen
pH-Werten
pH
3
5
7.5
9
Vges [mL]
Vtop [mL]
Vbottom [mL]
14.25
10.65
3.6
14.5
11
3.5
14.25
10.55
3.7
14.3
11
3.3
Vtop [mL]
Vbottom [mL]
0.75
0.25
0.76
0.24
0.74
0.26
0.77
0.23
Hinsichtlich der Stabilität des Systems gegenüber pH-Schwankungen kann man von
einem sehr stabilen System sprechen. Eine Änderung des pH-Wertes hat
makrospkopisch keine Auswirkungen auf die volumetrische Phasenkomposition.
Weitere Versuche bezüglich des Verteilungskoeffizienten für eine Proteinseparation
13
sowie eine genaue Analytik der einzelnen Phasenkompositionen sind hier
empfehlenswert.
Einfluss von Serumalbumin
Die Untersuchung eines wässrigen 2-Phasen-Systems auf den Einfluss einer
hochkonzentrierten Proteinlösung ist interessant, weil sich daraus zum einen
Informationen über die Verteilung des Proteins in den Phasen ableiten lassen und
zum anderen können eventuell auftretende Überladungseffekte untersucht werden.
Für die Auftrennung reiner Proteinlösungen werden häufig PEG/Phosphat-Systeme
verwendet, deshalb wird die Untersuchung an einem 10% PEG 1500 / 10% PhosphatSystem durchgeführt.
Als Protein wurde hierfür Serumalbumin gewählt und in einer maximalen
Konzentration von 40 g∙L-1 angesetzt.
Die Zusammensetzungen der zu analysierenden 50 g - Systeme waren wie folgt:
Tabelle 5: Komposition eines 10% PEG1500/ 10% Phosphat-Systems mit dazugehörigen Einwaagen für die
Proteinzugabe
System
βPEG
βPhosphat
mPEG [g]
mPhosphat [g]
mBSA-Lösung [g]
mBSA [mg]
mPuffer
βBSA
1
10 %
10 %
12.5
20
17.5
700
0
0.014
2
10 %
10 %
12.5
20
6.5
260
11
0.0052
3
10 %
10 %
12.5
20
12.5
125
5
0.0025
4
10 %
10 %
12.5
20
7.5
75
10
0.0015
Nach Vermischen der Suspensionen und Zentrifugation für 20 Minuten bei 20 °C
und 2500 g zeigte sich bei der Betrachtung der Phasenvolumina kein Unterschied.
Alle Systeme wiesen eine Bottom Phase von 31 mL und eine Top Phase von 12 mL
auf.
14
Abb.6: Ausbildung einer Interphase an der Phasengrenzfläche; die zugegebene Proteinmenge steigt von links
nach rechts an
Auffällig war hierbei eine Ausbildung einer Interphase. Dieses Phänomen ist in der
Literatur beschrieben und tritt bei hohen Proteinkonzentrationen verstärkt auf [14].
Es bildet sich eine Schicht aus trübem, flockigem Material, dass auf der
Phasengrenzfläche erscheint. Dabei präzipitieren Proteine aufgrund von Oberflächenspannungseffekten an der Phasengrenzfläche. Die Interphase kann nur
schlecht oder kaum resolubilisiert werden und beeinträchtigt dadurch die
Wiederfindung des Zielproteins im System.
Die Verteilung des Serumalbumins in den einzelnen Phasen kann über die
Konzentrationsbestimmung mit dem Biuret-Assay und die Volumina errechnet
werden.
Tabelle 6: Berechnete Proteinmassen in den einzelnen Phasen mit dazugehöriger Wiederfindung, sowie
Verteilungskoeffizient K und Verteilungsbreite G
System
1
2
3
4
mBSA [mg] (Top Phase)
5.34
3.52
2.98
2.59
mBSA [mg] (Bottom Phase)
395.03
162.33
110.10
65.59
mBSA [mg] (Gesamtsystem)
400.37
165.85
113.08
68.18
Recovery [%]
57.20
63.79
90.46
90.90
K
1.35E-02
2.17E-02
2.70E-02
3.94E-02
G
5.24E-03
8.40E-03
1.05E-02
1.53E-02
15
Hierbei zeigt sich, dass mit erhöhter Probenkonzentration die Wiederfindung des
Proteins abnimmt. Dies hängt mit großer Sicherheit mit der Ansammlung des
Serumalbumins in der Zwischenphase zusammen.
Dennoch ist der Verteilungskoeffizient K, sowie die Verteilungsbreite G im System 1
am niedrigsten, was eine stärkere Verteilung in die untere Phase des Systems
bedeutet, als den anderen wässrigen 2-Phasensystemen. Dennoch zeigt sich, dass
eine Beladung des Systems mit einer hohen Proteinkonzentration kritisch zu
betrachten ist.
Einfluss von Biomasse
In diesem Versuch soll untersucht werden, inwiefern die Biomasse einen Einfluss auf
das PEG1500/Dextran500-System hat. Das Hauptaugenmerk soll dabei auf die
Anordnung der Biomasse gelegt werden, ob eine Verteilung in die untere Dextranhaltige Phase durch Zentrifugation oder durch Verteilungseffekte statt findet. Auch
das Verteilungsverhalten in einem PEG/Phosphat-System wurde untersucht.
In der Literatur ist beschrieben, dass Biomasse im System Veränderungen der
Binodale, in Form einer Verschiebung in Richtung des Koordinatenursprungs,
hervorruft. Dies wäre gleichbedeutend mit einer, im Vergleich zum gleichen System
ohne Biomasse, verbesserten Phasentrennung, was mit einer erhöhten
Phasengrenzflächenspannung eingeht. Ob Zellen an dieser Phasengrenze nun
ausfallen soll unter anderem untersucht werden.
Es wurden verschiedene Systeme beider Arten mit je 1000 mg Zellen beladen. Als
Ausgangslösung für diesen Versuch diente eine 500 g∙L-1 Hefesuspension die frisch
angesetzt wurde. Die verwendeten Systeme waren 15% PEG1500/ 8% Dextran500,
15% PEG1500/ 4% Dextran500, 10% PEG1500/ 10% Phosphat und 10% PEG1500/ 7,5%
Phosphat.
Tabelle 7: Phasenkompositionen und Einwaagen der Biomasse
PEG [%]
Dextran [%]
m_PEG [g]
m_Dextran [g]
m_Zellen [mg]
15
8
5.625
6
1000
15
4
5.625
3
1000
PEG [%]
PO4 [%]
m_PEG [g]
m_PO4 [g]
m_Zellen [mg]
16
10
10
3.75
6
1000
10
7.5
3.75
4.5
1000
Die Systeme wurden gut vermischt und bei 2500 x g für 15 Minuten zentrifugiert.
In PEG1500/Phosphat-Systemen zeigte sich der erwartete Effekt der erhöhten
Schwerkraft durch das Zentrifugieren; es bildet sich ein Pellet in der unteren,
Phosphat-haltigen, Phase. Die Bottomphase ist jedoch auch deutlich eingetrübt,
während die obere Polyethylenglykolreiche Phase gelblich gefärbt ist. Außerdem
zeigte sich im 10% PEG/ 10% Phosphat-System eine deutliche Ablagerung von Zellen
an der Phasengrenzfläche. Dies hängt, wie schon bei der Proteinzugabe beobachtet,
mit der Oberflächenspannung an der Phasengrenzfläche zusammen. Auch hier kann
von der Ausbildung einer Interphase gesprochen werden.
Bei der Wiederholung dieser Versuche unter gleichen Vorraussetzungen, aber einer
Trennung der Phasen im Erdschwerefeld war der Effekt des Eintrübens der
Bottomphase und der Bildung einer Zwischenphase noch deutlicher geworden. Es ist
anhand der Bilder deutlich erkennbar, dass die Zellen auf der Phasengrenzfläche
aufliegen und nur in verringertem Maße in die untere Phase eindringen.
a)
b)
c)
Abb. 7: a) 10%PEG/10%Phosphat-System nach Zentrifugation, deutlich erkennbar sind Zellen an der
Zwischenphase und im Pellet b) 10%PEG/7,5%Phosphat-System nach Zentrifugation mit Pellet und
kaum wahrnehmbarer Zwischenphase c) Vergleich der beiden vorherigen System-kompositionen
nach Separation im Erdschwerefeld; deutlich sichtbar ist die geringere Vermischung im
10%PEG/10%Phosphat-System (links)
Bei der Analytik der PEG/Dextran-Systeme mit Zentrifugation nach Zellzugabe lies
sich keine Aussage über die Beschaffenheit der unteren (Dextran-)Phase machen.
17
Alle Zellen sind dort anzufinden und teilweise ist ein deutlicher Volumenzuwachs
ersichtlich gewesen. Die Analytik im Erdschwerefeld lies auch kaum mehr
Erkenntnisse zu. Lediglich eine leichte Trübung der Topphase war erkennbar.
Konstruktion der Binodalen mit der „Cloud Point“-Methode
Um mit einem wässrigen Zwei-Phasen-System arbeiten zu können, benötigt man
eine Binodale. Diese Binodale zeigt genau die Punkte an, in denen eine
Phasentrennung des Systems zu erwarten ist. Man kann eine Binodale unter
Verwendung der „Cloud Point“-Methode konstruieren.
Wie der Name andeutet, beruht die Methode auf der Eintrübung der Flüssigkeiten
im wässrigen Zwei-Phasen-System, was ein eindeutiges Anzeichen für eine
stattfindende Phasentrennung ist.
Hierfür wird zunächst ein definiertes Gewicht eines der beiden Komponenten des
Zwei-Phasen-Systems aus seiner Stammlösung vorgelegt, zum Beispiel Dextran.
Anschließend wird tropfenweise und unter ständigem Vermischen die zweite Phase
(z.B. Polyethylenglycol) aus einer Stammlösung in das System gebracht. Sobald sich
die Flüssigkeit eintrübt und eine milchige Farbe annimmt, ist der Cloud Point
erreicht. Man kann die Trübung unter Verwendung eines Falconröhrchens, anhand
der Sichtbarkeit der Skalierung für das Volumen des Röhrchens, gut erkennen. Es
wurde auch beobachtet, dass sich die Lösung nach ca. 10 bis 30 Sekunden erst
eintrübt. Diese Wartezeit ist durchaus empfehlenswert. Das Gewicht der
zugegebenen Komponente muss notiert werden.
Nun wird Wasser oder niedrig konzentrierter Puffer (z.B. 50 mM Phosphatpuffer,
pH 7,5) unter ständigem Mischen tropfenweise zugegeben bis sich die Lösung
wieder geklärt hat. Das Gewicht des zugesetzten Puffers muss ebenfalls notiert
werden.
Nachfolgend sind diese Schritte zu wiederholen.
Besonders die Anfangspunkte der Binodale sind schwierig zu erkennen, da bereits
kleine Zugaben der Komponenten eine sofortige Trübung des wässrigen ZweiPhasen-Systems bewirken und große Volumina des Puffers nötig sind um die
Lösung wieder zu klären. Dadurch ist die Auflösung in diesen Bereichen sehr
schlecht.
Hier
bietet
es
sich
an,
mehrere
Versuche
mit
verschiedenen
Anfangskonzentrationen der vorgelegten Komponente zu beginnen; zum Beispiel
20 %, 17,5 %, 15 % und 12,5 % Dextran.
18
Abb. 8: Binodale für ein PEG1500/Dextran, aufgenommen mit der Cloud-Point-Methode
Wichtig bei der Konstruktion der Binodalen ist die Temperatur. Geringe
Veränderungen um 1 bis 2 °C können den Verlauf der Binodale schon erheblich
verändern. Daher sollte unbedingt auf eine möglichst konstante Umgebungstemperatur, auch beim Ansatz der Systeme, geachtet werden. Der Einfluss einer
leicht erhöhten Umgebungstemperatur ist in Abb. 8 zu erkennen.
Abb. 9: Binodale für ein PEG1500/Phosphat-System, aufgenommen mit der Cloud-Point-Methode
19
Zusammenfassung und Ausblick
Die Messmethoden zur genauen Untersuchung eines wässrigen Zwei-PhasenSystems wurden etabliert. Eine schnelle und reproduzierbare Analyse von
PEG/Dextran-Systemen sowie der Stammlösungen, insbesondere von Dextran, ist
nun möglich. Verschiedene Einflüsse auf die Systeme wurden untersucht, jedoch
zunächst nur makroskopisch. Eine genauere Analyse mit den beschriebenen
Messmethoden kann fortführend vorgenommen werden.
Die Cloud-Point-Methode wurde etabliert und kann nun für verschiedene Systeme
verwendet werden. Denkbar ist ein Einsatz verschiedener Polymere, um auch
kostengünstigere Systeme im Vergleich zu Dextran basierten Systemen zu
verwenden.
Es traten jedoch auch einige Probleme auf. Zum Beispiel ist die 25%ige PhosphatStammlösung bei einem pH-Wert von 7,5 sehr instabil gewesen und ist oft
auskristallisiert. Der Ansatz einer hochkonzentrierten Salzstammlösung ist in der
Literatur nie genau beschrieben, auch nie ob die Massenkonzentration sich auf das
Phosphat oder auf die Salzeinwaage als ganzes bezieht.
Bei der Verwendung von Dextran kam es zu vielen Problemen mit der hohen
Viskosität. Die Analytik, insbesondere mit dem Polarimeter, wurde dadurch
erschwert.
Weiterführende Untersuchungen sind noch definitiv nötig um eine reproduzierbare
Verwendung
verschiedener
Systeme
für
ermöglichen.
20
die
diversen
Anwendungen
zu
Literatur
[1] Rito-Palomares, M – Practical application of aqueous two-phase partitioning to
process development for the recovery of biological products; Journal of
Chromatography B, 807 (2004) 3-11
[2] Franco, TT; Andrews, AT; Asenjo JA – Use of chemically modified proteins to
study the effect of a single protein on partitioning in aqueous two-phase
systems: effect of surface hydrophobicity; Biotechnology and Bioengineering, 49
(1996) 300-308
[3] Lebreton, B; Lyddiatt, A – Application of aqueous two-phase partition to the
production of homogeneous preparations of fluorescently labelled human
serum albumin; Journal of Chromatography B, 743 (2000) 263-269
[4] Baskir, JN; Hatton, TA; Suter, UW – Protein partitioning in two-phase aqueous
polymer systems; Biotechnology and Bioengineering, 34 (1989) 541-558
[5] Diamond, AD; Hsu, JT - Fundamental studies of biomolecule partitioning in
aqueous two-phase systems; Biotechnology and Bioengineering, 34 (1989) 10001014
[6] Gündüz, U; Korkmaz, K – Bovine serum albumin partitioning in aqueous twophase system: effect of pH and sodium chloride concentration; Journal of
Chromatography B, 743 (2000) 255-258
[7] Rito-Palomares, M; Hernandez, M – Influence of system and process parameters
on partitioning of cheese whey proteins in aqueous two-phase systems; Journal
of Chromatography B, 711 (1998) 81-90
[8] Rito-Palomares, M; Cueto, L – Influence of system and process parameters on
partitioning of cheese whey proteins in aqueous two-phase systems; Journal of
Chromatography B, 743 (2000) 5-12
[9] Solano-Castillo, C; Rito-Palomares, M – Kinetics of phase separation under
different process and design parameters in aqueous two-phase systems; Journal
of Chromatography B, 743 (2000) 195-201
[10] Farruggia, B; Nerli, B; Picó, G – Study of the serum albumin-polyethylenglycol
interaction to predict the protein partitioning in aqueous two-phase systems;
Journal of Chromatography B, 798 (2003) 25-33
[11] Haynes, CA; Carson, H; Blanch HW; Prausnitz, JM – Electrostatic potentioals
and protein partitioning in aqueous two-phase systems; AlChE Journal, Vol 37,
No. 9 (1991)
[12] Gündüz, U – Partitioning of bovine serum albumin in aqueous two-phase
systemoptimization of partition coefficient; Journal of Chromatography B, 743
(2000) 259-262
[13] Albertsson, PA – Partition of cell particles and macromolecules, 3rd ed. (Wiley,
New York, 1986)
[14] Bamberger S – Preparation of phase systems and measurement of their
physicochemical properties; Partitioning in aqueous two-phase systems (1985)
[15] http://www.creation-science-prophecy.com/amino/polarimeter.gif
21
[16] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/thumb/8/89/Pyknometer.jpg/180pxPyknometer.jpg
[17] http://www.falk-schuch.de/ocprsc/neu-9.gif
22