2D Elektrophorese: Analyse komplexer
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2D Elektrophorese: Analyse komplexer
FORSCHUNGSARBEITEN / RESEARCH ACTIVITIES 2010 2D ELEKTROPHORESE – ANALYSE KOMPLEXER PROTEINGEMISCHE 2D ELECTROPHORESIS – ANALYSIS OF COMPLEX PROTEIN MIXTURES Hintergrund Anwendung in aktuellen Projekten Die Proteomforschung befasst sich mit der Identifizierung und Die 2D DIGE-Technik wird zur Charakterisierung pflanzlicher Quantifizierung von Proteinen aus komplexen biologischen und tierischer Zellzustände angewendet. So wird z. B. nach Systemen unterschiedlicher Größenordnungen. So kann das Biomarkern für die positive Wirkung von biologisch aktiven Proteom einer einzelnen Zellorganelle von Interesse sein, ge- Chemikalien („Bioregulatoren“) auf gestresste Pflanzen nauso aber das einer ganzen Zelle, das einzelner Pflanzenorga- gesucht. In Experimenten mit Salz- und Trockenstress konnte ne oder ganzer Pflanzen. Eine leistungsfähige hochauflösende nach Behandlung mit einer Kombination aus zwei Bioregulato- Technik zur Auftrennung und Visualisierung dieser komplexen ren eine stark erhöhte Überlebensrate der gestressten Pflanzen Proteingemische ist die zweidimensionale (2D)-Elektrophorese. beobachtet werden. Auf Proteomebene ließ sich mit Hilfe Sie besteht aus einer isoelektrischen Fokussierung (IEF), bei der 2D DIGE-Technik eine signifikante Hochregulation von 25 der die Proteine in der ersten Dimension entsprechend ihres Proteinen für salzgestresste Pflanzen und von 29 Proteinen isoelektrischen Punktes aufgetrennt werden und einer SDS- für trockengestresste Pflanzen detektieren. Ein Großteil der Elektrophorese, die in der zweiten Dimension eine Trennung identifizierten Proteine ist an Vorgängen der Photosynthese nach der Masse der Proteine ermöglicht. beteiligt. In der quantitativen Proteomforschung wird nach signifikanten Parallel wird die Methode für den Vergleich von antikörper- Unterschieden der Expressionsmuster von Proteinen in Abhän- produzierenden CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen mit gigkeit verschiedener Faktoren, wie z. B. abiotischem Stress unterschiedlich hoher Produktivität verwendet. Das Ziel ist die oder Mutationen, gesucht, um dadurch komplexe Vorgänge Identifizierung molekularer Marker, die charakteristisch sind besser verstehen zu können. Desweiteren sind Vergleiche zwi- für hoch produzierende Zellen. schen zwei Zuständen wie gesundem und krankem Gewebe hilfreich zur Identifizierung spezifischer Marker, die eine Klassifizierung biologischer Proben erlauben. Methodik Am Fraunhofer IME werden Proteom-Analysen mit Hilfe der „Difference-in-gel-electrophoresis” (DIGE)-Technik durchgeführt. Dabei werden zwei zu vergleichende Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und auf Figure 1: 2D DIGE workflow: Samples from two states are labeled demselben 2D Gel getrennt. Die Fluoreszenzbilder der un- with different fluorescent dyes and separated in one gel. Protein terschiedlichen Proben eines Gels werden mit einem Scanner expression values are calculated and compared to identify upregu- aufgenommen und mit Hilfe einer Analyse-Software bearbei- lated and downregulated protein spots. tet und analysiert. Das Verhältnis der Expression eines jeden Proteinspots zwischen den beiden Proben wird berechnet – abgesichert durch statistische Methoden. Zur Identifizierung der Proteine werden die Proteinspots von Interesse aus dem Gel ausgeschnitten und per Massenspektrometrie analysiert. 46 I 47 F2 F3 Background Application in current projects One of the major aims of proteomic research is to identify The 2D DIGE technique is currently being applied in the ana- and quantify proteins expressed in complex biological lysis of animal and plant cells in a variety of contexts. For systems, including organelles, cells, organs and whole plants. example, we are searching for biomarkers that characterize Two-dimensional electrophoresis (2DGE) is a powerful, high- the positive influence of biologically active chemicals (“bio- resolution separation technique for the visualisation of these regulators”) on stressed plants. Plants subjected to salt and complex protein mixtures. The proteins are separated in the drought stress that were treated with a combination of two first dimension by isoelectric focusing (IEF) according to their bioregulators showed a significant increase in fitness. DIGE isoelectric point, and in the second dimension by SDS gel revealed the significant upregulation of 25 and 29 protein electrophoresis according to their molecular weight. spots for salt-stressed and drought-stressed plants, respec- In quantitative proteomics, 2DGE patterns are screened for tively, most of which appear to be involved in photosynthesis. significant differences (the presence/absence or intensity of We have also used DIGE to compare antibody-producing CHO protein spots) in response to conditions such as abiotic stress (Chinese hamster ovary) cell lines with different antibody or mutations, in order to understand more about complex production levels, aiming to identify molecular markers biological pathways. Furthermore comparisons between two characteristic for high-performance clones. states (e. g. healthy and diseased tissues) are important for the identification of protein biomarkers that help to classify Sponsor / Aufttraggeber samples. German Federal Ministry of Education and Research and Fraunhofer internal strategic funding Methodology Cooperation partners / Kooperationspartner At the Fraunhofer IME, proteome analysis is performed using Bayer CropScience, Fraunhofer ITWM, Fraunhofer FIT the difference-in-gel-electrophoresis (DIGE) technique, in which different samples are labeled with different fluorescent Contact / Ansprechpartner dyes and separated on the same 2D gel. The 2DGE patterns Dr. Stefan Schillberg for each sample can be scanned individually and compared Tel: +49 241 6085 - 11050 using appropriate software, including the calculation of pro- [email protected] tein difference ratios supported by statistical methods. Protein spots of interest are then cut from the gel and analyzed by Dr. Ruth Horn mass spectrometry for protein identification. Tel: +49 241 6085 - 12261 [email protected] Figure 2: 2D image of the whole leaf proteome of Arabidopsis thaliana in the pH range 4-7 Figure 3: 2D image of the whole CHO cell proteome in the pH range 3-10