Einführung in die Biophysik - Übungsblatt 6

Einführung in die Biophysik - Übungsblatt 6- mit Lösungen
July 1, 2015
Allgemeine Informationen:
Die Übung ndet immer montags in Raum H030, Schellingstr. 4, direkt im Anschluss an die
Vorlesung statt. Falls Sie Fragen haben, schreiben Sie bitte eine Email an:
[email protected]
1
Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT)
Recherchieren Sie mit Hilfe von Google Scholar das folgende Paper:
"Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules", Eid et al.,
DOI: 10.1126/science.1162986
Beantworten Sie dann die folgenden Fragen:
1.1 Beschreiben Sie den unten abgebildeten Aufbau! Gehen Sie dabei darauf ein, was eine "Evaneszente
Welle" und ein "Zero-Mode-Waveguide" (ZMW) sind, und weshalb sie eine so groÿe Rolle für das
korrekte Arbeiten der abgebildeten Vorrichtung spielen!
Figure 1
Lösung:
Eine Evaneszente Welle ist ein quantenmechanisches Phänomen. Es handelt sich dabei um eine
exponentiell abklingende Welle in einem klassisch nicht erlaubtem Bereich direkt hinter einer Grenzäche. Sie hat ihre höchste Intensität innerhalb eines Drittels der Wellenlänge entfernt von der
Grenzäche. Der Wellenvektor wird hier komplexwertig. Anwendung nden evaneszente Wellen
zum Beispiel in der Mikroskopie, um extrem kleine Objekte zu beleuchten. (mehr Nachlesen!)
Betrachten wir den Fall einer endlich hohen Potentialstufe. Die von links einlaufende Welle
beschreiben wir mit eikx , die von der Stufe reecktierte zurücklaufende Welle mit e−ikx . Für
die Transmission durch die Stufe spielt nur die einlaufendee Welle eine Rolle. Setzt man nun einen
komplexwertigen Wellenvektor im Transmissionsbereich hinter der Stufe für k ein, also kT = il,
ergibt sich: eikT x = ei(il)x = e−lx , also eine exponentiell abklingende Welle.
Die folgende Graphik veranschaulicht, wie eine evanezente Welle an einem Prisma auftritt. Mit
einem zweiten Prisma sehr nah am ersten Prisma kann man die Welle "vor dem vollständigen
Abklingen retten" und weiterlaufen lassen.
Figure 2
Ein Zero-Mode-Wave-Guide ist ein Wellenleiter, der Licht in ein Volumen leitet, das kleiner ist
als die Wellenlänge in allen drei Dimensionen. Zur Erinnerung: Für einen optischen Wellenleiter
braucht man in der Mitte Material mit höherem Brechungsindex als das umgebende Material, um
Totalreexion zu erhalten.
guide.png
Figure 3
Man braucht in dem oben genannten Paper ein derart kleines Beobachtungsvolumen, weil man
wirklich immer nur ein uoreszenzmarkiertes Nukleotid beobachten möchte. Das Problem ist, dass
die Polymerase eine sehr hohe Dichte an Nukleotiden benötigt (zwischen 0,1 und 10 micromolar),
um arbeiten zu können. Das heiÿt, es benden sich sehr viele Nukleotide in der Lösunge und somit
sehr viele störende Signale auÿenherum. Um diese auszugrenzen, muss man es schaen, ein extrem
kleines, nach auÿen hin abgeschottetes Volumen zu beleuchten und zu betrachten.
1.2 Was sind die Vorteile der SMRT verglichen mit der Sanger-Sequenzierung?
Lösung:
Man kann deutlich längere Sequenzen ermitteln, und das ganze verläuft auch schneller (so schnell
wie DNA-Polymerase, Real-Time).
1.3 Gehen Sie nun genauer auf die einzelnen Schritte der Sequenzierung ein, indem Sie untenstehende Abbildung erläutern!
Figure 4
Lösung:
Die DNA-Polymerase macht den zu sequenzierenden Einzelstrang zu einem Doppelstrang. Dabei
baut sie mit Fluoreszenzmarkern markierte Nukleotide ein. Das einzubauende Nukleotid verweilt
verhältnismäÿig lange in dem Zylinder, so dass es ein starkes Fluoreszenzsignal gibt. Andere,
wahllos diundierende Nukleotide verlalssen den Zylinder so schnell wieder, dass ihre Signale nur
zu einem verrauschten Background beitragen. Der Fluoreszenzmarker wird nach dem Einbauen des
Nukleotids abgespalten. Die Abfolge der Fluoreszenz-Signale gibt dann die Sequenz des Erbguts
an, da jeder Base jeweils mit einem bestimmten Farbsto markiert wurde.
1.3 In der Abbildung ist schematisch ein Fluoreszenz-Signal mit klar denierten Pulsen gezeigt.
Das Rauschen ist dabei sehr gering. Man könnte meinen, dass zufällig in den ZMW diundierte
Desoxiribonukleotid-Triphosphate (dNTPs) das Signal stören oder falsche Pulse erzeugen. Erklären
Sie, warum dies nicht der Fall ist! Wie lautet die Formel, mit der Diusionszeiten abgeschätzt
werden können?
D=
∆x2
4∆t
(1)
Nach ∆ t auösen, fertig. Diese Formel ist so einfach, dass man sie sich ruhig mal merken kann
für die Klausur.
Herleitung: http://engineering.dartmouth.edu/ d30345d/courses/engs43/Chapter2.pdf
2
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
(CRISPRs)
2.1 Warum sind CRISPR-Sequenzen häug palindromisch (oder zumindest beinahe palindromisch)?
Ernden Sie ein Beispiel einer palindromischen Sequenz von 20 Basen. (Anmerkung: Gemeint sind
hier nicht die gewöhnlichen Palindrome wie "Otto" oder "Rentner", sondern eine Sequenz, deren
komplementäre Sequenz mit ihr selbst identisch ist, wenn man jeweils am 5'-Ende zu lesen beginnt). Testen Sie, welche Sekundärstrukturen die von Ihnen erfundene Sequenz bildet, indem Sie
diese auf der NUPACK-Website analysieren lassen (Link: http://www.nupack.org/partition/new).
Wenn Sie alles richtig gemacht haben, sollten sie eine Sekundärstruktur der folgenden Form erhalten:
Figure 5
Lösung:
Sie sind palindromisch, damit die entsprechende RNA "Hairpins" bildet. Die Hairpins wiederrum
sind wichtig, damit bestimmte Schneide-Enzyme, zum Beispiel Csy4, die richtigen Stellen angreifen
können, um die CRISPR in die gewünschten Stüce zu zerteilen. Erst die zerteilte RNA stellt dann
eine Immunabwehr der Bakterien gegen Viren dar.
2.2 Welche Aufgabe übernehmen CRISPRs im Erbgut vieler Bakterien und Archaeen? Erläutern
Sie einige mögliche Anwendungen von CRISPRs in der Gentechnologie!
Lösung:
So etwas wie ein bakterielles Immunsystem. Sie dienen einem Mechanismus, der Resistenz gegen
das Eindringen von fremdem Erbgut durch Viren oder Plasmide verschat, und sind hierdurch ein
Teil des Immunsystem-Äquivalents von vielen Prokaryoten. CRISPR haben eine Länge, die zwischen 23 und 47 bp variiert. Die Einzelsequenzen des sich wiederholenden Grundmotives wechseln
sich ab mit Spacern, die eine Länge von 21 bis 72 bp haben. Während innerhalb einer CRISPRStruktur die sich wiederholende Sequenz erhalten bleibt, variiert die Sequenz der CRISPR in
verschiedenen Mikroorganismen stark.Die Sequenz von CRISPR repeats ist in der Regel palindromisch, was eine stabile Sekundärstruktur der zugehörigen RNA zur Folge hat.
Die Sequenzen der Spacer-Abschnitte variieren stark, sowohl innerhalb einer CRISPR-Struktur als
auch in verschiedenen Prokaryoten. 2005 wurde entdeckt, dass die Spacer-Sequenzen mit FremdDNA aus Bakteriophagen und Plasmiden identisch sind.[5][6][7] Dies führte zur Hypothese, dass
die Funktion von CRISPR darin besteht, den Organismus gegen Fremd-DNA zu verteidigen.
2007 wurde von Barrangou et al. gezeigt, dass Bakterien, die mit Phagen inziert werden, Teile der
Fremd-DNA als Spacer in die CRISPR-Bereiche ihres Genoms integrieren und hierdurch Immunität gegen die Phagen entwickeln können. Zudem zeigten sie, dass Spacer-Sequenzen, die künstlich
in die CRISPR-Bereiche von Bakterien eingefügt werden, diese gegen die zugehörigen Phagen resistent machen. Werden die Spacer-Sequenzen wieder herausgeschnitten, ist auch die Resistenz
aufgehoben. Es wurde auÿerdem gezeigt, dass die cas-Gene eine essentielle Rolle bei der Phagenabwehr spielen: Das Inaktivieren einiger cas-Gene (cas1) verhindert trotz vorhandener Spacer die
Abwehr von Phagen. Die Aktivität anderer cas-Gene (cas7) ist notwendig zur Integration neuer
Spacer in die CRISPR-Sequenz.
Das Ganze wird zum Beispiel verwendet, um industriell wichtige Keime wie Bierhefe, insulinproduzierende Bakterien, etc. immun gegen häuge Feinde zu machen.