Spectrométrie de masse à transformée de Fourier: notions de base

Spectrométrie de masse à transformée
de Fourier: notions de base et
quelques applications
Guillaume van der Rest
Laboratoire des Mécanismes Réactionnels
Ecole Polytechnique, Palaiseau
Déroulement du cours
1. Introduction: la place actuelle de la FTMS
2. Notions de base de FT-ICR
Une heure
3. Quelques améliorations apportées au
dispositif
4. Exemples d’applications
Une large place pour vos questions, que ce soit pour
éclaircir certains points ou aborder d’autre aspects
de la technique.
40 minutes
Déroulement de l’exposé
1. Introduction: la place actuelle de la FTMS
1. S’y retrouver dans les sigles.
2. A quoi ressemble l’instrument ?
3. Quel est son intérêt ?
2. Notions de base de FT-ICR
3. Quelques améliorations apportées au
dispositif
4. Exemples d’applications
1.1. S’y retrouver dans les sigles
• ICR : Ion Cyclotron Resonance
• FT-ICR (MS) : Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance (Mass Spectrometry)
• FTMS : Fourier Transform Mass Spectrometry
Historiquement ces termes ne regroupaient pas exactement les
mêmes significations, mais avec les instruments actuels ils sont
devenus presque synonymes.
• En français on trouve parfois RCI-TF.
1.2. A quoi ressemble l’instrument ?
Source
electrospray
Cellule
(cachée)
Optique de
transfert
Groupe de
pompage
Aimant
supraconducteur 7 T
1.3. Quel est son intérêt ?
• Plus de 300 instruments existaient dans le monde en
2000.
• Plusieurs vendeurs d’instrument investissent
actuellement pour un retour sur ce marché.
• Précision en masse : on peut atteindre une précision
de l’ordre de 2-3 ppm / 5 ppm.
• Résolution : des résolutions supérieures à 600 000
sont atteignables en routine.
Déroulement de l’exposé
1. Introduction: la place actuelle de la FTMS
2. Notions de base de FT-ICR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Un peu de physique
Piège de Penning
Mesure de la fréquence cyclotronique
Séquence menant à un spectre de masse
Comment ajouter de la (MS)n ?
Comparaison avec d’autres spectromètres de
masse
3. Quelques améliorations apportées au
dispositif
4. Exemples d’applications
2.1. Un peu de physique
Mouvement d’un ion dans un champ magnétique :
eB
1.535611×107 B
Hz
νc =
=
2π (m / z )
m/ z
Fréquence de rotation cyclotron :
• indépendante de la vitesse initiale des ions,
• inversement proportionnelle au rapport m/z.
Une mesure précise de la fréquence cyclotron permettra une
mesure précise de la masse.
2.2. Piège de Penning
… ou comment piéger les ions suivant l’axe z ?
• Idéalement on souhaiterait un potentiel de la forme :
Problème : Il faudrait des plaques infinies en xy et une grille n’interférant
pas avec le mouvement des ions.
Conséquence : Toutes les solutions pratiques vont ajouter un terme
électrostatique radial, lié à la taille finie du piège.
2.2. La cellule cubique
Le potentiel créé est de type quadrupolaire, comme dans un piège de Paul.
Mais il n’y a pas de composantes non-continues sur les tensions.
L’extremum au centre de la cellule est minimal dans l’axe du champ
magnétique mais maximal suivant les autres axes.
2.2. Le mouvement des ions
• Le mouvement des ions devient alors la
superposition de trois mouvements :
Voir Figure 1 de L. Schweikhard, J. Ziegler, H.
Bopp, K. Lützenkirchen, International Journal of
Mass Spectrometry and Ion Processes 141, 77
(1995).
On peut cependant négliger le mouvement magnétron, qui est de faible
amplitude pour des ions piégés à proximité du centre de la cellule.
Dans la suite nous considérerons les ions piégés, et le seul mouvement
d’intérêt sera la composante cyclotron.
2.2. Modes d’ionisation
eou h
Pour l’instant: formation directe des ions dans la cellule, avec une énergie
cinétique suffisamment faible.
Donc EI dans la cellule (ou MALDI dans la cellule à la limite).
2.3. Mesure de la fréquence cyclotron
• Comment passer d’un mouvement thermique non cohérent à un
signal mesurable ?
?
Int
m/z
(ou 1/)
S’ils sont produits à température ambiante, les ions auront une
vitesse initiale telle que leur mouvement cyclotron sera sur une
orbite de rayon inférieur à un millimètre.
Il sera nécessaire de les exciter, en phase, sur une orbite de rayon
plus grand pour détecter un signal sur les plaques de détection.
2.3.2. Excitation des ions
• Première étape : accroître leur rayon de façon à créer des
paquets d’ions cohérents.
Transformée de Fourier
1.0
12
10
0.5
x 10
3
8
0.0
6
4
-0.5
2
-1.0
0
0
5
10
15
3
x 10
20
25
30
140
160
180
200
220
240
260
280
Excitation mono-fréquence
1.0
1200
1000
0.5
800
0.0
600
400
-0.5
200
-1.0
0
0
5
10
15
3
x 10
20
25
30
0
Excitation en balayage de fréquences
100
200
300
400
2.3.4. Détection du courant induit
• Conversion du mouvement cohérent du paquet d’ions en un
courant électrique mesurable sur les plaques de détection.
Transformée de Fourier
1.0
4000
0.5
3000
0.0
2000
1000
-0.5
0
0
5
10
15
3
x 10
20
25
30
20
25
30
35
L’amortissement pseudo-exponentiel est dû en grande majorité à
des collisions avec du gaz résiduel, qui entraînent une perte de
cohérence du mouvement des ions.
La largeur du pic dépend directement de la constante de temps
de cet amortissement exponentiel.
Le vide doit être aussi bon que possible (~10-9 mbar).
40
2.3.6. Digitalisation et transformée de
Fourier
• Le signal digitalisé (un interférogramme) est traité par
transformée de Fourier pour obtenir le spectre des fréquences
cyclotron (donc les m/z) des ions excités sur une orbite haute.
Transformée de Fourier
14
1
10
3
0
x 10
τ = 4Taq
12
8
6
-1
4
-2
2
0
0
5
10
15
3
x 10
20
25
30
0
20
40
60
80
100
4000
1.5
1.0
3000
1
τ = Taq
10
0.5
0.0
2000
-0.5
1000
-1.0
-1.5
0
0
5
10
15
3
x 10
20
25
30
0
20
40
60
80
100
2.3.6. Avantages de la transformée de
Fourier
• Détection simultanée de l’ensemble des ions, de
masses différentes, présents dans la cellule.
• Accumulation de spectres pour augmenter le rapport
S/N.
– S croît en n (n = nombre de spectres accumulés)
– N croît en ¥n ; donc S/N croît en ¥n.
• Traitement du signal digitalisé.
– On dispose de toute l’artillerie de traitement du signal par
FFT, notamment au niveau de la déconvolution de fonctions
d’appareil (apodisation).
– On peut envisager des expériences de type 2D analogues
de celles de la RMN.
2.4. Séquence menant à un spectre de
masse
100 ms
1 ms
Total : 500 à 1000 ms
Détection
50 ms
Excitation
Ionisation
Début
Quench
• La succession de ces différents évènements successifs dans le
temps forme la séquence permettant de passer de l’ionisation
au spectre de masse.
• La boucle principale correspond aux n accumulations, le
traitement du signal résultant a lieu après la « FIN ».
250 ms
Fin
2.5. Comment ajouter de la (MS)n
• Sélection d’un ion par éjection radio-fréquence des
autres ions présents :
Neutralisation (et disparition) des
ions excités au-delà du rayon de
la cellule sur les parois de celleci.
Avant
Après
Les paramètres d’éjection sont critiques pour ne pas
exciter trop les ions que l’on souhaite conserver.
2.5.2. Excitation sélective résonante
10 ms
50 ms
Total : 1500 à 2000 ms
1000 ms
Détection
Excitation
monofréq.
100 ms
Excitation
(balayage)
Ouverture
vanne pulsée
100 ms
Pompage
Ejection
sélective
50 ms
Collisions
Ionisation
Début
Quench
• Par la durée et l’intensité de la radio-fréquence d’excitation on
peut contrôler l’énergie cinétique apportée à un ion.
• Pour obtenir une fragmentation par collision, l’introduction d’un
gaz de collision sera nécessaire.
1 ms
250 ms
Fin
2.6.1. Précision en masse et résolution
• En fréquence, la largeur des pics dépend :
– de la durée de digitalisation ( ûmin = 1/Tacq )
– de l’amortissement du signal suite aux collisions
û
haute pression = 2 ¥3 / 2
La largeur des pics est donc indépendante de la
fréquence.
14
14
B
m/ z ∝
ν
12
10
8
6
12
10
8
6
4
4
2
2
0
0
0
2
4
6
8
10
12
Hz
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
m/z
En m/z, la largeur des pics est proportionnelle à (m/z)2.
Les limites instrumentales en termes de résolution et
de précision en masse dépendent de m/z.
2.6.1. Résolution
• Résolutions typiques (7.0 T) à m/z 1 000
Tacq : 500 ms
45 000
± 0.02 uma
Tacq : 1 000 ms
90 000
± 0.01 uma
Tacq : 4 000 ms
360 000
± 0.003 uma
Il faudrait digitaliser pendant 10 s pour atteindre une
résolution de 1 000 000.
• Pour m/z 5 000 :
Tacq : 1 000 ms
17 800
± 0.3 uma
FT-ICR particulièrement bien adaptée aux ions
multichargés, qui se placeront à des bas m/z.
6.2.1. Précision en masse
• Un grand atout du FT-ICR, lié à la résolution, sa
capacité à mesurer très précisément des masses.
A m/z 1 000, avec un aimant de 7.0 T, on peut
attendre :
Calibration interne :
Calibration externe :
précision ~ 2-3 ppm.
précision ~ 5-10 ppm.
• Attention cependant aux effets de charge d’espace :
la présence d’ions abondants à des masses voisines
peut déplacer la fréquence cyclotron des ions.
2.6.2. Sensibilité et gamme dynamique
• Limite de détection d’un signal :
~ 200 charges / (m/z) / scan
Le rapport entre cette valeur et la quantité d’espèce neutre
initiale doit inclure l’efficacité d’ionisation (et de transport), le
nombre de valeurs de m/z différents (fragmentations,
multichargés, …) et le nombre de scans nécessaires à
l’obtention d’un S/N correct.
• Sensibilité « record »
10 atomoles de peptide injecté.
• Gamme dynamique :
Il faut concilier l’effet de charge d’espace (lié à des ions majoritaires
abondants) qui va déplacer les m/z mesurés
et la limite de détection du signal (pour les ions minoritaires).
2.6.3. Gamme de masse
• Limite inférieure :
Donnée par la fréquence de digitalisation.
Pour 8 MHz et 7.0 T : m/z 29.
• Limite supérieure :
Limite de piégeage, liée à l’accroissement du mouvement
magnétron (donc dépend de VT) :
7.0 T, VT 0.5 V: m/z 274 000 (mais précision : 5 000 ppm!)
Cependant il faut pouvoir exciter les ions avant détection, donc
en pratique on se situe à une limite 10 fois plus faible:
7.0 T, VT 0.5 V: m/z 27 400
Déroulement de l’exposé
1. Introduction: la place actuelle de la FTMS
2. Notions de base de FT-ICR
3. Quelques améliorations apportées au
dispositif
1. Différents types de cellules
2. Sources d’ionisation externe
3. Méthodes d’activation des ions
4. Exemples d’applications
3.1. Différents types de cellules
• Pour se rapprocher du cas idéal, plusieurs cellules
ont été développées.
Voir Figure 12 de A.G. Marshall, C.L. Hendrickson,
G.S. Jackson, Mass Spectrometry Reviews 17, 1
(1998).
3.2. Sources d’ionisation externe
• Apport très important :
– Ajout des modes d’ionisation modernes (ESI ou MALDI) au
détecteur FT-ICR.
– FT-ICR particulièrement bien adapté à l’étude d’ions
multichargés.
• Difficultés :
– Adaptation à un mode de détection pulsé.
– Piéger efficacement des ions produits loin de la cellule.
3.2.1. Transport des ions : multipôles
Voir Figure 1 de Michael A. Freitas, Christopher L.
Hendrickson, Mark R. Emmett and Alan G. Marshall,
International Journal of Mass Spectrometry, 185-187,
565 (1999).
3.2.1. Guides électrostatiques
Voir documentation Bruker sur l’APEX III.
3.2.2. Piégeage des ions
• Piégeage statique avec
gaz de collision
+ 1.0 V
+ 1.0 V
E kin
E kin
3.2.2. Piégeage des ions
• Piégeage SideKick™
+ 1.0 V
+ 1.0 V
+ 1.0 V
+ 1.0 V
E kin
− 1.0 V
3.2.2. Piégeage des ions
• Piégeage dynamique
− 1.0 V
+ 1.0 V
+ 1.0 V
− 1.0 V
+ 1.0 V
+ 1.0 V
3.3. Méthodes d’activation des ions
• SORI-CAD (Sustained Off-Resonance Irradiation –
Collision Activated Dissociation)
Ion à exciter
12
10
x 10
3
8
6
4
2
0
140
160
180
200
220
240
260
280
3.3. BIRD et IRMPD
• L’absorption successive de plusieurs photons infrarouge (thermiques pour le BIRD, d’un laser pour
l’IRMPD) mène à la dissociation.
E
Dissociation
3.3. ECD
• Electron Capture Dissociation
• Capture exothermique d’un électron par une
molécule multichargée :
[M,
nH]n+
e-
[M, nH](n-1)+•
H
OH
OH
O
N
H
CHR'
CHR'
CHR'
R
F1m+ + F2k+•
R
N
H
R
NH
c
.
z
Spécifique de la liaison amide et de liaisons S-S. Pas
ou peu de fragmentations de glycosylations ou de
phosphorylations.
Déroulement de l’exposé
1. Introduction: la place actuelle de la FTMS
2. Notions de base de FT-ICR
3. Quelques améliorations apportées au
dispositif
4. Exemples d’applications
1.
2.
3.
4.
Mesure de masses exactes
Mélanges complexes
Dissociation par capture d’électrons
Réactions ion-molécule
4.1. Mesure de masses exactes
Problème de la distribution isotopique
Masse monoisotopique
&+126
5pVROXWLR
R=10 000
Masse moyenne
R=1 000
3URLQVXOLQH ERYLQ
([HPSO
•
∆0
0
4.1. Séparation d’espèces proches
(Leu-Enk-NH2)H+:Mmono 555.29313 (Leu-Enk-OH)H+: Mmono 556.27713
Mmes 555.29268
Mmes 556.27694
Leu-Enk-OH
Leu-Enk-NH2
0.019 Da d’écart.
Résolution >> 30 000
/D = /D A T A /J P L C /e n k O H /1 /p d a ta /1
A d m in is tra to r
F ri J a n 1 7 0 9 :0 9 :0 2 2 0 0 3
Mélange 50/50
4.1. Résolution et massifs isotopiques
Myoglobine: Mmono théorique 19 940.965
Mav théo 19 954.499
15+
25
1:
4 23
Mmesurée majoritaire 19 952.2
17+
1 9
4 23
25
19 952.2
25
4 23
5
18+
1
16+
25
16
4 23
1 7
4 23
25
18
4 23
25
19+
25
10
4 23
Hème
%
%
%
$%
"
'
#&
#
!
!
"
*
*
()
+*
- *,
+ .
- *,
*/
14+
/D = /D A T A /J P L C /m y o _ 1 p m /2 /p d a ta /1
A d m in is tra to r
F ri J a n 1 7 0 9 :1 5 :2 0 2 0 0 3
4.1. Sélection pour la MS/MS
Sélection d’un pic
isotopique de l’état
de charge 17+
A d m in is tra to r
F
F
H FG
J
F
HFG
I
F
HFG
E
B
/D = /D A T A /J P L C /m y o _ M S M S /5 /p d a ta /1
DBC
>
A
@>?
;
;
= <;
;
= <;
<
Sélection de l’état
de charge 17+
F ri J a n 1 7 0 9 :1 2 :0 2 2 0 0 3
On atteint une résolution d’au moins 17000 sur la sélection.
Cela pourra servir en MS/MS dans des mélanges complexes.
4.2. Mélanges complexes
• Pouvoir de résolution élevé et mesure de masse
précise permettent d’extraire beaucoup d’information
d’un seul spectre de masse.
Lorsque plusieurs espèces sont présentes, il est
possible de mesurer simultanément toutes les
masses sans besoin de séparation préalable.
• Jusque 20 000 pics distincts dans un seul spectre.
4.2. Mélanges complexes
• Des extraits de pétrole bruts en ESI
Voir les figures et le contenu de Christine A. Hughey,
Ryan P. Rodgers, Alan G. Marshall, Kuangnan Qian
and Winston K. Robbins, Organic Geochemistry, 33,
743 (2002).
vy
x
p
l s
nq
vw
u t
d
4.2. « Peptide mass fingerprinting »
Exemple avec le cyctochrome c
p
nq
no
q
no
p
nq
l
l r
p
nq
no
l k
m
f
bh
no
T
VU
SQR
PNO
f
bh
KLM
be
c j
f
f
bh
be
c i
d
c g
c b
d
b
b
be
A d m in istra to r F riJa n 1 7 0 9 :06 :0 6 20 0 3
_
a`
]
]
^\
]
]
\]
Z
Z
Y[
Z
Z
Z
Y
X
W
X
be
/D = /D A T A /JP L C /16 01 0 3 /cytC /2 /p d a ta /1
4.2. Peptide mass fingerptinting
76% de couverture de la protéine. Seuls les peptides de
faible masse moléculaire manquent
4.2. Analyse de mélanges complexes
• Analyse par ESI/MS d’un mélange d’une protéine
(domaine Hck SH2) et de 324 ligands potentiels.
M. Wigger et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 1162 (2002)
4.3. ECD sur des peptides ou protéines
• Mécanisme « qualitatif »
– Capture de l’électron au niveau d’un ammonium quaternaire:
O
O
+ eR
HN
CH
C
N
H
R
R'
HN
CH
C
N
H
R'
NH3
NH3
– Déplacement rapide de l’atome d’hydrogène, ralenti
progressivement par collisions avec la chaîne peptidique.
H
OH
OH
O
R
N
H
CHR'
CHR'
CHR'
R
N
H
R
NH
c
z.
4.3. Caractéristiques des fragmentations
• Mécanisme « non ergodique » i.e. sans redistribution
de l’énergie interne dans l’intermédiaire excité :
– Pas de fragments de type b / y typiques de CID ou IRMPD.
– Pas de rupture de liaisons fragiles, même non-covalentes :
c
A
B
.
IRMPD
ECD
A + c. + z
z
Activated Ion ECD
[ A, B, nH ]
n+
[ A, B, nH ]
(n-1)+
4.3. Sites de fragmentation
• Liaisons S-S :
– Affinité pour H• ?
– Etats de Rydberg dissociatifs pour S-S-• ?
Nécessité de réduire les ponts disulfure avant analyse.
• Favorisées en C-terminal des tryptophanes.
• Pas de fragmentation de C-O éther ou C-N amines :
– La présence d’un groupe accepteur de H• (tel que C=O) à
proximité est nécessaire.
– Les O- et N-glycosylations de chaînes latérales ne sont pas
coupées par l’ECD.
4.3. Localisation de sites de
glycosylation
Une seule fragmentation (z202+) correspond à la perte d’un glycane.
E. Mirgorodskaya, P. Roepstorff, R.A. Zubarev, Anal. Chem. 71, 4431 (1999)
4.3. Approche top-down sur protéine
entière
• Développée par le groupe de F.W. McLafferty.
• Augmentation nette de la fragmentation d’où une
information de séquence sur une protéine entière.
Cytochrome c
D.M. Horn et al. Anal. Chem.
72, 4778 (2000)
4.4. Réactions ion-molécule
• La cellule FT-ICR, un « réacteur » pour la chimie des
ions en phase gazeuse?
se
y
l
a
n
A
Réactif Mélange
Substrat
de produits Purific
ation
Gaz
Ion initial
neutre
Ions
produits
n/
o
i
t
a
t
i
Exc
tion
c
e
t
é
d
Séle
c
tion
Caractérisation
Produit pur
…
Spectre de
masse
Ion isolé
…
4.4. Exemple de réaction étudiée
R
NH3
R
R
et/ou
R'
R'
R'
O
HC
NH2
- e-
O
+ H2O
HC
- CO
NH3
[ NH3, H2O ].+
(NH3)2.+
NH2
O
NH3
et
OH
O
• Etude du mécanisme détaillé des réactions d’ions.
• Propriétés thermochimiques d’espèces ionisées (affinités
protoniques, basicités, énergies de complexation ou de
solvatation…)
• Réactions caractéristiques à buts analytiques (échanges H/D sur
des peptides ou protéines).