Quelques exemples de nos travaux
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Quelques exemples de nos travaux
Quelques exemples de nos travaux C. Renard UMR SQPOV, Avignon Fév 2010 Plan • • • • • • Les pectines: définition et structure Méthodes d'étude des pectines Les pectines en tant qu'additifs Les enzymes pectolytiques Les pectines in situ: Quelques exemples de nos travaux – – – – Modification des homogalacturonanes Quelques mots sur les polyphénols Extraction de polyphénols de marc de pomme Extraction de jus par microondes Interaction - Association spontanée et rapide polyphénols-paroi cellulaire - Affinité entre les tannins et les pectines - Influences de DP (tannins) et de DM (pectines) - Modification de l’extractibilité des polysaccharides - Possibilité de mesurer l’interaction par la Calorimétrie Isothermale de Titration Préparation d’homogalacturonanes substitués • Pour étudier leurs interactions avec les polyphénols • Homogalacturonanes par hydrolyse acide • Substitution par halogénures d’alkyles • Test: calorimétrie isothermale de titration Expériences et Résultats ¾Pectines: Pectines commerciales de pommes Saponification Pectates Hydrolyse acide Rendement pondéral (%) Teneur en Gal-A (mmol/g) Rendement en Gal-A (%) Pectines / 3,58 / Pectates 94,9 3,69 97,9 HG 56,5 4,66 71,3 HG-TBA 221 2,4 100 Homogalacturonanes Neutralisation HG-TBA Alkylation HG modifiés 100 100 Degré d'éthylation (%) Degré de méthylation (%) Efficacité de la substitution Methylation 80 60 40 20 80 60 • 40 20 • 0 0 0 0,25 0,5 0,75 1 0 10 Degré de buthylation (%) 100 Propylation 80 60 40 20 - 0 0 0,25 0,5 0,75 1 Ratio molaire ProBr/Gal-A 0,25 0,5 0,75 1 10 Ratio molaire EtBr/Gal-A Ratio molaire MeI/Gal-A Degré de propylation (%) • Ethylation 10 100 • Buthylation 80 60 40 20 0 0 0,25 0,5 0,75 1 Ratio molaire BuBr/Gal-A 10 Influence de l’halogénure, Encombrement de la chaîne d’alkyle, Relation linéaire jusqu’au ratio 1 (alkylant/Gal-A), Insolubilité des molécules hautement substituées. Sans diminution de la longueur de chaîne • HPSEC HG-TBA HG-Me1 HG-Et6 HG-Pr12 8 min 13 min Préparation des polyphénols Poudre de pommes lyophilisées Extraction Hexane Méthanol Eau-Acétone Analyse par HPLC Polyphénols extraits SPE C18 Purification Polyphénols purifiés Concentration (mg/g de matière sèche) Rendt PCA (%) PCA ECAT Ac. chlor Ac. PCG DHC 146,48 / 6,3 0,53 0,77 0,08 0,24 5,6 PPH Extraits acétonique 2,899 22 69,8 0,85 1,97 0,14 0,16 10,9 PPH purifiés 0,236 80 686,3 7,6 / / 2,02 10,8 Quantité (g) Pomme DP Mesure de l’interaction par ITC microcalorimètre isothermale de titration ITC; Résultat obtenu en 2008, Procyanidines DP 35, 3mM, Pectine DM 70, 1,5 mM Avec les HGs: pic exothermique à 1/10 HG 35°C HG-Me DS 41 HG-Bu DS 74 Pourquoi les polyphénols? • Caractères organoleptiques – – – – amertume et astringence couleur : natifs, oxydés relations structure/propriétés des polyphénols rôle de la matrice • Propriétés nutritionnelles • Evolution des polyphénols au cours des procédés – transferts depuis le fruit – modifications des structures • oxydations , condensations • enzymatiques, chimiques: échelles de temps De la matière première au produit Pressage OH HO O OH OH OH HO OH O OH OH OH Clarifications OH HO O OH OH OH HO OH O OH OH HO Fermentation OH OH O OH OH OH OH HO O OH OH OH Matière première Cuisson Broyage Raffinage Cidre Une démarche commune • Observation – Une observation qui ne « cadre pas » avec la théorie générale – Une question finalisée qui conduit à des interrogations fondamentales • Modélisation – Elle permet d'analyser des phénomènes réels et de prévoir des résultats à partir de l'application d'une ou plusieurs théories à un niveau d'approximation donné. – Modélisation « ad hoc »: boite noire (statistique), basée sur des modèles descriptifs ou théoriques • Validation – Répéter l’observation initiale en faisant varier les leviers identifiés par le modèle – Le modèle permet-il de prévoir l’effet des modifications du procédé? Pour la caractérisation de procyanidines OH OH Absorbance (280 nm) HO O OH OH 4 OH OH HO 6 4 HO HO 8 OH OH OH OH HO O Procyanidols OH O OH OH OH 0 10 OH O 20 30 40 Temps de rétention (min) Thiolyse (dépolymérisation) OH HO OH O OH OH 1. Identification des unités constitutives Absorbance 280 nm benzylthioéther de (-)-épicatéchine toluène-thiol moyen de polymérisation (-)-épicatéchine 0 10 20 30 2. Détermination du degré 40 Temps de rétention (min) 50 3. Quantification et estimation de la pureté La réaction de thiolyse OH OH OH extension units HO O HO OH OH H+ O + O OH Procyanidin (Adapted from Thompson et al., 1972) HO O 2 S OH OH CH2 Benzylthioether adduct O OH unit OH OH HO terminal OH CH2 OH OH OH 2 OH FlavanylC4-carbocation + OH OH HO O 2 OH OH OH HO SH OH OH OH terminal unit (flavanol) Quantification par HPLC A 2 4 Before thiolysis Absorbance (280 nm) 0,06 0,05 7 3 5 X X 6 0,02 X X1 0,01 9 7 B After thiolysis 0,06 0,04 0,03 2' 0,07 Absorbance (280 nm) 0,07 4 0,05 0,04 5' 12 0,03 10 0,02 6 0,01 8 X X X X 0,00 0,00 0 10 20 30 40 50 0 Retention time (min) • Avant – Procyanidols – Acides hydroxycinnamiques • 10 20 30 Retention time (min) Après – Flavanols et dérivés benzylthioethers – Dérivés méthylés 40 50 Pourquoi le marc de pomme • Un co-produit abondant et mal valorisé – France: 200 KT pommes à cidre – Marc: environ 5% – Utilisation: extraction des pectines, alimentation des animaux Les ultrasons Bumble bee 150 Hz Prpoagation des sons en milieu liquide: le phénomène de cavitation Conséquences de la cavitation Implosion des bulles: micro-réacteur avec des conditions de T° et P extrèmes Peut-on utiliser la cavitation en extractions? 1. 2. • Sans ultrasons Avec ultrasons Extraction – à partir de marc de pomme industriel – par des solvants compatibles alimentaire • Dosage – Polyphénols totaux (Folin) – Polyphénols spécifiques (HPLC après thiolyse) Essais préliminaires- 1 • Solvant (ratio Ethanol / H2O) – 10g marc/ 100mL solvant TPC Eq.catechin (g/L) 1,20 TPC (ECatechin g/L) = f (% EtOH) Maximum 50% EtOH/H2O (v/v) 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0% 20% 40% EtOH 60% 80% 100% Rapport liquide / solide Concentration Quantité effective d’extrait TPC Ecatechin (g/L) = f (ratio S/L) y = -8,1354x2 + 8,1092x R2 = 0,9984 TPC Eq. catechin (g/L) 2 1,8 1,6 Eq. Catechin (g) 70,00 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Quantity of extract recovered 2 R = 0,9986 60,00 0,2 0 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 50,00 35% Ratio S/L X Volume récupérée = y = 617,22x 2 R = 0,9989 180,00 10,00 0,00 160,00 Volume (mL) 30,00 20,00 Solids and Liquids volumes recovered after filtration step function of solid/liqui ratio 200,00 40,00 140,00 0% 120,00 Liquid 100,00 Solid 80,00 5% 10% 15% 20% ratio S/L 25% 60,00 40,00 2 y = 396,83x - 325,24x + 99,698 2 R = 0,988 20,00 0,00 0% 5% 10% 15% 20% Ratio S/L 25% 30% 35% Rapport choisi 15% (w/v) 30% 35% Extraction assistée par ultrasons • Conditions fixées – EtOH/H2O (50/50, v/v) – Ratio S/L (w/v): 15% – Ultrasonic bath: PEX 3 • (REUS, Contes, France) • Plan d’expérience – Puissanced des US (W/g) – Température (°C) – Durée d’extraction Plan d’expérience +1 Box-Wilson (composite centré) • 6 expériences au centre -1 0 -1 • 8 expériences aux « coins » • 6 expériences en étoile 0 0 +1 -1 20 expériences au total +1 Valeurs utilisées et résultat PPT Variables et leurs niveaux Niveau -α -1 0 +1 +α Puissance US (W/g) Temp. (°C) Durée (min) 0,058 0,075 0,100 0,125 0,142 9,9 16,0 25,0 34,0 40,1 5 15 30 45 55 No. Puissance W/g Temp. °C Durée min Eq.Catechin [g/L] 1 -1 -1 -1 0,626 2 1 -1 -1 0,673 3 -1 1 -1 0,897 4 1 1 -1 0,865 5 -1 -1 1 0,783 6 1 -1 1 0,769 7 -1 1 1 1,056 8 1 1 1 1,104 9 -1,68179 0 0 0,843 10 1,68179 0 0 0,985 11 0 -1,68179 0 0,633 12 0 1,68179 0 1,175 13 0 0 -1,68179 0,658 14 0 0 1,68179 0,970 15 0 0 0 0,801 16 0 0 0 0,869 17 0 0 0 0,838 18 0 0 0 0,832 19 0 0 0 0,848 20 0 0 0 0,871 Exploitation des résultats • Modèle statistique – Modèle linéaire généralisé – Equation prennant en compte des effets linéaires, quadratiques et interactions • Equation – TPC = 0.844 + 0.021 P + 0.145 T + 0.086 t + 0.018 P2 + 0.015 T2 – 0.017 t2- 0.002 P.T + 0.002 P.t + 0.018 T.t Avec, P: Puissance US T: Température t: durée d’extraction Puissance Temp. Durée US – Calcul des conditions optimales 0.142 W/g 40.1°C 45 min Pour une concentration en PPT maximale Exploitation graphique • Graphique de Pareto – Choix des variables p = 0.05 • Calcul des surfaces de réponse Polyphénols spécifiques • Mêmes extractions – Dosage des polyphénols dans les extraits par LC-DAD après thiolyse – Quantification aux différentes longueurs d’onde • • • • Flavanols: 280 nm (fluo) Dihydrochalcones: 280 nm Acides hydroxycinnamiques: 320 nm Flavonols : 350 nm – Calcul des équations et surfaces de réponse - 280 nm Variables Flavan-3-ols Dihydrochalcones Phloretin Xyloglucosi de Temp. Extracti on time Monomeric Flavan-3-ols Polymeric Flavan-3-ols DP° PCA -1 -1 -1 0,169 0,143 2,866 0,021 0,144 2 1 -1 -1 0,149 0,126 3,402 0,019 0,138 3 -1 1 -1 0,239 0,212 3,770 0,023 0,153 4 1 1 -1 0,195 0,165 4,618 0,021 0,148 5 -1 -1 1 0,200 0,172 3,898 0,023 0,145 6 1 -1 1 0,196 0,171 3,934 0,023 0,144 7 -1 1 1 0,303 0,274 4,267 0,030 0,154 8 1 1 1 0,328 0,297 4,009 0,031 0,175 9 -1,68179 0 0 0,220 0,194 3,960 0,024 0,153 10 1,68179 0 0 0,224 0,194 3,819 0,024 0,162 11 0 -1,68179 0 0,162 0,138 2,926 0,022 0,152 12 0 1,68179 0 0,318 0,281 4,322 0,027 0,176 13 0 0 -1,68179 0,154 0,132 3,556 0,019 0,134 14 0 0 1,68179 0,283 0,253 4,226 0,029 0,180 15 0 0 0 0,220 0,193 3,943 0,023 0,151 16 0 0 0 0,228 0,199 3,875 0,026 0,159 17 0 0 0 0,227 0,199 3,727 0,025 0,162 18 0 0 0 0,232 0,202 3,706 0,025 0,160 19 0 0 0 0,223 0,195 3,973 0,023 0,150 20 0 0 0 0,225 0,196 3,970 0,027 0,162 No. US Power 1 Phloridzin - Variables 325 nm 350 nm No. US Power Temp. Extraction time Chlorogenic Acid p-coumaroylquinic Acid Flavo-nols 1 -1 -1 -1 0,049 0,012 0,075 2 1 -1 -1 0,040 0,007 0,078 3 -1 1 -1 0,048 0,008 0,094 4 1 1 -1 0,049 0,007 0,104 5 -1 -1 1 0,037 0,006 0,088 6 1 -1 1 0,039 0,007 0,088 7 -1 1 1 0,047 0,008 0,110 8 1 1 1 0,054 0,008 0,115 9 -1,68179 0 0 0,046 0,008 0,071 10 1,68179 0 0 0,055 0,007 0,090 11 0 -1,68179 0 0,037 0,010 0,078 12 0 1,68179 0 0,058 0,009 0,111 13 0 0 -1,68179 0,039 0,007 0,078 14 0 0 1,68179 0,061 0,009 0,108 15 0 0 0 0,042 0,007 0,096 16 0 0 0 0,044 0,008 0,099 17 0 0 0 0,050 0,008 0,098 18 0 0 0 0,051 0,008 0,101 19 0 0 0 0,043 0,007 0,096 20 0 0 0 0,048 0,009 0,101 Variables d’influence Main effects Quadratic effects Interaction effects Variables X1 X2 X3 X1² X2² X3² X1X2 X1X3 X2X3 TPC p-value F-ratio 0.0843 3.67 0.0000 174.20 0.0000 61.27 0.1213 2.87 0.2029 1.86 0.1387 2.59 0.8854 0.02 0.8720 0.03 0.2358 1.59 Yield p-value F-ratio 0.1094 3.09 0.0581 4.58 1.1969 1.91 0.6378 0.24 0.4335 0.67 0.3967 0.78 0.7923 0.07 0.6972 0.16 0.6907 0.17 Monomeric Flavan-3-ols p-value F-ratio 0.2740 1.34 0.0000 383.05 0.0000 246.42 0.3257 1.07 0.0995 3.30 0.1435 2.52 0.8391 0.04 0.0053 12.56 0.0006 24.61 Polymeric Flavan3-ols p-value F-ratio 0.1649 2.25 0.0000 423.10 0.0000 283.02 0.3475 0.97 0.1094 3.09 0.2393 1.57 0.7854 0.08 0.0025 16.07 0.0002 0.2393 DP° Procyanidins p-value F-ratio 0.1609 2.29 0.0000 64.67 0.0018 17.83 0.6794 0.18 0.1142 2.99 0.6708 0.19 0.9700 0.00 0.0064 11.80 0.0050 12.85 Phloridzin p-value F-ratio 0.4782 0.54 0.0126 9.20 0.0064 11.76 0.4239 0.70 0.8835 0.02 0.3845 0.83 0.3806 0.84 0.2446 1.53 0.4219 0.70 Phloretin Xyloglucoside p-value F-ratio 0.5388 0.40 0.0002 33.80 0.0000 71.34 0.3253 1.07 0.6222 0.26 0.3253 1.07 0.7873 0.08 0.1959 1.92 0.0123 9.29 Chlorogenic acid p-value F-ratio 0.4849 0.53 0.0118 9.43 0.2367 1.58 0.7133 0.14 0.7771 0.08 0.7952 0.07 0.3990 0.78 0.3416 1.00 0.3416 1.00 p-Coumaroylquinic acid p-value F-ratio 0.1313 2.70 0.5244 0.44 0.6958 0.16 0.4634 0.58 0.1244 2.81 0.8818 0.02 0.3577 0.93 0.0482 5.06 0.0482 5.06 p-value F-ratio 0.0108 9.75 0.0000 87.30 0.0001 39.42 0.0010 21.28 0.7899 0.07 0.4771 0.55 0.3502 0.96 0.5283 0.43 0.7507 0.11 280 nm 325 nm 350 nm Flavonols Exemple des flavonols • Graphique de Pareto • Equation et conditions optimales: Flavonols = 0.098 + 0.004 P + 0.011 T + 0.007 t – 0.005 P2 + 0.002 P.T – 0.001 P.t – 0.001 T2 + 0.001 T.t – 0.001 t2 US Power Temperature Durée 0.117 W/g 37.8°C 55 min Comparaison avec / sans US • Dans les conditions optimales TPC Eq.Catechin (g/L) 60,00 Comparison of extraction methods 50,00 > 20% 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,00 10,00 20,00 30,00 time (min) 40,00 50,00 Mécanisme • Déstruction des structures – cavitation sur les surfaces exposées • Exemple (carvi) Initial seed Conventionnal Extraction 300 min. 69°C – Yield 1,6% Sono-extraction 30 min. 20°C - Yield = 1,7% Extraction de jus par microondes • Thèse Aurélie Cendrès • Prune (abricot, raisin) Principe Temperature Sensor Reflex Oven opening Microwave oven Fruits PTFE grid Fruit juice Computer « Easy Wave » Oven opening Column Graduated cylinder Chronograph ¾Fruits frais et non transformé placés dans le micro-onde ¾Chauffage par micro onde de l’eau intrinsèque des fruits ¾Génération d’un phénomène d’hydrodiffusion de l’intérieur Æl’extérieur du fruit ¾Le jus atteint l’extérieur du fruit et tombe par gravité ¾Récupération directe du jus sans étape supplémentaire En pratique Sonde (dans le fruit) Jus Et les produits Est-ce que ça se boit? Test par les membres du laboratoire (7 femmes, 6 hommes, 21-55 ans) Je n’aime pas J’aime 0 9 5.5 Raisin 5.4 Prune Abricot 3.3 Impact de la puissance appliquée Yield (ml.kg-1) 600 400 1.5 W.g-1 1 W.g-1 0.5 W.g-1 200 0 0 5 10 Time (min) 15 20 Augmentation de la puissance appliquée: Extraction plus rapide mais rendement plus faible. Le facteur limitant est la surchauffe des fruits Modélisation de l’extraction ¾Une formule adaptée: y=a/(1+(x/x0)^b) décrit bien la forme de l’extraction ¾Les coefficients: Æb=trouvé à environ –2, forme générale Æa= plateau: volume maximal extrait Æx0=point d’inflexion: point où la vitesse maximale est atteinte Coef a Coef xo 300 20 15 200 10 100 5 0 0 200 400 puissance 600 0 800 Coef a manip1 Coef a manip2 Coef x0 manip1 Coef x0 manip2 Le modèle permet de mieux quantifier les impact des modifications de la puissance appliquée sur l’extraction. On devrait extraire plus et plus vite, or on extrait moins: surchauffe. Observation du phénomène • Extraction à partir de fruits frais Volume (ml) & Temperature (°C) Vitesse (ml/min) 16 160 Vitesse maximale 120 80 12 12 40 4 3 8 4 Hydrodiffusion 0 0 0 10 Time (min) 20 30 Que se passe-t’il avec des fruits initialement congelés? • Extraction à partir de fruits congelés Volume (ml) & Temperature (°C) 200 16 2 150 100 Vitesse (ml/min) 1 Hydrodiffusion 8 3 50 4 0 -50 12 0 10 Formation de points chauds Fonte de la glace 20 Temps (minutes) 30 Composition des produits 4 Polyphénols (g/L) 40 3 30 2 20 1 10 0 200 Prune Abricot Raisin Anthocyanes (mg/L) 0 Sucres (g/L) Prune 16 Abricot Raisin Acides (g/L) 160 12 120 8 80 4 40 0 0 Prune Abricot Raisin Prune Abricot Raisin Ratio of concentration Des comportements différents des polyphénols selon leur répartition dans le fruit 2 Polyphénols de la chair (flavanols, acides hydroxycinnamiques) 1,5 1 0,5 0 Ratio of concentration 0 50 100 150 Juice fraction (ml) 200 250 2 Polyphénols de l’épiderme (anthocyanes et flavonols) 1,5 1 0,5 0 0 50 100 150 Juice fraction 200 250 Extraction microonde • Mécanismes d’extraction – Frais: chauffage du centre vers l’extérieur, moteur de l’hydrodiffusion – Congelé: • déstructuration liée à la formation de cristaux de glace • Fonte (points chauds puis conduction thermique) • Hydrodiffusion après décongélation • Des questions en suspens: – Volume de vapeur produites (en fonction de la puissance appliquée) – Optimisation des rendements: éviter la surchauffe? – Oxydation enzymatique: oui, non, quelles conditions?