La transdifférentiation: définition

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La transdifférenciation
Séverine Létuvé
21 novembre 2011
M1 Santé/ UE7 ‘Biologie moléculaire’
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La transdifférenciation: définition
Environnement
Cellule polarisée
Acquisition d’un nouveau phénotype
Transdifférenciation = conversion d’une cellule différenciée en un autre
type cellulaire
 Plasticité cellulaire impliquant une modification
- de morphologie
- de fonction
 Phénomène
- Direct
- impliquant une dédifférentiation
- nécessitant le passage par un intermédiaire (cellule souche)
2
3
Mise en évidence historique d’une transition de phénotype:
apparition du sillon primitif au cours de l’embryogenèse
3
4
Implication de la transition de phénotype en
pathologie humaine (1)
Implication en pathologie humaine
• Conversion des cellules endothéliales et des fibroblastes en
cellules musculaires vasculaires et myofibroblastes ( SMA+):
hypertension pulmonaire artérielle
• Conversion des cellules étoilées du foie en myofibroblastes
Application en thérapie cellulaire
• Conversion des cellules  du pancréas (glucagon +) en cellules
(insuline +): régénération tissulaire en réponse à la disparition
massive des cellules  (modèle de diabète type I)
• Plasticité des cellules souches mésenchymateuses: différenciation
en cellules d’autres lignages (cellules , neurones, cellules
musculaires cardiaques…)
4
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Exemples de transition de phénotype (2)
• Transition épithélio-mésenchymateuse (TEM= Epithelial- mesenchymal
transition, EMT/ métaplasie):
Génération de cellules capables de migrer à partir de cellules épithéliales
- différenciation en cellules mésenchymateuses, fibroblastes
- acquisition de propriétés de cellules souches
• Mésenchymal- epithelial transition (MET): phénomène inverse de la TEM
Ex: formation des somites/embryogenèse
• Endothelial- mesenchymal transition (EndoMT): acquisition d’un
phénotype mésenchymateux par les cellules endothéliales
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Cas particulier de la transition épithélio-mésenchymateuse
(TEM)
Phénotype épithélial
Polarité apico-basale
Phénotype statique
Jonctions
adhérentes + serrées
E-cadhérine
Cytokératines
Phénotype métastable
Phénotype mésenchymateux
Absence de polarité
Extensions membranaires
Réorganisation du
cytosquelette
Cytokératines
Vimentine
-caténine nucléaire
Polarité ‘avant-arrière’
Phénotype migratoire
Absence de jonctions
intercellulaires
Production de matrice
extracellulaire
et médiateurs fibrogéniques
6
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La TEM:
Implication en physiologie humaine/ physiopathologie
• Initialement décrite dans le cadre de l’embryogenèse
TEM de type I
• Mise en évidence dans les phénomènes de réparation tissulaire et les
pathologies à composante fibrotique (rejet de greffe, fibrose rénale,
fibrose pulmonaire idiopathique…)
TEM de type II
• Impliquée dans la dissémination des cellules épithéliales tumorales
(métastases)
TEM de type III
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8
Stimuli inducteurs de TEM
• Facteurs solubles (facteurs embryogéniques, médiateurs
inflammatoires: TGF-, PDGF, EGF, FGF-2, IGF-BP5)
• Réarrangements matriciels (ex: matrice fibrillaire vs. Laminine)
• Agression épithéliale (ex: protéases, lésion)
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Signalisation intracellulaire de la TEM
9
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Rôle clé de Snail au cours de la TEM
Marqueurs épithéliaux
Marqueurs
mésenchymateux
Remaniements
du cytosquelette
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Les marqueurs de TEM (1)
Les plus fréquemment utilisés, liés à une:
• Altération de l’expression de protéines membranaires:
– Adhérence cellule-cellule
switch E-cadhérine/ N-cadhérine
– Adhérence à la matrice
5 intégrine, discoidin domain receptor tyrosine kinase 2 (= kinase
spécifique au récepteur du collagène)
– Forme de la cellule
cytosquelette: switch cytokératine/ vimentine
• Modification de la fonction cellulaire:
– Migration
protéines du cytosquelette: FSP-1 ± -SMA, métallo-protéases
matricielles
– Synthèse de protéines matricielles
fibronectine, collagène I
– Resistance à l’anoikis
+ Néo-expression de facteurs de transcription et translocation nucléaire de la caténine
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Les marqueurs de TEM (2)
Marqueurs induits
Nom
Type de TEM
Marqueurs réprimés
Nom
Type de TEM
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Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs (1)
• Petits ARN (19-22 nts) simple-brins
non-codants
• Répriment l’expression de gènes de
façon post-transcriptionnelle:
fixation par complémentarité totale ou
partielle avec séquence 3’UTR des
ARNm cibles
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Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs (2)
• Expression
- tissu-spécifique
Ex: miR-122/ foie; miR-1/ muscle squelettique; miR-133/
muscle cardiaque; miR-375/ îlots de Langerhans
- temporelle
Ex: gastrulation/ développement
- modulée par l’environnement tissulaire chez l’adulte
Ex: miR-21/ inflammation allergique des voies aériennes (IL-13 Tg);
miR-155/ fibrogenèse pulmonaire
• Fonctions (entre autres!)
- régulent la différenciation
Ex: famille miR-200/ phénotype épithélial;
miR-145/ conversion fibroblastes-cellules musculaires lisses
- régulent la prolifération
Ex: miR-203/ différenciation des kératinocytes: cellules basales
(proliférantes) vers supra-basales (différenciées)
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La machinerie des miRNAs et la transdifférenciation
• Induction de conversion de phénotype sans retour à un état pluripotent
(régulation épigénétique: inactivation par hyperméthylation de l’ADN)
• Expression réduite de Dicer associée avec un état moins différencié des
cellules (moindre maturation des miRNAs)
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Autres acteurs de la TEM: les ZEBs
Facteurs de transcription de la famille ZEB : répression de l’E-cadhérin et des miRNAs
a: Ségrégation des membres de la famille miR-200 en fonction de leur séquence ‘seed’
b: Sites de fixation des miR-200s au niveau des régions 3’UTR régions of de l’ARNm des ZEBs
c: Boucle de rétro-régulation négative impliquant les miR-200s et les ZEBs au cours de la TEM
NAT: Natural Antisense Transcript
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Mise en évidence de la transdifférenciation
But: mettre en évidence l’apparition d’un nouveau phénotype
différencié
 bien caractériser le phénotype initial (type de cellule, mais
également type de tissu! Exemple: cellule épithéliale bronchique
vs. alvéolaire)
 définir si mise en évidence précoce? (facteurs de transcription,
nouveau phénotype transitoire)
 ou détection plus tardive (maladie chronique: nouveau phénotype
stable)
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Outils de mise en évidence de la transdifférenciation
• Etude morphologique: microscopie classique
• Caractérisation et distribution cellulaire des marqueurs de phénotype + facteurs
de transcription (Immunocytochimie ± fluorescence et microscopie confocale)
• Quantification de l’expression à l’échelle protéique (Western Blot) et
transcriptionnelle (PCR, puces à ADN)
! Attention !
- choix du modèle cellulaire déterminant pour les marqueurs à étudier (origine
tissulaire) et la ‘facilité’ de mise en évidence de la TEM (cellules immortalisées >
cellules primaires)
- choix du mode de préparation des échantillons: ex. analyse des miRNAs/ ne pas
éliminer les petits ARNs…
- et du mode de culture (effet de la matrice sur le phénotype des cellules/ culture
en interface air-liquide pour différenciation épithéliale…)
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Exemple: Mise en évidence in vitro de la TEM
• Morphologie ‘allongée’ (spindle-shape) avec perte de polarité et
réorganisation des fibres de stress
• Disparition des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, cytokératine, ZO-1)
• Néo-expression de marqueurs mésenchymateux (N-cadhérine, FSP-1)
• Induction de Snail/ Slug/ Twist
• Translocation de la -caténine
• Augmentation de l’expression de collagène/ vimentine/ HSP-47
• Augmentation de la capacité migratoire
• Augmentation de l’expression de MMPs
• Résistance à l’apoptose/ anoïkis
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Mise en évidence in vitro de la TEM: chambre de
Boyden
• Détection d’une capacité migratoire accrue
TGF-1
Cellules épithéliales
(différentiées?)
Migration de ‘fibroblastes’
suite à l’induction de TEM?
Collagène
20
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TEM de cellules bronchiques immortalisées (BEAS-2B)…
E-cadhérine
Milieu
TGF-1
Vimentine
21(3
j)
22
…vs. TEM de cellules bronchiques primaires (NHBE)
Milieu
TGF-1
E-cadhérine /
Vimentine
22(6
j)
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Expression des marqueurs de TEM au niveau des cellules
épithéliales bronchiques humaines: Western-Blot
Jours
TGF-1
E-cadhérine
3
-
6
+
-
10
+
-
+
N-cadhérine
Vimentine
-actine
Milieu
70
2,5
2
1,5
1
0,5
0
3j
6j
10j
N-cadhérine
60
3,5
50
3
40
30
20
2,5
2
1,5
1
10
0,5
0
0
3j
6j
Vimentine
4
Vimentine/ -actine
E-cadhérine
N-cadhŽ
r ine/ -actine
E-cadhŽ
rine/  -actine
3
TGF-1
10j
3j
6j
10j
23
24
Expression des marqueurs de TEM au niveau des cellules
épithéliales bronchiques humaines: qPCR
Vimentine
0,25
ARNm vimentine / HPRT
ARNm cadhˇrine E / HPRT
E-cadhérine
0,2
0,15
0,1
0,05
0
3
6
18
24
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
72
3
Temps (h)
8,E-03
6,E-03
4,E-03
2,E-03
0,E+00
3
18
72
Temps (h)
Procollagène I1
24
72
TGF-1
6,E-01
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
mRNA MMP-9/UBC
mRNA FN/UBC
mRNA procoll Ia1/UBC
1,E-02
18
Temps (h)
Milieu
1,E-02
6
5,E-01
4,E-01
3,E-01
2,E-01
1,E-01
0,E+00
3
18
Temps (h)
Fibronectine
72
3
18
72
Temps (h)
MMP-9
24
Signalisation intracellulaire de la TEM au niveau des cellules
épithéliales bronchiques humaines
TGF-1 (3h)
Milieu
Dexa
-
-
+
+
MeOH
-
+
Salm
-
+
P Smad3
Smad3 T
-actine
Milieu
TGF-1
20
Effet des traitements
de l’asthme
(Dex: dexaméthasone;
Salm: salmétérol)
ratio Psmad3/Tsmad3
25
15
10
5
0
Milieu
Dexa
MeOH
Salm
25
Implication des facteurs de transcription Snail et ZEB1 dans la
TEM des cellules épithéliales bronchiques
3,5
8
TGF-1
ZEB1/ UBC
6
HCl
3
HCl
Snail/UBC
26
4
2
TGF
2,5
2
1,5
1
0,5
0
3
18
72
0
3h
18h
72h
Temps (h)
Temps (h)
26
27
Outils de détection in vivo de la transdifférenciation
• Phénomène souvent rare!
• Localisation préférentielle selon origine de la stimulation?
(ex: détection de marqueurs de TEM au voisinage d’une lésion épithéliale
ou d’une rupture de la membrane basale)
• Mise en évidence de cellules exprimant de façon concomitante des
marqueurs du phénotype originel et du nouveau phénotype
(voir marqueurs in vitro)
- Echelle protéique: Immunohistochimie/Immunofluorescence ±
microscopie confocale
- Echelle transcriptionnelle: hybridation in situ
27
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Ex: implication de la TEM dans le remodelage
des voies aériennes
Agressions répétées des
voies aériennes
Macrophage
Réparation
anormale
Epithélium
Eosinophile
(accumulation,
activation)
Synthèse de médiateurs inflammatoires,
fibrogéniques et MMPs
Fibroblaste
(activation, prolifération,
différenciation en myofibroblaste)
Inflammation
Remodelage bronchique
et alvéolaire
Trouble ventilatoire obstructif
(asthme, BPCO)
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Indices de TEM dans l’asthme?
• Augmentation de l’expression de TGF-1 (et corrélation avec épaisseur
lame basale et hyperéactivité bronchique)
• Altération de la barrière épithéliale (  E-cadhérine/ ZO-1,  cohésion)
• Accumulation de (myo)fibroblastes au niveau sous-épithélial
• Activation de la voie du TGF-1 au niveau
des cellules épithéliales bronchiques :
- Augmentation de l’expression de
phospho-Smad-2
- Diminution de l’expression de
Smad-7 (augmentation de la
sensibilité au TGF-1 ?)
29
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Recherche de TEM dans l’asthme (1)
Problème: Marquage avec anticorps
anti-Pan-cytokératine =
non spécifique des cellules
épithéliales!
(marque les cellules endothéliales et
cellules musculaires)
Pan-Cytokératine
Vimentine
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Implication de la TEM dans l’asthme (2)
CK5
Ajuster en fonction du tissu:
Cytokératine 5 = spécifique des
cellules épithéliales bronchiques
basales
Vimentine
31
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TEM et fibrose pulmonaire idiopathique
-SMA
TTF-1
Pro-SP-B
(Willis et coll., Am J Pathol 2005)
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TEM et rejet de greffe pulmonaire
(Borthwick et coll., Thorax 2009)
33
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Mise en évidence in vivo de la transdifférenciation:
modèles animaux
± Tag du phénotype originel
pour suivi au niveau tissulaire
(ex: cellules épithéliales/
promoteur SPC)
Stress tissulaire/
surexpression cellule-spécifique de
facteurs de transcription
(ex: Expression épithéliale
de Snail sous promoteur CC-10)
Inhibition de la signalisation
intracellulaire
(ex: voie TGF-1/Smad-3 KO,
Administration de BMP-7)
Marqueurs de transdifférentiation
‘Read-out’ du modèle: conséquence tissulaire
- Induction du phénomène recherché? (ex: fibrose)
- Altération de la fonction tissulaire? (ex: obstruction bronchique)
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Ex: TEM dans un modèle murin de fibrose rénale
Tag des hépatocytes:
Gène reporter LacZ sous promoteur de l’albumine
 ‘pistage’ au niveau des tissus fibrosés
30% des fibroblastes issus de l’épithélium!
+ Réversion par l’antagoniste du TGF-1: BMP-7
(Zeiberg et coll., J Biol Chem 2007)
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Ex: Conversion des cellules  en cellules  du pancréas
Tag des cellules :
Gène reporter YFP  ‘pistage’ au cours de la régénération de cellules 
65% des cellules insuline + sont YFP+ (90% sont co-expriment le glucagon)
(Thorel et coll., Nature 2010)
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La transdifférenciation sur la toile
The EMT International Association:
http://www.mtci.com.au/TEMTIA/TEMT-Assn.html
Congrès bis-annuel, 10-13 octobre 2011: Singapour
- Série de revues sur la TEM: J. Clin. Invest. Juin 2009: 119(6)
(Kalluri R. EMT: when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells
Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition
Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M, Nieto MA. Epithelial-mesenchymal
transitions: the importance of changing cell state in development and disease
Zeisberg M, Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions)
- Revue sur la régénération tissulaire: Nature Reviews - Genetics.
Octobre 2010: 11
Poss KD. Advances in understanding tissue regenerative capacity and
mechanisms in animals
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