bioelisa bioelisa anti-HBc

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bioelisa
bioelisa anti-HBc
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3000-1102
1 x 96 TESTS
ELISA test for the detection of total antibodies to hepatitis B core antigen (anti-HBc) in human serum or plasma.
Summary
Hepatitis B is a disease produced by a viral infection during which many serological markers appear. One of these
markers is the anti-HBc. The hepatitis B core antigen (HBcAg) is an internal component of hepatitis B virus which is
antigenically distinct from hepatitis B surface antigen (HBsAg). HBcAg/anti-HBc antigen-antibody system was
described by Almeida et al. in 1971.1 Antibodies to HBcAg (anti-HBc) are the first to be developed in the course of
an acute hepatitis B infection and may persist for life. Anti-HBc can usually be detected in the blood just after the
detection of HBsAg and before the onset of clinically apparent hepatitis. In acute hepatitis B with recovery, anti-HBc
is the only serological marker of infection in the period between HBsAg clearance and the appearance of anti-HBs.
Blood donations taken at this stage may be infectious and it has been suggested that screening for anti-HBc as
well as for HBsAg might further reduce the incidence of post transfusion hepatitis B.4 On the other hand, the
screening for anti-HBc should also be performed on any individual before the administration of hepatitis B vaccine
to know the immune status in order to vaccinate only the anti-HBc negative individuals. Furthermore several reports
have shown a correlation between the presence of anti-HBc in donated blood and the incidence of transfusion
associated non-A non-B hepatitis (NANBH or hepatitis C).7,8,9 With the implementation of anti-HBc screening of
blood donors, many of these cases could be prevented.
Principle
bioelisa anti-HBc is a competitive immunoenzymatic method for determination of antibodies to HBcAg in human
serum. The assay is based on a competition between human antibodies present in the sample and rabbit IgG antiHBc conjugated to peroxidase (HRP) when they are simultaneously incubated in a well coated with recombinant
HBcAg. After incubation and washing to remove unbound material, an enzyme substrate solution containing a
chromogen is added. This solution will develop a blue colour if the sample is negative. The blue colour changes to
yellow after blocking the reaction with sulphuric acid. The presence of anti-HBc in the sample will reduce the
development of colour proportionally to its concentration.
Components
1. MCPL MICROPLATE:
12 x 8 wells coated with recombinant HBcAg (E. coli). Individually separable wells.
2.
CONJ CONJUGATE:
1 x 6 ml of rabbit IgG anti-HBc conjugated to peroxidase. Contains red dye, stabilisers protein, 0.02%
thimerosal and 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use.
3.
WASH SOLN 10x CONCENTRATE WASHING SOLUTION:
2 x 50 ml of concentrate phosphate buffer (10x) containing 1% Tween 20 and 0.01% thimerosal. To be diluted
1/10 in distilled or deionised water before use.
4.
SUBS BUF SUBSTRATE BUFFER:
1 x 14 ml of citrate-acetate buffer containing hydrogen peroxide.
5.
SOLN TMB CHROMOGEN:
1 x 1.5 ml of 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) dissolved in dimethylsulphoxide (DMSO).
6.
CONTROL + POSITIVE CONTROL:
1 x 2 ml of rabbit IgG anti-HBc diluted in phosphate buffer. Contains stabilisers protein and 0.001% gentamicin
sulphate. Ready to use.
7.
CONTROL – NEGATIVE CONTROL:
1 x 3.5 ml of human serum negative for all HBV markers containing 0.001% gentamicin sulphate. Ready to use.
8.
H2SO4 1N STOPPING SOLUTION:
1 x 12 ml of 1N sulphuric acid. Ready to use.
9.
SEALS ADHESIVE SEALS:
To cover the microplate during incubations.
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
1
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bioelisa
10. BAG RESEALABLE BAG:
For storage of unused strips.
Precautions
bioelisa anti-HBc is intended for IN VITRO diagnostic use.
For professional use only.
WARNING: POTENTIALLY BIOHAZARDOUS MATERIAL.
All human source material used in the preparation of this product was found to be negative for the presence of
HIV-1/HIV-2 and HCV antibodies, as well as for the hepatitis B surface antigen, using a commercial licensed
method. Nevertheless, because no test method can offer complete assurance of the absence of infectious agents,
this product should be handled with caution:
-
-
Avoid contact of reagents with the eyes and skin. If that occurs, wash thoroughly with water.
Wear gloves.
Do not pipette by mouth.
Do not smoke.
Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container. Remains of samples, controls,
aspirated reagents and pipette tips should be collected in a container for this purpose and autoclaved 1 hour
at 121°C or treated with 10% sodium hypochlorite (final concentration) for 30 min before disposal. (Remains
containing acid must be neutralised prior addition of sodium hypochlorite).
Certain reagents in this kit contain sodium azide as preservative. Sodium azide may react with lead or copper
pipes and plumbing creating highly explosive metal azides. Flush drains with water thoroughly after disposing
of the remains of reagents.
Handling instructions:
-
Adjust washer to the plate used (flat bottom) in order to wash properly.
Do not mix reagents from different lots.
Do not use reagents after expiration date.
Do not use the reagent if you observed any change in appearance of components included in the kit.
Extreme care should be taken to avoid microbial contamination and cross contamination of reagents.
Use a new pipette tip for each specimen and each reagent.
It is very important to prepare the substrate-TMB solution just 5-10 minutes before use. Keep it in a
well-sealed container and avoid light exposure.
Soaps and/or oxidising agents remaining in containers used for preparation of substrate-TMB solution can
interfere with the reaction. If glass containers are used to prepare the solution, they should be washed with 1N
sulphuric or hydrochloric acid, rinsed well with distilled water and dried before use. We recommend using
disposable plastic containers.
Storage and stability
The components will remain stable through the expiration date shown on the label if stored between 2-8°C. The
bag containing the microplate should be brought to room temperature before opening to avoid condensation in the
wells. Once opened the bag, microplate strips are stable for 3 months at 2-8°C in the plastic bag tightly sealed, with
the silicagel. Once diluted, the washing solution is stable for two weeks if stored between 2-8°C. Store the
chromogen in the dark. As the substrate-TMB solution is not stable once prepared, instructions for its use should
be closely followed.
Material required not provided
Distilled or deionised water.
Multichannel pipettes and micropipettes (50 µl, 100 µl) and disposable tips.
Incubator at 37°C ± 1°C.
Timer.
Microplate reader with a 450 nm filter. Reference filter of 620 or 630 nm is advisable.
Manual or automated wash system.
Sample collection
Use fresh serum or plasma (citrate/EDTA). Other anticoagulants should be evaluated before use. Samples can be
stored at 2-8°C for 3 days. For longer periods, samples should be frozen (-20°C). Avoid repeated freezing and
thawing. Samples showing visible particulate matter should be clarified by centrifugation. Serum or plasma samples
should not be heat inactivated, since that may cause incorrect results. Samples should not contain sodium azide.
2
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bioelisa
Automatic processing
Automated or semi-automated assay may be used with different instruments. It is very important to validate any
automated system to demonstrate that results obtained for samples are equivalent to the ones obtained using
manual assay. It is recommended that the user validate periodically the instrument. If there is any difficulty in the
setting of Biokit automatic processors, please contact your distributor.
PROCEDURE (See procedural flow chart)
Previous operations
Allow all the reagents to reach room temperature (20-25°C) before running the assay.
Gently mix all liquid reagents before use.
Dilute the concentrate washing solution 1/10 with distilled or deionised water. For one plate, mix 50 ml of the concentrate
solution with 450 ml of water. If less than a whole plate is used, prepare the proportional volume of solution.
Assay procedure
1. Use only the number of strips required for the test. Reserve 7 wells for blank and controls. Transfer 50 µl of
negative control to 4 wells and 50 µl of positive control to 2 wells. Leave a well empty for the substrate blank.
2.
Transfer 50 µl of each sample to be tested into the appropriate wells.
3.
Add 50 µl of conjugate solution into each well, except the one reserved for substrate blank.
4.
Cover the plate with the adhesive seal, mix gently and incubate for 1 hour at 37°C.
5.
During the last 5-10 minutes of this incubation prepare the substrate-chromogen solution. If the entire plate is
used add 280 µl of chromogen (TMB) to the bottle containing the substrate buffer (14 ml) and mix well. If the
entire plate is not used, follow table 1. The final solution should be colourless; discard if it becomes blue.
TABLE 1
Strips required
Substrate buffer ml
Chromogen (TMB) µl
1
1.0
20
2
2.0
40
4
4.0
80
6
6.0
120
8
8.0
160
10
10.0
200
12
12.0
240
NOTE: The TMB is dissolved in DMSO. As the melting point of the DMSO is 18°C, the chromogen solution should
be allowed to reach a temperature of 20-25°C, and be well mixed before use. A yellowish colour is normal
for the chromogen solution.
6.
Remove and discard the adhesive seal. Aspirate the contents of the wells and fill them completely
(approximately 350 µl) with the diluted washing solution. Repeat the process of aspiration and washing 3 more
times. Ensure that each column of wells soaks for at least 15 seconds before the next aspiration cycle. After
the last washing blot the microplate on absorbent tissue to remove any excess liquid from the wells.
7.
Add 100 µl of substrate-TMB solution to each well, including the blank.
8.
Incubate for 30 minutes at room temperature (20-25°C).
9.
Stop the reaction by adding 100 µl of stopping solution in the same sequence and time intervals as for the
substrate-TMB.
10. Blank the reader at 450 nm with the blank well and read the absorbance of each well, within 30 minutes. It is
recommended to read in bichromatic mode using a 620 - 630 nm reference filter.
Quality control
Results of an assay are valid if the following criteria are accomplished:
1.
Substrate blank: absorbance value must be less than or equal to 0.100.
2.
Negative control: each of the individual absorbance values must not differ more than 20% of the mean of the
four values. The mean absorbance must be equal to or higher than 0.600 after subtracting the blank.
3.
Positive control: the mean absorbance value must equal to or less than 0.100 after subtracting the blank.
3
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bioelisa
Results
1. Calculate the cut-off value by adding the mean absorbance of the negative control to the mean absorbance of
the positive control and multiplying this result by 0.4.
Cut-off = (NCx + PCx) x 0.4
2.
Divide the sample absorbance by the cut-off value.
Positive:
Negative:
Equivocal:
ratio absorbance/cut-off ≤ 1.0
ratio absorbance/cut-off > 1.1
ratio absorbance/cut-off > 1.0 ≤ 1.1
Interpretation of the results
A positive result for anti-HBc means that the individual has been infected by the hepatitis B virus. It is not a marker
of immunity. A negative result indicates that the sample evaluated doesn’t contain anti-HBc or contains it in a
concentration lower than the analytical sensitivity of the kit. To evaluate the general state of a patient concerning
hepatitis B, additional tests to other serological markers should be performed.
Limitations of the procedure
As with other serological tests, the results obtained with bioelisa anti-HBc serve only as an aid to diagnosis and
should be interpreted taking into consideration the patients’ clinical history.
Optimal assay performance requires strict adherence to the assay procedure described. Deviation from the
procedure may lead to aberrant results.
Specimens with an anti-HBc concentration lower than 1.5 U/ml (PEI or WHO standard) may not be detected.
Any positive or equivocal sample should be retested and should be investigated for other serological markers of HBV.
Expected results
Anti-HBc antibody is the most frequent marker of hepatitis B virus infection and is found in acute, chronic or
resolved infection. The prevalence of anti-HBc and other markers of Hepatitis B infection vary widely in the world,
from high (70-90%, Africa, Asia and Western Pacific) to intermediate (20-55%, Southern and Eastern Europe) and
low (4-6%, Western Europe, North America and parts of South America). Different studies reported a prevalence
ranging from 0.53% to 2.16% on blood donors from United Kingdom.2,5,6
Performance characteristics
Analytical sensitivity
The limit of detection of the bioelisa anti-HBc kit is 1.5 units/ml using the anti-HBc reference serum from Paul
Ehrlich Institute (PEI), Germany. According to internal studies 1.0 PEI-U/ml is equivalent to approximately 1.0 IU/ml
of the WHO First International Standard for anti-HBc (NIBSC code 95/522).
Evaluations
The performance of bioelisa anti-HBc was evaluated in comparative studies with other commercial assays.
-
In an internal evaluation, 233 samples that were anti-HBc positive with another commercial assay (76 of which
were also positive for HBsAg) were tested with the bioelisa anti-HBc. 227 gave positive result (including the
76 HBsAg positive) and 6 were negative. The 6 discrepant samples were tested with a third commercial assay
and results were also negative.
-
In an external evaluation in comparison with other commercial assay, 175 samples were tested. 31 were
positive and 141 were negative with both assays. An overall agreement of 98.3% (172/175) was obtained.
Eliminating 2 equivocal samples from calculations, relative sensitivity was 100% (31/31) and relative specificity
was 99.2%.
-
In another external evaluation, 251 HBsAg positive samples were tested. 247 (98.4%) were reactive with the
bioelisa anti-HBc, from which 245 were also reactive with the alternative routine anti-HBc test. 4 samples were
anti-HBc negative with the bioelisa and with the routine test and 2 were positive only with the bioelisa.
Therefore, the relative sensitivity of bioelisa was 100% (245/245) and the overall agreement between both
methods was 99.2% (249/251).
4
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bioelisa
-
In another external evaluation, 5058 samples from consecutive routine blood donors were tested in parallel with
the bioelisa and the routine method. From these samples, 6 were reactive with both the bioelisa and the routine
test, 5 of which were confirmed as past infection after further tests for other HBV markers while 1 was positive
for anti-HBc only. Other 3 samples were repeatedly positive with the bioelisa and negative with the routine test,
2 of which were considered as false positives and 1 was inconclusive after additional tests. Considering as true
positives only the samples confirmed as being of past infection, the specificity found was 99.92% (5049/5053).
-
Another external evaluation concerning end-point sensitivity and performance comparing to other commercial
assays is in Bibliography.3
Precision
Intra-assay reproducibility:
The coefficient of variation obtained for the absorbance values of a negative sample assayed in 48 replicates were
4.34%, 4.19% and 3.66% in three lots studied.
Inter-assay reproducibility:
Three negative samples were tested in 3 different assays. The coefficients of variation obtained for the ratios
absorbance/cut-off of the 3 samples were 4.9%, 7.0% and 8.2% respectively.
Interferences
To study possible interferences, samples with potential risk of producing cross reaction were tested, including sera
positive for Rheumatoid Factor (RF), anti-nuclear antibodies (ANA), heterophiles antibodies, anti-HAV IgM,
anti-E. coli and from pregnant women. No evidences of interference were observed.
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bioelisa
bioelisa: Troubleshooting guide
Problem
Possible causes
Solution
1. Controls out of
validation.
1a. Incorrect temperature,
incubation or pipetting.
1b. Improper preparation of
reagents, error of dilution,
reagents not well mixed.
1c. Cross-contamination of
controls.
Check procedure. Repeat
assay.
assay.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. No colour or only a light
colour developed at the
end of the assay.
2a.
2b.
2c.
2d.
Pipette carefully. Do not
interchange caps. Repeat
assay.
Incorrect reading filter.
Check that the wavelength of
the filter used is 450 nm. If no
reference filter of 620-630 nm
is used, absorbance
increases approximately
0.050.
Interference in the optical Check the reader. Clean or
pathway.
dry the bottom of wells. Check
for air bubbles. Repeat
reading.
Used components from
Do not use components from
different lots.
different lots as they are
adjusted for each batch
released.
Expired reagents.
Check the kit expiration date.
Use a non-expired kit.
One or more reagents not Check procedure. Repeat
added or added in wrong assay.
sequence.
Inactive conjugate:
Check for contamination.
improper conservation.
assay.
Inactive microplate:
Always keep unused strips in
improper conservation.
the bag very well closed, with
the desiccant inside. Repeat
assay.
Inactive substrate:
Always use a freshly prepared
improper conservation or
dilution of TMB in substrate
dilution, the container used buffer. Use disposable
affects substrate stability,
containers or wash with acid
cross-contamination with
or ethanol and rinse with
the stopping solution.
deionised water before
re-use. Recheck procedure.
Repeat assay.
6
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bioelisa
bioelisa: Troubleshooting guide
Problem
Possible causes
Solution
3. Too much colour in all
microplate wells.
3a. Contaminated, oxidised
or improperly prepared
substrate.
Check that substrate is
colourless, discard if blue.
Make sure that TMB is
completely liquid before using.
Make sure that TMB is well
mixed in the substrate buffer.
Use acid or ethanol washed
or disposable vials or
containers. Repeat assay.
Check for contamination:
turbid aspect. Check dilutions.
Repeat assay.
Check the quality of distilled
or deionised water used for
dilution. Repeat assay.
Check the washer. Fill wells
with washing solution close to
the top, aspirate completely.
Increase the number of
wash cycles. After washing,
blot the inverted microplate on
tissue paper. Repeat assay.
3b. Contaminated or
improperly prepared
reagents.
3c. Contaminated washing
solution (1x).
4. Poor reproducibility
or high number
of non-repeatable
reactive samples.
3d. Insufficient washing or
washing not consistent:
filling volume and/or
aspiration insufficient or
not uniform. Insufficient
number of washing
cycles, contaminated
washer.
3e. Using of a washing
solution from other
manufacturer.
4a. Washing problems.
4b. Uncalibrated pipettes or
tips not well fitted.
Improper pipetting.
4c. Reagents and sera not at
room temperature or not
well mixed before using.
Use only biokit washing
solution.
See 3c, 3d, 3e.
Use only calibrated pipettes,
with well fitted tips and pipette
carefully, without bubbles and
splashing. Repeat assay.
Equilibrate reagents and
samples to room temperature
and mix thoroughly before
using.
Keep the microplate protected
from air currents.
4d. Air currents over the
microplate during
incubations.
4e. Too long time for addition Develop consistent and
of samples and/or
uniform technique.
reagents. Inconsistency in
time intervals. Air
bubbles.
4f. Interference in the optical See 1e.
pathway.
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bioelisa
LEER CAMBIOS SOMBREADOS
bioelisa anti-HBc
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1 x 96 TESTS
Test de ELISA para la detección de anticuerpos totales contra el antígeno core de la hepatitis B (anti-HBc)
en suero o plasma humano.
Sumario
La hepatitis B es una enfermedad causada por una infección vírica. A lo largo de la infección aparecen varios
marcadores serológicos entre los cuales está el anti-HBc. El antígeno "core" de la hepatitis B (HBcAg) es un
componente interno del virus de la hepatitis B antigénicamente distinto al antígeno de superficie (HBsAg). Este
sistema antígeno-anticuerpo HBcAg/anti-HBc fue descrito por Almeida y col. en 1971.1 El anti-HBc es el primer
anticuerpo detectable en el curso de una hepatitis B aguda y puede persistir durante toda la vida. El anti-HBc suele
detectarse en sangre inmediatamente después de la detección de HBsAg y justo antes de la aparición de las
manifestaciones clínicas de la enfermedad. En casos de hepatitis B aguda con recuperación, el anti-HBc es el
único marcador de la infección detectable en el período entre la desaparición de HBsAg y la aparición de anti-HBs.
La sangre extraída de un individuo durante este período puede ser infectiva y se ha sugerido que el cribado para
anti-HBc además del cribado para HBsAg en donantes, permitiría reducir la incidencia de hepatitis B
postransfusionales.4 Por otra parte, la detección de anti-HBc es útil en exámenes prevacunales ya que sólo es
necesario que se vacunen contra la hepatitis B aquellos individuos negativos para anti-HBc. Varios estudios han
demostrado una correlación entre la presencia de anti-HBc en donaciones sanguíneas con la aparición de
hepatitis no A no B (NANBH o hepatitis C) postransfusional.7,8,9 La implementación del cribado para anti-HBc en
donantes de sangre podría prevenir muchos de estos casos.
Principio
bioelisa anti-HBc es un método inmunoenzimático competitivo para la determinación de anticuerpos contra el
HBcAg en suero humano. El ensayo está basado en la competencia entre anticuerpos humanos presentes en la
muestra y anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa cuando se incuban simultáneamente en
los pocillos de una microplaca recubierta con HBcAg recombinante. Después de la incubación se efectúa un
lavado para eliminar el material no fijado y a continuación se añade una solución de sustrato enzimático y
cromógeno. Esta solución desarrollará un color azul cuando la muestra sea negativa. El color azul cambia a
amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico La presencia de anti-HBc en la muestra reduce el
desarrollo de color de forma proporcional a su concentración.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocillos recubiertos con antígeno recombinante HBcAg (E. coli). Pocillos separables individualmente.
2.
CONJ CONJUGADO:
1 x 6 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo,
proteínas estabilizadoras, mertiolato sódico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.
3.
WASH SOLN 10x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA:
2 x 50 ml de tampón fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sódico al 0,01%. A
diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse.
4.
SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO:
1 x 14 ml de tampón citrato-acetato que contiene peróxido de hidrógeno.
5.
SOLN TMB CROMÓGENO:
1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO).
6.
CONTROL + CONTROL POSITIVO:
1 x 2 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc diluidos en tampón fosfato. Contiene proteínas estabilizadoras
y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.
7.
CONTROL – CONTROL NEGATIVO:
1 x 3,5 ml de suero humano negativo para todos los marcadores de la hepatitis B. Contiene sulfato de
gentamicina al 0,001%. Listo para usar.
8.
H2SO4 1N SOLUCIÓN DE PARADA:
1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Listo para usar.
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bioelisa
9.
SEALS LÁMINAS ADHESIVAS:
Para cubrir la microplaca durante las incubaciones.
10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO:
Para guardar las tiras sin usar.
Precauciones
bioelisa anti-HBc es para el diagnóstico IN VITRO.
Para uso exclusivo por profesionales.
ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO.
Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la
presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la
hepatitis B, utilizando un método comercial autorizado. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la
total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución:
-
-
No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante
cantidad de agua.
Usar guantes.
No pipetear ningún reactivo con la boca.
No fumar.
Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos
de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente
destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121°C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración
final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir
el hipoclorito sódico).
Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar
con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar
los restos de reactivos, deje correr agua abundante.
Precauciones de manejo:
-
Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado.
No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes.
No usar los reactivos una vez hayan caducado.
No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit.
Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre
los reactivos.
Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo.
Es muy importante preparar la solución de sustrato-TMB justo 5-10 minutos antes de ser empleada.
Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz.
Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución
sustrato-TMB, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es
conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos
antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable.
Conservación y estabilidad
Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan
entre 2-8°C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar
condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8°C en
la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable
durante dos semanas si se conserva entre 2-8°C. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustratoTMB una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su
utilización.
Material necesario no incluido
Agua destilada o desionizada.
Pipetas multicanal y micropipetas (50 µl, 100 µl) y puntas desechables.
Incubador a 37°C ± 1°C.
Cronómetro.
Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 o 630 nm.
Sistema de lavado manual o automático.
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Recolección de la muestra
Usar suero fresco o plasma (citrato/EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las
muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8°C. Si es por un período de tiempo más largo las
muestras deben ser congeladas (-20°C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente.
Partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por
calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. No utilizar muestras que contengan azida sódica.
Procesamiento automático
Esta prueba permite su uso de modo automático o semi-automático en diferentes instrumentos. Es muy importante
validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son
equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente
el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de
Biokit, por favor contacte con su distribuidor.
PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento)
Operaciones previas
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de empezar el ensayo.
Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos.
Diluir la solución de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa mezclar 50 ml de
solución de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa preparar el
volumen proporcional de solución.
Realización de la prueba
1. Utilizar solamente el número de tiras necesario para el test. Reservar 7 pocillos para blanco y controles.
Transferir 50 µl de control negativo a 4 pocillos y 50 µl de control positivo a 2 pocillos. Dejar vacío un pocillo
para el blanco de sustrato.
2.
Transferir 50 µl de cada una de las muestras a analizar a los pocillos correspondientes.
3.
Añadir 50 µl de conjugado a cada pocillo, a excepción del pocillo para el blanco de sustrato.
4.
Cubrir la placa con una lámina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37°C.
5.
Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato-cromógeno. Para una
placa añadir 280 µl de la solución de cromógeno (TMB) a un vial de tampón sustrato (14 ml) y mezclar bien.
Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria según indica la tabla 1. La solución final debe ser
incolora, descartar en caso de que se vuelva azul.
TABLA 1
Tiras requeridas
Tampón sustrato ml
Cromógeno (TMB) µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
10
10,0
200
12
12,0
240
NOTA: El TMB está disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es de 18°C, el cromógeno
debe alcanzar una temperatura de 20-25°C y agitarse bien antes de usarlo. Es normal que el cromógeno
presente un color amarillento.
6.
Desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente
(aproximadamente 350 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración lavado 3 veces
más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo
ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para
eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos.
7.
Añadir 100 µl de sustrato-TMB a todos los pocillos, incluso el blanco.
8.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).
9.
Añadir 100 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos
intervalos observados en la adición del sustrato-TMB.
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bioelisa
10. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos
en el plazo máximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromática utilizando filtro de referencia de
620 - 630 nm.
Control de calidad
Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios:
1.
Blanco del sustrato: el valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0,100.
2.
Control negativo: cada uno de los valores individuales de absorbancia no debe variar más del 20% de la
media de los cuatro valores. La media de las absorbancias deber ser igual o mayor que 0,600 después de
restar el blanco.
3.
Control positivo: la media de las absorbancias debe ser igual o menor que 0,100 después de restar el blanco.
Resultados
1. Calcular el valor umbral sumando el valor promedio de absorbancias del control negativo y el del control
positivo y multiplicando el resultado de esta suma por 0,4.
Valor umbral = (CNx + CPx) x 0,4
2.
Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral.
Positivo:
Negativo:
Dudoso:
ratio absorbancia/valor umbral ≤ 1,0
ratio absorbancia/valor umbral > 1,1
ratio absorbancia/valor umbral > 1,0 ≤ 1,1
Interpretación de los resultados
Un resultado positivo para anti-HBc significa que el paciente ha contraído la hepatitis B alguna vez previamente.
No es un marcador de inmunidad. Un resultado negativo significa que la muestra analizada no contiene anti-HBc o
lo contiene por debajo del límite de detección del kit. Para evaluar la situación de un paciente respecto a la
hepatitis B deben practicarse los tests para los demás marcadores serológicos de la hepatitis B.
Limitaciones del procedimiento
Como ocurre con otras pruebas serológicas, los resultados obtenidos con el bioelisa anti-HBc sirven solamente
como ayuda al diagnóstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clínica del paciente.
Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier
desviación puede dar origen a resultados aberrantes.
Muestras con una concentración de anticuerpos anti-HBc inferior a 1,5 U/ml (estándar PEI o WHO) pueden no
detectarse.
Todas las muestras positivas o dudosas se deberían repetir y probarse para otros marcadores serológicos del
HBV.
Resultados esperados
El anticuerpo anti-HBc es el marcador más frecuente de infección por el virus de la hepatitis B y se detecta tanto
en la infección aguda como en la crónica y en la infección pasada con recuperación. La prevalencia de anti-HBc y
de otros marcadores de la hepatitis B varía ampliamente en el mundo, de alta (70-90%, ej., África, Asia y Pacífico
Oeste) a intermediaria (20-55%, ej., sur y este Europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, América del Norte y
partes de América del Sur). Diferentes estudios han descrito una prevalencia del 0,53 al 2,16% en donantes de
2,5,6
sangre del Reino Unido.
Características funcionales
Sensibilidad analítica
El límite de detección del bioelisa anti-HBc es 1,5 unidad/ml utilizando el suero de referencia anti-HBc del Paul
Ehrlich Institute (PEI), Alemania. Según estudios internos, 1,0 PEI-U/mL equivale a aproximadamente 1,0 UI/mL
del primer Estándar Internacional de la OMS para anti-HBc (código NIBSC 95/522).
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bioelisa
Evaluaciones
El funcionamiento del bioelisa anti-HBc se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales.
-
En una evaluación interna se probaron 233 muestras que eran positivas de anti-HBc con otro ensayo comercial
(76 de ellas eran también positivas de HBsAg). 227 presentaron resultado positivo (incluso las 76 positivas de
HBsAg) y 6 presentaron resultado negativo. Las 6 muestras discrepantes se probaron con un tercero ensayo
comercial y los resultados fueron también negativos.
-
En una evaluación externa en comparación con otro ensayo comercial, se probaron 175 muestras. 31 fueron
positivas y 141 fueron negativas con ambos ensayos. Se obtuvo una concordancia global del 98,3% (172/175).
Eliminándose 2 muestras dudosas de los cálculos, la sensibilidad relativa fue del 100% (31/31) y la
especificidad relativa fue del 99,2%.
-
En otra evaluación externa, se probaron 251 muestras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) fueron reactivas con el
bioelisa anti-HBc, de las cuales 245 fueron reactivas también con el método alternativo utilizado en rutina para
anti-HBc. 4 muestras fueron anti-HBc negativas con el bioelisa y con el método en rutina y 2 fueron positivas
solamente con el bioelisa. Por tanto, la sensibilidad relativa del bioelisa fue del 100% (245/245) y la
concordancia global entre ambos métodos fue del 99,2% (249/251).
-
En una otra evaluación externa, 5058 muestras consecutivas de donantes de sangre habituales se probaron en
paralelo con el bioelisa y con el método en rutina. De estas muestras, 6 fueron reactivas tanto con el bioelisa
como con el método en rutina, 5 de las cuales se confirmaron 5 como de infección pasada después de
realizarse tests adicionales para otros marcadores de HBV. mientras que 1 era positiva solamente para
anti-HBc. Otras 3 muestras fueron repetidamente positivas con el bioelisa y negativas con el test en rutina
siendo 2 de ellas consideradas como falsamente positivas y 1 de resultado inconclusivo después de realizar
tests adicionales. Considerando como positivas verdaderas solamente las muestras confirmadas como de
infección pasada, la especificidad encontrada fue del 99,92% (5049/5053).
-
Otra evaluación externa de sensibilidad a punto final y funcionamiento comparando con otros ensayos
3
comerciales se encuentra en la bibliografía.
Precisión
Reproducibilidad intra-ensayo:
Los coeficientes de variación obtenidos para los valores de absorbancia de 48 replicados de una muestra negativa
fueron del 4,34%, 4,19% e 3,66% en tres lotes estudiados.
Reproducibilidad inter-ensayo:
Tres muestras negativas se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos para los
ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 4,9%, 7,0% y 8,2% respectivamente.
Interferencias
Para estudiar posibles interferencias, se probaron muestras con un riesgo potencial de producir reacciones
cruzadas, tales como sueros positivos de factor reumatoide (RF), anticuerpos anti-nucleares (ANA), anticuerpos
heterófilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli y de mujeres embarazadas. No se observaron evidencias de interferencia.
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bioelisa
bioelisa: Guía de problemas
Problema
Posibles causas
Solución
1. Controles fuera de
validación.
1a. Temperatura, incubación
o pipeteo incorrecto.
1b. Preparación incorrecta de
reactivos, error en las
diluciones. Reactivos no
mezclados
correctamente.
1c. Contaminación cruzada
entre controles.
Comprobar procedimiento.
Repetir el ensayo.
Comprobar procedimiento.
Repetir el ensayo.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. Sin color o poco color al
final del ensayo.
2a.
2b.
2c.
2d.
Pipetear cuidadosamente. No
intercambiar los tapones de
los viales. Repetir el ensayo.
Filtro de lectura
Comprobar que el filtro de
incorrecto.
lectura sea de 450 nm. Si no
se usa filtro de referencia de
620 o 630 nm, las
absorbancias aumentan
aproximadamente
50 miliunidades.
Interferencia en el camino Comprobar el lector. Limpiar o
óptico.
secar el fondo de los pocillos.
Comprobar que no haya
burbujas de aire. Repetir la
lectura.
Se han utilizado
No utilizar componentes de
componentes de lotes
lotes diferentes puesto que
diferentes.
están ajustados para cada
lote en particular.
Reactivos caducados.
Comprobar la caducidad del
kit. No utilizar un kit
caducado.
Uno o más reactivos no
Comprobar el procedimiento.
añadidos o añadidos en
Repetir el ensayo.
secuencia equivocada.
Conjugado inactivo:
Comprobar si ha habido
conservación incorrecta. contaminación, comprobar el
procedimiento. Repetir el
ensayo.
Microplaca inactiva:
Mantener siempre las tiras no
conservación incorrecta. utilizadas en la bolsa minigrip,
bien cerrada, con el
desecante dentro. Repetir el
ensayo.
Sustrato inactivo:
Utilizar siempre una dilución
conservación o dilución
fresca de TMB en tampón
incorrecta, el contenedor sustrato. Usar contenedores
utilizado afecta la
desechables o lavados con
estabilidad del sustrato,
ácido o etanol y enjuagados
contaminación cruzada
con agua desionizada.
con la solución de
Comprobar el procedimiento.
parada.
Repetir el ensayo.
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bioelisa
bioelisa: Guía de problemas
Problema
Posibles causas
Solución
3. Demasiado color en
todos los pocillos de la
microplaca.
3a. Sustrato contaminado,
oxidado o preparado
incorrectamente.
Comprobar que el sustrato
preparado sea incoloro,
descártelo si está azul.
Asegúrese que el TMB está
completamente líquido antes
de utilizarlo. Asegurar la
correcta mezcla del TMB en
el tampón sustrato. Utilizar
viales o contenedores
desechables o lavados con
solución ácida o etanol.
Repetir el ensayo.
Comprobar contaminación
(aspecto turbio). Comprobar
diluciones. Repetir el ensayo.
Comprobar la calidad del
agua destilada/desionizada
utilizada para preparar la
dilución. Repetir el ensayo.
Comprobar el lavador. Llenar
los pocillos hasta el tope y
aspirar completamente.
Incrementar el número de
ciclos de lavado. Golpear la
placa invertida contra papel
absorbente. Repetir el
ensayo.
Utilizar sólo la solución de
lavado de biokit.
3b. Reactivos contaminados
o preparados
incorrectamente.
3c. Solución de lavado (1x)
contaminada.
3d. Lavado insuficiente o no
consistente: llenado o
aspiración insuficiente o
no uniforme, número de
ciclos de lavado
insuficiente. Lavador
contaminado.
3e. Se ha utilizado solución
de lavado de otro
fabricante.
4. Reproducibilidad pobre o 4a. Problemas de lavado.
elevado número de
4b. Pipetas mal calibradas o
muestras reactivas que
puntas mal encajadas.
no se repiten.
Técnica de pipeteo
incorrecta.
4c.
4d.
4e.
4f.
Ver apartados 3c, 3d, 3e.
Utilizar pipetas calibradas con
puntas bien ajustadas.
Pipetear cuidadosamente sin
burbujas ni salpicaduras.
Repetir el ensayo.
Reactivos y muestra no a Atemperar muestras y
temperatura ambiente o
reactivos y mezclarlos bien
no correctamente
antes de utilizarlos.
mezclados antes de usar.
Corrientes de aire sobre
Mantener la microplaca
la microplaca durante las protegida de las corrientes de
incubaciones.
aire.
Demasiado tiempo en la Desarrollar una técnica
adición de muestras y/o
uniforme y consistente.
reactivos. Inconsistencia
en los intervalos de
tiempo, burbujas de aire.
Interferencia en el camino Ver 1e.
óptico.
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bioelisa
HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN
bioelisa anti-HBc
3000-1102
1 x 96 TESTS
ELISA-Test zur Bestimmung der Gesamtantikörper gegen das Kernantigen der Hepatitis B (anti-HBc) in
Humanserum oder –plasma.
Zusammenfassung
Die Hepatitis B ist eine Krankheit, die durch eine Virusinfektion verursacht wird. Im Verlauf der Infektion treten
verschiedene serologische Marker u.a. der Anti-HBc auf. Das „Kern“-Antigen der Hepatitis B (HBcAg) ist ein
interner Bestandteil des Hepatitis B-Virus, das sich unter antigenetischem Gesichtspunkt von dem
Oberflächen-Antigen (HBsAg) unterscheidet. Dieses HBcAg/Anti-HBc-Antigen-Antikörper-System wurde 1971 von
Almeida und Kol.1 beschrieben. Der Anti-HBc ist der erste im Verlauf einer akuten Hepatitis B nachweisbare
Antikörper und kann lebenslang weiterbestehen. Der Anti-HBc-Antikörper lässt sich in der Regel unmittelbar nach
dem Nachweis von HBsAg und genau vor dem Auftreten der klinischen Manifestationen der Krankheit im Blut
nachweisen. In Fällen akuter Hepatitis B mit Erholung ist der Anti-HBc der einzige im Zeitraum zwischen dem
Verschwinden des HBsAg und dem Auftreten des Anti-HBs nachweisbare Infektionsmarker. Das einer Person in
diesem Zeitraum abgenommene Blut kann infektiös sein und es ist vorgeschlagen worden, dass die zusätzliche
Sichtung auf Anti-HBc neben HBsAg bei Spendern das Vorkommen von posttransfusionaler Hepatitis B senken
würde.4 Der Nachweis von Anti-HBc erweist sich zudem bei Untersuchungen vor Impfungen als nützlich, da nur
diejenigen Personen geimpft werden müssen, deren Anti-HBc-Befund negativ ausfällt. Verschiedene Studien
haben einen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Anti-HBc in Blutspenden und dem Auftreten von
Hepatitis weder A noch B (NANBH oder Hepatitis C) nach Transfusionen gezeigt.7,8,9 Die Einführung der Sichtung
der Anti-HBc bei Blutspendern könnte vielen dieser Fälle vorbeugen.
Prinzip
bioelisa anti-HBc ist eine kompetitive enzymimmune Methode, um die HBcAg-Antikörper im Humanserum zu
bestimmen. Der Versuch basiert auf dem Wettbewerb zwischen in der Probe vorhandenen menschlichen
Antikörpern und mit Peroxidase konjugierten IgG-Kaninchenantikörpern Anti-HBc, wenn sie gleichzeitig in den
Vertiefungen eines mit rekombinanten HBcAg beschichteten Mikrotiters inkubiert werden. Nach der Inkubation wird
ausgewaschen, um das ungebundene Material zu beseitigen und anschließend wird ein Enzymsubstrat, das zu
einem Farbumschlag führt, hinzugegeben. Diese Lösung wird sich bei einer negativen Probe blau verfärben. Die
blaue Farbe wird gelb, nachdem die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt worden ist. Das Vorhandensein von
Anti-HBc in der Probe mindert die Verfärbung direkt proportional zu seiner Konzentration.
Bestandteile
1. MCPL MIKROTITERPLATTE:
12 x 8 Vertiefungen, beschichtet mit rekombinantem HBcAg Antigen (E. coli). Einzeln trennbare Vertiefungen.
2.
CONJ KONJUGAT:
1 x 6 ml Peroxidase konjugierte IgG- Kaninchen-HBc-Antikörper. Enthält roten Farbstoff, stabilisierende
Proteine, Thimerosal 0,02% und 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig.
3.
WASH SOLN 10x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG:
2 x 50 ml konzentrierter Phosphatpuffer (10x), der 1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal enthält. Vor Gebrauch
mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/10 verdünnen.
4.
SUBS BUF SUBSTRATPUFFER:
1 x 14 ml Zitrat/Azetat-Puffer mit Wasserstoffperoxid.
5.
SOLN TMB CHROMOGEN:
1 x 1,5 ml 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO). Enthält roten Farbstoff.
6.
CONTROL + POSITIVE KONTROLLE:
1 x 2 ml in Phosphatpuffer gelöste IgG-Kaninchen-HBc-Antikörper. Enthält stabilisierende Proteine und
0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig.
7.
CONTROL – NEGATIVE KONTROLLE:
1 x 3,5 ml für alle Hepatitis-B-Marker negatives Humanserum. Enthält 0,001% Gentamicinsulfat. Gebrauchsfertig.
8.
H2SO4 1N STOPPLÖSUNG:
1 x 12 ml 1N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig.
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bioelisa
9.
SEALS HAFTFOLIE:
Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationsphasen.
10. BAG FOLIENBEUTEL:
Zur Aufbewahrung der nicht verwendeten Streifen.
Vorsichtsmassnahmen
bioelisa anti-HBc ist ausschliesslich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt.
Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal.
ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL.
Das gesamte zur Herstellung dieses Produkts verwendete Humanmaterial ist unter Verwendung eines
zugelassenen kommerziellen Verfahrens auf die Anwesenheit von HBsAg, HIV-1/HIV-2 und HCV Antikörpern
getestet und für negativ befunden worden. Da kein Nachweisverfahren die Abwesenheit von infektiösen Agenzien
garantieren kann, ist dieses Produkt mit entsprechenden Vorsichtsmassnahmen zu handhaben:
-
-
Eine Berührung der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden; bei Berührung mit reichlich Wasser
auswaschen.
Handschuhe verwenden.
Die Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren.
Nicht rauchen.
Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Die Reste von
Proben, Kontrollen, aspirierte Reagenzien und Pipettenspitzen müssen in einem dafür vorgesehenen Behälter
gesammelt werden und eine Stunde bei 121°C autoklaviert werden oder mit Natriumhypochlorit in einer
Endkonzentration von 10% 30 Minuten lang behandelt werden. (Die Reste, die Säure enthalten können,
müssen vor Zugabe des Natriumhypochlorit neutralisiert werden).
Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf
Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und –Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim
Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden.
Hinweise für die Handhabung:
-
Für sachgemäßes Auswaschen den Wascher auf den Mikrotiterplattentyp einstellen (flacher Grund).
Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen nicht mischen.
Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.
Verwenden Sie das Reagenz nicht, wenn Sie an irgendeinem zu dem Kit gehörenden Bestandteil irgendeine
Änderung des Erscheinungsbilds beobachten.
Es ist besondere Sorgfalt aufzuwenden, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Kreuzkontamination
zwischen den Reagenzien zu vermeiden.
Zur Pipettierung jeder Probe und jedes Reagenz ist eine neue Einweg-Pipettenspitze zu verwenden.
Reste von Seifen und/oder Oxidationsmitteln, die in den zur Herstellung der TMB-Substratlösung verwendeten
Gefässe zurückgeblieben sind, können die Reaktion beeinflussen. Bei Verwendung von Glasgefäßen sollten
diese darum mit 1N Schwefelsäure oder Salzsäure ausgewaschen, mit reichlich destilliertem Wasser
ausgespült und vor Gebrauch getrocknet werden. Vorzugsweise sind Einweggefäße aus Kunststoff zu
verwenden.
Lagerung und Stabilität
Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8°C bleiben die Bestandteile bis zum auf dem Etikett angegebenen
Verfallsdatum haltbar. Der Beutel mit der Mikrotiterplatte muss vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht
werden, um eine Kondensationsbildung in den Vertiefungen zu vermeiden. Nach dem Öffnen des Beutels ist die
Mikrotiterplatte bei Lagerung zwischen 2 und 8°C im gut verschlossenen Kunststoffbeutel mit dem Silicagelbeutel
3 Monate haltbar. Die Waschlösung bleibt nach Verdünnung zwei Wochen haltbar, wenn sie bei 2-8°C gelagert
wird. Das Chromogen vor direktem Licht schützen. Die TMB-Substratlösung ist nach Zubereitung nicht stabil,
deshalb sind die Gebrauchsanweisungen sorgfältig zu befolgen.
Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material
Destilliertes oder deionisiertes Wasser.
Mehrkanalpipetten und Mikropipetten (50 µl, 100 µl) und Einwegspitzen.
Inkubator bei 37°C ± 1°C.
Stoppuhr.
Mikrotiterplattenmessgerät mit Filter 450 nm. Empfohlen wird ein Referenzfilter 620 oder 630 nm.
Manuelles oder automatisiertes Waschsystem.
16
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bioelisa
Probenmaterial
Frisches Serum oder Plasma (Zitrat/EDTA) benutzen. Andere Antikoagulantien müssen zuvor evaluiert werden.
Die Proben können 3 Tage lang bei 2-8°C gelagert werden. Bei längerer Lagerung müssen die Proben eingefroren
werden (-20°C). Mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Sichtbare suspendierte
Partikel sind durch Zentrifugieren zu entfernen. Die Seren oder Plasmen dürfen nicht hitzinaktiviert werden, da es
sonst zu falschen Ergebnissen kommen kann. Keine Proben verwenden, die Natriumazid enthalten.
Automatische Verarbeitung
Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten
eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die
erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das
Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der
automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung.
DURCHFÜHRUNG (Siehe schematischer Ablauf)
Vorbereitung
Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur gebracht worden sein (20-25°C).
Flüssige Reagenzien müssen vor Gebrauch vorsichtig gemischt werden.
Die konzentrierte Waschlösung ist mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1/10 zu verdünnen. Für eine
Platte 50 ml konzentrierte Waschlösung mit 450 ml Wasser mischen. Wird nicht die ganze Platte gebraucht, dann
eine proportional entsprechende Menge der Lösung herstellen.
Versuchsprotokoll
1. Nur die für den Test erforderliche Anzahl von Streifen verwenden. 7 Vertiefungen für Leerwert und Kontrolle
reservieren. 50 μl von negativer Kontrolle auf 4 Vertiefungen und 50 μl von positiver Kontrolle auf
2 Vertiefungen hinzugeben. Eine Vertiefung für das Substratsleerwert freilassen.
2.
50 µl von jeder zu analysierenden Probe auf die entsprechenden Vertiefungen überführen.
3.
50 µl des Konjugats auf jede Vertiefung hinzugeben, mit Ausnahme der Vertiefung für die Leerwertsprobe.
4.
Die Platte mit einer Haftfolie abdecken, leicht schütteln und 1 Stunde lang bei 37°C inkubieren.
5.
Während der letzten 5-10 Minuten dieser Inkubation die Substrat-Chromogen-Lösung zubereiten. Bei
Verwendung der ganzen Platte 280 µl der TMB-Chromogen-Lösung in die Reagenzflasche mit Substratpuffer
(14 ml) einfüllen und gut mischen. Wird nicht die ganze Platte benötigt, dann die erforderliche Menge gemäß
Tabelle 1 zubereiten. Die endgültige Lösung muss farblos sein; bei Blaufärbung nicht mehr verwenden.
TABELLE 1
Erforderliche Streifen
Substratpuffer ml
Chromogen (TMB) µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
10
10,0
200
12
12,0
240
HINWEIS: Das TMB ist in DMSO gelöst. Da die Schmelzpunkt von DMSO bei 18°C liegt muss das Chromogen vor
Gebrauch auf eine Temperatur von 20-25°C gebracht und gut gemischt werden. Eine Gelbfärbung der
Chromogenlösung ist normal.
6.
Die Haftfolie abnehmen und entsorgen. Den Inhalt aus den Vertiefungen herauspipettieren und diese
vollständig (ca. 350 µl) mit verdünnter Waschlösung befüllen. Den Vorgang aus Aspirierung und Auswaschen
weitere 3 Mal wiederholen. Stellen sie sicher, dass jede Vertiefungsreihe mindestens 15 Sekunden einweicht,
bevor ein neuer Aspirationszyklus einsetzt. Nach dem letzten Waschen die Platte umgekehrt über
saugfähigem Papier ausklopfen, um alle Flüssigkeitsüberschüsse in den Vertiefungen zu beseitigen.
7.
100 µl des TMB-Substrats auf alle Vertiefungen sogar des Leerwertes hinzugeben.
8.
30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren.
9.
100 µl Stopplösung in jede Vertiefung einfüllen, dabei die gleiche Reihenfolge und die gleichen Zeitabstände
einhalten wie bei der Zugabe des TMB-Substrats.
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bioelisa
10. Das Messgerät anhand der Vertiefung mit der Leerwertsprobe bei 450 nm auf Null stellen und die Extinktion
jeder einzelnen Vertiefung innerhalb einer Zeitspanne von maximal 30 Minuten ablesen. Empfohlen wird eine
biochromatische Messung mit einem Referenzfilter von 620 - 630 nm.
Qualitätskontrolle
Die Ergebnisse einer Serie sind gültig, wenn folgende Kriterien erfüllt sind:
1.
Substratleerwert: der Extinktionsgrad muss unterhalb oder gleich 0,100 sein.
2.
Negative Kontrolle: keiner der einzelnen Extinktionswerte darf mehr als 20% vom Mittelwert der vier Werte
abweichen. Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder höher als 0,600 liegen.
3.
Positive Kontrolle: Der Extinktionsmittelwert muss nach dem Abzug von Leerwert bei oder unter 0,100 liegen.
Qualitative Ergebnisse
1. Schwellenwert berechnen, indem der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle und der der positiven
Kontrolle addiert und das Ergebnis dieser Summe mit 0,4 multipliziert wird.
Schwellenwert = (NKx + PKx) x 0,4
2.
Die Extinktion der Probe durch den Schwellenwert teilen.
Positiv:
Negativ:
Zweifelhaft:
Verhältnis Extinktion/Schwellenwert ≤ 1,0
Verhältnis Extinktion/Schwellenwert > 1,1
Verhältnis Extinktion/Schwellenwert > 1,0 ≤ 1,1
Auswertung der Ergebnisse
Ein positiver Befund auf Anti-HBc bedeutet, dass der Patient sich früher einmal mit Hepatitis B infiziert hat. Es ist
kein Immunitätsmarker. Ein negativer Befund bedeutet, dass die analysierte Probe entweder keine Anti-HBc
aufweist oder dass diese unterhalb der Nachweisgrenze des Kits liegen. Um die Situation eines Patienten im
Hinblick auf Hepatitis B zu bewerten, müssen die Tests für die übrigen serologischen Marker der Hepatitis B
durchgeführt werden.
Begrenzung der Methode
Wie auch bei anderen serologischen Untersuchungen dienen die mit bioelisa anti-HBc ermittelten Resultate als
Hilfe bei der Diagnose und müssen unter Berücksichtigung des klinischen Befunds des Patienten interpretiert
werden.
Für eine optimale Leistung des Kits sind die beschriebenen Anweisungen genauestens zu befolgen. Irgendeine
Abweichung kann zu abwegigen Ergebnissen führen.
Proben mit einer Anti-HBc-Antikörperkonzentration von weniger als 1,5 E/ml (Standard PEI oder WHO) können
nicht nachgewiesen werden.
Alle positiven oder zweifelhaften Proben müssen wiederholt und auf andere serologische HBV-Marker überprüft
werden.
Erwartete Ergebnisse
Der Anti-HBc-Antikörper ist der am häufigsten auftretende Marker für eine Infektion mit dem Virus der Hepatitis B
und er wird sowohl bei der akuten als auch chronischen Infektion sowie einer durchgemachten Infektion mit
Erholung nachgewiesen. Die Prävalenz von Anti-HBc und sonstigen Hepatitis-B-Markern schwankt weltweit sehr
stark, von hoch (70-90%, z.B. Afrika, Asien und Westpazifik) über mittel (20-55%, z.B. Süd- und Osteuropa bis
niedrig (4-6%, z.B. Westeuropa, Nordamerika und Teile Südamerikas). Verschiedene Studien haben bei
2,5,6
Blutspendern im Vereinigten Königreich eine Prävalenz von 0,53 bis 2,16% beschrieben.
Charakteristika des Tests
Analytische Sensibilität
Die Nachweisgrenze des bioelisa anti-HBc beträgt 1,5 Einheit/ml, wenn das Referenz-Anti-HBc-Serum des
Paul-Ehrlich-Instituts (PEI), Deutschland, benutzt wird. Nach internen Studien, 1,0 PEI-U/mL entspricht etwa 1,0
IU/mL der WHO Erste Internationalen Standard für Anti-HBc (NIBSC Code 95/522).
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bioelisa
Auswertungen
Die Leistungsfähigkeit von bioelisa anti-HBc wurde in Vergleichsstudien mit anderen kommerziellen Tests
untersucht.
-
Bei einer internen Auswertung wurden 233 Proben getestet, die mit einem anderen handelsüblichen Test
positiv für Anti-HBc waren (76 von ihnen waren auch positiv für HBsAg). 227 erbrachten ein positives Ergebnis
(sogar die 76 positiven für HBsAg) und 6 ergaben einen negativen Befund. Die 6 abweichenden Proben
wurden mit einem dritten handelsüblichen Test geprüft und die Ergebnisse waren ebenfalls negativ.
-
Bei einer externen Auswertung wurden im Vergleich mit einem anderen handelsüblichen Test 175 Proben
getestet. 31 waren mit beiden Tests positiv und 141 negativ. Man erhielt eine Gesamtkonkordanz von 98,3%
(172/175). Bei Ausschluss von 2 zweifelhaften Proben lag die relative Sensitivität bei 100% (31/31) und die
relative Spezifität bei 99,2%.
-
Bei einer anderen externen Auswertung, wurden 251 positive HBsAg-Proben getestet. 247 (98,4%) reagierten
mit dem bioelisa anti-HBc, von denen 245 ebenfalls mit der routinemäßig für Anti-HBc verwendeten
Alternativmethode reagierten. 4 Proben waren mit dem bioelisa und der Routinemethode Anti-HBc negativ
und 2 waren nur mit dem bioelisa positiv. Somit lag die relative Sensitivität von bioelisa bei 100% (245/245)
und die Gesamtkonkordanz zwischen beiden Methoden betrug 99,2% (249/251).
-
Bei einer anderen externen Auswertung wurden 5058 aufeinanderfolgende Proben von gewöhnlichen
Blutspendern parallel mit bioelisa und der Routinemethode getestet. Von diesen Proben reagierten 6 sowohl
mit bioelisa als auch der Routinemethode, 5 davon wurden nach der Durchführung von zusätzlichen Tests für
sonstige HBV-Marker als zurückliegende Infektion bestätigt, während 1 nur für Anti-HBc positiv ausfiel.
Weitere 3 Proben waren wiederholt positiv mit bioelisa und negativ mit dem Routinetest, wobei 2 von ihnen
nach Durchführung zusätzlicher Tests als falsch positiv und 1 als nicht eindeutiges Resultat eingestuft wurden.
Wenn man die als zurückliegende Infektion bestätigten Proben als tatsächliche positive Befunde ansieht, lag
die gefundene Spezifität bei 99,92% (5049/5053).
-
Eine weitere externe Auswertung der Sensitivität am Endpunkt und Funktionieren mit Vergleich mit anderen
3
handelsüblichen Versuchen, erscheint in der Literatur.
Präzision
Intra-Assay Reproduzierbarkeit:
Die erhaltenen Variationskoeffizienten für die Extinktionswerte einer negativen Probe, die 48 Mal repliziert wurde,
lagen bei 4,34%, 4,19% und 3,66% bei drei untersuchten Chargen.
Inter-Assay Reproduzierbarkeit:
Drei negative Proben unterschiedlichen Niveaus wurden in 3 verschiedenen Tests getestet. Die erhaltenen
Variationskoeffizienten für das Verhältnis Extinktion/Schwellenwert der 3 Proben lagen bei 4,9%, 7,0% und 8,2%.
Interferenzen
Um mögliche Interferenzen zu prüfen, wurden Proben mit einem potenziellen Risiko zur Erzeugung von
Kreuzreaktionen, wie etwa Seren mit positiven Rheumafaktor (RF), Anti-Nuklearen Antikörpern (ANA), heterophilen
Antikörpern, IgM Anti-HAV, Anti-E. coli und von schwangeren Frauen getestet. Es wurden keine Hinweise auf
Interferenzen beobachtet.
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bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung
Problem
Mögliche Ursachen
1. Kontrollen außerhalb der 1a. Temperatur, Inkubation
oder Pipettieren falsch.
Validierung.
1b. Unsachgemäße
Vorbereitung der
Reagenzien, falsche
Verdünnung. Reagenzien
nicht richtig
durchgemischt.
1c. Kreuzkontamination
zwischen Kontrollen.
1d. Falscher Lesefilter.
1e. Interferenz in der Optik.
1f. Es wurden Komponenten
aus unterschiedlichen
Chargen verwendet.
1g. Reagenzien abgelaufen.
2. Keine oder nur schwache 2a. Ein Reagenz oder
mehrere nicht oder in der
Färbung am Ende des
falschen Reihenfolge
Tests.
hinzugefügt.
2b. Konjugat inaktiv:
unsachgemäße
Konservierung.
2c. Mikrotiterplatte inaktiv:
unsachgemäße
Konservierung.
2d. Substrat inaktiv:
unsachgemäße
Konservierung oder
Verdünnung, der
verwendete Behälter
beeinträchtigt die
Stabilität des Substrats,
Kreuzkontamination mit
der Stopplösung.
Lösung
Methode überprüfen. Den
Test wiederholen.
Test wiederholen.
Sorgfältig pipettieren. Die
Reagenzflascheverschlüsse
nicht vertauschen. Den Test
wiederholen.
Überprüfen, ob ein Lesefilter
der Wellenlänge 450 nm
eingesetzt ist. Wird kein
Referenzfilter mit 620-630 nm
eingesetzt, dann erhöht sich
die Extinktion um ca. 0,050.
Das Messgerät überprüfen.
Den Grund der Vertiefungen
reinigen oder trocknen.
Prüfen, ob Luftblasen
eingeschlossen sind. Die
Ablesung wiederholen.
Keine Komponenten aus
unterschiedlichen Chargen
mischen, da diese spezifisch
für jeden Chargen
zusammengestellt sind.
Verfallsdatum des Kits prüfen.
Ein abgelaufenes Kit nicht
mehr verwenden.
Test wiederholen.
Prüfen, ob es zu einer
Kontamination gekommen ist.
Test wiederholen.
Die nicht verwendeten
Streifen sind immer im
verschließbaren Folienbeutel
zusammen mit dem
Trockenmittel aufzubewahren.
Den Test wiederholen.
Immer eine neu zubereitete
TMB-Lösung im
Substratpuffer verwenden.
Einwegbehälter verwenden
oder die Behälter mit Säure
oder Ethanol auswaschen und
mit desionisiertem Wasser
ausspülen. Methode
überprüfen. Den Test
wiederholen.
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bioelisa
bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung
Problem
Mögliche Ursachen
Lösung
3. Zu starke Färbung in
allen Vertiefungen der
Mikrotiterplatte.
3a. Substrat kontaminiert,
oxidiert oder
unsachgemäß
vorbereitet.
Prüfen, ob das vorbereitete
Substrat farblos ist; bei
Blaufärbung nicht mehr
verwenden. Vor Verwendung
das TMB prüfen und
sicherstellen, dass es
vollkommen flüssig ist. Für
eine vollständige
Durchmischung des TMB im
Substratpuffer sorgen.
Einweg-Reagenzgläser oder
–Behälter verwenden oder
diese mit Säure oder Ethanol
auswaschen. Den Test
wiederholen.
Auf Kontamination prüfen
(Trübung). Verdünnungen
prüfen. Den Test wiederholen.
Die Qualität des
destillierten/deionisierten
Wassers zur Herstellung der
Verdünnung prüfen. Den Test
wiederholen.
Wascher prüfen. Die
Vertiefungen bis zum Rand
befüllen und vollständig
aspirieren. Die Anzahl der
Waschzyklen und die
Einweichzeit erhöhen. Die
umgekehrte Platte auf
saugfähigem Papier
ausklopfen. Den Test
wiederholen.
Nur die Waschlösung von
biokit verwenden.
3b. Reagenzien kontaminiert
oder unsachgemäß
zubereitet.
3c. Waschlösung (1x)
kontaminiert.
3d. Waschen ungenügend
oder nicht konsistent:
Füllmenge und/oder
Aspirieren ungenügend
oder nicht einheitlich,
Anzahl der Waschzyklen
ungenügend. Wascher
kontaminiert.
4. Schlechte
Reproduzierbarkeit oder
erhöhte Anzahl reaktiver
Proben, die sich nicht
wiederholen.
3e. Es wurde Waschlösung
von einem anderen
Hersteller verwendet.
4a. Probleme beim Waschen.
4b. Pipetten schlecht
kalibriert oder
Pipettenspitzen nicht
richtig eingesetzt.
Unsachgemäße
Pipettiertechnik.
4c. Reagenzien und Seren
nicht auf Raumtemperatur
oder vor Gebrauch nicht
richtig gemischt.
4d. Mikrotiterplatten während
der Inkubationen der
Zugluft ausgesetzt.
4e. Zuviel Zeit bei der
Zugabe von Proben
und/oder Reagenzien.
Inkonsistente
Zeitintervalle. Luftblasen.
4f. Interferenzen in der Optik.
Siehe Abschnitte 3c, 3d, 3e.
Nur kalibrierte Pipetten mit
richtig eingesetzten
Pipettenspitzen verwenden.
Sorgfältig und ohne Blasen
und Spritzer pipettieren. Den
Test wiederholen.
Reagenzien und Seren auf
Raumtemperatur bringen und
vor Gebrauch gut mischen.
Die Mikrotiterplatte vor Zugluft
geschützt lagern.
Eine einheitliche und
konsistente Technik
entwickeln.
Siehe 1e.
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bioelisa
LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS
bioelisa anti-HBc
3000-1102
1 x 96 TESTS
Test d’ELISA pour la détection des anticorps totaux contre l’antigène du core de l’hépatite B (anti-HBc)
dans du sérum ou du plasma humain.
Sommaire
L’hépatite B est une maladie provoquée par une infection virale. Pendant le processus infectieux, plusieurs
marqueurs sérologiques apparaissent, dont l’anti-HBc. L’antigène "core" de l’hépatite B (HBcAg) est un composant
interne du virus de l’hépatite B antigéniquement différent de l’antigène de surface (HBsAg). Ce système
antigène-anticorps HBcAg/anti-HBc a été décrit par Almeida et col. en 1971.1 L’anti-HBc est le premier anticorps
détectable au cours d’une hépatite B aiguë et peut persister durant toute la vie. L’anti-HBc se détecte
généralement dans le sang immédiatement après la détection du HBsAg et juste avant l’apparition des
manifestations cliniques de la maladie. En cas d’hépatite B aiguë avec guérison, l’anti-HBc est le seul marqueur de
l’infection détectable dans la période entre la disparition du HBsAg et l’apparition de l’anti-HBs. Le sang prélevé
d’un individu durant cette période peut être infectant, c’est pourquoi il a été suggéré d’effectuer un dépistage de
l’anti-HBc en plus du dépistage du HBsAg chez les donneurs pour réduire l’incidence des hépatites B posttransfusionnelles.4 Par ailleurs, la détection de l’anti-HBc est également utile lors des examens avant
l’administration du vaccin, car il ne sera alors nécessaire de vacciner contre l’hépatite B que les individus négatifs à
l’anti-HBc. Plusieurs études ont démontré une corrélation entre la présence d’anti-HBc dans les dons de sang avec
l’apparition d’hépatite non A non B (NANBH ou hépatite C) post-transfusionnelle.7,8,9 La réalisation du dépistage de
l’anti-HBc chez les donneurs de sang pourrait prévenir un grand nombre de ces cas.
Principe
bioelisa anti-HBc est une méthode immunoenzymatique compétitive pour la détermination d’anticorps contre le
HBcAg en sérum humain. Le test se base sur la concurrence entre les anticorps humains présents dans
l’échantillon et les anticorps IgG de lapin anti-HBc conjugués avec de la peroxydase quand ils sont incubés
simultanément dans les puits d’une microplaque recouverte avec de l’HBcAg recombinant. Après l’incubation, il est
effectué un lavage pour éliminer le matériel non fixé et ensuite, on ajoute une solution de substrat enzymatique et
chromogène. Cette solution développera une couleur bleue si l’échantillon est négatif. La couleur bleue devient
jaune après avoir arrêté la réaction avec de l’acide sulfurique. La présence d’anti-HBc dans l’échantillon réduit
l’intensité de la couleur proportionnellement à sa concentration.
Composants
1. MCPL MICROPLAQUE:
12 x 8 puits recouverts d’antigène recombinant HBcAg (E. coli). Puits séparables individuellement.
2.
CONJ CONJUGUÉ:
1 x 6 ml d’anticorps IgG de lapin anti-HBc conjugués avec de la peroxydase. Contient du colorant rouge, des
protéines stabilisatrices, du mertiolate de sodium à 0,02% et du sulfate de gentamicine à 0,001%. Prêt à l’emploi.
3.
WASH SOLN 10x SOLUTION DE LAVAGE CONCENTRÉE:
2 x 50 ml de tampon de phosphate concentré (10x) contenant du Tween 20 à 1% et du mertiolate de sodium à
0,01%. À diluer 1/10 dans de l’eau distillée ou désionisée avant utilisation.
4.
SUBS BUF TAMPON SUBSTRAT:
1 x 14 ml de tampon de citrate-acétate contenant du peroxyde d’hydrogène.
5.
SOLN TMB CHROMOGÈNE:
1 x 1,5 ml de 3,3’, 5,5’-Tétraméthylbenzidine (TMB) dissout dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
6.
CONTROL + CONTRÔLE POSITIF:
1 x 2 ml d’anticorps IgG de lapin anti-HBc dilués en tampon phosphate. Contient des protéines stabilisatrices
et du sulfate de gentamicine à 0,001%. Prêt à l’emploi.
7.
CONTROL – CONTRÔLE NÉGATIF:
1 x 3,5 ml de sérum humain négatif à tous les marqueurs de l’hépatite B. Contient du sulfate de gentamicine à
0,001%. Prêt à l’emploi.
8.
H2SO4 1N SOLUTION D’ARRÊT:
1 x 12 ml de l’acide sulfurique 1N. Prêt à l’emploi.
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9.
SEALS LAMELLES ADHÉSIVES:
Pour couvrir la microplaque pendant les incubations.
10. BAG SAC EN PLASTIQUE:
Pour conserver les barrettes non-utilisées.
Précautions
bioelisa anti-HBc est destiné à un usage diagnostique IN VITRO.
Utisation réservée aux professionnels.
ATTENTION: MATÉRIEL À RISQUE BIOLOGIQUE.
Tout le matériel d’origine humaine utilisé dans le cadre de la préparation de ce produit a donné des résultats négatifs
quant à la présence d’anticorps des virus HIV-1/HIV-2 et HCV, de même qu’à celle de l’antigène de surface de
l’hépatite B, en utilisant une méthode commerciale autorisée. Compte tenu du fait qu’aucune méthode n’est capable
d’offrir une garantie absolue de l’absence d’agents infectieux, ce produit doit être manipulé avec précaution:
-
-
Veiller à ce que les réactifs n’entrent jamais en contact avec la peau ou les yeux; si cela était le cas, laver
abondamment avec de l’eau.
Porter des gants.
Ne pipeter aucun réactif avec la bouche.
Ne pas fumer.
Déposer tout le matériel utilisé dans des récipients conçus pour le matériel biocontaminant. Les restes
d’échantillons, de contrôles, de tampons et de réactifs aspirés doivent être recueillis dans un récipient destiné à
cet effet et autoclavés pendant une heure à 121°C ou traités dans de l’hypochlorite de sodium à une
concentration finale de 10% pendant 30 minutes. (Les restes contenant de l’acide doivent être neutralisés avant
d’ajouter l’hypochlorite de sodium).
Certains réactifs de ce coffret contiennent de l’azide sodique comme conservateur. L’azide sodique peut
réagir au contact de tuyauteries et de bouches d’écoulement des eaux en plomb ou en cuivre. Cette réaction
donne lieu à des azides métalliques hautement explosives. Lorsque vous jetez les restes de réactifs, veuillez
laisser couler l’eau abondamment.
Précautions de manipulation:
-
Adapter le laveur au type de plaque utilisé (fond plat) pour effectuer un bon lavage.
Ne pas mélanger les réactifs provenant de lots différents.
Ne pas utiliser de réactifs après expiration de leur date limite d’utilisation.
Ne pas utiliser le réactif si on observe un changement dans l’apparence de l’un des composants de ce kit.
De plus grandes précautions doivent être prises pour éviter des contaminations microbiennes et une
contamination croisée entre les réactifs.
Utiliser une pointe jetable neuve pour pipeter chaque échantillon ou réactif.
Il est très important de préparer la solution substrat-TMB juste 5-10 minutes avant l’emploi. La conserver dans
un récipient bien fermé et à l’abri de la lumière.
Des restes de savons et/ou d’agents oxydants dans les récipients utilisés pour la préparation de la solution
substrat-TMB peuvent interférer dans la réaction. Si on emploi de récipients en verre, il convient de les laver
avec de l’acide sulfurique ou chlorhydrique 1N, de bien les rincer avec de l’eau distillée et de les sécher avant
de les utiliser. Utiliser de préférence du matériel en plastique jetable.
Conservation et stabilité
Les composants resteront stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette, à condition d’être conservés à
2-8°C. Le sachet contenant la microplaque doit être laissé à température ambiante avant d’être ouvert pour éviter toute
condensation dans les puits. Après ouverture du sachet, la microplaque reste stable pendant 3 mois lorsqu’elle est
conservée dans le sac en plastique bien fermé avec le petit sachet cartouche et à une température d’entre 2 et 8°C. Une
fois diluée, la solution de lavage reste stable pendant 2 semaines si celle-ci est conservée à une température d’entre
2 et 8°C. Garder le chromogène à l’abri de la lumière. Une fois préparée, la solution substrat-TMB n’est pas stable, c’est
pourquoi les indications données pour son utilisation doivent être strictement suivies.
Matériel nécessaire non fourni
Eau distillée ou désionisée.
Pipettes multicanal et micropipettes (50 µl, 100 µl) et cônes jetables.
Incubateur à 37°C ± 1°C.
Chronomètre.
Lecteur de microplaques avec filtre de 450 nm. Recommandable filtre de référence de 620 ou 630 nm.
Système de lavage manuel ou automatique.
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Prélèvement de l’échantillon
Utiliser du sérum frais ou du plasma (citrate/EDTA). D’autres anticoagulants doivent être évalués avant leur
utilisation. Les échantillons peuvent être conservés pendant 3 jours à une température d’entre 2 et 8°C. Pour une
plus longue conservation, ceux-ci doivent être congelés (-20°C). Éviter les cycles répétés de
congélation/décongélation des échantillons. Des particules en suspension doivent être éliminées par centrifugation.
Les sérums ou plasmas ne doivent pas être inactivés à chaud; en effet, cela pourrait donner lieu à de mauvais
résultats. Ne pas utiliser échantillons que contiennent de l’azide sodique.
Traitement automatique
Ce test peut être utilisé de manière automatique ou semi-automatique avec divers instruments. Il est très important
de valider un système automatique pour démontrer que les résultats obtenus sur les échantillons sont équivalents
aux résultats d’un test manuel. Il est recommandé à l’utilisateur de valider l’instrument régulièrement. Si vous
rencontrez des difficultés dans la programmation et le réglage des processeurs automatiques de Biokit, veuillez
contacter votre distributeur.
PROCÉDURE (Voir schéma de la procédure)
Opérations préalables
Tous les réactifs doivent revenir à température ambiante (20-25°C) avant le début du test.
Les réactifs liquides doivent être homogénéisés doucement avant l’emploi.
Diluer la solution de lavage concentrée 1/10 dans de l’eau distillée ou désionisée. Pour une plaque, mélanger
50 ml de solution de lavage concentrée à 450 ml d’eau. En cas de non utilisation d’une plaque complète, préparer
le volume proportionnel de solution.
Réalisation du test
1. N’utiliser que le nombre de barrettes nécessaire pour le test. Réserver 7 puits pour le blanc et les contrôles.
Transférer 50 µl de contrôle négatif à 4 puits et 50 µl de contrôle positif à 2 puits. Laisser un puits vide pour le
blanc du substrat.
2.
Transférer 50 µl de chaque échantillon aux puits correspondants.
3.
Ajouter 50 µl de conjugué dans tous les puits de la plaque, à l’exception du puits destiné au blanc de substrat.
4.
Couvrir la plaque avec une lamelle adhésive, mélanger doucement et laisser incuber pendant 1 heure à 37°C.
5.
Pendant les 5-10 dernières minutes de cette incubation, préparer la solution substrat-chromogène. Pour une
plaque, ajouter 280 µl de la solution de chromogène (TMB) dans un flacon de tampon substrat (14 ml) et bien
mélanger. Si toute la plaque n’est pas utilisée, préparer la quantité nécessaire d’après les indications du
tableau 1. La solution finale doit être incolore. Si celle-ci vire au bleu, ne pas l’utiliser.
TABLEAU 1
Barrettes requises
Tampon substrat ml
Chromogène (TMB) µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
10
10,0
200
12
12,0
240
NOTE: Le TMB est dissout dans du DMSO. Compte tenu du fait que la température de fusion du DMSO est de
18°C, le chromogène doit atteindre une température de 20-25°C. Bien agiter avant l’emploi. Le fait que le
chromogène présente une couleur jaunâtre est normal.
6.
Jeter la lamelle adhésive. Aspirer le contenu des puits et les remplir entièrement (environ 350 µl) de solution
de lavage diluée. Répéter 3 fois plus le processus d’aspiration-lavage. S’assurer que chaque colonne de puits
soit mise à tremper pendant au moins 15 secondes avant le nouveau cycle d’aspiration. Après le dernier
lavage, taper la plaque inversée sur un papier buvard pour éliminer tout excès de liquide dans les puits. Jeter
la lamelle adhésive.
7.
Ajouter 100 µl de substrat-TMB à tous les puits y compris le blanc.
8.
Laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante (20-25°C).
9.
Ajouter 100 µl de solution d’arrêt à chaque puits en suivant la même séquence et aux mêmes intervalles que
pour l’ajout du substrat-TMB.
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10. Mettre le lecteur à zéro avec le puits du blanc à 450 nm et lire l’absorbance de chacun des puits dans le délai
maximum de 30 minutes. Il est recommandé de procéder à la lecture bi-chromatique en utilisant un filtre de
référence 620 - 630 nm.
Contrôle de qualité
Les résultats d’un assai ne sont valables que dans le respect des critères suivants:
1.
Blanc de substrat: la valeur d’absorbance doit être inférieure ou égale à 0,100.
2.
Contrôle négatif: chaque valeur individuelle d’absorbance ne doit pas varier de plus de 20% par rapport à la
moyenne des quatre valeurs. La moyenne doit être égale ou supérieure à 0,600 après avoir ôté le blanc.
3.
Contrôle positif: la moyenne d’absorbance doit être inférieure à 0,100 après avoir ôté le blanc.
Résultats
1. Calculer la valeur seuil en ajoutant la valeur moyenne d’absorbances du contrôle négatif et celle du contrôle
positif et en multipliant le résultat de cette somme par 0,4.
Valeur seuil = (CNx +CPx) x 0,4
2. Diviser l’absorbance de l’échantillon par la valeur seuil.
Positif:
Négatif:
Douteux:
rapport absorbance/valeur seuil ≤ 1,0
rapport absorbance/valeur seuil > 1,1
rapport absorbance/valeur seuil > 1,0 ≤ 1,1
Interprétation des résultats
Un résultat positif à l’anti-HBc signifie que le patient a contracté l’hépatite B au moins une fois préalablement. Ce
n’est pas un marqueur d’immunité. Un résultat négatif signifie que l’échantillon analysé ne contient pas d’anti-HBc
ou en contient en dessous de la limite de détection du coffret. Pour évaluer la situation d’un patient par rapport à
l’hépatite B, il faut faire les tests pour les autres marqueurs sérologiques de l’hépatite B.
Limites de la procédure
Comme dans d’autres tests sérologiques, les résultats obtenus grâce à bioelisa anti-HBc servent d’aide au
diagnostic et doivent être interprétés en tenant compte du dossier médical du patient.
Pour le bon fonctionnement du coffret, les instructions données doivent scrupuleusement être suivies. Tout écart
peut donner lieu à l’obtention de résultats aberrants.
Des échantillons ayant une concentration d’anticorps anti-HBc inférieure à 1,5 U/ml (Standard PEI ou de l’OMS) peuvent
ne pas être détectés.
Tous les échantillons positifs ou douteux devront être répétés et testés pour d’autres marqueurs sérologiques du HBV.
Résultats attendus
L’anticorps anti-HBc est le marqueur le plus fréquent d’infection par le virus de l’hépatite B et il est détecté aussi
bien en infection aiguë, qu’en infection chronique et infection passée avec guérison. La prévalence de l’anti-HBc et
d’autres marqueurs de l’hépatite B varie largement dans le monde, de haute (70-90%, par ex.: Afrique, Asie et
Pacifique de l’Ouest) à moyenne (20-55%, par ex.: Europe du Sud et de l’Est) et basse (4-6%, par ex.: Europe
occidentale, Amérique du Nord et parties de l’Amérique du Sud). Différentes études ont décrit une prévalence de
0,53 à 2,16% chez les donneurs de sang du Royaume Uni.2,5,6
Caractéristiques fonctionnelles
Sensibilité analytique
La limite de détection du bioelisa anti-HBc est de 1,5 unité/ml en utilisant le sérum de référence anti-HBc du Paul
Ehrlich Institute (PEI), Allemagne. Selon des études internes, 1,0 PEI-U/mL est équivalente à environ 1,0 UI/mL du
Premier Étalon International de l’OMS pour l’anti-HBc (code NIBSC 95/522).
Évaluations
Le fonctionnement du bioelisa anti-HBc a été évalué en le comparant à d’autres tests du commerce.
-
Dans une évaluation interne, 233 échantillons étant positifs à l’anti-HBc ont été testés avec un autre essai
commercial (76 étant également positifs au HBsAg). 227 ont présenté un résultat positif (y compris les
76 positifs au HBsAg) et 6 ont présenté un résultat négatif. Les 6 échantillons divergents ont été testés avec
un troisième essai commercial et les résultats ont également été négatifs.
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-
Dans une évaluation externe en faisant une comparaison avec un autre essai commercial, 175 échantillons
ont été testés. 31 ont été positifs et 141 négatifs avec les deux tests. Ce qui a permis d’obtenir une
concordance globale de 98,3% (172/175). En éliminant 2 échantillons douteux des calculs, la sensibilité
relative a été de 100% (31/31) et la spécificité relative de 99,2%.
-
Dans une autre évaluation externe, il a été essayé 251 échantillons positifs au HBsAg. 247 (98,4%) ont été
réactifs avec le bioelisa anti-HBc, dont 245 ont été également réactifs avec la méthode alternative utilisée en
routine pour l’anti-HBc. 4 échantillons ont été anti-HBc négatifs avec le bioelisa et avec la méthode en routine
et 2 ont été positifs uniquement avec le bioelisa. Donc, la sensibilité relative du bioelisa a été de 100%
(245/245) et la concordance globale entre les deux méthodes a été de 99,2% (249/251).
-
Dans une autre évaluation externe, 5058 échantillons consécutifs de donneurs de sang habituels ont été
testés en parallèle avec le bioelisa et avec la méthode en routine. De ces échantillons, 6 ont été réactifs avec
le bioelisa et avec la méthode en routine, dont 5 ont été confirmés comme étant d’infection passée après avoir
réalisé les tests supplémentaires pour d’autres marqueurs de HBV, alors que 1 n’était positif qu’à l’anti-HBc.
3 autres échantillons ont été positifs à plusieurs reprises avec le bioelisa et négatifs avec le test en routine,
2 étant considérés comme faussement positifs et 1 ayant un résultat non-concluant après avoir réalisé des
tests supplémentaires. En ne considérant comme véritablement positifs que les échantillons confirmés comme
d’infection passée, la spécificité trouvée a été de 99,92% (5049/5053).
-
Une autre évaluation externe portant sur la sensibilité à point final et le fonctionnement en comparaison à
d’autres méthodes commerciales se trouve dans la bibliographie.3
Précision
Reproductibilité intra-test:
Les coefficients de variation obtenus pour les valeurs d’absorbance de 48 répliques d’un échantillon négatif ont été
de 4,34%, de 4,19% et de 3,66% dans trois lots étudiés.
Reproductibilité inter-test:
Trois échantillons négatifs ont été testés dans trois tests différents. Les coefficients de variation obtenus pour les
ratios absorbance/valeur seuil des 3 échantillons ont été de 4,9%, de 7,0% et de 8,2%.
Interférences
Pour étudier d’éventuelles interférences, les échantillons ont été testés avec un risque potentiel que se produisent
des réactions croisées, tels que les sérums positifs à un facteur rhumatoïde (RF), les anticorps antinucléaires
(ANA), anticorps hétérophiles, IgM anti-HAV, anti-E. coli et de femmes enceintes. Il n’a pas été observé
d’évidences d’interférence.
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bioelisa
bioelisa: Guide de problèmes
Problème
Causes éventuelles
Solution
1. Contrôles hors
validation.
1a. Température, incubation
ou pipetage incorrect.
1b. Préparation incorrecte
des réactifs, erreur dans
les dilutions. Réactifs non
mélangés correctement.
1c. Contamination croisée
entre contrôles.
Vérifier la procédure. Refaire
le test.
le test.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. Incolore ou faible couleur 2a.
à la fin du test.
2b.
2c.
2d.
Pipeter soigneusement. Ne
pas échanger les bouchons
des flacons. Refaire le test.
Filtre de lecture incorrect. S’assurer que le filtre de
lecture soit bien de 450 nm.
Si le filtre de référence de
620-630 nm n’est pas utilisé,
les absorbances augmentent
d’environ 50 milliunités.
Interférence sur le chemin Vérifier le lecteur. Nettoyer ou
optique.
sécher le fond des puits.
S’assurer de l’absence de
bulles d’air. Répéter la
lecture.
Des composants de lots
Ne pas utiliser de lots
différents ont été utilisés. différents dans la mesure où
ils sont faits pour chaque lot
en particulier.
Réactifs périmés.
Vérifier la date d’expiration du
coffret. Ne pas utiliser de
coffret périmé.
Un ou plusieurs réactifs
n’ont pas été ajoutés ou
le test.
l’ont été dans une
séquence erronée.
Conjugué inactif:
Vérifier s’il n’y a pas eu
mauvaise conservation.
contamination; vérifier la
procédure. Refaire le test.
Microplaque inactive:
Toujours conserver les
mauvaise conservation.
barrettes non usagées dans
un sac mini grip bien fermé,
avec le desséchant à
l’intérieur. Refaire le test.
Substrat inactive:
Toujours utiliser une dilution
conservation ou dilution
fraîche de TMB dans le
incorrecte.
tampon substrat. Utiliser des
Le conteneur utilisé altère conteneurs jetables ou lavés
la stabilité du substrat.
avec de l’acide ou de l’éthanol
Contamination croisée
et rincés avec de l’eau
avec la solution d’arrêt.
désionisée. Vérifier la
procédure. Refaire le test.
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bioelisa
bioelisa: Guide de problèmes
Problème
Causes éventuelles
3. Trop de couleur dans
tous les puits de la
microplaque.
3a. Substrat contaminé,
oxydé ou mal préparé.
4. Reproductibilité pauvre
ou élevée nombre
d’échantillons réactifs
qui ne se répètent pas.
Solution
S’assurer que le substrat-TMB
de travail soit incolore. S’il est
bleu, l’écarter. S’assurer que le
TMB soit entièrement liquide
avant de l’utiliser. S’assurer
que le TMB soit bien mélangé
avec le tampon substrat.
Utiliser des flacons ou des
conteneurs jetables ou lavés
avec de la solution acide ou de
l’éthanol. Refaire le test.
3b. Réactifs contaminés ou
Vérifier contamination (aspect
mal préparés.
trouble). Vérifier dilutions.
Refaire le test.
3c. Solution de lavage (1x)
Vérifier la qualité de l’eau
contaminée.
distillée / désionisée utilisée
pour la préparation de la
dilution. Refaire le test.
3d. Lavage insuffisant ou non Vérifier le lavoir. Remplir les
consistant: remplissage
puits jusqu’en haut et aspirer
ou aspiration insuffisant
complètement. Augmenter le
ou non uniforme, nombre nombre de cycles de
de cycles de lavage
lavage. Taper la plaque
insuffisant. Lavoir
inversée contre le papier
contaminé.
buvard. Refaire le test.
3e. Une solution de lavage
Utiliser la solution de lavage
d’un autre fabricant a été du biokit.
utilisée.
3f. Mauvaise dilution des
échantillons.
le test.
4a. Problèmes de lavage.
Voir rubriques 3c, 3d, 3e.
4b. Pipettes mal calibrées ou Utiliser des pipettes calibrées
cônes mal encastrés.
avec des cônes bien ajustés.
Technique de pipetage
Pipeter soigneusement sans
incorrect.
faire de bulles et sans
éclaboussures. Refaire le test.
4c. Réactifs et échantillons
Tempérer échantillons et
non placés à température réactifs et bien les agiter
ambiante ou non
avant usage.
correctement mélangés
avant l’usage.
4d. Courants d’air sur la
Mettre la microplaque à l’abri
microplaque pendant les des courants d’air.
incubations.
4e. Trop de temps dans
Développer une technique
l’addition des échantillons uniforme et reproductible.
et ou des réactifs.
Inconsistance dans les
intervalles de temps,
bulles d’air.
4f. Interférence sur le chemin Voir 1e.
optique.
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bioelisa
VEDI CAMBI RISALTATI
bioelisa anti-HBc
3000-1102
1 x 96 TESTS
Test ELISA per la determinazione degli anticorpi totali dell'antigene core dell'epatite B (anti-HBc) nel siero
o nel plasma umano.
Sommario
L'epatite B è una malattia causata da un'infezione virale, accompagnata dalla comparsa nel siero di alcuni
marcatori: uno di questi è l'anti-HBc. L'Ag core dell'epatite B (HBcAg) è un componente interno del virus dell'epatite
B antigenicamente distinto dall'Ag di superficie (HBsAg). Il sistema antigene/anticorpo HBcAg/anti-HBc fu descritto
da Almeida e altri nel 1971.1 Gli anticorpi all'HBcAg (anti-HBc) sono i primi a svilupparsi nel corso di una infezione
acuta di epatite B e possono rimanere per sempre. L'anti-HBc viene generalmente identificato nel sangue dopo
l'HBsAg e prima dell'emergere di un'epatite clinicamente evidente. Nelle epatiti B acute con ricovero, l’anti-HBc è
l’unico marcatore sierologico d’infezione nel periodo tra la scomparsa dell’HBsAg e la comparsa dell’anti-HBs.
Donazioni di sangue in questa fase possono essere infette ed è stato suggerito che lo screening per l’anti-HBc
come per l’HBsAg possa ulteriormente ridurre l’incidenza di epatite B post-trasfusioni.4 Inoltre, lo screening per
l’anti-HBc deve essere fatto per ogni individuo prima della somministrazione del vaccino dell’epatite B per
conoscere lo stato d’immunità per vaccinare solo gli individui negativi all’anti-HBc. Diversi studi hanno mostrato una
correlazione tra la presenza dell’anti-HBc in sangue da donatore e l’incidenza, associata a trasfusioni, dell’epatite
non-A non-B (NANBH o epatite C).7,8,9 Con l’introduzione dello screening anti-HBc dei donatori di sangue, molti
casi di NANBH da trasfusione potranno essere evitati.
Principio
bioelisa anti-HBc è un metodo immunoenzimatico competitivo per la determinazione degli anticorpi all’HBcAg nel
siero umano. Il test si basa sulla competizione tra gli anticorpi umani presenti nel campione e anticorpi IgG
anti-HBc di coniglio coniugate a perossidasi (HRP) quando sono incubate in contemporanea in un pozzetto
rivestito di HBcAg ricombinante. Dopo incubazione e lavaggio per rimuovere il materiale non legato, si aggiunge
una soluzione con il substrato enzimatico contenente un cromogeno. Questa soluzione svilupperà colore blu se il
campione è negativo. La colorazione blu vira al giallo dopo il blocco de la reazione con acido solforico. La
presenza di anti-HBc nel campione ridurrà lo sviluppo di colore proporzionalmente alla propria concentrazione.
Componenti
1. MCPL MICROPIASTRA:
12 x 8 pozzetti ricoperti con HBcAg ricombinante (E. coli). Pozzetti separabili singolarmente.
2.
CONJ CONIUGATO:
1 x 6 ml di anticorpi IgG anti-HBc di coniglio coniugati con perossidasi. Contiene un colorante rosso, proteine
stabilizzatrici, sodio mertiolato allo 0,02% e solfato di gentamicina allo 0,001%. Pronto all’uso.
3.
WASH SOLN 10x SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA:
2 x 50 ml di tampone fosfato concentrato (10x) contenente Tween 20 all’1% e sodio mertiolato allo 0,01%. Da
diluire 1/10 con acqua distillata o deionizzata prima dell’uso.
4.
SUBS BUF TAMPONE SUBSTRATO:
1 x 14 ml di tampone citrato-acetato contenente perossido di idrogeno.
5.
SOLN TMB CROMOGENO:
1 x 1,5 ml di 3,3’, 5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB) diluita in dimetilsulfossido (DMSO).
6.
CONTROL + CONTROLLO POSITIVO:
1 x 2 ml di anticorpi IgG anti-HBc di coniglio diluiti in tampone fosfato. Contiene proteine stabilizzatrici e
0,001% di solfato di gentamicina. Pronto all’uso.
7.
CONTROL – CONTROLLO NEGATIVO:
1 x 3,5 ml di siero umano negativo a tutti i marcatori HBV e contenente 0,001% di solfato di gentamicina.
Pronto all’uso.
8.
H2SO4 1N SOLUZIONE BLOCCANTE:
1 x 12 ml di acido solforico 1N. Pronto all’uso.
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bioelisa
9.
SEALS FOGLI ADESIVI:
Per coprire la micropiastra durante le incubazioni.
10. BAG SACCHETTO DI PLASTICA:
Per conservare le strisce non adoperate.
Precauzioni
bioelisa anti-HBc è per uso diagnostico IN VITRO.
Solo per uso professionale.
ATTENZIONE: MATERIALE POTENZIALMENTE BIOPERICOLOSO.
Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione di questo prodotto è risultato negativo per anticorpi
dei virus HIV-1/HIV-2 e HCV, come pure a quella dell'antigene di superficie dell'epatite B, secondo analisi eseguite
con un metodo commerciale autorizzato. Poiché nessun metodo può offrire la totale sicurezza dell’assenza di
agenti infettivi, questo prodotto deve essere manipolato con precauzione:
-
-
Evitare che i reagenti entrino a contatto con la pelle o con gli occhi; se ciò dovesse accadere, lavare con
acqua abbondante.
Usare guanti.
Non pipettare mai i reagenti con la bocca.
Non fumare.
Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante. I resti di campioni,
controlli, reagenti aspirati e puntali monouso devono essere raccolti in un recipiente apposito e sterilizzati in
autoclave per un'ora a 121°C, oppure trattati con ipoclorito di sodio a una concentrazione finale del 10% per
30 minuti. (I resti contenenti acido devono essere neutralizzati prima di aggiungere l'ipoclorito sodico).
Alcuni reagenti del kit contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire a contatto con
tubature e scarichi in piombo o in rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Far scorrere acqua in
abbondanza quando si gettano i residui di reagenti.
Precauzioni durante l'uso:
-
Adattare il lavatore al tipo di piastra utilizzata (fondo piatto) per realizzare un buon lavaggio.
Non mescolare reagenti provenienti da lotti diversi.
Non usare reagenti scaduti.
Non utilizzare il reagente se si osserva qualche cambio di aspetto di un qualsiasi componente del kit.
Prendere le precauzioni necessarie per evitare la contaminazione microbica e la contaminazione incrociata tra
i reagenti.
Utilizzare un nuovo puntale monouso per pipettare ogni singolo campione o reagente.
È molto importante preparare la soluzione di substrato-TMB soltanto 5-10 minuti prima dell'uso. Mantenerla in
un recipiente ben chiuso e al riparo dalla luce.
Eventuali resti di saponi e/o agenti ossidanti nei recipienti utilizzati per la preparazione della soluzione
substrato-TMB possono interferire nella reazione. Se si adoperano contenitori di vetro, è perciò conveniente
lavare i recipienti da utilizzare con acido solforico o cloridrico 1N, risciacquarli accuratamente con acqua
distillata e asciugarli prima dell’uso. Usare preferibilmente materiale plastico monouso.
Conservazione e stabilità
I componenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta, se conservati a 2-8°C. Il sacchetto che
contiene la micropiastra deve essere portato a temperatura ambiente prima dell'apertura per evitare la formazione
di condensa nei pozzetti. Dopo l'apertura del sacchetto, la micropiastra rimane stabile per 3 mesi se conservata a
2-8°C nel sacchetto di plastica ben chiuso, con la bustina di gel di silice dentro. La soluzione di lavaggio, una volta
diluita, rimane stabile per due settimane se conservata a 2-8°C. Conservare il cromogeno al riparo dalla luce. Una
volta preparata, la soluzione substrato-TMB non rimane stabile, quindi è necessario seguire scrupolosamente le
istruzioni per l'uso.
Materiale necessario non incluso
Acqua distillata o deionizzata.
Pipette multicanale e micropipette (50 µl, 100 µl) e puntali monouso.
Incubatrice a 37°C ± 1°C.
Cronometro.
Lettore di micropiastre con filtro da 450 nm. Raccomandabile un filtro di riferimento da 620 o 630 nm.
Sistema di lavaggio manuale o automatico.
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bioelisa
Raccolta dei campioni
Usare siero fresco o plasma (citrato/EDTA). Altri anticoagulanti devono essere valutati prima dell'uso. I campioni
possono essere conservati per 3 giorni a 2-8°C. Per tempi più lunghi i campioni vanno congelati (-20°C). Non
procedere a ripetuti congelamenti e scongelamenti. Eventuali particelle in sospensione vanno eliminate mediante
centrifugazione. Il siero o plasma non deve essere inattivato a caldo per evitare risultati erronei. Non utilizzare
campioni qui contengono sodio azide.
Trattamento automatico
Questo test è utilizzabile in modo automatico o semiautomatico con vari strumenti. È molto importante validare
qualsiasi sistema automatico per dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test
manuale. È raccomandabile validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e
regolazione dei processori automatici Biokit, contattare il proprio distributore.
PROCEDURA (Vedere schema del procedimiento)
Operazioni preliminari
Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (20-25°C) prima di cominciare il test.
I reagenti liquidi devono essere omogeneizzati delicatamente prima dell'uso.
Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 1/10 con acqua distillata o deionizzata. Per una piastra mescolare
50 ml di soluzione di lavaggio concentrata con 450 ml d'acqua. Se non si utilizza una piastra completa, preparare il
volume proporzionale di soluzione.
Esecuzione del test
1. Utilizzare solo il numero di strisce necessarie per il test. Prevedere 7 pozzetti per bianco e controlli.
Dispensare 50 µl di controllo negativo in 4 pozzetti e positivo in 2 pozzetti. Lasciare il pozzetto del bianco
vuoto.
2.
Dispensare 50 µl di ogni campione da analizzare nei pozzetti corrispondenti.
3.
Aggiungere 50 µl di coniugato in ogni pozzetto, ad eccezione del pozzetto per il bianco del substrato.
4.
Coprire la piastra con un foglio adesivo, agitarla delicatamente e incubare per 1 ora 37°C.
5.
Durante gli ultimi 5-10 minuti di questa incubazione, preparare la soluzione di substrato-cromogeno. Per una
piastra aggiungere 280 µl della soluzione di cromogeno (TMB) in un flacone di tampone substrato (14 ml) e
mescolare bene. Se non si adopera tutta la piastra, preparare la quantità necessaria come indicato nella
tabella 1. La soluzione finale deve essere incolore: scartarla se diventa azzurra.
TABELLA 1
Strisce occorrenti
Tampone substrato ml
Cromogeno (TMB) µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
10
10,0
200
12
12,0
240
NOTA: Il TMB è diluito in DMSO. Dato che la temperatura di fusione del DMSO è di 18°C, il cromogeno deve
raggiungere una temperatura di 20-25°C ed essere agitato bene prima dell'uso. È normale che il
cromogeno presenti un colore giallastro.
6.
Scartare il foglio adesivo. Aspirare il contenuto dei pozzetti e riempirli completamente (circa 350 µl) con
soluzione di lavaggio diluita. Ripetere il processo di aspirazione e lavaggio altre 3 volte. Verificare che ogni
colonna di pozzetti stia a bagno per almeno 15 secondi prima del nuovo ciclo di aspirazione. Dopo l'ultimo
lavaggio battere sulla piastra, capovolta su una carta assorbente, per rimuovere dai pozzetti il liquido in
eccesso.
7.
Aggiungere 100 µl di substrato-TMB in tutti i pozzetti, compreso il bianco.
8.
Incubare senza coprire per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25°C).
9.
Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante in ogni pozzetto, mantenendo la stessa sequenza e con gli stessi
intervalli osservati nell'aggiunta del substrato-TMB.
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10. Regolare lo zero del lettore con il pozzetto del bianco a 450 nm e leggere l'assorbanza di ogni pozzetto entro
30 minuti al massimo. Si raccomanda di eseguire la lettura bicromatica utilizzando un filtro di riferimento di
620 - 630 nm.
Controllo di qualità
I risultati di una prova sono validi se vengono rispettati i seguenti criteri:
1.
Bianco del substrato: il valore di assorbanza deve essere inferiore o uguale a 0,100.
2.
Controllo negativo: ogni singolo valore ottenuto non deve presentare variazioni superiori al 20% della media
dei quattro valori. L'assorbanza media deve essere uguale o superiore a 0,600 una volta sottratto il bianco.
3.
Controllo positivo: la media di assorbanza deve essere uguale o inferiore a 0,100 una volta sottratto il bianco.
Risultati
1. Calcolare il valore di soglia aggiungendo l'assorbanza media del controllo negativo all'assorbanza media del
controllo positivo e moltiplicando il risultato per 0,4.
Valore di soglia = (CNx + CPx) x 0,4
2.
Dividere l'assorbanza del campione per il valore di soglia.
Positivo:
Negativo:
Dubbio:
rapporto assorbanza/valore di soglia ≤ 1,0
rapporto assorbanza/valore di soglia > 1,1
rapporto assorbanza/valore di soglia > 1,0 ≤ 1,1
Interpretazione dei risultati
Un risultato positivo per l'anti-HBc significa che un individuo è stato infettato dal virus dell'epatite B. Non è un
marcatore di immunità. Un risultato negativo indica che il campione analizzato non contiene anti-HBc o ne contiene
in una concentrazione inferiore del limite di misura del kit. Si suggerisce di ripetere ogni risultato positivo. Per
valutare lo stato generale di un paziente per l'epatite B, provare gli altri marcatori sierologici.
Limitazioni della procedura
Come per altri test sierologici, i risultati ottenuti con il bioelisa anti-HBc sono soltanto un aiuto per la diagnosi e
devono essere interpretati alla luce della storia clinica del paziente.
Per il corretto funzionamento del kit, seguire scrupolosamente le istruzioni indicate. Ogni deviazione può dare
origine ad aberrazioni dei risultati.
Campioni con concentrazione di anti-HBc inferiore a 1,5 U /ml (Standard PEI o WHO) possono non essere rilevati.
Tutti i campioni positivi o incerti dovrebbero essere ripetuti e testati per altri marcatori sierologici dell'HBV.
Risultati attesi
L'anticorpo anti-HBc è il marcatore più frequente di infezione da virus dell'epatite B e viene rilevato sia
nell'infezione acuta, sia in quella cronica e nell'infezione superata con guarigione. La prevalenza di anti-HBc e di
altri marcatori dell'epatite B varia notevolmente nel mondo: può essere alta (70-90%, per esempio Africa, Asia e
Pacifico Ovest), media (20-55%, per esempio in Europa meridionale e orientale) o bassa (4-6%, per esempio in
Europa occidentale, America settentrionale e alcune regioni dell'America meridionale). Diversi studi hanno descritto
una prevalenza compresa tra lo 0,53 e il 2,16% in donatori di sangue del Regno Unito.2,5,6
Caratteristiche di funzionalità
Sensibilità analitica
Il limite di rilevamento del bioelisa anti-HBc è 1,5 unità/ml usando il siero di riferimento anti-HBc del Paul Ehrlich
Institut (PEI), Germania. Secondo studi interni, 1,0 PEI-U/mL è equivalente a circa 1,0 UI/mL del Primo Standard
Internazionale WHO per l’anti-HBc (codice NIBSC 95/522).
Valutazioni
Il funzionamento del bioelisa anti-HBc è stato valutato mediante studi comparativi con altri test in commercio.
-
In una valutazione interna sono stati testati 233 campioni anti-HBc positivi con un altro test in commercio
(di questi, 76 erano anche HBsAg positivi). 227 hanno dato risultato positivo (compresi i 76 HBsAg positivi)
e 6 hanno dato risultato negativo. I 6 campioni discordanti sono stati testati con un terzo test in commercio,
e i risultati sono stati anche questa volta negativi.
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bioelisa
-
In una valutazione esterna di comparazione con un altro test in commercio, sono stati testati 175 campioni.
31 sono risultati positivi e 141 negativi con entrambi i test. È stata ottenuta una concordanza globale del 98,3%
(172/175). Se non si calcolano i 2 campioni dubbi, la sensibilità relativa è stata del 100% (31/31) e la specificità
relativa del 99,2%.
-
In un'altra valutazione esterna, sono stati testati 251 campioni HBsAg positivi. 247 (98,4%) sono stati reattivi
con il bioelisa anti-HBc; di questi 245 sono stati reattivi anche con il metodo alternativo anti-HBc utilizzato di
routine. 4 campioni si sono rivelati anti-HBc negativi con il bioelisa e con il metodo di routine e 2 sono risultati
positivi soltanto con il bioelisa. Quindi, la sensibilità relativa del bioelisa è stata del 100% (245/245) e la
concordanza globale fra entrambi i metodi è stata del 99,2% (249/251).
-
In un'altra valutazione esterna, 5058 campioni consecutivi di donatori di sangue abituali sono stati testati in
parallelo con il bioelisa e con il metodo di routine. Di questi campioni, 6 sono stati reattivi sia con il bioelisa sia
con il metodo di routine; in 5 di questi è stata confermata l'esistenza di un'infezione superata dopo la
realizzazione di ulteriori tests per altri marcatori di HBV, mentre 1 era positivo solo per anti-HBc. Altri 3 campioni
si sono rivelati ripetutamente positivi con il bioelisa e negativi con il test di routine: 2 sono stati considerati falsi
positivi e 1 ha dato un risultato inconcludente dopo la realizzazione di ulteriori tests. Considerando come veri
positivi solo i campioni per i quali è stata confermata la presenza di un'infezione superata, la specificità rilevata
è stata del 99,92% (5049/5053).
-
Un’altra valutazione esterna di sensibilità al punto finale e funzionamento in comparazione con altri tests in
3
commercio si trova nella bibliografia.
Precisione
Riproducibilità intra-test:
I coefficienti di variazione ottenuti per i valori di assorbanza di un campione negativo testato in 48 repliche sono
stati del 4,34%, 4,19% e 3,66% in tre lotti esaminati.
Riproducibilità inter-test:
Sono stati testati tre campioni negativi in tre test diversi. I coefficienti di variazione ottenuti per i rapporti
assorbanza/valore di soglia dei 3 campioni sono stati del 4,9%, 7,0% e 8,2%.
Interferenze
Per studiare possibili interferenze, sono stati testati campioni che presentavano il rischio potenziale di produrre
reazioni crociate, come sieri positivi al fattore reumatoide (RF), anticorpi anti-nucleari (ANA), anticorpi eterofili, IgM
anti-HAV, anti-E. coli e di donne in gravidanza. Non sono stati rilevati segni evidenti di interferenza.
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bioelisa
bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi
Problema
Possibili cause
Soluzione
1. Controlli non
convalidanti.
1a. Temperatura,
incubazione o pipettaggio
erronei.
1b. Preparazione erronea dei
reagenti, errore nelle
diluizioni. Reagenti non
correttamente mescolati.
1c. Inquinamento incrociato
dei controlli.
Verificare procedimento.
Ripetere il test.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. Senza colore o con poco
colore alla fine della
prova.
2a.
2b.
2c.
2d.
Verificare procedimento.
Ripetere il test.
Pipettare con attenzione. Non
scambiare i tappi delle fiale.
Ripetere il test.
Filtro di lettura erroneo.
Controllare che il filtro di
lettura sia di 450 nm. Se non
si usa un filtro di riferimento di
620-630 nm, le assorbanze
aumentano di circa
50 milliunità.
Interferenza nella via
Controllare il lettore. Pulire o
ottica.
asciugare il fondo dei pozzetti.
Verificare l'assenza di bolle
d'aria. Ripetere la lettura.
Sono stati usati
Non utilizzare componenti di
componenti di lotti diversi. lotti diversi dato che sono
dosati per ogni singolo lotto.
Reagenti scaduti.
Controllare la scadenza del kit
e dei suoi componenti. Non
usare kit scaduti.
Uno o più reagenti non
Controllare il procedimento.
sono stati aggiunti, o
Ripetere la prova.
sono stati aggiunti in una
sequenza sbagliata.
Coniugato inattivo:
Controllare se vi è stato
conservazione erronea.
inquinamento, verificare il
procedimento. Ripetere il test.
Micropiastra inattiva:
Conservare sempre le strisce
conservazione erronea.
non utilizzate nel sacchetto
minigrip, ben chiuso, con il
deumidificante dentro.
Ripetere il test.
Substrato inattivo: errore Utilizzare sempre una
di conservazione o di
diluizione fresca di TMB nel
diluizione, il contenitore
tampone substrato. Usare
utilizzato influisce sulla
contenitori monouso oppure
stabilità del substrato,
lavati con acido o etanolo e
inquinamento incrociato
sciacquati con acqua
con la soluzione
deionizzata. Verificare il
bloccante.
procedimento. Ripetere il test.
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0843
bioelisa
bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi
Problema
Possibili cause
3. Troppo colore in tutti i
pozzetti della
micropiastra.
3a. Substrato inquinato,
ossidato o preparato in
modo sbagliato.
3b.
3c.
3d.
3e.
4a.
4. Riproducibilità scarsa o
elevato numero di
4b.
campioni reattivi che non
si ripetono.
4c.
4d.
4e.
4f.
Soluzione
Controllare che il substrato
preparato sia incolore,
scartarlo se è azzurro.
Verificare che il TMB sia
completamente liquido prima
di usarlo. Controllare la
corretta miscelazione del TMB
nel tampone substrato.
Utilizzare fiale o contenitori
monouso o lavati con
soluzione acida o etanolo.
Ripetere il test.
Reagenti inquinati o
Controllare inquinamento
preparati in modo
(aspetto torbido). Controllare
sbagliato.
diluizioni. Ripetere il test.
Soluzione di lavaggio (1x) Controllare la qualità
inquinata.
dell'acqua
distillata/deionizzata utilizzata
per preparare la diluizione.
Ripetere il test.
Lavaggio insufficiente o
Controllare il lavatore.
impreciso: Riempimento o Riempire i pozzetti fino all'orlo
aspirazione insufficiente o e aspirare completamente.
non uniformi, numero di
Incrementare il numero di
cicli di lavaggio
cicli di lavaggio. Battere
insufficiente. Lavatore
sulla piastra capovolta su
inquinato.
carta assorbente. Ripetere il
test.
È stata adoperata una
Utilizzare solo la soluzione di
soluzione di lavaggio di
lavaggio biokit.
marca diversa.
Problemi di lavaggio.
Vedere punti 3c, 3d, 3e.
Pipette calibrate male o
Utilizzare pipette calibrate con
puntali incastrati male.
puntali ben fissati. Pipettare
Tecnica di pipettaggio
accuratamente senza fare
erronea.
bolle né schizzi. Ripetere il
test.
Reagenti e campione non Portare a temperatura
a temperatura ambiente o ambiente i campioni e i
non correttamente
reagenti e mescolarli bene
mescolati prima dell'uso. prima dell'uso.
Correnti d'aria sulla
Mantenere la micropiastra al
micropiastra durante le
riparo dalle correnti d'aria.
incubazioni.
Tempi troppo lunghi
La tecnica deve essere
nell'aggiunta di campioni uniforme e precisa.
e/o reagenti. Imprecisione
negli intervalli di tempo,
bolle d'aria.
Interferenza nella via
Vedere 1e.
ottica.
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bioelisa
bioelisa anti-HBc
LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
3000-1102
1 x 96 TESTS
Teste de ELISA para a detecção de anticorpos totais contra o antígeno core da hepatite B (anti-HBc) em
soro ou plasma humano.
Sumário
A hepatite B é uma enfermidade causada por uma infecção viral. Durante o período de infecção aparecem vários
marcadores sorológicos, entre os quais está o anticorpo anti-HBc. O antígeno “core” da hepatite B (HBcAg) é um
componente interno do vírus da hepatite B antigenicamente diferente do antígeno de superfície (HBsAg). Este
sistema antígeno-anticorpo HBcAg / anti-HBc foi descrito por Almeida e col. 1971.1 O anti-HBc é o primeiro
anticorpo detectável no curso da hepatite B aguda e pode persistir durante toda a vida. O anti-HBc é detectado no
sangue imediatamente após a detecção de HBsAg e logo antes da aparição das manifestações clínicas da
doença. Nos casos de hepatite B aguda em recuperação, o anti-HBc é o único marcador da infecção detectável no
período compreendido entre o desaparecimento de HBsAg e o aparecimento de anti-HBs. O sangue extraído de
um indivíduo durante este período pode ser infeccioso e tem-se sugerido que a triagem para anti-HBc além da
triagem para HBsAg em doações de sangue, permitiria uma maior redução na incidência de hepatite B
pós-transfusão.4 Por outro lado, a determinação de anti-HBc deveria ser realizada antes de administrar a vacina
de hepatite B em qualquer indivíduo com a finalidade de vacinar somente aqueles indivíduos negativos para
anti-HBc. Vários estudos demonstraram uma correlação entre a presença de anti-HBc em doadores de sangue e a
incidência de hepatite não A, não B (NANBH ou hepatite C) pós-transfusão.7,8,9 A implementação do teste para
anti-HBc em doadores de sangue poderia prevenir muitos destes casos.
Princípio
bioelisa anti-HBc é um método imunoenzimático competitivo para a determinação de anticorpos contra o HBcAg no
soro humano. O ensaio está baseado na competição entre os anticorpos anti-HBc humanos presentes na amostra e
os anticorpos anti-HBc de coelho conjugados com peroxidase, quando são incubados simultaneamente nos pocinhos
de uma microplaca recoberta com HBcAg recombinante. Após a incubação, lava-se para eliminar o material não
fixado e em seguida adiciona-se uma solução de substrato enzimático e cromógeno. Esta solução desenvolverá cor
azul quando a amostra for negativa. A cor azul passará a amarelo depois do bloqueio da reação com ácido sulfúrico.
A presença de anti-HBc na amostra reduz o desenvolvimento de cor de forma proporcional a sua concentração.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocinhos recobertos com antígeno HBcAg recombinante (E. coli). Pocinhos separáveis individualmente.
2.
CONJ CONJUGADO:
1 x 6 ml de anticorpos IgG de coelho anti-HBc conjugados com peroxidase. Contém corante vermelho,
proteínas estabilizantes, mertiolato sódico a 0,02% e sulfato de gentamicina a 0,001%. Pronto para usar.
3.
WASH SOLN 10x SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA:
2 x 50 ml de tampão fosfato concentrado (10x) que contém Tween 20 a 1% e mertiolato sódico a 0,01%. Diluir
1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar.
4.
SUBS BUF TAMPÃO SUBSTRATO:
1 x 14 ml de tampão citrato-acetato que contém peróxido de hidrogênio.
5.
SOLN TMB CROMÓGENO:
1 x 1,5 ml de 3,3’, 5,5’- Tetrametilbenzina (TMB) dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO).
6.
CONTROL + CONTROLE POSITIVO:
1 x 2 ml de anticorpos IgG de coelho anti-HBc diluídos em tampão fosfato. Contém proteínas estabilizantes e
sulfato de gentamicina a 0,001%. Pronto para usar.
7.
CONTROL – CONTROLE NEGATIVO:
1 x 3,5 ml de soro humano negativo para todos os marcadores da hepatite B. Contém sulfato de gentamicina
a 0,001%. Pronto para usar.
8.
H2SO4 1N SOLUÇÃO DE BLOQUEIO:
1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Pronto para usar.
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bioelisa
9.
SEALS FOLHAS ADESIVAS:
Para cobrir a placa durante as incubações.
10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO:
Para guardar as tiras não utilizadas.
Precauções
bioelisa anti-HBc é para o diagnóstico IN VITRO.
Para uso exclusivamente por profissionais.
ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO.
Todos os materiais de origem humana utilizados na preparação deste produto foram testados e apresentaram
resultado negativo em relação à presença de anticorpos contra os vírus HIV-1/HIV-2 e HCV, assim como para o
antígeno de superfície da hepatite B, utilizando um método comercial autorizado. No entanto, dado que nenhum
método pode oferecer a total segurança da ausência de agentes infecciosos, este produto deve ser manipulado
com precaução:
-
-
Não permitir que os reagentes entrem em contato com a pele e os olhos. Se isto ocorrer, lavá-los com
abundante quantidade de água.
Usar luvas.
Não pipetar nenhum reativo com a boca.
Não fumar.
Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Os restos de
amostras, controles, reativos aspirados e ponteiras descartáveis, devem ser recolhidos em um recipiente
destinado a este fim, que deverá ser autoclavado a 121°C, ou tratar-se com hipoclorito de sódio a uma
concentração de 10%, durante 30 minutos. (Os restos que contém ácido devem ser neutralizados antes de
adicionar hipoclorito de sódio).
Alguns reativos deste kit contêm azida sódica. A azida sódica pode reagir com os encanamentos e ralos de
chumbo ou cobre, originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos,
fazê-lo em abundante volume de água.
Cuidados de manipulação:
-
Ajustar o lavador ao tipo de placa utilizada (fundo plano), para conseguir uma boa lavagem.
Não utilizar reativos procedentes de lotes diferentes.
Não utilizar os reativos após sua data de validade.
Não use o reagente se se observar qualquer alteração na aparência dos componentes incluídos no kit.
Tomar as devidas precauções para evitar contaminação microbiana e contaminação cruzada entre reativos.
Utilizar ponteiras descartáveis para pipetar as amostras e os reativos.
É muito importante preparar a solução de substrato-TMB 5 a 10 minutos antes de ser utilizada. Mantê-la em
um recipiente bem vedado e ao abrigo da luz direta.
Restos de sabões e detergentes, ou agentes oxidantes nos recipientes utilizados para a preparação da
solução de substrato-TMB, podem interferir na reação. Por essa razão, caso se utilizem recipientes de vidro é
recomendável que sejam previamente lavados com ácido sulfúrico ou clorídrico 1N, enxaguados
abundantemente com água destilada ou deionizada e secos. Usar de preferência material plástico
descartável.
Conservação e estabilidade
Os componentes permanecem estáveis até a data de validade indicada nos rótulos se forem conservados entre
2 e 8°C. A bolsa que contém a microplaca deve estar a temperatura ambiente antes de abri-la, para evitar
a condensação nos pocinhos. Uma vez aberta a bolsa, as tiras são estáveis por 3 meses guardadas a 2-8°C na
bolsa de plástico bem fechada, com a bolsinha de silicagel. A solução de lavagem, uma vez diluída, é estável
durante 2 semanas, se conservada entre 2 e 8°C. Guardar o cromógeno ao abrigo da luz. A solução substrato-TMB
uma vez preparada não é estável, por isso, devem-se seguir estritamente as indicações para sua utilização.
Material necessário não incluído
Água destilada ou deionizada.
Pipeta multicanal e micropipetas (50 µl, 100 µl) e ponteiras descartáveis.
Incubador a 37°C ± 1°C.
Cronômetro.
Leitor de microplacas com filtro de 450 nm. Recomendável filtro de referência de 620 ou 630 nm.
Sistema de lavagem manual ou automático.
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bioelisa
Coleta da amostra
Usar soro fresco ou plasma (citrato/EDTA). Outros anticoagulantes devem ser avaliados antes de serem utilizados.
As amostras podem ser conservadas por 3 dias entre 2-8°C. Para guardar por um período de tempo mais longo as
amostras devem ser congeladas (-20°C). Evitar congelar e descongelar as amostras repetidamente. Partículas em
suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. As amostras não devem ser inativadas pelo calor, pois podem
produzir-se resultados incorretos. Não utilizar amostras que contenham azida sódica.
Processamento automático
Esta prova pode ser utilizada de modo automático ou semi-automático com diferentes instrumentos. É muito
importante validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são
equivalentes aos obtidos empregando-se o ensaio manual. É recomendado que o usuário valide periodicamente o
instrumento. Se encontrar qualquer dificuldade na programação e ajuste dos processadores automáticos de Biokit,
por favor, contate seu distribuidor.
PROCEDIMENTO (Ver esquema do procedimiento)
Operações prévias
Todos os reativos devem estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de iniciar-se o ensaio.
Os reativos líquidos devem ser homogeneizados suavemente antes do seu uso.
Diluir 1/10 a solução de lavagem concentrada com água destilada ou deionizada. Para uma placa completa,
misturar 50 ml de solução de lavagem concentrada com 450 ml de água. No caso de não se utilizar uma placa
completa, preparar o volume proporcional de solução.
Realização da prova
1. Utilizar somente o número de tiras necessárias para o teste. Reservar 7 pocinhos para o branco e controles.
Transferir 50 µl de controle negativo a 4 pocinhos e 50 µl de controle positivo a 2 pocinhos. Deixar vazio um
pocinho para o branco do substrato.
2.
Transferir 50 µl de cada uma das amostras aos pocinhos correspondentes.
3.
Adicionar 50 µl de conjugado em cada pocinho, com exceção do pocinho do branco do substrato.
4.
Cobrir a placa com uma folha adesiva, agitá-la ligeiramente e incubar por uma hora a 37°C.
5.
Durante os últimos 5-10 minutos desta incubação, preparar a solução de substrato-cromógeno. Se for utilizar
toda a placa colocar 280 µl de solução de cromógeno (TMB) diretamente no frasco de tampão substrato
(14 ml) e homogeneizar bem. Se não for utilizar toda a placa, preparar a quantidade necessária indicada na
tabela 1. A solução para uso deve ser incolor; descartar caso se torne azul.
TABELA 1
Tiras requeridas
Tampão substrato ml
Cromógeno (TMB) µl
1
1,0
20
2
2,0
40
4
4,0
80
6
6,0
120
8
8,0
160
10
10,0
200
12
12,0
240
NOTA: O TMB está dissolvido em DMSO. Dado que a temperatura de fusão do DMSO é de 18°C, deixar que o
cromógeno alcance a temperatura de 20-25°C para que se descongele completamente e homogeneizar
bem antes de usar. É normal que o cromógeno apresente cor amarelada.
6.
Retirar a folha adesiva. Aspirar o conteúdo dos pocinhos e enchê-los completamente (aproximadamente
350 µl), com a solução de lavagem. Repetir o processo de aspiração e lavagem 3 vezes mais. Assegurar que
cada coluna de pocinhos esteja em remolho ao menos 15 segundos antes do novo ciclo de aspiração. Após a
última lavagem golpear a placa invertida sobre um papel absorvente para eliminar qualquer excesso de
líquido nos pocinhos.
7.
Adicionar 100 µl de substrato-TMB em todos os pocinhos, inclusive o branco.
8.
Incubar sem cobrir durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).
9.
Parar a reação pipetando 100 µl de solução de bloqueio em cada pocinho, guardando a mesma seqüência e
com os mesmos intervalos observados na adição do substrato-TMB.
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bioelisa
10. Ajustar o zero do leitor com o pocinho do branco a 450 nm e ler a absorbância de cada um dos pocinhos, no prazo
máximo de 30 minutos. É recomendável fazer leitura bicromática, utilizando filtro de referência de 620 - 630 nm.
Controle de qualidade
Os resultados de um ensaio são válidos se são cumpridos os seguintes critérios:
1.
Branco do substrato: o valor de absorbância deve ser inferior ou igual a 0,100.
2.
Controle negativo: cada um dos valores individuais obtidos não deve variar mais de 20% da média dos quatro
valores. A média das absorbâncias deve ser igual ou maior que 0,600 depois de subtrair o branco.
3.
Controle positivo: a média das absorbâncias deve ser igual ou menor que 0,100 depois de subtrair o branco.
Resultados
1. Calcular o valor cut-off somando a média das absorbâncias do controle negativo e do controle positivo e
multiplicando o resultado da soma por 0,4.
Cut-off = (CNx + CPx) x 0,4
2.
Dividir a absorbância da amostra pelo cut-off.
Positivo:
Negativo:
Duvidoso:
relação absorbância/cut-off ≤ 1,0
relação absorbância/cut-off > 1,1
relação absorbância/cut-off > 1,0 ≤ 1,1
Interpretação dos resultados
Um resultado positivo para anti-HBc significa que o paciente contraiu a hepatite B alguma vez. Não é um marcador
de imunidade. Um resultado negativo significa que a amostra analisada não contém anti-HBc, ou o contém abaixo
do limite de detecção deste kit. Para avaliar a situação de um paciente com relação à hepatite B devem ser
analisados outros marcadores sorológicos desta doença.
Limitações do procedimento
Tal como ocorre com outras provas sorológicas, os resultados obtidos com o bioelisa anti-HBc servem somente
como ajuda ao diagnóstico e devem ser interpretados tendo em conta a história clínica do paciente.
Para o correto funcionamento do kit as instruções para uso devem ser seguidas estritamente. Qualquer desvio
pode dar origem a resultados aberrantes.
Amostras com uma concentração de anticorpos anti-HBc inferior a 1,5 Unidade /ml (Padrão PEI ou OMS) podem
não ser detectadas.
Todas as amostras que apresentarem um resultado positivo ou duvidoso deveriam ser repetidas e testadas para
outros marcadores sorológicos do HBV.
Resultados esperados
O anticorpo anti-HBc é o marcador mais freqüente de infecção pelo vírus da hepatite B e é detectado tanto na infecção
aguda como na crônica e em infecção passada com recuperação. A prevalência de anti-HBc e de outros marcadores
da hepatite B varia amplamente no mundo, de alta (70-90%, ex., África, Ásia e Pacifico Oeste) a intermediaria (20-55%,
ex., sul e leste Europeu) e baixa (4-6%, ex., Europa ocidental, América do Norte e partes da América do Sul). Diferentes
estudos descreveram uma prevalência de 0,53 a 2,16% em doadores de sangue do Reino Unido.2,5,6
Características funcionais
Sensibilidade analítica
O limite de detecção do bioelisa anti-HBc é 1,5 unidade/ml utilizando o soro de referência anti-HBc do Instituto
Paul Ehrlich (PEI). De acordo com estudos internos, 1,0 PEI-U/mL é equivalente a cerca de 1,0 UI/mL do Primeiro
Padrão Internacional para anti-HBc (código NIBSC 95/522).
Avaliações
O funcionamento do bioelisa anti-HBc foi avaliado em estudos comparativos com outros ensaios comerciais.
-
Em uma avaliação interna foram testadas 233 amostras que eram positivas de anti-HBc com outro ensaio
comercial (76 delas eram também HBsAg positivas). 227 apresentaram resultado positivo (inclusive as
76 positivas de HBsAg) e 6 resultado negativo. As 6 amostras discrepantes foram provadas com um terceiro
ensaio comercial e os resultados obtidos foram também negativos.
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3000-1102 R13 11.2014 por.doc
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bioelisa
-
Em uma avaliação externa em comparação com outro ensaio comercial, foram provadas 175 amostras.
31 foram positivas e 141 foram negativas com ambos ensaios. Foi obtida uma concordância global de 98,3%
(172/175). Eliminando dos cálculos 2 amostras duvidosas, a sensibilidade relativa foi de 100% (31/31) e a
especificidade relativa foi de 99,2%.
-
Em outra avaliação externa, foram testadas 251 amostras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) foram reativas com
o bioelisa anti-HBc, das quais 245 foram reativas também com o método alternativo utilizado de rotina para
anti-HBc. 4 amostras foram anti-HBc negativas com o bioelisa e com o método de rotina e 2 amostras foram
positivas somente com o bioelisa. Portanto, a sensibilidade relativa do bioelisa foi de 100% (245/245) e a
concordância global entre ambos métodos foi de 99,2% (249/251).
-
Em uma outra avaliação externa, 5058 amostras consecutivas de doadores de sangue habituais foram testadas
em paralelo com o bioelisa e com o método utilizado de rotina. Destas amostras, 6 foram reativas tanto com o
bioelisa como com o método de rotina, 5 das quais se confirmaram como de infecção passada depois de
realizar testes adicionais para outros marcadores de HBV enquanto que 1 era positiva somente para anti-HBc.
Outras 3 amostras foram repetidamente positivas com o bioelisa e negativas com o teste de rotina sendo
2 delas consideradas como falsamente positivas e 1 de resultado inconclusivo depois de realizar testes
adicionais. Considerando como positivas verdadeiras somente as amostras confirmadas como de infecção
passada, a especificidade encontrada foi de 99,92% (5049/5053).
-
Uma outra avaliação externa de sensibilidade a ponto final e funcionamento comparando com outros ensaios
3
comerciais se encontra na bibliografia.
Precisão
Reprodutibilidade intra-ensaio:
Os coeficientes de variação obtidos para os valores de absorbância de 48 replicados de uma amostra negativa
foram de 4,34%, 4,19% e 3,66% em três lotes estudados.
Reprodutibilidade inter-ensaio:
Três amostras negativas foram analisadas em 3 ensaios diferentes. Os coeficientes de variação obtidos para os
índices absorbância/cut-off das 3 amostras foram 4,9%, 7,0% e 8,2%, respectivamente.
Interferências
Para estudar possíveis interferências, foram testadas amostras com um risco potencial de produzir reações
cruzadas, tais como soros positivos de fator reumatóide (RF), anticorpos antinucleares (ANA), anticorpos
heterófilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli e de mulheres grávidas. Não se observaram evidencias de interferência.
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3000-1102 R13 11.2014 por.doc
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bioelisa
bioelisa: Guia de problemas
Problema
Possíveis causas
Solução
1. Controles fora de
validação.
1a. Temperatura, incubação
ou pipetagem incorreta.
1b. Preparação incorreta de
reativos, erro de diluição.
Reativos não
homogeneizados.
1c. Contaminação cruzada
entre controles.
Verificar o procedimento.
Repetir o ensaio.
Repetir o ensaio.
1d. Filtro de leitura incorreto.
1e. Interferência no caminho
ótico.
1f. Foram utilizados
componentes de lotes
diferentes.
1g. Reativos vencidos.
2. Sem cor ou pouca cor ao 2a. Um ou mais reativos não
adicionados ou
final do ensaio.
adicionados em
seqüência incorreta.
2b. Conjugado inativo:
conservação incorreta.
Pipetar cuidadosamente. Não
intercambiar as tampas dos
frascos. Repetir o ensaio.
Comprovar que o filtro de
leitura seja de 450 nm. Se
não se usa filtro de referência
de 620-630 nm, as
absorbâncias aumentam
aproximadamente
50 miliunidades.
Verificar o leitor. Limpar ou
secar o fundo dos pocinhos.
Comprovar que não hajam
bolhas de ar. Repetir a leitura.
Não utilizar componentes de
lotes diferentes já que os
mesmos são ajustados para
cada lote.
Verificar a data de validade
do kit. Não utilizar kits
vencidos.
Repetir o ensaio.
Verificar se há contaminação
visível. Verificar o
procedimento. Repetir o
ensaio.
2c. Microplaca inativa:
Manter sempre as tiras não
conservação incorreta.
utilizadas na bolsa de
plástico, bem fechada, com o
dessecante dentro. Repetir o
ensaio.
2d. Substrato inativo:
Utilizar sempre uma diluição
conservação ou diluição
recém preparada de TMB em
incorreta, o recipiente
tampão substrato. Utilizar
utilizado afeta a
recipientes descartáveis ou
estabilidade do substrato, lavados com ácido ou etanol
contaminação cruzada
e enxaguados com água
com a solução de
deionizada. Verificar o
bloqueio.
procedimento. Repetir o
ensaio.
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3000-1102 R13 11.2014 por.doc
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bioelisa
bioelisa: Guia de problemas
Problema
Possíveis causas
Solução
3. Demasiada cor em todos
os pocinhos da
microplaca.
3a. Substrato contaminado,
oxidado ou preparado
incorretamente.
Comprovar que o substrato
preparado seja incolor,
descarte-o caso se torne azul.
Assegurar-se de que o TMB
esteja completamente líquido
antes de utilizá-lo. Misturar
bem o TMB com o tampão
substrato. Utilizar frascos ou
recipientes descartáveis de
plástico ou de vidro lavados
com ácido ou etanol. Repetir
o ensaio.
Verificar se há contaminação
(aspecto turvo). Comprovar
as diluições. Repetir o ensaio.
Verificar a qualidade da água
destilada/deionizada utilizada
para preparar a diluição.
Repetir o ensaio.
Verificar o lavador. Encher
totalmente e aspirar
completamente os pocinhos.
Aumentar o número de
ciclos de lavagem. Bater a
placa invertida sobre papel
absorvente. Repetir o ensaio.
3b. Reativos contaminados
ou preparados
incorretamente.
3c. Solução de lavagem (1x)
contaminada.
4. Reprodutibilidade pobre
ou elevado Número de
amostras reativas que
não se repetem.
3d. Lavagem insuficiente ou
não uniforme: volume
dispensado ou aspiração
insuficiente ou não
uniforme, número de
ciclos de lavagem
insuficiente. Lavador
contaminado.
3e. Foi utilizada solução de
lavagem de outro
fabricante.
4a. Problemas de lavagem.
4b. Pipetas mal calibradas ou
ponteiras mal
encaixadas. Técnica de
pipetagem incorreta.
4c. Reativos e/ou amostras
muito frios ou não
homogeneizados antes
de usar.
4d. Correntes de ar sobre a
microplaca durante as
incubações.
4e. Demasiada demora na
adição de amostras e/ou
reativos. Inconsistência
nos intervalos de tempo,
bolhas de ar.
4f. Interferência no caminho
ótico.
Utilizar somente a solução de
lavagem de biokit.
Ver itens 3c, 3d, 3e.
Utilizar pipetas calibradas,
com ponteiras bem
encaixadas. Pipetar
cuidadosamente sem fazer
bolhas nem salpicar. Repetir
o ensaio.
Deixar os reativos e amostras
alcançarem a temperatura
ambiente e misturá-los bem
antes de usar.
Manter a microplaca
protegida de correntes de ar.
Desenvolver uma técnica
uniforme e reprodutível.
Ver 1e.
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bioelisa
bioelisa anti-HBc
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1 x 96 TESTS
Procedural flow chart / Esquema del procedimiento / Schematischer Ablauf /
Schéma de la procédure / Schema del procedimento / Esquema do procedimento
Pipette Samples and Controls: 50 µl/well
Dispensar Muestras y Controles: 50 µl/pocillo
Proben und Kontrollen verteilen: 50 µl/Vertiefung
Dispenser Échantillons et Contrôles: 50 µl/puits
Dispensare Campioni e Controlli: 50 µl/pozzetto
Pipetar Amostras e Controles: 50 µl/pocinho
Ð
Add Conjugate: 50 µl/well
Añadir el Conjugado: 50 µl/pocillo
Konjugat hinzugeben: 50 µl/Vertiefung
Ajouter le Conjugué: 50 µl/puits
Aggiungere il Coniugato: 50 µl/pozzetto
Adicionar o Conjugado: 50 µl/pocinho
Ð
Incubate 1 hour at 37°C
Incubar 1 hora a 37°C
1 Stunde bei 37°C inkubieren
Incuber 1 heure à 37°C
Incubare 1 ora a 37°C
Incubar 1 hora a 37°C
Ð
Wash 4x / Lavar 4x
Waschen 4x / Laver 4x
Lavare 4x / Lavar 4x
Ð
Pipette Substrate: 100 µl/well
Dispensar el Sustrato: 100 µl/pocillo
Substrat pipettieren: 100 µl/Vertiefung
Dispenser le Substrat: 100 µl/puits
Dispensare il Substrato: 100 µl/pozzetto
Pipetar o Substrato: 100 µl/pocinho
Ð
Incubate 30 minutes at RT
Incubar 30 minutos a TA
30 Minuten bei RT inkubieren
Incuber 30 minutes à TA
Incubare 30 minuti a TA
Incubar 30 minutos a TA
Ð
Pipette Stopping Solution: 100 µl/well
Dispensar la Solución de Parada: 100 µl/pocillo
Stopplösung zufügen: 100 µl/Vertiefung
Dispenser la Solution d’Arrêt: 100 µl/puits
Dispensare la Soluzione Bloccante: 100 µl/pozzetto
Pipetar a Solução de Bloqueio: 100 µl/pocinho
Ð
Cut-off: (NCx + PCx) x 0.4
Valor umbral: (CNx + CPx) x 0,4
Schwellenwert: (NKx + PKx) x 0,4
Valeur seuil: (CNx + CPx) x 0,4
Valore di soglia: (CNx + CPx) x 0,4
Cut-off: (CNx + CPx) x 0,4
Read at 450 nm
Leer a 450 nm
Bei 450 nm ablesen
Lire à 450 nm
Leggere a 450 nm
Ler a 450 nm
43
3000-1102 R13 11.2014 procedural flow chart.doc
0843
bioelisa
bioelisa anti-HBc
3000-1102
1 x 96 TESTS
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3000-1102 R13 11.2014 bibliography.doc
0843
·T3800-0158 R13

bioelisa bioelisa anti-HBc

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