Enzygnost* Anti

Transcription

Enzygnost* Anti

Enzygnost* Anti-HBc/IgM
Enzyme immunoassay for the qualitative detection of IgM antibodies to
hepatitis B (core) antigen in serum or plasma
Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern
gegen das Hepatitis B (core)-Antigen in Serum oder Plasma
Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps
IgM dirigés contre l’antigène de core de l’hépatite B dans le sérum ou le
plasma
Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli
anticorpi IgM contro l’antigene «core» dell’epatite B nel siero o nel
plasma
Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los
anticuerpos de la IgM contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el
suero o en el plasma
Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos
IgM contra o antígeno „core“ da hepatite B no soro e no plasma
English:
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Español:
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hasta 41
Português:
Páginas 42
a
Test procedure and programming steps
Testdurchführung und -programmierung
Réalisation et programmation du test
Esecuzione e programmazione de test
Programación y realización del test
Procedimento e programação
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Bibliography/Literatur/Littérature/
Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
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49
Edition February 2004
Intended Use
Enzyme immunoassay for the qualitative detection of IgM antibodies to hepatitis B (core) antigen
in serum or plasma. The enzyme immunoassay is processed on the BEP ® II, BEP® III and BEP® 2000
ELISA processors. The test was developed for investigation of individual samples, not pooled
samples. The product is for in vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
In almost all cases of acute hepatitis B infection, IgM antibodies to hepatitis B core antigen (antiHBc IgM) are produced shortly after the onset of viral multiplication and remain in the circulation
for about 7 to 17 weeks.
For this reason, a relatively reliable diagnosis of acute hepatitis B infection can be derived solely
on the basis of this parameter since HBsAg and HBeAg may also occur in the serum in chronic
hepatitis and thus further parameters (anti-HBs, anti-HBe or anti-HBc) need to be evaluated for
the differential diagnosis.
In some cases of acute hepatitis B infection, the HBs and HBe antigens may have already
disappeared before the onset of clinical symptoms, but the corresponding antibodies may still
not be detectable. In such cases the assay of total anti-HBc would provide no clarification
because these are long-term antibodies which may still be present in the circulation even years
after an infection, possibly as the only antibodies. This gap in the diagnosis of acute hepatitis B
can be filled by the assay of anti-HBc IgM 1.
Principle of the Method
The HBc/IgM Antibodies contained in the test sample bind to the anti-human IgM antibodies
coated onto the wells of the microtitre plate. POD-labelled HBc antigen binds to the specific HBc/
IgM antibodies.
After removing the excess conjugate and unbound sample constituents the enzyme reaction of the
bound conjugate is determined (blue colour reaction). The enzymatic conversion of the chromogen
is terminated by the addition of Stopping Solution POD (yellow colour reaction). The intensity of the
colour reaction is proportional to the concentration of antibodies contained in the sample.
Reagents
Materials provided
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBc/IgM test plate
HBcAg/POD-Conjugate
Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM)
Sample Buffer (Anti-HBc/IgM)
Control Serum, positive (Anti-HBc/IgM)
Control Serum, negative (Anti-HBc/IgM)
Washing Solution POD (concentrate)**
Buffer/Substrate TMB**
Chromogen TMB**
Stopping Solution POD**
Empty bottle for Working Chromogen Solution
Adhesive foils
PE bag for storing unused strips
Barcode table
Instruction for Use
1 pcs.
3 x 0.6 mL
3 x 6 mL
3 x 40 mL
1 x 0.3 mL
1 x 0.5 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pcs.
6 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit
(code no. OUVP).
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Edition February 2004
Composition
Enzygnost* Anti-HBc/IgM (test plate): Microtitration plate coated with monoclonal antibodies to
human IgM.
HBcAg/POD-Conjugate: Genetically engineered HBc antigen, conjugated with peroxidase
(POD).
Preservative: phenol (max. 1 g/L)
Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM): Tris buffer containing Boviserin® and Tween 20.
Sample Buffer (Anti-HBc/IgM): Tris buffer containing glycerol, Boviserin® and Tween 20.
Anti-HBc/IgM Control Serum, positive: Stabilised human serum containing IgM antibodies to
HBc antigen, diluted in Sample Buffer.
Nominal absorbance: ≥ 0.7
Anti-HBc/IgM Control Serum, negative: Stabilised human serum without antibodies to HBc
antigen, diluted in Sample Buffer.
Nominal absorbance: ≤ 0.1
Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution containing Tween.
Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solution.
Preservative: n-butanol (max. 1%)
Chromogen TMB: Tetramethylbenzidine dihydrochloride
Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera has been tested for
HBsAg, anti-HIV1, anti-HIV2 and anti-HCV. Only donations with negative findings are used for
the manufacture of Anti-HBc/IgM Control Serum, negative. Only donations with anti-HIV1,
anti-HIV2 and anti-HCV negative findings are used for the manufacture of Anti-HBc/IgM
Control Serum, positive.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained
from human blood should always be handled with due care, observing the precautions
recommended for biohazardous material 2. This also applies particularly for the Anti-HBc/IgM
Control Serum, positive, as the production procedure does not assure virus inactivation.
3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at
least one hour at +121 °C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles
connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating
pathogenic human viruses. The concentrations and reaction times specified by the
manufacturer must be observed.
Preparation of the Reagents
Bring all the reagents and samples to +18 to +25 °C before beginning the test (without removing
the test plate from its container/bag).
For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD to 400 mL with distilled or
deionized water.
Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10
mL of Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit and store closed
and protected from light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water.
For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the
Chromogen TMB vial and of the Buffer/Substrate TMB vial.
Predilute all the test samples (but not the control sera) in tubes 1+100 with Sample Buffer
(Anti-HBc/IgM) [e. g. 10 µL sample + 1000 µL Sample Buffer (Anti-HBc/IgM)].
Working Conjugate Solution: Withdraw the necessary amount from the vial of HBcAg/POD
Conjugate and dilute 1+10 with the Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM).
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For half a test plate withdraw 0.6 mL of HBcAg/POD Conjugate and add to an original vial
(6 mL) of the Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM) (= 1+10).
Storage and Stability
Stored unopened at the stated temperature all the components of the Enzygnost* Anti-HBc/IgM
may be used up to the dates given on the labels.
For details on the stability and storage of the opened and diluted reagents, see Table 1 in the
Appendix.
Equipment required:
For automatic dispensing of reagent and washing
BEP® II:
BEP® III:
For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for
evaluation
BEP® 2000:
For fully automatic processing and evaluation of the test
Pipettes:
piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µL
Incubator:
Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods
All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma)
obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3
days at +2 to +8 °C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be
frozen.
Procedure
Test procedure using the BEP® II
1. Dispense samples: Fill 4 wells with 10 µL / well of Anti-HBc/IgM Control Serum, negative, and
one well with 10 µL Anti-HBc/IgM Control Serum, positive; then fill the following wells with 10 µL
/ well of prediluted sample and, at the end of the set of samples or at the end of the test plate, fill
one well with 10 µL of Anti-HBc/IgM Control Serum, positive. Then seal with foil.
The pipetting steps must be performed within 15 min per test plate.
2. Incubate: Incubate at room temperature (+18 to +25 °C) for at least 15 min (max. 30 min).
3. Dispense conjugate: Remove the foil. Without washing the wells, add 100 µL of Working
Conjugate Solution to each necessary well, cover with fresh foil and then place into the
incubator.
4. Incubate: Incubate at +37 °C ± 1 °C for 60 ± 2 minutes, then proceed immediately to "5.
Wash".
5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 or 5 times (see Note) with approx.
0.3 mL/well of Washing Solution POD.
6. Add substrate: Pipette 100 µL of Working Chromogen Solution into each well. Seal the plate
with fresh foil.
7. Incubate: Incubate protected from light at +18 to +25 °C for 30 min ± 2 min.
8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keeping
to the same timing as in "6. Add substrate".
9. Read: Read at 450 nm within one hour.
It is recommended to use a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams).
Read the absorbances of the control and patient samples at 450 nm; the recommended
wavelength for the reference measurement is 650 nm (if nesessary, between 615 and 690 nm).
Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 at
"Test procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e.
not covered with adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to be
made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then
processed fully automatically (see BEP® III instruction manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the BEP®
II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP® III.
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Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully
automatically in the instrument (see instruction manual for the BEP® 2000).
Test validation
The individual values of the absorbances for the control sera are used to calculate the mean
values if:
-0.010 ≤ Aneg. ≤ 0.1
–0.010 ≤ Apos. ≥ 0.7
If one of the absorbance values of the Anti-HBc/IgM Control Serum is outside the specification,
this value can be neglected.
Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these
conditions are not fulfilled, the test is to be repeated.
Evaluation
On the BEP® 2000 and BEP® III the results are evaluated automatically. Please consult the
instruction manuals for further details in this respect. The following sections apply if the results
are evaluated without software assistance.
Calculate the mean absorbance of the negative controls, then add 0.07 to obtain the cut-off
value:
–
Aneg. + 0.07 = cut-off value
In order to improve the reliability of results close to the cut-off the following retest range has been
defined for the test:
cut-off value ± 10%
Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows:
Test result:
^ HBc/IgM antibody negative
1. Asample < cut-off - 10% =
^ HBc/IgM antibody positive
2. Asample > cut-off + 10% =
^ equivocal
3. cut-off – 10% ≤ Asample ≤ cut-off + 10% =
If an equivocal result is obtained the sample is to be retested.
If, after the retest, it is still not possible to class the samples as positive or negative, the result is
considered „equivocal“.
Limitations of the Procedure
1.Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test result.
2.Lipaemic, icteric or haemolytic samples do not interfere with the test. In isolated rare cases,
samples with high levels of rheumatoid factor accompanied by high levels of anti-HBc may
result in elevated signals.
3.Samples containing antibodies to CMV, HAV, HIV, HCV, rubella virus, as well as samples
which are positive for anti-HBs, do not interfere with the test result.
4.Samples from patients with raised transaminase values as well as samples containing
autoantibodies and ANA were not found to interfere with the test result.
5.Samples containing antibodies to EBV as well as samples from haemodialysis patients may
exhibit elevated reactivity.
6.Inadequately coagulated sera, samples containing sodium azide, and microbially
contaminated samples, should not be used. Any particulate constituents (e.g. fibrin clots)
should be removed before the assay.
7.For thawed samples ensure good homogenisation of the material.
8.Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical
lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the
enclosed barcode table).
Exceptions are Washing Solution POD, Stopping Solution POD and the Working Chromogen
Solution (which is prepared from Chromogen TMB and Buffer/Substrate TMB using the
required lots).
9.Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not
be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use
pipettes with metal parts which are in direct contact with the liquid). Do not perform the
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substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working
Chromogen Solution has developed a blue colour before transferral into the test plate, this
indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean
container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided.
10.The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on
a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in
contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial
contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor
the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to
unspecific reactions.
11. Highly reactive samples may cause precipitation of the dye during the stopping reaction. This
does not interfere with the photometric evaluation.
12.The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur
but this has no effect on the test result.
13.Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product
performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported
by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the
responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents
on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these
instructions for use.
14.Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical
history, clinical presentation and other findings.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and Specificity
The results of the study on sensitivity and specificity are summarized in Tables 2 + 3 (see Appendix).
To establish the sensitivity, a total of 192 anti-HBc/IgM-positive samples were investigated. All
the tested samples were found to be positive as defined by the criteria of the Enzygnost* AntiHBc/IgM test. Nevertheless the possibility cannot be ruled out that isolated samples may escape detection when the test is used on a large scale.
To establish the specificity, a total of 2559 anti-HBc/IgM-negatvie samples were investigated and
the specificty was found to be 99.60% to 99.91% (initial testing) and 99.91% to 100% (retest
result). Deviations from these findings may occur due to variations in sample population, test
procedure, etc.
Current knowledge indicates that a positive result in the anti-HBc/IgM test does not yield definite
evidence of HBV infection, just as a negative test result also does not definitely exclude HBV
infection.
Reproducibility
The results on intra-assay and inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the
Appendix). The data shown below are typical results. Depending on various factors (procedure,
etc), different values may well be obtained.
* Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other
countries.
BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and
other countries.
Boviserin is a registered trademark of Aventis Behring.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor: Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
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0197
Tab. 1 Stability and Storage
Material/reagent
State
Storage
Stability•
diluted sample
1+100
diluted with
Sample Buffer
(Anti-HBc/IgM)
+2 to +8 °C
24 hours
Test plate
(remaining strips)
once opened
+2 to +8 °C
6 weeks
HBcAg/POD Conjugate
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
Conjugate Buffer
(Anti-HBc/IgM)
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
Working Conjugate Solution
1+10
+2 to +8 °C
4 weeks
+18 to +25 °C
1 week
+2 to +8 °C
4 weeks
+2 to +8 °C
4 weeks
+2 to +8 °C
4 weeks
in the bag with
the desiccant
Sample Buffer
(Anti-HBc/IgM)
once opened
Anti-HBc/IgM Control Serum,
positive
once opened
Anti-HBc/IgM Control Serum,
negative
Chromogen TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Buffer/Substrate TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Working Chromogen Solution
1+10
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
closed container,
protected from
light
5 days
8 hours
Wash Solution POD
(concentrate)
undiluted
once opened
1:20
1:20
+2 to +8 °C
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
expiry date
1 week
1 day
Stopping Solution POD
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
• use each component by the expiry date at the latest
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Tab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies yielded the following data:
Sample panel
Number of samples
Acute HBV Infection
192
Initially reactive Retest reactive
192
n.d.
Tab. 3 Specificity
The specificity studies at two independent centres (W, R) yielded the following data:
Sample panel
Number of sample
(W) normal negative serum samples
(W) normal negative plasma samples
(R) patient panel
997
501
1061
Initially reactive Retest reactive
2
2
1
0
0
1
Tab. 4 Reproducibility
Sample
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Sample
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Intra-assay
Mean
absorbance
0.236
0.182
0.155
0.159
Inter-assay
Mean
absorbance
0.158
0.113
0.125
0.104
OWSE G13 C0541 (909)
% CV
4.3
6.8
6.3
5.7
% CV
10.9
5.9
5.8
16.9
H/R
8
In a study on intra-assay reproducibility
the samples were each tested in
20-fold determinations (FP 2, n=18).
In the study on inter-assay reproducibility
the samples were each tested in
3-fold determinations in 5 independent runs.
Tab. 5 Test procedure and programming
Menu programming
Test procedure
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
for the
BEP® 2000
Prepare reagents
BEP® II
MENU NO
4 x 10 µL Control Serum, negative
2 x 10 µL Control Serum, positive
10 µL prediluted sample each
OPERATE 1
NO
OPERATE 2
YES
Dispense conjugate
®
®
BEP II
15 min (max 30 min)
(+18 to +25 °C)
BEP III
in the case of partially
filled plates: Add waterfilled strips to make up to
half a plate
100 µL Working
Conjugate Solution
100
1
NO
OPERATE 3
YES
Wash and dispense chromogen
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Wash 4x: BEP® II
Automatic processing
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dispense Stopping Solution
100 µL Working
Chromogen Solution
30 min ± 2 min
(+18 to +25 °C
protected from light)
100 µL Stopping Solution
after max. 1 h
Evaluate at 450 nm
(Referencewavelength: 650 nm)
Test result
OWSE G13 C0541 (909)
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
H/R
9
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.1
0.07
-
Anwendungsbereich
Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen das Hepatitis B
(core)-Antigen in Serum oder Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit
den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III und BEP® 2000. Der Test wurde entwickelt für die
Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro
diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
IgM-Antikörper gegen das Hepatitis B (core)-Antigen (Anti-HBc/IgM) werden in nahezu allen
Fällen einer akuten Hepatitis-B-Infektion bereits kurz nach dem Beginn der Virusvermehrung
gebildet und bleiben für ungefähr 7 bis 17 Wochen in der Zirkulation.
Aus diesem Grunde kann die Anti-HBc/IgM-Bestimmung als einziger Parameter für eine relativ
sichere Diagnose einer akuten Hepatitis-B-Infektion herangezogen werden, da HBsAg und
HBeAg auch bei chronischen Hepatitiden im Serum auftreten können und somit für die Differentialdiagnose das Heranziehen weiterer Parameter (Anti-HBs, Anti-HBe oder Anti-HBc) notwendig machen. In einigen Fällen einer akuten Hepatitis-B-Infektion können die HBs- und HBeAntigene beim Auftreten von klinischen Symptomen bereits verschwunden, die entsprechenden
Antikörper aber noch nicht meßbar sein. Eine Bestimmung von Gesamt-Anti-HBc würde in einem solchen Falle keine Aufklärung bringen, da es sich hierbei um Langzeit-Antikörper handelt,
die auch noch Jahre nach einer Erkrankung möglicherweise als einzige Antikörper zirkulieren
können. Die Anti-HBc/IgM-Bestimmung kann diese diagnostische Lücke schließen 1.
Prinzip der Methode
Die in der Untersuchungsprobe vorhandenen HBc/IgM-Antikörper binden sich an die auf der
Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierten Anti-Human-IgM-Antikörper. An die spezifischen
HBc/IgM-Antikörper wird POD-markiertes HBc-Antigen gebunden.
Nach Entfernung des überschüssigen Konjugates und der ungebundenen Probenbestandteile
wird die Enzymreaktion des gebundenen Konjugates bestimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird durch den Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBc/IgM Testplatte
HBcAg/POD-Konjugat
Konjugatpuffer (Anti-HBc/IgM)
Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM)
Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv
Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ
Waschlösung POD (Konzentrat)**
Puffer/Substrat TMB**
Chromogen TMB**
Stopplösung POD**
Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung
Abklebefolien
PE-Beutel zur Aufbewahrung nicht benötigter Riegel
Barcode-Tabelle
Packungsbeilage
1 Stück
3 x 0,6 ml
3 x 6 ml
3 x 40 ml
1 x 0,3 ml
1 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 Stück
6 Stück
1 Stück
1 Stück
1 Stück
** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost*
TMB (Bestell-Nr. OUVP).
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Ausgabe Februar 2004
Zusammensetzung
Enzygnost* Anti-HBc/IgM (Testplatte): Mit monoklonalen Antikörpern gegen Human-IgM beschichtete Mikrotitrationsplatte.
HBcAg/POD-Konjugat: Gentechnologisch hergestelltes HBc-Antigen, Peroxidase (POD)-konjugiert.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM): Tris-Puffer mit Boviserin® und Tween 20.
Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM): Tris-Puffer mit Glycerin, Boviserin® und Tween 20.
Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv: stabilisiertes Humanserum mit IgM-Antikörpern gegen
HBc-Antigen, verdünnt in Proben-Puffer, Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l).
Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ: stabilisiertes Humanserum ohne Antikörper gegen
HBc-Antigen, verdünnt in Proben-Puffer, Extinktionsrichtwert: ≤ 0,1.
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l).
Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung.
Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung.
Konservierungsmittel: n-Butanol (max. 1%)
Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid
Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung.
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde auf
HBsAg, auf Anti-HIV1, Anti-HIV2 und auf Anti-HCV untersucht. Für die Herstellung von AntiHBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Für
die Herstellung von Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv wurden nur Spenden mit negativem
Anti-HIV1-, Anti-HIV2- und Anti-HCV-Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie
auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter
Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden2. Dies gilt insbesondere auch für das Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv, da durch das
Herstellungsverfahren eine Virusinaktivierung nicht garantiert werden kann.
3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten.
4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das
geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte
nicht dem Behältnis entnehmen.
Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen.
Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen und verschlossen unter Lichtschutz
aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von
Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
Alle zu untersuchenden Proben, nicht jedoch die Kontrollsera, werden in einem Röhrchen
1+100 mit Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) vorverdünnt (z. B. 10 µl) Proben + 1000 µl ProbenPuffer (Anti-HBc/IgM).
Konjugat-Gebrauchslösung: Dem HBcAg/POD-Konjugat ist die benötigte Menge zu entnehmen und mit dem Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) 1+10 zu verdünnen.
Für eine halbe Testplatte 0,6 ml HBcAg/POD-Konjugat zu einer Originalabfüllung (6 ml)
Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) zupipettieren (1+10).
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Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBc/IgM bei der angegebenen Lagertemperatur bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar.
Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien
sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen.
Erforderliche Geräte:
Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der WaschBEP® II:
schritte
BEP® III:
Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung
BEP® 2000:
Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten:
Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl
Inkubator:
Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden
Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.
Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen)
verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben
sollten maximal 3 Tage bei +2 bis +8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren.
Testdurchführung
Testdurchführung mit BEP® II
1. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 10 µl Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ, in eine
Vertiefung 10 µl Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 10 µl
vorverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 10 µl Anti-HBc/IgMKontroll-Serum, positiv dosieren, mit Folie abkleben.
Die Pipettiervorgänge müssen innerhalb 15 min pro Testplatte durchgeführt werden.
2. Proben-Inkubation: Mind. 15 min (max. 30 min) bei Raumtemperatur (+18 bis +25 °C)
inkubieren.
3. Konjugat-Dosierung: Folie abziehen und ohne vorher zu waschen, je 100 µl der KonjugatGebrauchslösung pro Bestimmung zupipettieren, mit neuer Folie abkleben und anschließend
in den Inkubator stellen.
4. Konjugat-Inkubation: 60 min ± 2 min bei +37 °C ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4
bzw. 5mal (siehe Hinweis) waschen.
6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen,
Platte mit neuer Folie abkleben.
7. Substrat-Inkubation: 30 min ± 2 min bei +18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.
8. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den
gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten.
9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren.
Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert.
Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge
der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.
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Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung
(Punkt 1 der "Testdurchführung mit BEP® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben.
Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe
Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen
Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind
jedoch in der Kombination BEP® III/Enzygnost* validiert worden.
Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP® 2000-Bedienungsanleitung).
Testvalidierung
Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte
eingesetzt, wenn
-0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1
Epos. ≥ 0,7
Von den Extinktionswerten des Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der
Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden.
Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden
diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten.
Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet.
Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen ein Wert von
0,07–addiert:
Eneg. + 0,07 = Grenzwert (cut off)
Um Ergebnisse nahe dem Grenzwert besser abzusichern, wurde eine grenzwertige Zone definiert:
Grenzwert ± 10%
Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
Testergebnis:
^ HBc/IgM-Antikörper-negativ
1. EProbe < cut off – 10% =
^ HBc/IgM-Antikörper-positiv
2. EProbe > cut off + 10% =
^ grenzwertig
3. cut off - 10% ≤ EProbe ≤ cut off + 10% =
Untersuchungsproben mit einem grenzwertigen Testergebnis sollten erneut getestet werden.
Ist auch danach keine Zuordnung der Proben als positiv oder negativ möglich, lautet das Testergebnis „grenzwertig“.
Einschränkungen der Testdurchführung
1.Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.
2.Lipämische, ikterische oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. In
seltenen Einzelfällen können Proben mit hohem Rheumafaktor- und gleichzeitig hohem antiHBc-Gehalt zu erhöhten Signalen führen.
3.Proben mit Antikörpern gegen CMV, HAV, HIV, HCV, Rubella-Virus sowie Anti-HBs positive
Proben beeinflussen das Testergebnis nicht.
4.Mit Proben von Patienten mit erhöhten Transaminasen-Werten sowie mit Auto-Antikörperoder ANA-haltigen Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
5.Proben mit Antikörpern gegen EBV sowie Proben von Hämodialyse-Patienten können erhöhte Reaktivität zeigen.
6.Ungenügend geronnene Seren, natriumazidhaltiges Probenmaterial und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.B. Fibrin-Gerinnsel) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden.
7.Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
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H/R
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8.Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den
chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte
Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der
Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnung, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind.
9.Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in
Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit
flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von
Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der
Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den
vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
10.Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder
im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten
Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet,
so ist sorgfältig darauf zu achten, dass weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen
mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten.
11. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflusst.
12.Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
13.Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf
optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
14.Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem
klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und Spezifität
Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 und 3 (im
Anhang) zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden 192 anti-HBc/IgM positive Proben untersucht. Alle
getesteten Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost* Anti-HBc/IgM positiv gefunden.
Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich bei breiter Anwendung des
Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können.
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden 2559 anti-HBc/IgM negative Proben untersucht und
eine Spezifität von 99,60% bis 99,91% (initiale Testung) bzw. 99,91% bis 100% (Retestung)
ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a., sind abweichende Werte möglich.
Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der anti-HBc/IgM-Testung
nicht mit Sicherheit eine HBV-Infektion abgeleitet werden, wie auch ein negatives Testergebnis
keineswegs eine HBV-Infektion sicher ausschließt.
Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich.
* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und
anderen Ländern.
BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland
und anderen Ländern.
Boviserin ist eine eingetragene Marke von Aventis Behring.
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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H/R
14
0197
Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Material/Reagenz
Zustand
Lagerung
Stabilität•
verdünnte Untersuchungsprobe
1+100
verdünnt mit
Proben-Puffer
(Anti-HBc/IgM)
+2 bis +8 °C
24 Stunden
Testplatte
(restliche Riegel)
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
6 Wochen
HBcAg/POD-Konjugat
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
Konjugat-Puffer
(Anti-HBc/IgM)
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
Konjugat-Gebrauchslösung
1+10
+2 bis +8 °C
4 Wochen
+18 bis +25 °C
1 Woche
+2 bis +8 °C
4 Wochen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
im Beutel mit
Trockenkapseln
Proben-Puffer
(Anti-HBc/IgM)
nach Öffnen
Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum,
positiv
nach Öffnen
Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum,
negativ
Chromogen TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Puffer/Substrat TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
geschlossenes
Gefäß,
lichtgeschützt
5 Tage
8 Stunden
Chromogen-Gebrauchslösung 1+10
Waschlösung POD
(Konzentrat)
unverdünnt
nach Öffnen
1:20
1:20
+2 bis +8 °C
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
bis Verfallsdatum
1 Woche
1 Tag
Stopplösung POD
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
• in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum
OWSE G13 C0541 (909)
H/R
15
Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
akute HBV Infektion
192
initial reaktiv
retest reaktiv
192
n.d.
Tab. 3 Spezifität
Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an zwei unabhängigen Zentren (W, R) folgende
Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
(W) normal negative Seren
(W) normal negative Plasmen
(R) Patientenkollektiv
997
501
1061
initial reaktiv
retest reaktiv
2
2
1
0
0
1
Tab. 4 Reproduzierbarkeit
Probe
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Probe
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Intra-assay
Extinktionsmittelwert
0,236
0,182
0,155
0,159
Inter-assay
Extinktionsmittelwert
0,158
0,113
0,125
0,104
OWSE G13 C0541 (909)
% VK
4,3
6,8
6,3
5,7
% VK
10,9
5,9
5,8
16,9
H/R
16
Bei der Untersuchung zur Intra-assayReproduzierbarkeit wurden die Proben in
jeweils 20-fach-Bestimmung (FP 2, n=18)
getestet.
Bei der Untersuchung zur Inter-assayReproduzierbarkeit wurden die Proben in
jeweils 3-fach-Bestimmung in 5
unabhängigen Läufen getestet.
Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung
Testdurchführung
Vorbereitung der Reagenzien
BEP® 2000
Menüprogrammierung
für den
BEP® II
MENU NO
4 x 10 µl Kontroll-Serum, negativ
2 x 10 µl Kontroll-Serum, positiv
je 10 µl vorverdünnte Probe
OPERATE 1
NO
OPERATE 2
YES
Dosierung Konjugat
BEP® II
15 min (max 30 min)
(+18 bis +25 °C)
BEP® III
teilbestückte Platten mit
„Wasserriegeln“ auf
halbe Platten
ergänzen
100 µl KonjugatGebrauchslösung
100
1
NO
OPERATE 3
YES
Waschen und Dosierung Chromogen
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
automatische
Testabarbeitung
4x Waschen:
BEP® II
100 µl Chromogen
Gebrauchslösung
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dosierung Stopplösung
30 min ± 2 min
(+18 bis +25 °C
lichtgeschützt)
100 µl Stopplösung
nach maximal 1 h
Auswertung 450 nm
(Referenzwellenlänge: 650 nm)
Testergebnis
OWSE G13 C0541 (909)
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
H/R
17
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.1
0.07
-
Domaine d’utilisation
Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps IgM dirigés contre
l’antigène de core de l’hépatite B dans le sérum ou le plasma. La réalisation du test
immunoenzymatique se fait à l’aide des ELISA Processeurs BEP® II, BEP® III et BEP® 2000. Le
test a été mis au point pour l'analyse d'échantillons individuels, et non de pools d'échantillons. Le
produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt diagnostique
Des anticorps IgM anti-antigène de core de l’hépatite B sont formés dans presque tous les cas
d’hépatite B aiguë peu de temps après le début de la réplication du virus, et persistent dans la
circulation pendant environ 7 à 17 semaines.
Le dosage de l’anti-HBc/IgM peut donc être utilisé comme seul paramètre pour un diagnostic
relativement fiable d’hépatite B aiguë, dans la mesure où l’AgHBs et l’AgHBe peuvent
également apparaître dans le sérum en cas d’hépatite chronique, rendant ainsi le dosage
d’autres marqueurs (anti-HBs, anti-HBe ou anti-HBc) indispensables pour un diagnostic
différentiel. Dans certains cas d’hépatite B aiguë, les antigènes HBs et HBe peuvent disparaître
dès l’apparition des symptômes cliniques, alors que les anticorps correspondants ne sont pas
encore mesurables. Un dosage d’anti-HBc total n’apporte alors aucun éclaircissement, dans la
mesure où il s’agit d’un anticorps qui peut circuler à taux résiduel des années après la maladie.
Le dosage de l’anti-HBc/IgM permet de combler cette lacune 1.
Principe de la méthode
Les anticorps IgM anti-HBc présents dans l’échantillon à tester se lient aux anticorps anti-IgM
humaine fixés à la surface de la plaque de microtitration. L’antigène HBc marqué à la POD se lie
aux anticorps IgM anti-HBc spécifiques.
Après élimination de l’excès de conjugué et des éléments non liés de l’échantillon, on mesure la
réaction enzymatique du conjugué lié (réaction colorée bleue). La transformation enzymatique
du chromogène est interrompue par l’addition de la Solution d’arrêt POD (réaction colorée
jaune). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d’anticorps dans
l’échantillon.
Réactifs
Contenu du coffret
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBc/IgM plaque-test
Conjugué AgHBc/POD
Tampon conjugué (Anti-HBc/IgM)
Tampon échantillons (Anti-HBc/IgM)
Sérum de contrôle positif anti-HBc/IgM
Sérum de contrôle négatif anti-HBc/IgM
Solution de lavage POD (concentrée)**
Tampon/substrat TMB**
Chromogène TMB**
Solution d‘arrêt POD**
Flacon vide pour solution d’emploi du chromogène
Feuilles adhésives
Sachet PE pour conservation des barrettes non utilisées
Tableau de codes à barres
Fiche technique
1 pièce
3 x 0,6 ml
3 x 6 ml
3 x 40 ml
1 x 0,3 ml
1 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 pièce
6 pièces
1 pièce
1 pièce
1 pièce
** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost*
TMB (code OUVP).
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Edition Février 2004
Composition
Enzygnost* Anti-HBc/IgM (plaque-test) : plaque de microtitration recouverte d’anticorps
monoclonaux anti-IgM humaine.
Conjugué AgHBc/POD : antigène HBc obtenu par génie génétique, conjugué à la peroxydase
(POD).
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Tampon conjugué (anti-HBc/IgM) : tampon Tris additionné de Boviserin® et de Tween 20.
Tampon échantillons (anti-HBc/IgM) : tampon Tris additionné de glycérine, de Boviserin® et de
Tween 20.
Sérum de contrôle anti-HBc/IgM positif : sérum humain stabilisé contenant des anticorps
IgM anti-AgHBc, dilué en Tampon échantillons, valeur de D.O. indicative : ≥ 0,7.
Sérum de contrôle anti-HBc/IgM négatif : sérum humain stabilisé exempt d’anticorps antiAgHBc,dilué en Tampon échantillons, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,1.
Solution de lavage POD (concentrée) : solution tampon phosphate additionnée de Tween.
Agent de conservation : phénol (max. 1g/l)
Tampon/substrat TMB : peroxyde d’hydrogène (0,1 g/l) en solution tampon acétate.
Agent de conservation : n-butanol (env. 1%)
Chromogène TMB : tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure
Solution d’arrêt POD : acide sulfurique 0,5 N
Mises en garde et précautions d‘emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro.
2. Tout don de sang prévu pour la préparation des sérums de contrôle est soumis à des tests de
dépistage d’AgHBs, d’anti-VIH1, d’anti-VIH2 et d’anti-VHC. Pour la préparation du Sérum de
contrôle Anti-HBc/IgM négatif, seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés. Pour la
préparation du Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif, seuls les dons trouvés négatifs en
anti-VIH1, anti-VIH2 et anti-VHC ont été utilisés.
Indépendamment de cela, tout produit obtenu à partir de sang humain doit etre manipulé avec
les precautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut
exclure tout risque d’infection 2.
Ceci vaut particulièrement pour le Sérum de contrôle anti-HBc/IgM positif, dans la mesure où
le procédé de fabrication ne permet pas de garantir l’inactivation virale.
3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.
4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à
+121 °C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un
à l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement prévu pour inactiver les virus
pathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués par
le fabricant.
Préparation des réactifs
Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 °C avant le début du test, sans sortir la plaquetest de son emballage.
Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désionisée
en complétant à 400 ml.
Solution d’emploi du chromogène : pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec
10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution
d’emploi du chromogène), et la conserver dans le flacon fermé à l’abri de la lumière. Après
emploi, bien rincer le flacon avec de l’eau distillée.
Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d’un
flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.
Prédiluer tous les échantillons à tester, mais pas les sérums de contrôle, au 1/101 à l’aide du
Tampon échantillons (anti-HBc/IgM) dans des tubes (par ex. 10 µl d’echantillon + 1000 µl de
Tampon échantillons (anti-Hbc/IgM).
Solution d’emploi du conjugué : prélever la quantité nécessaire de Conjugué AgHBc/POD et
la diluer au 1/11 à l’aide du Tampon conjugué (anti-HBc/IgM).
OWSE G13 C0541 (909)
H/R
19
Pour une demi-plaque, ajouter 0,6 ml de Conjugué AgHBc/POD au contenu d’un flacon (6 ml)
de Tampon conjugué (anti-HBc/IgM) (dilution au 1/11).
Stabilités et conditions de conservation
Avant leur ouverture, tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HBc/IgM se conservent à la
température indiquée jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette.
Pour les stabilités et conditions de conservation après ouverture des flacons et préparation des
réactifs à leur dilution d'emploi, se reporter au tableau 1 en annexe.
Matériel nécessaire:
pour la distribution automatique des réactifs et l'automatisation des étapes de
BEP® II:
lavage
BEP® III:
pour l'automatisation du test après la distribution des échantillons et de
l'exploitation des résultats
BEP® 2000 :
pour l’entière automatisation du test et de l’ exploitation des résultats
Pipettes:
pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl
Incubateur:
bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d'incubation équivalente
Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.
Echantillons à tester
Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA)
obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être
conservés 3 jours maximum à +2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
Réalisation du test
Réalisation du test à l’aide du BEP® II
1. Distribution des contrôles et échantillons : distribuer 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM
négatif dans 4 cupules, 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif dans 1 cupule, 10 µl de
chacun des chantillons à tester prédilués dans les cupules suivantes, puis, à la fin de la série ou de
la plaque, de nouveau 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif dans 1 cupule. Couvrir la
plaque d’une feuille adhésive.
Ces étapes de pipetage ne doivent pas durer plus de 15 mn par plaque.
2. Incubation des contrôles et échantillons : laisser incuber au moins 15 min (max. 30 min) à
la température ambiante (+18/+25 °C).
3. Distribution du conjugué : retirer la feuille adhésive, ajouter dans chaque cupule 100 µl de
la solution d’emploi du conjugué, couvrir d’une nouvelle feuille adhésive et placer la plaque
dans l’incubateur.
4. Incubation du conjugué : laisser incuber 60 ± 2 min à +37 °C ± 1 °C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage.
5. Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer
dans chacune d’elles env. 0,3 ml de Solution de lavage; faire 4 à 5 lavages (cf. Remarque)
6. Distribution du substrat : ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du
chromogène, et couvrir d’une nouvelle feuille adhésive.
7. Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 °C a l’abri de la lumière.
8. Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de
Solution d’arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 6.
9. Mesure : faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit a 450 nm.
Il est recommandé d’utiliser un photomètre avec deux longueurs d’onde (une de mesure et une
de référence).
La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm.
La longueur d’onde de référence doit être de 650 nm (com-prise entre 615 et 690).
Réalisation du test sur le BEP® III
Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la
distribution des échantillons (point 1 du paragraphe «Réalisation du test sur le BEP® II»).
Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une
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feuille adhésive, dans le BEP® III. Si la plaque n’est pas totalement utilisée, la compléter au
moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuite
effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP® III).
Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions
techniques (cadence de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été
validés dans la combinaison BEP® III/Enzygnost*.
Réalisation du test sur le BEP® 2000
La distribution des échantillons ainsi que la réalisation du test sont effectuées entièrement
automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000).
Validation du test
Calculer les valeurs moyennes des sérums de contrôle à partir des différentes valeurs mesurées si:
-0,010 ≤ D.O.neg. ≤ 0,1
– 0,010 ≤ D.O.pos. ≥ 0,7
Pour le sérum de contrôle négatif, une valeur sortant du domaine indiqué peut être négligée.
Pour le sérum de contrôle positif, les deux valeurs obtenues doivent correspondre au domaine
indiqué.
Si ces critères ne sont pas obtenus, le test doit être recommencé.
Exploitation du test
L’exploitation des résultats est effectuée automatiquement par le BEP® 2000 et le BEP® III.
Respecter les instructions indiquées pour l’appareil utilisé. Ci-dessous le protocole
d’exploitation du test en l’absence d’un logiciel.
Calculer la valeur moyenne des densités optiques du contrôle négatif.
Pour– obtenir
la valeur-seuil, ajouter 0,07 à cette valeur moyenne :
–
D.O.nég. + 0,07 = valeur-seuil (cut off)
Afin de rendre plus fiables les résultats trouvés proches de la valeur-seuil, une zone grise a été
définie comme suit :
zone grise ± 10%
Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit:
Résultat du test
^ Anticorps anti-HBc/IgM-negatif
1. D.O.échantillon < cut off - 10% =
^ Anticorps anti-HBc/IgM-positif
2. D.O.échantillon > cut off + 10% =
^ douteux
3. cut off - 10% ≤ D.O.échantillon ≤ cut off + 10% =
Les échantillons trouvés dans la zone grise doivent être retestés une deuxième fois.
Si le résultat du deuxième test ne permet toujours pas d’interpréter l’échantillon comme positif ni
comme négatif, le rendre «douteux».
Limites du test et sources d'erreurs
1.Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA et le citrate, n’ont pas d’influence sur le
résultat du test.
2.Les échantillons lipémiques, ictériques ou hémolytiques n’ont pas d’influence sur le test.
Dans certains cas, les échantillons ayant un taux élevé de facteurs rhumatoïdes et
simultanément d’anti-HBc peuvent donner des signaux augmentés.
3.Une étude effectuée avec des échantillons contenant des anticorps anti-CMV, anti-HAV, antiVIH, anti-VHC et anti-virus de la rubéole, ainsi qu’avec des échantillons anti-HBs-positifs n’a
montré aucune influence sur le test.
4.Une étude effectuée avec des échantillons de patients ayant des valeurs de transaminases
élevées, ou contenant des auto-anticorps ou des ANA, n’a montré aucune influence sur le test.
5.Les échantillons contenant des anticorps anti-EBV ainsi que ceux provenant de patients
hémodialysés peuvent présenter une réactivité augmentée.
6.Ne pas utiliser de sérums insuffisamment coagulés, ni d’échantillons contenant de l’azide de
sodium ou contaminés. Les éventuelles particules (par ex. caillot de fibrine) doivent être
éliminées avant le test.
7.Si on utilise des échantillons décongelés, veiller à bien les homogénéiser avant emploi.
8.Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la
solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le
Chromogène TMB et le Tampon/substrat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la
combinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau des
codes à barres joint.
9.Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi de Chromogène et la Solution d’arrêt POD ne
doivent pas entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes
(ne pas utiliser de pipettes à parties métalliques au niveau du passage des solutions).
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21
La réaction du substrat ne doit pas être effectuée à proximité de désinfectants contenant de
l’eau de Javel. Une coloration bleue de la solution d’emploi du chromogène avant son
transfert dans la plaque indique une contamination ; préparer une nouvelle solution dans un
récipient propre. Eviter tout contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées.
10.La plaque doit rester immobile pendant l’incubation (la placer par ex. sur un support fixe ou
dans un bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact avec
l’eau thermostatée. Si l’eau contient des stabilisateurs pour éviter la contamination, bien
veiller à ce que ni la surface supérieure de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent en
contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions non-spécifiques.
11. En cas d’échantillons fortement réactifs, il peut y avoir absence de coloration au moment de
l’arrêt de la réaction, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation photométrique.
12.Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc
devenir trouble, sans que cela ait d’influence sur le résultat du test.
13.Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser les
performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées par
l’utilisateur ne sont pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles
peuvent affecter les performances du système et les résultats des dosages. Il est de la
responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou
à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles
d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation.
14.Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents
médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatation
Caractéristiques du test
Sensibilité et spécificité
Les résultats des études de sensibilité et de spécificité sont résumés dans les tableaux 2 et 3 en
annexe. Pour l’étude de sensibilité, 192 échantillons anti-HBc/IgM-positifs ont été testés. Tous
ont été trouvés positifs selon les critères du test Enzygnost* Anti-HBc/IgM.
Indépendamment de cela, on ne peut exclure que, dans le cadre d’une large utilisation du test,
certains échantillons ne soient pas révélés.
Pour l’étude de spécificité, 2559 échantillons anti-HBc/IgM-négatifs ont été testés, et ont donné
une spécificité comprise entre 99.60% et 99.91% pour le test initial, et entre 99.91% et 100%
pour le retest. Selon par ex. le collectif étudié ou la réalisation du test, d’autres valeurs peuvent
être obtenues.
Selon les connaissances actuelles, un résultat positif obtenu avec le test anti-HBc/IgM ne
permet pas de déduire avec certitude une infection par le virus de l’hépatite B. De même, un
résultat négatif ne permet en aucun cas d’exclure avec certitude une infection par le virus de
l’hépatite B.
Reproductibilité
Les résultats de reproductibilité et de répétabilité sont résumés dans le tableau 4 en annexe. Les
données doivent être considérées comme des exemples. Elles peuvent en effet diverger selon
par ex. la réalisation du test.
* Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans
d’autres pays.
BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans
d’autres pays.
Boviserin est une marque déposée de Aventis Behring.
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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H/R
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0197
Tab. 1 Stabilités et conditions de conservation
Echantillons/réactifs
état
Conservation
stabilité•
échantillon à tester dilué
dilué au 1/101
en Tampon
échantillons
(Anti-HBc/IgM)
+2/+8 °C
24 heures
Plaque
(barrettes restantes)
après ouverture
+2/+8 °C
6 semaines
Conjugué AgHBs/POD
après ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Tampon conjugué
(anti-HBc/IgM)
après ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Solution d’emploi du conjugué
1/11
+2/+8 °C
4 semaines
+18/+25 °C
1 semaine
dans sachet avec
capsule dessicative
Tampon échantillons
(anti-HBc/IgM)
après ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Sérum de contrôle anti-HBc/IgM,
positif
après ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Sérum de contrôle anti-HBc/IgM,
négativ
après ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Chromogène TMB
après ouverture
+2/+8 °C
date de
péremption
Tampon/substrat TMB
après ouverture
+2/+8 °C
date de
péremption
Solution d’emploi du
chromogène
1/11
+2/+8 °C
+18/+25 °C
dans récipient
fermé à l’abri
de la lumière
5 jours
8 heures
Solution de lavage POD
(concentrée)
non diluée
après ouverture
+2/+8 °C
1/20
1/20
+2/+8 °C
+18/+25 °C
date de
péremption
1 semaine
1 jour
après ouverture
+2/+8 °C
Solution d’arrêt POD
• jamais au-delà de la date de péremption
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date de
péremption
Tab. 2 Sensibilité
Les études de sensibilité ont donné les résultats suivants :
Collectif d‘échantillons
nombre
d‘échantillons
Infection HBV aiguë
192
réactif
réactif
au test initial
au retest
192
n.d.
Tab. 3 Spécificité
Les études de spécificité effectuées dans deux centres indépendants (W, R) ont donné les
résultats suivants :
Collectif d‘échantillons
nombre
réactif
réactif
d‘échantillons
au test initial
au retest
(W) sérums négatifs normaux
(W) plasmas négatifs normaux
(R) collectif de patients
997
501
1061
2
2
1
0
0
1
Tab. 4 Reproductibilité
Échantillon
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Échantillon
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Répétabilité
Valeur
moyenne de D.O.
0,236
0,182
0,155
0,159
Reproductibilité
Valeur
moyenne de D.O.
0,158
0,113
0,125
0,104
OWSE G13 C0541 (909)
H/R
% CV
4,3
6,8
6,3
5,7
% CV
10,9
5,9
5,8
16,9
24
Pour l‘étude de répétabilité, tous les
échantillons ont été testés 20 fois
(FP 2, n=18).
Pour l‘étude de reproductibilité, tous les
échantillons ont été testés 3 fois
dans 5 séries différentes.
Tab. 5 Réalisation du test et programmation
Réalisation du test
préparation des réactifs
BEP® 2000
Programmation du menu
pour le
BEP® II
MENU NO
4 x 10 µl de Sérum de contrôle négatif
2 x 10 µl de Sérum de contrôle positif
10 µl de chaque échantillon non dilué
OPERATE 1
NO
OPERATE 2
YES
Distribution du Conjugué
BEP® II
15 min (max 30 min)
(+18/+25 °C)
BEP® III
compléter éventuellement
la plaque à mi-plaque
avec des barrettes
remplies d‘eau
100 µl Conjugué à la
dilution d‘emploi
100
1
NO
OPERATE 3
YES
Lavage et distribution du Chromogène
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
réalisation
automatique du test
4 lavages:
BEP® II
100 µl de solution
d‘emploi du chromogène
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Distribution de la Solution d‘arrêt
30 min ± 2 min
(+18/+25 °C
à l‘abri de la lumière)
100 µl de solution d‘arrêt
après 1 h maximum
exploitation à 450 nm
(longueur d‘onde de référence: 650 nm)
résultat du test
OWSE G13 C0541 (909)
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
H/R
25
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.1
0.07
-
Settore d‘impiego
Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM contro
l’antigene «core» dell’epatite B nel siero o nel plasma. Il test immunoenzimatico viene impiegato
sugli analizzatori BEP® II, BEP® III e BEP® 2000 ELISA. Il test è stato realizzato per la determinazione
di campioni singoli, e non per pool di campioni. Il prodotto deve essere utilizzato solo per scopi
diagnostici in vitro.
Significato diagnostico
Gli anticorpi IgM contro l’antigene «core» dell’epatite B (anti-HBc/IgM) si manifestano in quasi
tutti i casi di una infezione acuta da virus dell’epatite B subito dopo l’inizio della moltiplicazione
dei virus e rimangono in circolazione ca 7–17 settimane.
Per questa ragione, la determinazione degli anticorpi HBc/IgM nel siero può essere presa come
unico parametro per una diagnosi relativamente sicura dell’infezione acuta da virus dell’Epatite
B, in quanto l’HBsAg e l’HBeAg possono comparire nel siero anche nei casi di epatiti croniche e
quindi richiedono un ulteriore parametro (anti-HBs, anti-HBe o anti-HBc) per la diagnosi
differenziale. In alcuni casi di infezione acuta da virus dell’Epatite B gli antigeni HBs e HBe
possono scomparire già all’apparire dei sintomi clinici, mentre gli anticorpi relativi non sono
ancora rilevabili. La determinazione degli anticorpi totali anti-HBc non sarebbe in questi casi di
nessun aiuto, perchè si tratta di anticorpi persistenti che possono rimanere in circolo anche per
anni. La determinazione degli anticorpi HBc/IgM può colmare questa lacuna diagnostica 1.
Principio del metodo
Gli anticorpi HBc/IgM presenti nel campione in esame si legano agli anticorpi anti-IgM umane
fissati sulla superficie della micropiastra. L’antigene HBc marcato POD si lega agli anticorpi
specifici HBc/IgM.
Dopo l’eliminazione del coniugato in eccesso e delle componenti del campione non legate, viene
valutata l’attività enzimatica del coniugato legato (reazione di colore blu). La trasformazione
enzimatica del cromogeno viene interrotta mediante aggiunta della Soluzione bloccante POD
(reazione di colore giallo). L’intensità del colore sviluppato è proporzionale alla concentrazione
di anticorpi nel campione.
Reagenti
Materiali forniti
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBc/IgM, piastra test
Coniugato HBcAg/POD
Tampone per il coniugato (Anti-HBc/IgM)
Tampone per campioni (Anti-HBc/IgM)
Siero di controllo, positivo (Anti-HBc/IgM)
Siero di controllo, negativo (Anti-HBc/IgM)
Soluzione di lavaggio POD (concentrata)
Tampone/Substrato TMB
Cromogeno TMB
Soluzione bloccante POD
Flacone vuoto per la soluzione d’uso di cromogeno
Fogli adesivi
Sacchetto in PE per le strip non utilizzate
Tabella con i codici a barre
Istruzioni per l‘uso
1 pz
3 x 0,6 mL
3 x 6 mL
3 x 40 mL
1 x 0,3 mL
1 x 0,5 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pz
6 pz
1 pz
1 pz
1 pz
** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB
(codice OUVP).
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Edizione Febbraio 2004
Composizione
Enzygnost* anti-HBc/IgM (piastra test): piastra per microtitolazione sensibilizzata con anticorpi
monoclonali contro le IgM umane.
Coniugato HBcAg/POD: antigene HBc prodotto con tecniche di ingegneria genetica, coniugato
con perossidasi (POD).
Conservante: fenolo (max. 1 g/L)
Tampone per il coniugato (anti-HBc/IgM): tampone Tris contenente Boviserin® e Tween 20.
Tampone per i campioni (anti-HBc/IgM): tampone Tris contenente glicerolo, Boviserin® e Tween 20.
Siero di controllo anti-HBc/IgM, positivo: siero umano stabilizzato, contenente anticorpi IgM
contro l’antigene HBc, diluito in tampone per campioni.
Valore nominale di estinzione: ≥ 0,7
Conservanti: fenolo (max. 1 g/L)
Siero di controllo anti-HBc/IgM, negativo: siero umano stabilizzato, privo di anticorpi contro
l’antigene HBc, diluito in tampone per campioni.
Valore nominale di estinzione: ≤ 0,1
Conservanti: fenolo (max. 1 g/L)
Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione di tampone fosfato contenente Tween.
Mezzo di conservazione: fenolo (max. 1g/L)
Tampone substrato TMB: perossido di idrogeno (0,1 g/L) in soluzione tampone acetato.
Mezzo di conservazione: n-butanolo (max. 1%).
Cromogeno TMB: tetrametilbenzidina-cloridrato
Soluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 N
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in-vitro.
2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei sieri di controllo è stata esaminata per
la ricerca dell‘HBsAg e degli anticorpi anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV. Per la produzione del
siero di controllo anti-HBc/IgM negativo sono stati impiegati esclusivamente sieri che
risultavano negativi. Per la produzione del siero di controllo anti-HBc/IgM positivo sono stati
impiegati esclusivamente sieri che risultavano negativi all’anti-HIV1, all’anti-HIV2 e all’anti-HCV.
Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni
rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibile escludere
con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni.2
In particolare, per il Siero di controllo-anti HBc/IgM positivo, il procedimento di produzione non
può garantire l’inattivazione del virus.
3. Si consiglia l'uso di guanti di protezione durante l'intera esecuzione del test.
4. Per la distruzione del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per
almeno 1 ora a + 121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due raccoglitori
collegati in serie. I raccoglitori dovrebbero contenere un disinfettante adatto all'inattivazione
dei virus patogeni umani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal
produttore.
Preparazione dei Reagenti
Prima dell’inizio del test, portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +18/+25°C. Non togliere
la piastra test dal sacchetto di alluminio.
Per ogni piastra test diluire 20 mL di liquido di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata o
deionizzata.
Soluzione d’uso di cromogeno: per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10
mL di tampone/substrato TMB nel flacone vuoto appositamente fornito (soluzione d’uso di
cromogeno), e onservare ben chiuso al riparo dalla luce. Dopo l’uso, lavare accuratamente il
flacone con acqua distillata.
A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamente
nel tampone/substrato TMB.
Prediluire in una cuvetta tutti i campioni in esame, non però i sieri di controllo, 1+100 con il
tampone per i campioni (anti-HBc/IgM), (es. 10 µL di campione + 1000 µL di tampone per i
campioni (anti-HBc/IgM).
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Soluzione d’uso di coniugato: prelevare la quantità necessaria di Coniugato HBcAg/POD e
diluire 1+10 con il tampone-coniugato (anti-HBc/IgM).
Per ogni metà piastra test prelevare 0,6 mL di coniugato HBcAg/POD e diluire con una
confezione originale (6 mL) di tampone-coniugato (anti-HBc/IgM) (1+10).
Conservazione e validità
Prima dell'apertura, tutte le componenti della confezione Enzygnost* Anti-HBc/IgM possono
essere utilizzate fino alla data di scadenza indicata in etichetta, purché conservate alla
temperatura indicata.
La conservazione e la validità dei reagenti diluiti per l'uso, dopo l'apertura, sono riportate in
appendice nella Tabella 1.
Strumentazione necessaria:
Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di
BEP® II:
lavaggio
BEP® III:
Per l'esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la
distribuzione dei campioni
BEP® 2000:
Per l'esecuzione completamente automatica del test e la valutazione
dei risultati
Pipette:
Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µL
Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+37 ± 1 °C) o analoghi metodi di incubazione
Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata.
Campioni
Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/
eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere
conservati a +2/+8 °C per non più di 3 giorni. Se i campioni devono essere conservati per un
lungo periodo di tempo, devono essere congelati.
Esecuzione del test
Esecuzione del test con il BEP® II
1. Distribuzione dei campioni: distribuire 10 µL di Siero di controllo Anti-HBc/IgM, negativo in
4 pozzetti e 10 µL di Siero di controllo Anti-HBc/IgM, positivo in un pozzetto; quindi distribuire
in ognuno dei successivi pozzetti 10 µL di campione prediluito e alla fine serie di campione o
della piastra, distribuire 10 mL di Siero di controllo Anti-HBc/IgM positivo in un pozzetto.
Chiudere con un foglio adesivo.
L’operazione di distribuzione deve essere completata entro 15 minuti per ogni piastra.
2. Incubazione dei campioni: incubare la piastra coperta con un foglio adesivo a temperatura
ambiente (+18/+25 °C) almeno 15 min (max. 30 min).
3. Distribuzione del coniugato: rimuovere il foglio adesivo senza effettuare prima alcun
lavaggio e distribuire in ogni pozzetto 100 µL della soluzione d’uso del coniugato. Ricoprire
con un nuovo foglio adesivo e quindi inserire nel sistema di incubazione.
4. Incubazione del coniugato: incubare per 60 ± 2 min, a +37 ± 1 °C; al termine procedere
quindi immediatamente con la fase di lavaggio.
5. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo, aspirare tutti i pozzetti e lavare 4 - 5 volte con ca. 0,3
mL di soluzione di lavaggio (ved. nota).
6. Distribuzione del substrato: distribuire in ogni pozzetto 100 µL di soluzione d’uso di
cromogeno e ricoprire la piastra con un nuovo foglio adesivo.
7. Incubazione del substrato: incubare la piastra per 30 ± 2 min, a +18/+25 °C al riparo dalla luce.
8. Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e aggiungere in ogni pozzetto 100 µL di
soluzione bloccante POD, con lo stesso ordine seguito al punto 6.
9. Valutazione: leggere fotometricamente i risultati a 450 nm entro 1 ora.
Si consiglia l’uso di un fotometro con due lunghezze d’onda (raggio di misura e raggio di
riferimento).Effettuare la misurazione dei valori di estinzione dei campioni di controllo e dei pazienti
a 450 nm. La lunghezza d’onda della misura di riferimento dovrebbe essere di 650 nm (evtl. fra 615
e 690 nm).
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Esecuzione del test con il BEP® III
Prima di utilizzare il BEP® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di dispensazione
del campione (paragrafo 1 - Esecuzione del test con il BEP® II). Subito dopo porre le piastre non
coperte (senza foglio adesivo) nel BEP® III. Le piastre parzialmente riempite devono essere
completate per almeno metà della piastra (6 strip) aggiungendo “strip riempite con acqua”. Il test
viene quindi eseguito in modo completamente automatico (vedere Manuale d’uso del BEP® III).
Per motivi tecnici, i settaggi dei tempi di incubazione nel software del BEP® III possono differire da
quelli del BEP® II (velocità del sistema), ma sono stati validati per i reattivi Enzygnost* su BEP® III.
Esecuzione del test usando BEP® 2000
Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in
maniera completamente automatica dallo strumento (v. manuale d’uso del BEP® 2000).
Validità del test
I valori di estinzione dei controlli negativi vengono utilizzati per calcolare il valore medio, quando:
-0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1
– 0,010 ≤ Epos. ≥ 0,7
Se uno dei valori di estinzione del siero di controllo anti-HBc/IgM, negativo, non rientra
nell’ambito indicato, può non essere preso in considerazione.
I valori di estinzione dei controlli positivi devono rientrare entrambi nell’ambito indicato. Se
queste condizioni non vengono rispettate, il test deve essere ripetuto.
Valutazione del test
Sul BEP® 2000 e sul BEP® III il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Per
maggiori informazione consultare il manuale d'uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione
dei risultati senza l'ausilio del software.
Dai valori di estinzione dei controlli negativi si calcola il valore medio.
Per calcolare il valore soglia si somma al valore medio di estinzione dei controlli negativi il valore
di estinzione
di 0,07.
–
Eneg. + 0,07 = Valore soglia (cut off)
Per valutare con maggior sicurezza i risultati vicini al valore soglia, viene definita la seguente
zona limite:
Valore soglia ± 10%
Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono così classificati:
Risultato del test:
^ Campioni anti-HBc/IgM negativi
1. Ecampione < cut off - 10% =
^ Campioni anti-HBc/IgM positivi
2. Ecampione > cut off + 10% =
^ Valore soglia
3. cut off -10% ≤ Ecampione ≤ cut off + 10% =
I campioni con un risultato dubbio, devono essere ritestati.
Se anche dopo ripetizione non è possibile valutare con sicurezza se un campione è positivo o
negativo, allora il risultato deve essere classificato come «dubbio».
Limitazioni del esecuzione del test
1.Anticoagulanti come l’eparina, EDTA e citrato non interferiscono con il risultato del test.
2.I campioni lipemici, itterici o emolitici non interferiscono con il test. In qualche raro caso, i
campioni con elevati livelli di fattore reumatoide accompagnato da elevati livelli di anti-HBc
possono dare segnali elevati.
3.I campioni contenenti anticorpi anti-CMV, HAV, HIV, HCV e rosolia, ed i campioni risultati
positivi per l’anti-HBs, non interferiscono con il risultato del test.
4.I campioni di pazienti con elevati valori di transaminasi, ed i campioni contenenti
autoanticorpi ed ANA non interferiscono con il risultato del test.
5.I campioni contenenti anticorpi anti-EBV ed i campioni di pazienti in emodialisi, possono
presentare una reattività elevata.
6.I sieri non completamente coagulati, i campioni contenenti sodio azide o contaminati da
microbi non devono essere usati. Eventuali particelle (ad es. coagulo di fibrina) devono
essere rimosse prima del test.
7.Per i campioni scongelati assicurare una buona omogeneizzazione del materiale.
8.I reagenti non devono essere interscambiati con altri kit a meno che non siano dello stesso
lotto (devono avere la combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre stampati sulla
confezione e riportata nell’allegata tabella dei codici a barre).
Sono esclusi la Soluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d’uso
di cromogeno (preparata con il cromogeno TMB ed il Tampone/Substrato TMB appartenenti
tutti allo stesso lotto).
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H/R
29
9.Il Tampone/Substrato TMB, la Soluzione d’uso di Cromogeno e la Soluzione Bloccante POD
non devono venire in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non usare
pipette con parti metalliche a diretto contatto con il liquido). Non eseguire la reazione con il
substrato in presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la Soluzione d’uso di
Cromogeno ha sviluppato un colore blu prima della dispensazione nella piastra test, questo
indica che la soluzione è contaminata; in tal caso preparare una soluzione fresca in un
contenitore pulito. Evitare il contatto delle suddette soluzioni con la cute.
10.Durante il periodo di incubazione la piastra deve essere protetta da vibrazioni (ad es.
utilizzare un supporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti devono
venire a contatto con l’acqua termostatata. Se vengono utilizzati conservanti per evitare la
contaminazione dell’acqua, occorre fare attenzione che la superficie della piastra test ed i
pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in quanto simili contaminazioni
possono produrre reazioni aspecifiche.
11. Campioni altamente reattivi possono causare la formazione di un precipitato entro la soluzione
colorata durante la reazione bloccante. Questo non interferisce con la valutazione fotometrica.
12.Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi
intorbidamenti, che però non interferiscono sui risultati del test.
13.Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le
prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono
supportate da Dade Behring poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui
risultati del test. Pertanto è responsabilità dell’utente validare tutte le modifiche apportate a
queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi da quelli inclusi nei fogli di istruzioni
o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring.
14.I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del
paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri
accertamenti.
Caratteristiche specifiche del test
Sensibilità e specificità
I risultati dello studio sulla sensibilità e specificità sono riassunti nelle Tabelle 2 + 3 (v. appendice).
Per determinare la sensibilità sono stati analizzati un totale di 192 campioni anti-HBc/IgM,
positivi. Tutti i campioni analizzati sono risultati positivi, così come definito dai criteri del test
Enzygnost* Anti-HBc/IgM. Tuttavia non si può escludere che qualche campione possa sfuggire
alla rilevazione, quando il test è utilizzato su larga scala.
Per determinare la specificità sono stati analizzati un totale di 2559 campioni anti-HBc/IgM
negativi ed è risultata una specificità di 99,60% - 99,91% (test iniziale) e 99,91% - 100%
(ripetizione del test). Le deviazioni da questi risultati possono essere dovute ad una diversa
popolazione esaminata, alla procedura del test, ecc.
Secondo lo stato attuale delle conoscenze, un risultato positivo del test anti-HBc/IgM non
costituisce una prova sicura di un’infezione da HBV, come pure un risultato negativo non
esclude con assoluta certezza un’infezione da HBV.
Riproducibilità
I risultati della riproducibilità intra-serie e inter-serie sono riassunti nella Tabella 4
(nell’appendice). I dati indicati sono risultati tipici. Si possono avere risultati diversi, dovuti a
fattori differenti (procedura, ecc.)
* Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi.
BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e
altri paesi.
Boviserin è un marchio registrato della Aventis Behring.
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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H/R
30
0197
Tab. 1 Conservazione e validità
Campioni/Reagenti
Condizioni
Conservazione
Stabilità•
campione diluito
1+100 diluito
con Tampone
per campioni
(Anti-HBc/IgM)
+2/+8 °C
24 ore
Piastra test
(pozzetti rimanenti)
dopo apertura
+2/+8 °C
6 settimane
Coniugato HBcAg/POD
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Tampone per il coniugato
(anti-HBc/IgM)
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Coniugato diluito per l’uso
1+10
+2/+8 °C
4 settimane
+18/+25 °C
1 settimana
(nel sacchetto
con l’essiccante)
Tampone per i campioni
(anti-HBc/IgM)
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Siero di controllo anti-HBc/IgM,
positivo
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Siero di controllo anti-HBc/IgM,
negativo
dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Cromogeno TMB
dopo apertura
+2/+8 °C
data di
scadenza
Tampone/Substrato TMB
dopo apertura
+2/+8 °C
data di
scadenza
Soluzione d’uso di cromogeno
1+10
+2/+8 °C
+18/+25 °C
(ben chiuso, protetto dalla luce)
5 giorni
8 ore
Soluzione di lavaggio POD
(concentrata)
indiluito
dopo apertura
+2/+8 °C
1:20
1:20
+2/+8 °C
+18/+25 °C
data di
scadenza
1 settimana
1 giorno
dopo apertura
+2/+8 °C
Soluzione bloccante POD
• In nessun caso oltre la data de scadenza.
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H/R
31
data di
scadenza
Tab. 2 Sensibilità
Gli studi sulla sensibilità hanno fornito i seguenti dati :
Panello dei campioni
Numeri di campioni
Infezione HBV acuta
192
Inizialmente
Ripetutamente
reattivi
reattivi
192
n.d.
Tab. 3 Specificità
Gli studi sulla specificità, condotti da due diversi centri (W, R) hanno fornito i seguenti dati:
Pannello dei campioni
Numero di campioni Inizialmente
Ripetutamente
reattivi
reattivi
(W) siero negativo normale
(W) plasma negativo normale
(R) pannello dei pazienti
997
501
1061
2
2
1
0
0
1
Tab. 4 Riproducibilità
Intra-serie
Campione Estinzione
media
FP 1
0,236
FP 2
0,182
FP 3
0,155
FP 4
0,159
Inter-serie
Campione Estinzione
media
FP 1
0,158
FP 2
0,113
FP 3
0,125
FP 4
0,104
OWSE G13 C0541 (909)
% CV
4,3
6,8
6,3
5,7
% CV
10,9
5,9
5,8
16,9
H/R
32
In uno studio sulla riproducibilità intra-serie,
i campioni sono stati analizzati in
determinazioni ripetute 20 volte (FP 2, n = 18).
In uno studio sulla riproducibilità inter-serie,
i campioni sono stati analizzati in
determinazioni ripetute 3 volte in 5 sedute
indipendenti.
Tab. 5 Esecuzione e programmazione del test
Esecuzione del test
Preparazione dei reagenti
BEP® 2000
Programmazione del
menù per il
BEP® II
MENU NO
4 x 10 µl Siero di controllo, negativo
2 x 10 µl Siero di controllo, positivo
10 µl per campioni non diluiti
OPERATE 1
NO
OPERATE 2
YES
Dispensazione Coniugato
BEP® II
15 min (max 30 min)
(+18/+25 °C)
100 µl coniugato diluito,
pronto per l‘uso
BEP® III
Nel caso di piastre riempite
parzialmente, aggiungere
file di pozzetti con acqua
fino a riempire mezza
piastra test
100
1
NO
OPERATE 3
YES
Lavaggio e dispensazione Cromogeno
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Esecuzione
automatica del test
4 lavaggi BEP® II
100 µl Soluzione
d‘uso del cromogeno
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dispensazione Soluzione Bloccante
30 min ± 2 min
(+18/+25 °C
al riparo della luce)
100 µl Soluzione bloccante
al massimo entro 1 ora
Lettura a 450 nm (lunghezza
d‘onda di riferimento: 650 nm)
Risultati
OWSE G13 C0541 (909)
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
H/R
33
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.1
0.07
-
Campos de aplicación
Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos de la IgM contra
el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma. La realización del ensayo
inmunológico se lleva a cabo con los ELISA Procesadores BEP® II, BEP® III y BEP® 2000. El test
fue dessarollado para la investigación de muestras aisladas, no para muestras en pool. El
producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro.
Importancia diagnóstica
Los anticuerpos IgM contra el antígeno de la hepatitis B (core) (Anti-HBc/IgM) se forman en casi
todos los casos de hepatitis B aguda ya poco tiempo después de comenzar la multiplicación de
los virus y permanecen en la circulación durante unas 7 a 17 semanas.
Por ese motivo, la determinación de Anti-HBc/IgM puede usarse como parámetro único para un
diagnóstico relativamente seguro de una hepatitis B aguda, ya que tanto HBsAg como HBeAg
pueden aparecer en el suero también en las hepatitis crónicas y con ello hacen necesaria la
investigación de otros parámetros (Anti-HBs, Anti-HBe o Anti-HBc) para establecer el
diagnóstico diferencial. En algunos casos de hepatitis B aguda, los antígenos HBs y HBe
pueden haber ya desaparecido antes de presentarse los síntomas clínicos, momento en que los
anticuerpos correspondientes todavía no pueden dosarse. En estos casos la determinación de
los anticuerpos totales Anti-HBc no aclararía la situación, ya que se trata aquí de anticuerpos de
larga permanencia que pueden encontrarse en la circulación, como únicos anticuerpos, aún
años después de la enfermedad. En cambio, la determinación de Anti-HBc/IgM permite
establecer este diagnóstico 1.
Principio del método
Los anticuerpos HBc/IgM existentes en la muestra a investigar se unen a los anticuerpos AntiIgM humana fijados sobre la superficie de la placa de microtitulación. A los anticuerpos HBc/IgM
específicos se va a unir el antígeno HBc marcado con POD.
Después de eliminar el exceso de conjugado y los componentes de la muestra no enlazados, se
determina la actividad enzimática del conjugado fijado (reacción cromática azul). La
transformación enzimática del cromógeno se interrumpe por adición de la solución de
detenimiento POD (reacción cromática amarilla). La intensidad del color es proporcional a la
concentración de anticuerpo presente en la muestra.
Reactivos
Contenido del envase comercial
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBc/IgM placa de prueba
Conjugado HBcAg/POD
Tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM)
Tampón para muestras (Anti-HBc/IgM)
Suero control, positivo (Anti-HBc/IgM)
Suero control, negativo (Anti-HBc/IgM)
Solución de lavado POD (concentrado)**
Tampón/Sustrato TMB**
Cromógeno TMB**
Solución de detenimiento POD**
Frasco vacío para la solución de uso cromógeno
Láminas adhesivas
Bolsa de PE para guardar los elementos no necesarios
Tabla Barcode
Boletín informativo
1 unidad
3 x 0,6 ml
3 x 6 ml
3 x 40 ml
1 x 0,3 ml
1 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 unidad
6 unidades
1 unidad
1 unidad
1 unidad
** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales para
Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP).
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H/R
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Edición Febrero 2004
Composición
Enzygnost* Anti-HBc/IgM (placa de prueba): Placa de microtitulación recubierta con anticuerpos monoclonales contra la IgM humana.
Conjugado HBcAg/POD: Antígeno HBc obtenido por tecnología genética, conjugado con
peroxidasa (POD).
Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)
Tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM): Tampón Tris con Boviserin® y Tween 20.
Tampón para muestras (Anti-HBc/IgM): Tampón Tris con glicerina, Boviserin® y Tween 20.
Suero de control Anti-HBc/IgM, positivo: Suero humano estabilizado, con anticuerpos IgM
contra el antígeno HBc, diluido con tampón para muestras; valor teórico de extinción: ≥ 0,7.
Agentes de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)
Suero de control Anti-HBc/IgM, negativo: Suero humano estabilizado, sin anticuerpos contra
el antígeno HBc, diluido con tampón para muestras; valor teórico de extinción: ≤ 0,1.
Agentes de conservación: Fenol (máx. 1 g/l)
Solución de lavado POD (concentrado): Solución de tampón de fosfato con adición de Tween.
Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato.
Agente de conservación: n-butanol (máx. 1%)
Cromógeno TMB: Diclorhidrato de tetrametilbenzidina
Solución de detenimiento POD: Acido sulfúrico 0,5 N
Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro.
2. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación de sueros de control ha sido
investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV. Para la
elaboración del suero control anti-HBc/IgM, negativo se usaron solamente donaciónes con
resultado negativo. Para la elaboración del suero control anti-HBc/IgM, positivos se usaron
solamente donaciones con resultados negativos para anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana
deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de
seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir la
existencia de agentes patógenos2. Esto también rige especialmente para el Suero de control
Anti-HBc/IgM, positivo, pues mediante el procedimiento de elaboración no se puede
garantizar una inactivación del virus.
3. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.
4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por
lo menos 1 hora a + 121 °C. Las soluciones aspiradas se deben recoger en dos recipientes
conectados uno con el otro. Los recipientes deben contener un medio de desinfección
apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la concentración y el
tiempo de acción dados por el fabricante.
Preparación de reactivos
Llevar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +18 y +25 °C antes de iniciar
la prueba, sin sacar del recipiente la placa de prueba.
Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 ml.
Solución de uso del cromógeno: Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMB
con 10 ml de tampón/sustrato TMB en el frasco plástico adjunto (solución de uso del
cromógeno) y conservar el frasco cerrado al abrigo de la luz. Después de su uso, lavar
cuidadosamente el frasco con agua destilada.
Para evitar la repleción no está permitido verter el contenido total del frasco de cromógeno TMB
en el frasco de tampón/sustrato TMB.
Prediluir todas las muestras a investigar, pero no los sueros de control, en un tubo de ensayo
en proporción 1+100 con tampón para muestras (Anti-HBc/IgM) (por ej. 10 µl de muestra
+ 1000 µl de tampón para muestras (Anti-HBc/IgM)).
Solución de uso del conjugado: Extraer la cantidad necesaria del conjugado HBcAg/POD y
diluirlo 1+10 con el tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM).
Para media placa de prueba pipetear 0,6 ml de conjugado HBcAg/POD en el frasco original
(6 ml) de tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM) (1+10).
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H/R
35
Estabilidad y almacenaje
Todos los componentes del envase combinado Enzygnost* Anti-HBc/IgM aún cerrados,
conservados a la temperatura indicada, son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas
en las etiquetas.
La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los
reactivos ya diluidos listos para el uso se pueden tomar de la Tabla 1 del apéndice.
Equipo necesario:
BEP® II:
Para el desarollo automático de la dosificación de reactivos y de las
etapas de lavado
BEP® III:
Para la realización completamente automática del test después de la
distribución de las muestras, así como para la evaluación
Para la realización completamente automática del test
BEP® 2000:
Pipetas:
Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl
Incubadora:
Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación
similares
Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.
Material a investigar
Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con
EDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de
laboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre +2 y +8 °C. Para tiempos
más largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.
Procedimiento
Procedimiento con el BEP® II
1. Dosificación de las muestras: Colocar en 4 pocillos 10 µl de suero de control Anti-HBc/IgM,
negativo, por c/u; luego en el siguiente pocillo 10 µl de suero de control Anti-HBc/IgM,
positivo. En los siguientes pocillos dosificar 10 µl de cada una de las muestras prediluidas y
al final de la serie o de la placa de prueba colocar otra vez 10 µl de suero de control Anti-HBc/
IgM, positivo. Cubrir con lámina adhesiva.
El proceso de pipeteo no debe durar más de 15 minutos por placa de prueba.
2. Incubación de las muestras: Incubar no menos de 15 min (máx. 30 min) a la temperatura
ambiente (entre +18 y +25 °C).
3. Distribución del conjugado: Retirar la lámina adhesiva y, sin lavar previamente, pipetear
100 µl de solución de uso del conjugado en cada pocillo, cubrir con una nueva lámina
adhesiva y a continuación colocar en el incubador.
4. Incubación del conjugado: Incubar durante 60 ± 2 min a +37 ± 1 °C y a continuación lavar
de inmediato.
5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada
uno de ellos con aprox. 0,3 ml de solución de lavado 4 ó 5 veces (ver Advertencia).
6. Distribución del sustrato: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de uso del
cromógeno y cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva.
7. Incubación del sustrato: Incubar 30 ± 2 min entre +18 y +25 °C al abrigo de la luz.
8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva. Agregar a cada pocillo 100 µl de solución
de parada POD manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6.
9. Medición: Valorar fotométricamente a 450 nm dentro del término de una hora.
Es recomendable utilizar un fotómetro con dos longitudes de onda (rayo de medida y rayo de
referencia).
La medida de la extinción de las muestras de control y de las muestras de pacientes debe
realizarse con una longitud de onda de 450 nm; como longitud de onda de la medida de
referencia se recomienda 650 nm (o entre 615 y 690).
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Procedimiento con el BEP® III
Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la
distribución de las muestras (punto 1 del "Procedimiento en el BEP® II"). Directamente después
de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina adhesiva en el BEP® III. Aquí
es importante observar que las placas de prueba que no estén llenas se deben completar con
"elementos con agua" hasta por lo menos la mitad de la placa de prueba (6 elementos). Todas
las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma completamente automática por el
aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III).
Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del
procedimiento en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin
embargo validados en la combinación BEP® III/Enzygnost*.
Procedimiento con el BEP® 2000
La dosificación de las muestras y la subsiguiente realización del test se efectúan de forma
completamente automática en el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000)
Valoración del test
Los valores de las extinciones de los sueros de control se pueden utilizar para calcular el valor
medio cuando:
-0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1
–0,010 ≤ Epos. ≥ 0,7
Si uno de los valores de extinción del suero de control Anti-HBc/IgM, negativo, se halla fuera del
límite especificado, se puede no tenerlo en cuenta para el cálculo.
Los valores de extinción de los controles positivos, en cambio, deben estar ambos dentro del
límite especificado. Si no se cumplen estos requisitos, hay que repetir la prueba.
Valoración de la prueba
Las valoraciones se efectúan automáticamente con el BEP® 2000 y el BEP® III. Para esto
consultar, por favor, los manuales de funcionamiento. Los siguientes capítulos son para tener en
cuenta en caso de evaluaciones sin la ayuda del software.
Obtener el valor medio de las extinciones de los controles negativos.
Para calcular el valor límite, sumar 0,07 al valor medio de extinción de los controles negativos:
–
Eneg. + 0,07 = valor límite (cut off)
Para determinar mejor los resultados próximos al valor límite, se ha establecido una zona límite:
Valor límite ± 10%
Según los criterios de la prueba, las muestras se clasifican de la siguiente manera:
Resultado de la prueba:
^ Anticuerpo HBc/IgM negativo
1. Emuestra < cut off - 10% =
^ Anticuerpo HBc/IgM positivo
2. Emuestra > cut off + 10% =
^ valor límite
3. cut off - 10% ≤ Emuestra ≤ cut off + 10% =
Las muestras cuyos resultados son de valor límite deben ser analizadas nuevamente.
Si después de ello tampoco se puede catalogar la muestra como positiva o negativa, el
resultado de la prueba se expresa como de «valor límite».
Limitaciones del Procedimiento
1.Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test.
2.Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolíticas no alteran el desarrollo del test. En algunos
casos aislados, muestras que presentan un factor reumatoideo alto junto con un contenido
alto de anti-HBc pueden producir una señal elevada.
3.Las muestras con anticuerpos contra CMV, HAV, HIV, HCV, Virus de la rubéola, así como, las
muestras con Anti-HBs positivo, no influyen en los resultados del test.
4.En muestras de pacientes con un valor elevado de transaminasas, así como, con
autoanticuerpos o en muestras conteniendo ANA, no se observo ninguna influencia sobre
los resultados del test.
5.Muestras con anticuerpos contra EBV, así como muestras de pacientes en hemodiálisis,
pueden mostrar un aumento en la reactividad.
6.Los sueros que no estén completamente coagulados, el material que contenga azida sódica y las
muestras a investigar contaminadas microbiológicamente no deben ser utilizadas. Las partículas
existentes (por ej., coagulo de fibrina) deben ser retiradas antes de empezar con el test.
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7. En las muestras descongeladas se debe observar que haya una buena homogenización del material.
8.Los reactivos (con excepción de la solución de lavado POD, la solución de detenimiento
POD y la solución de uso del cromógeno elaborada a partir de los reactivos dependientes del
lote, cromógeno TMB y Tampón/sustrato TMB) sólo se pueden utilizar juntos si provienen del
mismo lote, esto es, con el mismo número de 6 cifras (Nr. de Lote) que está impreso en el
envase o que se puede tomar de la Tabla Barcode incluida.
9.El tampón substrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de detenimiento
POD no deben entrar en contacto con iones de metales pesados ni con sustancias oxidantes
(no utilizar pipetas con partes metálicas que entren en contacto con el líquido). No efectuar la
reacción del sustrato en la proximidad de sustancias desinfectantes que contengan
hipoclorito. Una coloración espontánea azul de la solución de uso del cromógeno antes de
colocarla en la placa de prueba indica una contaminación; en este caso, se deberá preparar
una solución fresca en un recipiente limpio. Evite el contacto cutáneo con las soluciones
arriba mencionadas.
10.Durante la incubación debe mantenerse la placa de ensayo quieta (p. ej. sobre un flotador
fijo o en un baño de agua no circulante); los pocillos permanecen de esta manera en
contacto con el agua. En el caso de usar medios de conservación en el agua, para evitar su
contaminación, debe observarse cuidadosamente que ni la superficie de la placa de prueba
ni los pocillos entren en contacto con estas soluciones, ya que una contaminación de este
tipo puede ocasionar reacciones inespecíficas.
11. Para muestras con reactividad alta puede, durante la reacción de detenimiento, precipitarse
el colorante. Esto no afecta el resultado de la valoración fotométrica.
12.Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón
puede aparecer turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test.
13.Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el
rendimiento del producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones
definidas por el usuario no están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al
rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario
validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en
analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade Behring o en
estas instrucciones de uso.
14.Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia
clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.
Características del test
Sensibilidad y especificidad
Los resultados de los ensayos para la sensibilidad y la especificidad están resumidos en las
Tablas 2 y 3 (en el anexo).
Para determinar la sensibilidad se estudiaron 192 muestras con anti-HBc/IgM positivo. Todas
las muestras estudiadas fueron encontradas positivas según los criterios del Enzygnost* AntiHBc/IgM. Independiente de esto, no se puede excluir que al utilizar el test en un rango mucho
más amplio, algunas muestras aisladas no puedan ser reconocidas.
Para la determinación de la especificidad se estudiaron 2559 muestras con anti-HBc/IgM
negativo y se encontró una especificidad del 99,60% al 99,91% (ensayo inicial) y del 99,91% al
100% (repetición del ensayo). Dependiendo, entre otros, de la colectividad estudiada y del
desarrollo del test, es posible que aparezcan valores discrepantes.
De acuerdo con el estado actual de los conocimientos de un resultado positivo para el ensayo
de anti-HBc/IgM no se puede deducir con seguridad una infección con HBV, así como tampoco,
un resultado negativo puede excluir definitivamente una infección.
Reproducibilidad
Los resultados de los ensayos de reproducibilidad intra/inter-assay están resumidos en la Tabla 4
(en el anexo). En este caso se trata de un datos obtenidos de un ejemplo. Debido a la diferencias,
entre otras, en el desarrollo del test es posible que aparezcan valores discrepantes.
* Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países.
BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países.
Boviserin es una marca registrada de Aventis Behring.
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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0197
Tabla 1 Estabilidad y almacenaje
Material/reactivo
Estado
Almacenaje
Estabilidad•
Muestra diluida
1+100 diluido entre +2 y +8 °C
con Tampón
para muestras
(Anti-HBc/IgM)
24 horas
Placa de prueba
(elementos restantes)
abierto
6 semanas
Conjugado HBcAg/POD
abierto
entre +2 y +8 °C
4 semanas
Tampón para conjugado
(Anti-HBc/IgM)
abierto
entre +2 y +8 °C
4 semanas
Solución de uso del conjugado
1+10
entre +2 y +8 °C
4 semanas
entre +18 y +25 °C
1 semana
entre +2 y +8 °C
4 semanas
entre +2 y +8 °C
4 semanas
entre +2 y +8 °C
4 semanas
entre +2 y +8 °C en
envase con cápsulas
deshidratantes
Tampón para muestras
(Anti-HBc/IgM)
abierto
Suero de control Anti-HBc/IgM,
positivo
abierto
Suero de control Anti-HBc/IgM,
negativo
Cromógeno TMB
abierto
entre +2 y +8 °C
Fecha de
caducidad
Tampón/sustrato TMB
abierto
+2 bis +8 °C
Fecha de
caducidad
Solución de uso del
cromógeno
1+10
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
en recipiente
cerrado, al abrigo
de la luz
5 días
8 horas
Solución de lavado POD
(concentrado)
sin diluir
abierto
entre +2 y +8 °C
1:20
1:20
entre +2 y +8 °C
entre 18 y + 25 °C
Fecha de
caducidad
1 semana
1 día
abierto
entre +2 y +8 °C
Solución de detenimiento POD
• En ningún caso más allá de la fecha de caducidad
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Fecha de
caducidad
Tab. 2 Sensibilidad
En los estudios de la sensibilidad se encontraron los siguientes datos:
Colectividad de muestras
Número de
Reactividad
Reactividad
muestras
inicial
repetida
Infección HBV aguda
192
192
n.d.
Tab. 3 Especificidad
En los estudios de la sensibilidad se encontraron en dos centros independientes (W, R) los
siguientes datos:
Colectividad de muestras
Número de
Reactividad
Reactividad
muestras
inicial
repetida
(W) Sueros negativos normales
(W) Plasmas normales negativos
(R) Colectividad de pacientes
997
501
1061
2
2
1
0
0
1
Tab. 4 Reproducibilidad
Muestra
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Muestra
FP 1
FP 2
FP 3
FP 4
Intra assay
Promedio de
extinción
0,236
0,182
0,155
0,159
Inter assay
Promedio de
extinción
0,158
0,113
0,125
0,104
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% CV
4,3
6,8
6,3
5,7
% CV
10,9
5,9
5,8
16,9
H/R
40
En los estudios de reproducibilidad
intra assay las muestras fueron
determinadas 20 veces c/u (FP 2, n = 18).
En los estudios de reproducibilidad
inter assay las muestras fueron
determinadas 3 veces c/u en 5
carreras diferentes.
Tab. 5 Realización de la prueba y programación
Programación
Procedimiento
Preparación de los reactivos
para el
BEP® 2000
BEP® II
MENU NO
4 x 10 µl de suero control, negativo
2 x 10 µl de suero control, positivo
10 µl de muestra no diluida
OPERATE 1
NO
OPERATE 2
YES
Dosificación del conjugado
®
®
BEP II
BEP III
15 min (max 30 min)
(entre +18 y +25 °C)
fraccionadas a
medias placas con
«elementos con agua»
100 µl de conjugado diluido
listo para el uso
100
1
NO
OPERATE 3
YES
Lavado y dosificación del cromógeno
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Procesamiento
automático
4 lavar:
BEP® II
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dosificación solución de detenimiento
100 µl de solución de
uso del cromógeno
30 min ± 2 min
(entre +18 y +25 °C
protegido de la luz)
100 µl de sol. de detenimiento
máximo 1 h después
Valoración a 450 nm (longitud
de onda de referencia: 650 nm)
Resultado de la prueba
OWSE G13 C0541 (909)
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
H/R
41
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.1
0.07
-
Campo de aplicação
Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o antígeno
“core” da hepatite B no soro e no plasma. O processamento do teste imunoenzimático efectuase com os processadores ELISA BEP® II, BEP® III e BEP® 2000. O teste foi desenvolvido para
o exame de amostras singulares, não de amostras em pool. O produto só pode ser utilizado
para fins de diagnóstico in vitro.
Significado diagnóstico
Anticorpos IgM contra o antígeno “core” da hepatite B (anti-HBc/IgM) formam-se em quase
todos os casos de infecção aguda de hepatite B, já pouco depois do início da multiplicação do
vírus, e permanecem aprox. 7 a 17 semanas na circulação.
Por este motivo, a detecção de anti-HBc/IgM é o único parâmetro ao nosso alcance para um
diagnóstico relativamente seguro de uma infecção aguda de hepatite B, uma vez que o HbsAg
e o HbeAg também podem ocorrer no soro em hepatites crónicas, tornando-se pois necessário
lançar mão de outros parâmetros para um diagnóstico diferencial (anti-HBs, anti-HBe ou antiHBc). Em alguns casos de infecção aguda de hepatite B pode ocorrer que os antígenos Hbs e
Hbe, ao manifestarem-se os sintomas clínicos, já tenham desaparecido, e os anticorpos
correspondentes não sejam ainda mensuráveis. Uma determinação do anti-HBc total nada
esclareceria neste caso, pois os anticorpos em questão são anticorpos de longa vida, talvez os
únicos que podem ainda circular durante anos, mesmo, depois da doença 1.
Princípio do método
Os anticorpos contra a HBc/IgM existentes na amostra a examinar, associam-se aos anticorpos
contra a IgM anti-humana fixados na superfície da placa de microtitração. Aos anticorpos específicos
HBc/IgM associa-se o HBc-Antígeno marcado com POD. Depois do excedente do conjugado e dos
componentes não associados terem sido removidos, a reacção enzimática do conjugado
combinado é determinada (reacção cromática azul). A transformação enzimática do cromógeno é
interrompida através da adição de solução de bloqueio POD (reacção cromática amarela). A
intensidade da cor é proporcional à concentração de anticorpos existentes na amostra.
Reagentes
Conteúdo da embalagem
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBc/IgM Placa de ensaio
Conjugado HBcAg/POD
Tampão de conjugado (Anti-HBc/IgM)
Tampão para amostras (Anti-HBc/IgM)
Soro de controlo, positivo (Anti-HBc/IgM)
Soro de controlo, negativo (Anti-HBc/IgM)
Solução de lavagem POD (concentrado)**
Tampão/substrato TMB**
Cromógeno TMB**
Solução de paragem POD**
Frasco vazio para a solução de uso do cromógeno
Folhas adesivas
Bolsa de PE, para guardar as barras não utilizadas
Tabela de código de barras
Folheto da embalagem
1 unidade
3 x 0,6 ml
3 x 6 ml
3 x 40 ml
1 x 0,3 ml
1 x 0,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 unidade
6 unidades
1 unidade
1 unidade
1 unidade
** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes
acidionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP).
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Edição Fevereiro 2004
Composição
Enzygnost* Anti-HBc/IgM (Placa de ensaio): placa de microtitulação recoberta com anticorpos
monoclonais contra IgM humana.
Conjugado HBcAg/POD: antígeno Hbc, obtido por tecnologia genética, conjugado com
peroxidase (POD).
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Tampão para conjugado (anti-HBc/IgM): Tampão Tris com Boviserin® e Tween 20.
Tampão para amostras (anti-HBc/IgM): Tampão Tris com glicerina, Boviserin® e Tween 20.
Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo: soro humano, estabilizado, com anticorpos IgM contra o antígeno HBc, diluído em tampão para amostras; valor indicativo de extinção: ≥ 0,7.
Soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo: soro humano, estabilizado, sem anticorpos contra o
antígeno HBc, diluído em tampão para amostras; valor indicativo de extinção: ≤ 0,1
Solução de lavagem POD (concentrado): solução tampão de fosfato com teor de Tween.
Tampão/substrato TMB: peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em tampão de acetato.
Conservante: n-butanol (aprox. 1%)
Cromógeno TMB: diidrocloreto de tetrametilbenzidina
Solução de paragem POD: ácido sulfúrico 0,5 N
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in-vitro.
2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de soros de controlo foi
previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, Anti-HIV1, Anti-HIV2 e Anti-HCV.
Na elaboração do Soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo, só são utilizadas dádivas com
resultado negativo e na de Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo, só dádivas com
resultados anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV negativos.
No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com as
precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco
biológico 2. O aviso vale sobretudo para o Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo, porque, em
virtude do processo de elaboração, não se pode garantir uma inactivação do vírus.
3. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste.
4. Para desinfecção de materiais sólidos, convém colocá-los na autoclave durante pelo menos 1
hora a uma temperatura de, pelo menos, +121 °C. Todas as soluções aspiradas devem ser
recolhidas em dois receptáculos ligados em série, que devem conter um desinfectante
apropriado para inactivação de vírus patogénicos humanos. Devem observar-se a concentração e o tempo de acção indicados pelo fabricante.
Preparação dos reagentes
Levar previamente todos os reagentes e amostras à temperatura de +18 a +25 °C, mas sem
tirar a placa de ensaio do seu recipiente.
Para cada placa de ensaio, diluir 20 ml da solução de lavagem POD com água destilada ou
desionizada até obter 400 ml.
Solução de uso do cromógeno: diluir, por placa, 1 ml de cromógeno TMB com 10 ml de
tampão/substrato TMB no frasco de plástico vazio adjunto à embalagem e conservar este
fechado e ao abrigo da luz. Lavar bem o frasco com água destilada depois do uso.
Dada a capacidade dos frascos, não vazar todo o cromógeno TMB para o frasco de tampão/
substrato.
Pré-diluir num tubo todas as amostras a examinar, não porém os soros de controlo, a 1+100
com tampão para amostras (anti-HBc/IgM): por ex. 10 µl de amostra + 1000 µl de tampão
para amostra (anti-HBc/IgM).
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Solução de uso do conjugado: retirar ao Conjugado HbcAg/POD a quantidade necessária e
diluir 1+10 com Tampão para conjugado (anti-HBc/IgM).
Adicionar com a pipeta, para meia placa, 0,6 ml de Conjugado HbcAg/POD a um frasco original (6 ml) de Tampão para conjugado (anti-HBc/IgM) (1+10).
Estabilidade e condições de conservação
Antes de abertos, e enquanto conservados à temperatura de armazenagem indicada, todos os
componentes da embalagem combinada Enzygnost* Anti-HBc/IgM mantêm-se utilizáveis até ao
termo do prazo de validade indicado nos rótulos.
A estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso podem
depreender-se da tabela 1 em anexo.
Aparelhos necessários:
para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases
BEP® II:
de lavagem
BEP® III:
processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem
das amostras
BEP® 2000:
para o processamento automático e avaliação do teste
Pipetas:
pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl
Incubador:
banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação
comparáveis
Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados.
Material a investigar
Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/
Heparina/Citrato), colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser
conservadas durante de 3 dias, no máximo, entre +2 - +8 °C. Se se pretender conservá-las
durante um período de tempo superior, deverão ser congeladas.
Execução do teste
Execução do teste com o BEP® II
1. Dosagem das amostras: Colocar 10 µl de soro de controlo anti-HBc/IgM negativo em cada
uma das 4 cavidades, numa cavidade 10 µl de soro de controlo anti-HBc/IgM positivo, em cada
uma das cavidades seguintes 10 µl da amostra não diluída e, no final da série ou placa de teste,
dosear novamente 10 µl de soro de controlo anti-HBc/IgM positivo e tapar com a folha.
As operações de pipetagem por cada placa de teste, têm de ser executadas num período de
tempo de 15 minutos.
2. Incubação das amostras: pelo menos 15 min (máx. 30 min) à temperatura ambiente (+18 a
+25 °C).
3. Distribuição do conjugado: retirar a folha sem lavar antes, adicionar 100 µl de solução de
uso do conjugado por determinação, cobrir com nova folha e colocar na incubadora.
4. Incubação do conjugado: 60 min ± 2 min a +37 °C ± 1 °C. Passar imediatamente à lavagem.
5. Lavagem: retirar a folha, aspirar todos os poços e lavar 4 ou 5 vezes (v. Advertência) com
aprox. 0,3 ml de cada vez.
6. Distribuição do substrato: distribuir 100 µl de solução de uso do cromógeno em cada poço,
cobrir a placa com nova folha adesiva.
7. Incubação do substrato: deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre +18 e +25 °C.
8. Reacção de paragem: retirar a folha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de solução de
interrupção POD, mantendo o mesmo ritmo que em 6.
9. Leitura: fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora.
É aconselhável empregar um fotómetro com dois comprimentos de onda (um de medição e
outro de referência).
Efectuar a medição das extinções (absorvências) das amostras de controlo e dos pacientes a
450 nm; como comprimento de onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre
615 e 690 nm).
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Execução do teste com BEP® III
No caso do processamento ser feito com BEP® III é necessário preparar as placas de ensaio
incluindo a dosagem das amostras (ponto 1 da «execução do teste com BEP® II»).
Imediatamente a seguir, as placas de ensaio são colocadas no BEP® III abertas, ou seja, sem
película colada. Ao mesmo tempo, é necessário prestar atenção a que as placas de ensaio
parcialmente providas de «barras de água» sejam acrescentadas até ficarem, no mínimo, pelo
meio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente
(vide instruções de serviço do BEP® III).
Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados
no software do BEP® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP® II, mas
foram validados na combinação BEP® III/Enzygnost*.
Execução do teste com BEP® 2000
A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste efectua-se de forma
completamente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP® 2000).
Validação do teste
Os valores de extinção dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se:
-0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1
–0,010 ≤ Epos. ≥ 0,7
Dos 4 valores de extinção do soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo, pode mostrar-se um fora
da especificação e ser negligenciado.
Os valores de extinção do controlo positivo têm de corresponder ambos às especificações. Não
se cumprindo estas condições, há que repetir o teste.
Avaliação
As avaliações efectuam-se automaticamente com o BEP® 2000 e BEP® III. Para o efeito,
consultar as instruções de serviço. Deverão observar-se os capítulos seguintes no caso da
avaliação ser efectuada sem a assistência de Software.
Tirar a média dos valores de extinção dos controlos negativos. Para calcular o valor-limite,
adicionar
0,07 ao valor médio de extinção dos controlos negativos:
–
Eneg. + 0,07 = valor-limite (cut off)
Para conferir maior segurança a resultados próximos do valor-limite, foi definida uma zona-limite:
valor-limite ± 10%
De acordo com os critérios do teste, as amostras serão classificadas do seguinte modo:
Resultado do teste:
^ anticorpos HBc/IgM-negativo
1. Eamostra < cut off -10% =
^ anticorpos HBc//IgM-positivo
2. Eamostra > cut off + 10% =
^ zona-limite (duvidoso)
3. cut off - 10% ≤ Eamostra ≤ cut off + 10% =
Amostras com resultados situados na zona-limite (duvidosos) devem ser novamente testadas.
Se também após repetição do teste não for ainda possível classificar uma amostra como
positiva ou negativa, o resultado será: “duvidoso”.
Limitações e fontes de erro
1.Os anticoagulantes como a heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste.
2.As amostras lipémicas, ictéricas ou hemolíticas não afectam o teste. Esporadicamente, em
casos individuais, as amostras com elevado factor reumático e, simultaneamente, elevado
teor de anti-HBc, podem provocar um aumento dos sinais.
3.As amostras com anticorpos contra o CMV, HAV, HIV, HCV, o vírus da rubéola e as amostras
positivas Anti-HBs não influenciam o resultado do teste.
4.Com amostras com valores elevados de transaminases e auto-anticorpos ou amostras
contendo ANA não foi verificada qualquer influência sobre o resultado do teste.
5.As amostras com anticorpos contra o EBV e as amostras de pacientes hemodialisados
podem apresentar uma reactividade elevada.
6. Os soros insuficientemente coagulados, o material de amostra contendo azida de sódio e as
amostras de análise contaminadas por micróbios não devem ser utilizadas. Os
componentes com eventuais partículas existentes (p. ex., coágulo de fibrina) deverão ser
eliminados antes da realização do teste.
7.Tratando-se de amostras descongeladas, é necessário prestar atenção a que o material
fique bem homogeneizado.
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8.Os reagentes (excluindo a solução de lavagem POD, a solução de bloqueio POD e a solução
cromógena pronta para uso fabricada a partir de reagentes associados a lotes de
cromógeno TMB e tampão/substrato TMB) só deverão ser utilizados associados a lotes, ou
seja, unicamente na combinação de 6 números da designação do lote (designação do lote)
impressa na embalagem ou retirados, respectivamente, da tabela do código de barras
embalada separadamente.
9.O tampão/substrato TMB, a solução cromógena pronta para uso e a solução de bloqueio
POD não podem entrar em contacto com iões de metal pesado ou substâncias oxidantes
(não utilizar pipetas com partes metálicas para conduzir o líquido). Não executar as reacções
do substrato na proximidade de desinfectantes contendo hipoclorito. A coloração
espontânea da solução cromógena pronta a usar antes de ser transferida para a placa de
ensaio indicia que há contaminação; é necessário preparar uma solução fresca num
recipiente limpo. Evitar o contacto da pele com as soluções referidas anteriormente.
10.Durante a incubação, a placa de ensaio deverá repousar (p. ex., sobre um flutuador fixo ou
em banho-maria não circulante); neste caso, as cavidades ficam em contacto com a água
temperada. Se forem utilizados estabilizadores para impedir a propagação dos germes na
água, é necessário ter todo o cuidado para que nem a superfície das placas de ensaio, nem
as cubetas entrem em contacto com estas soluções, uma vez que essa circunstância pode
provocar reacções não específicas.
11. Nas amostras fortemente reactivas, na reacção de bloqueio o corante pode perder-se. A
interpretação fotométrica não é influenciada por esse facto.
12.Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão,
podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste.
13.A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito
de optimizar o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As
modificações definidas pelo utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida em
que podem afectar o desempenho do sistema e os resultados do ensaio. Constitui
responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em
relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos nas folhas de
instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização.
14.Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico
médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.
Características dos testes
Sensibilidade e especificidade
Os resultados referentes ao controlo da sensibilidade e da especificidade, estão resumidos nas
tabelas 2 e 3 (no anexo).
Para determinar a sensibilidade, foram analisadas 192 amostras anti-HBc/IgM positivas. Todas
as amostras testadas foram consideradas positivas, de acordo com os critérios do Enzygnost*
Anti-HBc/IgM. Independentemente disso, em caso de utilização ampla do teste, não é de excluir
que para algumas das amostras individuais não se possa fazer a prova.
Para determinar a especificidade, foram examinadas 2559 amostras anti-HBc/IgM negativas e
foi determinada uma especificidade de 99,60% a 99,91% (teste inicial) ou de 99,91% a 100%
(novo teste).Os valores podem ser divergentes, entre outras coisas, em função da população
examinada e da execução do teste.
De acordo com o nível de conhecimentos actual, do resultado positivo do teste anti-HBc/IgM
não pode inferir-se com segurança que exista uma infecção de HBV, da mesma maneira que, o
resultado negativo do teste também não exclui com segurança a infecção de HBV.
Reprodutibilidade
Os resultados dos ensaios Intra/Inter estão resumidos na tabela 4 (no anexo). Neste caso, tratase de dados determinados a título exemplificativo. É perfeitamente possível obter valores divergentes, em função da execução do teste.
* Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros
países.
BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros
países.
Boviserin é uma marca registada da Aventis Behring.
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OWSE G13 C0541 (909)
H/R
46
0197
Tab. 1 Estabilidade e condições de conservação
Material/Reagente
Estado
Conservação
Estabilidade•
Amostras de análise
diluídas
Diluídas 1+100
com amostras
tampão
(Anti-HBc/IgM)
+2 a +8 °C
24 horas
Placa de teste
(restantes barretas)
aberto
+2 a +8 °C
6 semanas
no saco com cáp-
sulas desidratantes
Conjugado HBcAg/POD
aberto
+2 a +8 °C
4 semanas
Tampão para amostras
(anti-HBc/IgM)
aberto
+2 a +8 °C
4 semanas
Solução de uso do conjugado
1+10
Tampão para amostras
(anti-Hbc/IgM)
aberto
Soro de controlo anti-HBc/IgM,
positivo
+2 a +8 °C
4 semanas
+18 a +25 °C
1 semana
+2 a +8 °C
4 semanas
+2 a +8 °C
4 semanas
+2 a +8 °C
4 semanas
aberto
Soro de controlo anti-HBc/IgM,
negativo
Cromógeno TMB
aberto
+2 a +8 °C
até data de venci.
Tampão/substrato TMB
aberto
+2 a +8 °C
até data de venci.
Solução de uso do
cromógeno
1+10
+2 a +8 °C
5 dias
+18 a +25 °C
8 horas
recipiente fechado,
ao abrigo da luz
Solução de lavagem POD
(concentrado)
não diluída
aberto
1:20
1:20
+2 a +8 °C
+2 a +8 °C
+18 a +25 °C
até data de venci.
1 semana
1 dia
Solução de paragem POD
aberto
+2 a +8 °C
até data de venci.
• Nunca depois da data de vencimento
OWSE G13 C0541 (909)
H/R
47
Tab. 2 Sensibilidade
Nas análises de sensibilidade, foram determinados os seguintes dados:
População de amostras
Número de
Inicialmente
Novo teste
amostras
reactivo
reactivo
Infecção aguda de HBV
192
192
n.d.
Tab. 3 Especificidade
Nas análises de especificidade, foram determinados os seguintes dados em dois centros
independentes (W, R):
População de amostras
Número de
Inicialmente
Novo teste
amostras
reactivo
reactivo
(W) soros normais negativos
(W) plasmas normais negativos
(R) população de pacientes
997
501
1061
2
2
1
0
0
1
Tab. 4 Reprodutibilidade
Ensaio Intra
Amostra Valor médio
de extinção
FP 1
0,236
FP 2
0,182
FP 3
0,155
FP 4
0,159
Ensaio Inter
Amostra Valor médio
de extinção
FP 1
0,158
FP 2
0,113
FP 3
0,125
FP 4
0,104
OWSE G13 C0541 (909)
% VK
4,3
6,8
6,3
5,7
% VK
10,9
5,9
5,8
16,9
H/R
48
No exame referente ao ensaio Intra da
reprodutibilidade, as amostras foram
testadas sempre com uma determinação
de 20 x (FP 2, n = 18).
No exame referente ao ensaio Inter da
reprodutibilidade, as amostras foram
testadas sempre com uma determinação
tripla, em 5 operações diferentes.
Tab. 5 Procedimento e programação
Programação do Menu
Procedimento
Preparação dos reagentes
para o
BEP® 2000
BEP® II
MENU NO
4 x 10 µl soro de controlo, negativo
2 x 10 µl soro de controlo, positivo
10 µl de amostras pré-diluída cada vez
OPERATE 1
NO
OPERATE 2
YES
Dosagem do conjugado
®
®
BEP II
BEP III
15 min (máx 30 min)
(+18 a +25 °C)
placas incompletas:
completar até meia placa
com „barretas de
água“
100 µl de solução de
uso do conjugado
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
100
1
NO
OPERATE 3
YES
Lavagem e dosagem do cromógeno
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
processamento
automático
Lavar: BEP® II 4 x
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dosagem da solução de bloqueio
100 µl de solução de
uso do cromógeno
30 min ± 2 min
(+18 a +25 °C
ao abrigo da luz)
100 µl de solução de paragem
após máx 1 hora
Leitura 450 nm
(Comprimento de onda de ref.: 650 nm)
Resultado do teste
OWSE G13 C0541 (909)
H/R
49
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.1
0.07
-
Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
1. Frösner G. Viral hepatitis. In: Thomas L, ed. Clinical Laboratory Diagnostics, Frankfurt/Main:
TH Books, 1998: 1260-87.
2. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /
Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
LOT
EXP
CCYY-MM-DD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical
Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario
para Diagnóstico In Vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de
Lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de
Catálogo
Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice
d'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as
Instruções de Utilização
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H/R
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