Descargue aquí el inserto

Transcription

HEp-2000®
Colorzyme® ANA-Ro
Test System
For Professional Use
Pour l’Usage Professionnel
Per Uso Professionale
Para El Uso Profesional
Für Professionellen Gebrauch
För yrkesmässigt bruk
Basic Staining Patterns
2
Motifs fluorescents de base / Pattern Basiliara della
colorazione / Patrones básicos de tinción / Grundlegende Verfärbung Muster / Grundfärgningsmönster
English
3
Français
10
Italiano
17
Español
24
Deutsch
31
Svensk
39
Bibliography
46
Bibliographie/Riferimenti
Bibliografici/Bibliographie/Bibliografi
BASIC STAINING PATTERNS
MOTIFS FLUORESCENTS DE BASE
PATTERN BASILIARA DELLA COLORAZIONE
PATRONES BÁSICOS DE TINCIÓN
GRUNDLEGENDE VERFÄRBUNG MUSTER
GRUNDFÄRGNINGSMÖNSTER
Homogenous
Homogène
Omogeneo
Homogénea
Homogene
Homogent
Speckled
Moucheté
Punteggiato
Moteado
Gesprenkelte
Fläckigt
Nucleolar
Nucléolaire
Nucleolare
Nucleolar
Nukleoläre
Nukleolärt
Centromere
Centromérique
Centromero
Centrómero
Zentromer
Centromert
HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Test System
with antigen substrate to allow specific binding of
autoantibodies to cell nuclei. If ANA’s are present,
a stable antigen-antibody complex is formed. After
washing to remove non-specifically bound antibodies,
the substrate is incubated with an anti-human antibody
conjugated to horseradish peroxidase (HRP). When
results are positive, there is the formation of a stable
three-part complex consisting of HRP-conjugated antihuman antibody bound to human antinuclear antibody
which is bound to nuclear antigen. This complex is
visualized by incubating the slide in Colorzyme® color
reagent which contains an enzyme-specific substrate.
The reaction between the enzyme labeled antibody
and enzyme specific substrate results in a color reaction
visible by standard light microscopy of the slide. In
positive samples, the cell nuclei will show a blue-purple
staining with a staining pattern characteristic of the
particular nuclear antigen distribution within the cells.
If the sample is negative for ANA, the nucleus will show
no clearly discernible pattern of nuclear staining. The
cytoplasm may demonstrate weak staining while the
nonchromosome region of the mitotic cells may demonstrate a darker staining.
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
INTENDED USE: This is an indirect enzyme antibody
test for the semi-quantitative detection of antinuclear
antibody in human serum. This test system uses transfected† HEp-2 cells, which allow specific identification of
autoantibodies to the SSA/Ro antigen. Autoantibodies
to SSA/Ro may show a distinctive staining pattern on
the transfected cells. When this pattern is present, it is
considered to be confirmatory evidence that anti- SSA/
Ro antibodies are present.
Absence of this distinctive pattern does not rule out
the possible presence of anti-SSA/Ro antibodies.
This test system is to be used as an aid in the detection of antibodies associated with systemic rheumatic
disease.
Antinuclear antibody (ANA) is a general term used to
describe autoantibodies against various cell nuclear
proteins. Early studies of these autoantibodies, using
immunofluorescent techniques, revealed a select few
nuclear protein specificities (1). Because of the high
correlation of positive ANA with systemic lupus erythematosus (SLE), a negative ANA essentially ruled out the
disease (2).
SYSTEM COMPONENTS (MATERIALS PROVIDED)
Use: All components come ready to use with no
aliquoting or reconstitution required (except the PBS
buffer and Colorzyme® color reagent which must be
dissolved in deionized or distilled water before use).
Storage: All components can be stored under refrigeration at 2-10°C. After reconstitution, PBS buffer reagent
should be stored in a closed container under refrigeration at 2-10°C.
Although antibodies specific to DNA continue to show a
high disease correlation with SLE (3), a number of nuclear (4) and cytoplasmic (5-7) macromolecules have also
been detected and associated with other connective
tissue diseases (8-10). Some of these antibodies appear
to have diagnostic and/or prognostic significance in
progressive systemic sclerosis (11-12), mixed connective tissue disease (13-15), Sjögren’s syndrome (16-17),
polymyositis (18), and/or rheumatoid arthritis (19). Because of these disease associations, ANA testing is now
recognized as a general screening tool for connective
tissue disease (20).
After reconstitution, Colorzyme® color reagent should
be stored in a closed container at room temperature
for up to 30 days. Depending on the rate of use, 150 ml
of Colorzyme® color reagent can be used with up to
twenty slides.
Stability: All components remain stable at least 12
months from date of manufacture. Do not use any
component beyond its expiration date.
Sensitivity of the ANA test varies with the type of
substrate used, fixative procedure, and types of ANA
present in sera. Cell culture substrates generally show
greater sensitivity than tissue sections (21-24). Detection
of autoantibodies to the SSA/Ro antigen is especially
variable. Rodent tissues do not contain detectable
levels of SSA/Ro antigen (25), and reports of detection
of anti-SSA/Ro antibodies in cell culture substrates vary
in sensitivity from 50 to 90% (26-27).
REACTIVE REAGENTS
Substrate Slides: ‡Catalog No. 2007-Ro (seven-well);
2013-Ro (thirteen-well). Seven or thirteen well ANA
substrate slides using HEp-2000® cells (with mitotic
figures) grown and stabilized directly on the test wells.
These are HEp-2 cells that have been stably transfected
with the SSA/Ro autoantigen. Unique moat slide design
minimizes cross contamination of wells during testing.
Slides also include additional control wells designated
positive, negative, and PBS to aid in proper interpretation of results.
The Immuno Concepts HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Test System with transfected mitotic* human epithelioid
cells (HEp-2), represents an advanced immunoenzyme
system for detection of ANA. HEp-2 cells with mitotic
figures have been shown to have greater sensitivity and
yield sharper pattern recognition than classical mouse
kidney substrate in detecting antibodies in progressive systemic sclerosis (PSS) (28). Mitotic figures aid in
differential pattern recognition as well as in detecting
previously unreported nuclear antigens present in
higher concentrations in mitotically active cells (29-31).
The HEp-2 cells in this test system have been transfected
with multiple copies of the specific DNA sequence that
carries the information for the SSA/Ro autoantigen. Approximately 10-20% of the transfected cells over-express
this antigen, so detection of autoantibodies to SSA/Ro
is more consistent than it is on HEp-2 cells that have
not been transfected. Autoantibodies to SSA/Ro may
show a distinctive staining pattern on the transfected
cells. When this pattern is present, it is considered to be
confirmatory evidence that anti- SSA/Ro antibodies are
present.
SSA/Ro Positive Control: Catalog No. 2035-Ro. Readyto-use dropper vial containing 1.0 ml positive human
control serum with antibody specific to SSA/Ro antigens.
This serum demonstrates the fine speckled staining reaction which is typical of anti- SSA/Ro seen on Immuno
Concepts HEp-2000® cell substrate. The expression is
predominantly nuclear in localization, with prominent
nucleolar staining. Weak cytoplasmic staining may also
be seen in the over-expressing cells. The chromosome
region of mitotic cells demonstrates a negative staining
reaction. This reagent contains 0.1% sodium azide as a
preservative.
Homogeneous Positive Control: Catalog No. 2021.
Ready-to-use dropper vial containing 1.0 ml positive human control serum with antibody specific to DNA and/
or DNP nuclear antigens. This serum demonstrates a
homogeneous staining reaction on Immuno Concepts
HEp-2000® cell substrate. The chromosome region of
mitotic cells demonstrates the same homogeneous
staining reaction. This reagent contains 0.1% sodium
azide as a preservative.
Absence of this distinctive pattern does not rule out
† The transfected cells and their application are
protected by U.S. Patent 5,518,881 and other U.S. and
foreign patents pending.
Speckled Positive Control: Catalog No. 2022. Readyto-use dropper vial containing 0.5 ml positive human
control serum with antibody specific to Sm and/or RNP
nuclear antigens. This serum demonstrates one of the
most common speckled staining reactions seen on Immuno Concepts HEp-2000® cell substrate. The chromosome region of mitotic cells demonstrates a negative
staining reaction. This reagent contains 0.1% sodium
* Mitosis is a term used to describe the cell division
process. It is generally divided into six phases including
interphase, prophase, metaphase, anaphase, telophase, and cytokinesis.
PRINCIPLE OF THE TEST
Nucleolar Positive Control: Catalog No. 2023. Readyto-use dropper vial containing 0.5 ml positive human
control serum with antibody specific to nucleolar
antigens. This serum demonstrates a nucleolar stain-
The Immuno Concepts HEp-2000® Colorzyme® ANARo Test System uses the indirect enzyme antibody
technique. Diluted patient samples are incubated
3
ing reaction on Immuno Concepts HEp-2000® cell
substrate. This reagent contains 0.1% sodium azide as a
preservative.
Standard light microscope capable of 200X and 400X
magnification
PRECAUTIONS
Centromere Positive Control: Catalog No. 2025.
Ready-to-use dropper vial containing 0.5 ml positive
human control serum with antibody specific to chromosomal centromeres (kinetochore). This serum demonstrates a discrete speckled staining reaction on Immuno
Concepts HEp-2000® cell substrate. The chromosome
region of mitotic cells demonstrates the same discrete
speckled staining reaction. This reagent contains 0.1%
sodium azide as a preservative.
Titratable Control Serum: Catalog No. 2026. Ready-touse vial containing 1.0 ml positive human control serum
to be treated as an undiluted patient sample. This
reagent contains 0.1% sodium azide as a preservative.
Negative Control Serum: Catalog No. 2031. Readyto-use dropper vial containing 1.0 ml negative human
control serum. Although the negative control serum
may demonstrate weak staining of the cytoplasm with
brighter staining of the non-chromosome region of the
mitotic cell, it demonstrates no discernible pattern of
nuclear staining. This reagent contains 0.1% sodium
Enzyme Antibody Reagent: Catalog No. 4009-Ro (9.0
ml), 4075-Ro (23 ml). Goat anti-human IgG (heavy and
light chains) conjugated to horseradish peroxidase
(HRP). Reagent comes ready-to-use in precision dropper bottles with 9.0 ml for each 10 slides in complete
test kits.
Color Reagent: *Catalog No. 4066. HRP specific enzyme substrate powder, containing 4 chloro 1-naphthol.
Each package contains powder to make 150 ml of
self-activating Colorzyme® color reagent.
Preparation: Dissolve contents of one pouch in 150 ml
of deionized or distilled water. Mix well until completely
dissolved. This color reagent is stable for 30 days at
room temperature in a closed container. This color
reagent may be reused for up to 30 days or until any
color change or precipitate is visible. Cloudiness or
opalescence, with no visible precipitate upon reuse
is normal. Depending on the rate of use, 150 ml of
Colorzyme® color reagent can be used with up to
twenty slides.
‡This slide is protected by one or more of the following
U.S. and foreign patents: 4,387,972; D-274261; 0727046;
D-273261; 5,518,881; Canadian patent 1,171,302 and
other patents pending.
* This material is protected by one or more of the following U.S. and foreign patents: 4615972, Canadian patent
1231633, Italian patent 1177110, and other patents
pending.
NON-REACTIVE REAGENTS
PBS Buffer Powder: Catalog No. 1011. Phosphate-buffered saline powder (0.01 M, pH 7.4 ± 0.2). Each pouch
contains sufficient buffer powder to make 1 liter. (One
pouch of buffer powder is supplied for each five slides
in complete test kits.)
Preparation: Dissolve one pouch of buffer powder in 1
liter of deionized or distilled water, cover, and store refrigerated between 2-10°C for up to four weeks or until
signs of contamination or other visible changes occur.
Semi-Permanent Mounting Medium: Catalog No. 1111.
Ready-to-use dropper vial containing 5.0 ml glycerolbased mounting medium, pH 9.1 ± 0.2. This reagent
contains 0.1% sodium azide as a preservative.
1. All human source materials used for this product
have been tested and found to be negative (not
repeatedly reactive) for antibodies to Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1), Human Immunodeficiency Virus-2 (HIV-2), hepatitis C virus (HCV),
and for hepatitis B surface antigen (HBsAg) by FDA
approved methods. However, no test method can
offer complete assurance that HIV-1, HIV-2, hepatitis C, hepatitis B, or other infectious agents are
absent. Thus, all kit materials should be handled in
the same manner as potentially infectious materials.
2. All patient samples should be handled at the Biosafety Level 2 as recommended for any potentially
infectious human serum or blood specimen in the
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health Manual: Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. Dilution of the components or substitution of components other than those provided in this system
may yield inconsistent results.
4. Sodium azide (0.1%) is used as a preservative. Sodium azide may react with lead or copper plumbing and form explosive metal azide salts. When
disposing of reagents, flush with ample volumes of
tap water to prevent potential residues in plumbing. Sodium azide is a poison and may be toxic if
ingested.
5. This kit is for in vitro diagnostic use.
6. In the event hemolyzed or lipemic sera must be
used, heat inactivate sera 30 minutes at 56°C for
optimal results. Microbially contaminated sera
should not be used.
7. It has been demonstrated that false positive ANA’s
may occur due to C1q binding to DNA, independent of the substrate used (32). To eliminate potential C1q interference, routinely heat inactivate all
patient sera at 56°C for 30 minutes prior to testing.
8. The titratable control serum is intended for use in
monitoring lot to lot and run to run reproducibility.
It is not intended as a measurement of overall
sensitivity or specificity of the assay.
9. Do not smoke, eat, or drink in areas where specimens or kit reagents are handled.
10. Avoid splashing or generation of aerosols at all
times.
11. Incubation times and temperatures other than
those specified may give erroneous results.
12. Cross contamination of reagents or samples may
give false results.
13. Reusable glassware must be washed and thoroughly rinsed free of detergents prior to use. All
glassware must be clean and dry before use.
14. Bring all reagents, slides, and specimens to room
temperature (18-24°C) prior to use.
15. Wear disposable latex gloves when handling specimens and reagents, and wash hands thoroughly
afterwards.
16. Microbial contamination of reagents or samples
may give false results.
17. Never pipette by mouth and avoid contact of
reagents and specimens with skin and mucous
membranes. If contact occurs, wash with a germicidal soap and copious amounts of water.
18. Color reagent may be reused for up to 30 days
or until any color change or precipitate is visible.
Cloudiness or opalescence, with no visible precipitate upon reuse is normal. Depending on the rate
of use, 150 ml of Colorzyme® color reagent can be
used with up to twenty slides.
SPECIMEN COLLECTION
Coverslips: Catalog No. 1041. Each packet contains
ten 24 x 60 mm No. 1 glass coverslips.
Collection: Serum is the preferred specimen. Approximately 5 ml of whole blood should be collected aseptically by venipuncture using a sterile vacuum collection
tube or other suitable collection system. Allow blood to
clot at room temperature (18-24°C). Serum should be
separated from the clot by centrifugation as soon as
possible to minimize hemolysis.
ADDITIONAL MATERIALS REQUIRED (BUT NOT
PROVIDED)
Volumetric pipettes to deliver 20-25 µl volumes
Three Coplin jars or staining dishes
Squeeze bottle or Pasteur pipettes
Serological pipettes
One-liter screw cap containers (for PBS buffer)
Closed container for storing Colorzyme® color
reagent.
Deionized or distilled water
Test tubes to prepare serum dilutions
Bibulous paper or paper towels
Chamber for incubation
Disposable latex gloves
Lab timer
Interfering Substances: Sera exhibiting a high degree
of hemolysis, icterus, lipemia, or microbial growth
should not be used because these conditions may
cause aberrant results. Specimens containing visible
particulate matter should be clarified by centrifugation
before testing.
Storage: Sera may be stored at 2-10°C up to one week.
If testing is further delayed, sera should be stored frozen
at -20°C or lower. Serum should not be stored in a selfdefrosting refrigerator or freezer.
4
CAUTION: Repeated freeze/thawing of patient samples
may yield false positive or false negative results.
SSA/Ro: A serum is considered positive for SSA/Ro
antibodies if 10-20% of the interphase nuclei show the
distinctive SSA/Ro staining pattern, which appears as
a distinct speckled pattern with prominent staining of
the nucleoli. These are the over-expressing transfected
cells. The remaining 80-90% of the interphase nuclei
may or may not demonstrate a fine speckled staining of
the nucleus with or without staining of the nucleoli.
INTERPRETATION OF RESULTS
QUALITY CONTROL
Positive, negative and PBS controls should be run in the
wells provided for quality control on each slide. The
positive control should show dark blue-purple staining in
the nuclei of the cells, with a clearly discernible pattern
characteristic of the control serum that was used. The
cytoplasm may stain light blue-purple in the positive
control well. The negative control should show light
blue-purple staining of both the cytoplasm and nucleus,
but with no discernible pattern of nuclear staining. The
PBS control is used to observe non-specific staining
by the enzyme antibody reagent, and should not
exhibit blue staining. If the controls do not appear as
described, the test is invalid and should be repeated. If
the HEp-2000® ANA-Ro test is to be used for confirmation of the presence of anti- SSA/Ro antibodies, the
SSA/Ro Positive Control, catalog number 2035-Ro, must
be run on at least one slide in that day’s run.
Titers: When reading titers, many laboratories begin
reading with the well that contains the most dilute
sample and read “backwards” to the 1:40 dilution. The
first well in which a clearly discernible pattern is visible
is the titer end-point. We recommend this technique
for determining titer end-points. It is important that the
intensity of staining not be confused with the presence
or absence of antinuclear antibodies. The key factor
to consider in determining whether a given dilution
of serum is positive is the appearance of a clearly
discernible nuclear pattern, irrespective of the staining
intensity. Due to the increased concentration of SSA/Ro
antigen in the over-expressing cells, it is not unusual to
see staining of these cells in very high titers. The clinical
significance of these high titers is unknown.
OPTIONAL TITRATABLE CONTROL
When reading titers, many laboratories begin reading
with the well that contains the most dilute sample and
read “backwards” to the 1:40 dilution. The first well in
which a clearly discernible nuclear staining pattern is
visible is the titer end-point. We recommend this technique for determining titer end-points.
Caution: Some sera may demonstrate nuclear and
cytoplasmic staining with no apparent nuclear pattern.
This phenomenon is generally due to heterophile antibodies and should be reported as negative (33).
ENZYME STAINING INTENSITY
The mean titer and titer range (± one dilution on either
side of the mean) determined were established in our
laboratory and are stated as a guide. This control is provided to allow each laboratory to assess the reproducibility (precision) of its ANA testing. Since this control is
not intended to be an indicator of titer accuracy, each
laboratory should establish its own mean titer end-point
for this sample, and should use this information to assess
run-to-run reproducibility (precision).
The degree of staining intensity has no proven clinical
value and only limited value as an indicator of titer (34).
To simplify interpretation, record screening results as
strongly positive or positive, and titer accordingly.
Strongly Positive Reaction: Dark to very dark bluepurple staining, clear-cut cell outline, sharply defined
nuclear pattern.
Positive Reaction: Dim or subdued blue-purple staining
with greater variability of staining between cells; cell
outline may be less well defined in some cells with a
majority of cells still demonstrating a clearly discernible
pattern of staining.
Through multiple testing of this titratable control, using
the Immuno Concepts HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Test System, a mean titer value has been established
for each lot number. The lot number, mean titer and
titer range (± one twofold dilution on either side of the
mean) are stated on the vial label and should be used
as a guide for the test system performance.
NOTE: Because the cells are grown directly on the
slide surface, all cells are not in the same phase of the
cell cycle. It is not unusual to see differential staining
intensities from cell to cell due to the differences in the
concentration and location of different antigens during
the cell cycle.
It is important that the intensity of staining not be
confused with the presence or absence of antinuclear
antibodies. The key factor to consider in determining
whether a given dilution of serum is positive is the appearance of a clearly discernible pattern, irrespective
of the intensity of the staining. This titratable control will
show the typical speckled pattern associated with the
RNP antibody. Also present may be a second pattern
of NSp I (several discrete speckles in the nucleus of
interphase cells), however, it is the typical RNP speckled
pattern that is to be used for the purpose of reading
end-point.
REPORTING OF RESULTS
Screening: Results should be reported as strongly
positive or positive at the 1:40 dilution, and the nuclear
staining pattern should be reported.
Titering: Results should be reported as the last serial
dilution in which a clearly discernible pattern is seen.
Results with a strong reaction at the 1:2560 dilution
should be reported as greater than 1:2560. Titers of 1:
40 to 1:80 are considered low titers; 1:160 to 1:320 are
considered medium titers; and 1:640 and greater are
considered high titers.
The values obtained in our laboratory may differ from
your values. Some of the many factors that can affect
your results may include, but are not limited to:
1. The proper alignment of the microscope light path.
Refer to your microscope manual for instructions.
2. The numerical aperature of the objective. The
numerical aperature is related to the light gathering
capability and the resolution of the objective. The
numercial aperature is printed on the side of the
objective.
3. Precision and accuracy of dilution technique,
equipment, and performance of the test procedures.
PATTERN DETECTION
Homogeneous: A solid staining of the nucleus with or
without apparent masking of the nucleoli. The chromosome region of metaphase mitotic cells is clearly
positive with a smooth or peripheral staining intensity
greater than, or equal to, interphase nuclei.
Synonyms: Diffuse; solid.
Nuclear antigens: dsDNA; nDNA; DNP; histone.
Disease association: High titers are suggestive of SLE.
Lower titers are suggestive of SLE or other connective
tissue diseases (35).
INTERPRETATION OF PATIENT RESULTS
200X total magnification is recommended for screening
positive/negative, while 400X total magnification is
recommended for pattern recognition and viewing
mitotic cells.
Peripheral: A solid staining, primarily around the outer
region of the nucleus, with weaker staining toward
the center of the nucleus. The chromosome region of
metaphase mitotic cells is clearly positive with a smooth
or peripheral staining intensity greater than, or equal to,
interphase nuclei.
Synonyms: Rim, shaggy, membraneous.
Nuclear antigens: dsDNA, ssDNA, nDNA, DNP,
histone.
Disease association: High titers suggestive of SLE.
Lower titers suggestive of SLE or other connective
tissue diseases (35).
Negative: A serum is considered negative for antinuclear antibodies if nuclear staining is less than or equal
to the negative control well with no clearly discernible
pattern. The cytoplasm may demonstrate weak staining, with brighter staining of the nonchromosome region
of mitotic cells, but with no clearly discernible nuclear
pattern.
Positive: A serum is considered positive if the nucleus
shows a clearly discernible pattern of staining in a
majority of the interphase cells.
5
Speckled: A coarse or fine granular staining of the
nucleus generally without staining of the nucleoli. The
non-chromosome region of metaphase mitotic cells
demonstrates staining, while the chromosome region is
negative for stain.
Nuclear antigens: Sm; RNP; Scl-70; SS-B; and other
antigen/antibody systems not yet characterized.
Disease association: High titers are suggestive of SLE
(Sm antigen), mixed connective tissue disease
(RNP antigen), scleroderma (Scl-70 antigen), or
Sjögren’s syndrome-sicca complex (SS-B antigen).
Lower titers may be suggestive of other connective tissue disease (36).
chromosome staining and may be difficult to see.
USE OF MITOTIC CELLS
Discerning Speckled vs. Homogeneous Antibody: A
fine speckled pattern of staining is sometimes difficult
to differentiate from homogeneous staining. If the pattern is homogeneous, there will be solid staining of the
chromosomes of the mitotic cells. If the pattern is strictly
speckled, the region outside of the chromosomes will
show a fine speckled reaction.
Nucleolar: Large coarse speckled staining within the
nucleus, generally less than 6 in number per cell, with or
without occasional fine speckles, 5-10 in number. The
nonchromosome region of metaphase mitotic cells
demonstrates strong staining, while the chromosome
region may demonstrate faint staining. Anaphase and
telophase cells may demonstrate similar staining to
interphase nuclei.
Nuclear antigens: Generally referred to as 4-6s RNAs
and other nuclear antigens, such as fibrillarin, RNA
Polymerase I, NOR 90, and PM/Scl.
Disease association: High titers prevalent in scleroderma and Sjögren’s syndrome (37).
Centromere: A discrete speckled staining pattern
highly suggestive of the CREST* syndrome variant of
progressive systemic sclerosis (28). The nuclear speckles
are very discrete and usually some multiple of 46 (usually 23-46 speckles per nucleus). Because centromeres
are constrictions where spindle fibers attach on chromosomes, mitotic cells will show the same speckling
reaction in the chromosome region (12).
Synonyms: ACA; discrete speckled.
Nuclear antigens: Chromosomal centromere
(Kinetochore).
Disease association: Highly suggestive of the CREST*
syndrome variant of progressive systemic sclerosis
(28).
NOTE: If fine speckling of the entire mitotic cell occurs
along with solid staining of the chromosome region,
it is highly probable that two or more antibodies are
present. Report the screening dilution as speckled/
homogeneous and titer each antibody to endpoint.
Peripheral vs. Nuclear Membrane Antibody: Antibody
that shows a peripheral pattern is generally associated
with DNA/DNP nuclear antigens. High titers of these
antibodies are suggestive of SLE. In substrates that do
not include mitotic cells, the peripheral pattern can be
difficult to distinguish from nuclear membrane antibody.
By using Immuno Concepts’ mitotic cells, these patterns
can be differentiated, because the chromosome
region of the mitotic cells will be stained intensely in a
peripheral pattern, but will not be stained by nuclear
membrane antibody. This distinction is clinically important because nuclear membrane antibody does not
have DNA/DNP specificity and is not associated with
SLE (39).
*CREST is a form of PSS with prominent calcinosis, as well
as Raynaud’s phenomenon, esophageal dysfunction,
sclerodactyly, and telangiectasia.
SSA/Ro
SSA/Ro: A distinct speckled pattern with prominent
staining of the nucleoli in 10-20% of the interphase
nuclei. These are the over-expressing transfected cells.
The remaining 80-90% of the interphase nuclei may or
may not demonstrate a fine speckled staining of the
nucleus with or without staining of the nucleoli. The
nonchromosome region of metaphase mitotic cells
demonstrates staining, while the chromosome region is
negative.
Nuclear antigens: SSA/Ro (60kD).
Disease association: Seen in 60-70% of patients with
primary Sjögren’s Syndrome, 30-40% of patients
with SLE, and greater than 95% of patients with
subacute cutaneous lupus (38).
��
��
��
Nucleolar
��
��
MITOTIC��
CELLS
PCNA
DETECTION
Mitotic cells should be visible on every field when
viewed at 200X magnification or lower. To verify
whether a cell is in mitosis, view at 400X magnification.
Mitotic cells show a characteristic round cell shape with
no detectable nuclear membrane. The chromosome
region of mitotic cells will generally show an irregular
shape within the cell, due to the lack of nuclear membrane, and extreme constriction of the chromosomes.
��
��
Sera positive for DNA and/or DNP and/or
histone (such
��
��
as the Immuno
Concepts homogeneous
positive control) will show bright staining of the chromosome region
of these cells. In samples negative for DNA and/or
��
DNP and/or
histone (such as the Immuno Concepts
speckled positive control), the mitotic cells will not show
6
Scl-70
(49).
5. Although a high-titered ANA may be highly suggestive of connective tissue disease, it should not be
considered diagnostic but rather viewed as a part
of the overall clinical history of a patient.
6. Staining patterns often change with progressive
titration of sera. This phenomenon is generally
due to the presence of more than one nuclear
antibody.
7. Positive ANAs are also seen in a small percentage of patients with infectious and/or neoplastic
diseases (9).
8. Autoantibodies to SSA/Ro show a distinctive staining pattern on HEp-2000® transfected cells. When
this pattern is present, it is considered to be confirmatory evidence that anti- SSA/Ro antibodies are
present. Absence of this pattern does not rule out
9. Because of the overexpression of the SSA/Ro
autoantigen in the HEp-2000® cells, samples that
contain anti- SSA/Ro antibodies show higher titer
values on these cells than the values obtained on
non-transfected HEp-2 cells. Since none of the
other autoantigens in the HEp-2000® cells are affected by the transfection process, sera with other
auto-antibody specificities do not show significant
titer differences between the transfected HEp2000® cell line and non-transfected HEp-2 cells.
Anti-Centromere Antibody (ACA) vs. Atypical speckled
antibody resembling Centromere: In order to verify anticentromere antibody, the chromosome region of the
mitotic cells should stain brightly with discrete speckles.
If the chromosome region does not stain, the antibody
is not anti-centromere, and should be reported as
“atypical speckled” (40).
SSA/Ro vs. Patterns which may resemble SSA/Ro
staining: The distinctive SSA/Ro staining is seen as a
distinct bright speckled pattern with prominent staining
of the nucleoli in 10-20% of the interphase nuclei. The
remaining 80-90% of the interphase nuclei may or may
not demonstrate a fine speckled staining of the nucleus
with or without staining of the nucleoli. The chromosome region of metaphase mitotic cells does not
demonstrate staining. The nucleolar pattern can be
differentiated by large coarse speckled staining in all of
the nuclei, generally fewer than 6 per cell. The Scl-70
pattern shows fine speckled staining and nucleolar
staining in all of the interphase nuclei and staining of
the chromosomal region of the metaphase mitotic cells.
Antibodies to Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)
show variable coarse and fine speckling in 30-50% of
the interphase nuclei.
CYTOPLASMIC STAINING
EXPECTED VALUES
Although autoantibodies to cytoplasmic antigens
are not commonly associated with connective tissue
disease, these antibodies may be detected using
epithelial cell culture substrates (41). Mitochondrial and
smooth muscle antibodies are the two most commonly
detected antibodies and are generally associated
with mononucleosis, chronic active hepatitis, and liver
disease (42, 43). Using the HEp-2 cell substrate, smooth
muscle antibody has also been demonstrated in patients with warts (44).
In a large university medical center, using HEp-2 cell
ANA substrate, the following data were generated over
a two-year period (50). Table 1.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
NORMAL SAMPLES
Sera from 500 healthy blood donors, 242 females and
258 males, none of whom had any known history
of rheumatic diseases, were tested in parallel using
commercially available, non-transfected HEp-2 cells
and the HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Test System.
In this population, 36 samples (7.2%) showed positive
antinuclear antibody tests at a 1:40 dilution of serum.
Patterns of staining were identical on the two substrates
for 34 of the 36 positive samples. The two samples that
showed differences were both from female patients,
and both were confirmed to contain anti- SSA/Ro
antibodies. One of these samples showed a weak fine
speckled reaction on the non-transfected HEp-2 cells
and the typical “ SSA/Ro” staining on the HEp-2000®
Colorzyme® ANA-Ro Test System. The other sample
was negative on the non-transfected HEp-2 cells, but
showed typical “ SSA/Ro” staining on the HEp-2000®
Colorzyme®ANA-Ro Test System. The SSA/Ro specificity
of these two samples was confirmed by ELISA testing
and by Western immunoblotting. Samples which were
negative on the ANA tests were also negative in the
ELISA assay.
Anti-Mitochondrial Antibody (AMA): Discrete speckles
concentrated in the perinuclear region of the cell and
extended in lower density to the outer regions of the
cytoplasm. This should be distinguished from anti-Golgi
antibody, which generally stains only one side of the
perinuclear region, and from anti-ribosomal antibody,
which demonstrates finer speckles with a strandlike
appearance consistent with the location of the endoplasmic reticulum within the cell.
NOTE: Perinuclear speckles can most easily be distinguished from peripheral nuclear staining by noting
that the mitochondrial speckles form an interrupted
speckled staining around the outside of the nuclear
membrane, while peripheral sera form a solid smooth
staining inside the nuclear membrane.
REPORT SERA AS NEGATIVE FOR ANTINUCLEAR ANTIBODIES AND VERIFY POSITIVE FOR ANTI-MITOCHONDRIAL
ANTIBODY ON AMA SPECIFIC SUBSTRATE.
Anti-Smooth Muscle Antibody (ASMA): Very fine
fibrous staining over the entire cytoplasm of cells with
a “spiderweb” appearance. Unlike mitochondrial
antibody, smooth muscle antibody staining is uniform
over the entire cytoplasm and may also extend over
the nucleus. Mitotic cells generally show large discrete
speckles outside the chromosome region. Smooth
muscle antibody has been shown to have a high specificity to actin (45, 46).
SERA FROM PATIENTS WITH ONLY SSA/Ro ANTIBODIES
Sera from 46 patients with SLE or Sjögren’s Syndrome
were tested using commercially available, non-transfected HEp-2 cells and the HEp-2000® Colorzyme®
ANA-Ro Test System. All of these sera were confirmed
to contain antibodies to the SSA/Ro autoantigen by
ELISA testing and by Western immunoblotting. No other
autoantibodies were detected in any of these samples.
Thirty-six of these samples (78%) were positive (speckled
pattern) with the non-transfected HEp-2 cells, and all
46 (100%) were positive (distinctive SSA/Ro staining
pattern) with the HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Test
System.
REPORT SERA AS NEGATIVE FOR ANTINUCLEAR ANTIBODY AND VERIFY POSITIVE FOR ANTI-SMOOTH MUSCLE
ANTIBODY ON ASMA SPECIFIC SUBSTRATE.
LIMITATIONS OF THE TEST
SERA FROM PATIENTS WITH AUTOANTIBODIES
OTHER THAN SSA/Ro
1. Diagnosis cannot be made on the basis of antinuclear antibody detection alone. The physician
must interpret these results in conjunction with the
patient’s history and symptoms, the physical findings, and other diagnostic procedures.
2. Treatment should not be initiated on the sole basis
of a positive test for antinuclear antibodies. Clinical indications, other laboratory findings, and the
physician’s clinical impression must be considered
before any treatment is initiated.
3. Certain drugs, including procainamide and
hydralazine, may induce a lupus erythematosus-like disease (47). Patients with drug-induced
LE may demonstrate positive homogeneous
or homogeneous/peripheral ANAs commonly
directed against nuclear histones (48).
4. A small percentage of patients with SLE may not
demonstrate ANAs by indirect immunoenzyme
technique but may have ANAs by other techniques
Serum samples from 230 patients with a variety of
rheumatic and non-rheumatic diseases were tested in
parallel using commercially available, non-transfected
HEp-2 cells and the HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Test System. A single staining pattern was seen with
120 samples, and mixed patterns were seen with 110
samples. Among the total population of 230 samples,
333 staining patterns were identical on both substrates.
Twenty-nine samples showed the distinctive “ SSA/Ro”
staining pattern on the HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Test System. Twenty-three of these samples showed
speckled patterns on the non-transfected HEp-2 cells.
The six discrepant samples (positive on HEp-2000®,
but negative on non-transfected HEp-2 cells) all had
SSA/Ro antibodies, as demonstrated by the distinctive
“ SSA/Ro” staining pattern, ELISA tests, and Western blot
confirmation.
7
TITER COMPARISONS
Because of the overexpression of the SSA/Ro autoantigen in the HEp-2000® cells, samples that contain antiSSA/Ro antibodies show higher titer values on these cells
than the values obtained on non-transfected HEp-2
cells. Since none of the other autoantigens in the HEp2000® cells are affected by the transfection process,
sera with other autoantibody specificities do not show
significant titer differences between the transfected
HEp-2000® cell line and non-transfected HEp-2 cells.
TITER REPRODUCIBILITY
Ten samples, chosen from CDC controls and other
well characterized in-house sera, were run on three
different lot numbers of HEp-2000® slides, on three
different occasions. In no case did a negative sample
show positive results. All titer values were within one
two-fold dilution of the established mean titer value for
all samples tested.
CONFIRMATION OF SSA/Ro ANTIBODIES
In a large rheumatology reference laboratory, serum
samples from 349 patients with known positive ANA
tests were assayed using the HEp-2000® Colorzyme®
ANA-Ro Test System. In this selected population, 239
samples showed the distinctive SSA/Ro staining pattern.
Positive ELISA tests for SSA/Ro antibodies were obtained
in 238 (99.6%) of these samples. An additional 79
samples showed strong speckled and/or homogeneous
patterns, and gave positive ELISA tests for SSA/Ro antibodies. Thus, if the distinctive SSA/Ro pattern is seen, it
is confirmatory for the presence of SSA/Ro antibodies,
but the absence of the pattern does not rule out the
possible presence of SSA/Ro antibodies. In the studies
outlined above, we have examined a total of 429
sera that contain SSA/Ro antibodies as confirmed by
ELISA testing and/or Western Immunoblots, and which
showed the distinctive SSA/Ro staining pattern on the
transfected HEp-2000® cell line. We have also seen
samples which contain SSA/Ro antibodies, but do not
display the distinctive SSA/Ro staining pattern, because
high levels of other autoantibodies (usually anti-DNA
antibodies or anti-Sm/RNP antibodies) mask the SSA/Ro
pattern. Thus, if the distinctive SSA/Ro pattern is seen, it
is confirmatory for the presence of SSA/Ro antibodies,
but the absence of the pattern does not rule out the
possible presence of SSA/Ro antibodies.
TABLE 1
Diagnosis
Abnormal Population
(Over 4,500 Sera Tested):
Systemic lupus erythematosus
Rheumatoid arthritis
Mixed connective tissue disease
Progressive systemic sclerosis-diffuse
Progressive systemic sclerosis-CREST
Juvenile rheumatoid arthritis
Systemic
Polyarticular
Pauciarticular-B27+
DM/PM
Vasculitis
Normal Population (Over 9,000 Sera Tested):
20-60 Years
70-80 Years
Pattern
Segregation
%
Positive
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
Abbreviations: S = Speckled, H = Homogenous, P = Peripheral, N = Nucleolar, ACA = anti-Centromere
Diagnostic
Population pathologique
(plus de 4 500 échantillons de sérum testés) :
Lupus érythémateux disséminé
Polyarthrite rhumatoïde
Connectivité mixte (MCTD)
Sclérodermie généralisée évolutive - diffuse
Sclérodermie généralisée évolutive - CREST ACA
Arthrite rhumatoïde juvénile
Disséminée
Polyarticulaire
Pauciarticulaire B27+
DM/PM
Vascularite
Population saine
20-60 ans
70-80 ans
Motif
Ségrégation
%
Positif
M,P+H,H,P
M,H
M
M,N
ACA
93
40
99
85
93
M
M
M
M
14
13
0
25
20
M
M
2
3.5
Abréviations : M = Moucheté, H = Homogène, P = Périphérique, N = Nucléolaire, ACA = anti-Centromère
Diagnosi
Popolazione anormale (oltre 4.500 sieri analizzati)
Lupus eritematoso sistemico
Artrite reumatoide
Malattia mista del tessuto connettivo
Sclerosi sistemica progressiva-diffusa
Sclerosi sistemica progressiva-CREST
Artrite reumatoide giovanile
Sistemica
Poliarticolare
Pauciarticolare-B27+
DM/PM
Vasculite
Popolazione normale (oltre 9.000 sieri analizzati)
20-60 anni
70-80 anni
8
Pattern
Isolamento
%
Positivo
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
HEp-2000® ANA-Ro COLORZYME®
TEST PROCEDURE
1.
RECONSTITUTE BUFFER (PBS)
NOTE: It is important that slide wells do not dry
during this procedure or damage to the substrate
may occur.
DO NOT BLOT OR DRY THE SLIDE IN ANY MANNER
OR ALLOW SLIDE TO SIT WITHOUT ENZYME ANTIBODY REAGENT FOR LONGER THAN 15 SECONDS.
Dissolve contents of one buffer pouch in one liter
of deionized or distilled water. The PBS buffer
may be covered and stored at 2-10°C up to four
weeks.
2.
3.
RECONSTITUTE COLOR REAGENT
Dissolve contents of one pouch in 150 ml of deionized or distilled water. Mix well until completely
dissolved. This color reagent is stable for 30 days
at room temperature in a closed container. This
color reagent may be reused for up to 30 days
or until any color change or precipitate is visible.
Cloudiness or opalescence, with no visible precipitate upon reuse is normal. Depending on the
rate of use, 150 ml of Colorzyme® color reagent
can be used with up to twenty slides.
9.
DILUTE PATIENT SAMPLES
11.
perature, i.e. 18-24°C)
Place lid on incubation chamber. Allow slide(s)
to incubate 30 minutes (±5 minutes) at room
temperature (18-24°C).
10.
12.
PREPARE SUBSTRATE SLIDES (20-25 µl/well)
13.
14.
MOUNT COVERSLIP
Remove one slide at a time from PBS and dip 3-5
times in deionized or distilled water. Tap slide on
its side against bibulous paper or paper toweling
to remove excess water. DO NOT BLOT OR DRY
THE SLIDE IN ANY MANNER OR ALLOW TO SIT WITHOUT COVERSLIP FOR LONGER THAN 15 SECONDS.
Add 4-5 drops of semi-permanent mounting
medium along midline of each slide. Carefully
place coverslip in position, avoiding air pockets,
by gently lowering coverslip from one end of the
slide to the other.
NOTE: Excess mounting medium on slide may
result in a lack of clear resolution of cells (blurred
image). Excess mounting medium may be
removed from slide by gently blotting coverslip
with bibulous or lens paper while avoiding any
direct movement of the coverslip. Slides may be
read immediately or stored for an extended time
at 2-10°C with no loss of reactivity.
INCUBATE SLIDES (30±5 minutes at room tem-
PBS RINSE
FOR TECHNICAL ASSISTANCE:
1-800-251-5115 (Toll Free)
or e-mail: [email protected]
PBS WASH (10 minutes)
Wash slide(s) 10 minutes with PBS in a slide staining
dish or Coplin jar. Gentle agitation is recommended at slide immersion, midpoint, and removal.
This wash may be extended 10-30 minutes with
no variability in final test results. Discard PBS wash
solution after use. For optimal results, change PBS
at midpoint and use a magnetic stirrer.
8.
PBS RINSE
Remove one slide at a time from Coplin jar and
rinse each side of slide 4-5 seconds with PBS. Do
not squirt buffer directly on the wells. Place each
PBS rinsed slide into a Coplin jar filled with distilled
or deionized water until all slides have removed
from the color reagent. Immediately proceed to
step 14.
Remove slide(s) from incubator tray and rinse
briefly with PBS using a squirt bottle, Pasteur, or
serological pipette. Do not squirt buffer directly
on the wells.
NOTE: To avoid cross contamination on 13-well
slides, direct PBS stream along midline of slide, tilting first toward wells 1-5 followed by tilting toward
wells 6-10.
7.
COLOR REAGENT INCUBATION (30 minutes at
room temperature, i.e. 18-24°C)
Remove one slide at a time from PBS, dip 3-5
times in deionized or distilled water, and tap slide
on its side against bibulous paper or paper toweling to remove excess water. Immediately place
slide(s) into a Coplin jar containing activated
color reagent and incubate 30 minutes.
perature, i.e. 18-24°C)
Place slide(s) into a moist covered chamber (a
petri dish with moistened paper toweling will be
adequate). Incubate, with lid in place, for 30
minutes (±5 minutes) at room temperature
(18-24°C).
6.
PBS WASH (10 minutes)
Wash slide(s) 10 minutes with PBS in a slide staining
dish or Coplin jar. Gentle agitation is recommended at slide immersion, midpoint, and removal.
This wash may be extended 10-30 minutes with no
variability in final test results.
Remove slide(s) from pouch(es) and place control sera on control wells as follows: Invert control
dropper bottle and squeeze gently until drop is
visible at the tip. Gently touch the drop to appropriate control well while avoiding direct contact
of dropper tip with slide surface. Place positive
control on well marked “+”, negative control on
well marked “-”, and one drop of PBS buffer on
well marked “PBS”. Add 1 drop (20-25 µl) patient
sample to the numbered wells.
NOTE: For general screening, the homogeneous
positive control is recommended. For semi-quantitative titering, select the positive control illustrating the most similar pattern of Staining to the
screening sample (e.g. for patient sample yielding
a speckled pattern of staining in screening, use
speckled positive control). If the HEp-2000®
ANA-Ro test is to be used for confirmation of the
presence of anti- SSA/Ro antibodies, the SSA/Ro
Positive Control, catalog number 2035-Ro, must
be run on at least one slide in that day’s run.
CAUTION: DIRECT CONTACT OF DROPPER TIP WITH
SLIDE SURFACE MAY RESULT IN DAMAGE TO THE
ANTIGEN SUBSTRATE.
5.
PBS RINSE
Remove slide(s) from incubator tray and rinse
briefly with PBS. Do not squirt buffer directly on
the wells.
Screening: Dilute patient samples to 1:40 by adding 0.05 ml (50 µl) serum to 1.95 ml reconstituted
PBS.
Semi-Quantitative Titering: Make two-fold serial
dilutions of screening sample(s) (e.g. 1:80, 1:160, 1:
320...1:2560) using PBS.
4.
INCUBATE SLIDES (30±5 minutes at room tem-
ENZYME ANTIBODY REAGENT (Cover the wells
with 12-14 drops)
Remove one slide at a time from PBS and dip 3-5
times in deionized or distilled water. Tap slide on
its side against bibulous paper or paper toweling
to remove excess water. Immediately return slide
to the incubation chamber and cover the wells
completely using enzyme antibody reagent; begin by placing a drop over each well . Repeat for
each slide. Enzyme antibody reagent has been
titered to compensate for residual deionized or
distilled water remaining on the slide after rinsing.
9
SYSTÈME DE TEST ANA-Ro COLORZYME®
HEp-2000®
POUR UTILISATION DIAGNOSTIQUE IN VITRO
de division cellulaire. Elle comprend généralement six
phases : interphase, prophase, métaphase, anaphase,
télophase et cytocinèse.
RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
PRINCIPE DU TEST
UTILISATION PRÉVUE : Il s’agit d’un test immunoenzymatique indirect pour la détection semiquantitative des anticorps anti-nucléaires dans le sérum
humain. Ce système de test utilise des cellules HEp-2
transfectées†, qui permettent l’identification spécifique
des auto-anticorps anti- SSA/Ro. Les auto-anticorps
anti- SSA/Ro peuvent présenter une image fluorescente
caractéristique sur les cellules transfectées. Lorsque ce
motif est présent, il est considéré comme une preuve
confirmant la présence d’anticorps anti- SSA/Ro.
Le système de test ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000®
d’Immuno Concepts utilise la technique immuno-enzymatique indirecte. Les échantillons de patient dilués
sont mis à incuber avec le substrat antigénique afin de
permettre la liaison spécifique des auto-anticorps aux
noyaux cellulaires. En présence d’ANA, un complexe
antigène-anticorps stable se forme. Après le rinçage
destiné à éliminer les anticorps non liés spécifiquement,
le substrat est mis à incuber avec un anticorps antihumain conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP).
Lorsque les résultats sont positifs, on observe la formation d’un complexe tripartite stable composé d’un anticorps anti-humain conjugué à de la HRP lié à un anticorps anti-nucléaire humain, lui-même lié à un antigène
nucléaire. Pour visualiser ce complexe, il faut mettre la
lame à incuber dans le réactif coloré Colorzyme® qui
contient un substrat spécifique à l’enzyme. La réaction
entre l’anticorps marqué par une enzyme et le substrat
spécifique à l’enzyme se traduit par une réaction
colorée sur la lame, visible par microscope optique
classique. Dans les échantillons positifs, les noyaux des
cellules présenteront une coloration bleu-violet sombre
et une répartition particulière des antigènes nucléaires
dans les cellules. Si l’échantillon est négatif pour l’ANA,
le noyau ne présentera pas de répartition nucléaire
claire La coloration du cytoplasme peut être faible
tandis que celle des régions non chromosomiques des
cellules mitotiques peut être plus sombre.
L’absence de ce motif caractéristique n’exclut pas
la présence éventuelle d’anticorps anti-SSA/Ro.
Ce système de test doit être utilisé comme une aide
à la détection des anticorps associés aux maladies
rhumatismales systémiques.
Anticorps anti-nucléaire (ANA) est un terme général
utilisé pour décrire les auto-anticorps dirigés contre
diverses protéines nucléaires. Les premières études
de ces auto-anticorps, à l’aide de techniques
d’immunofluorescence, ont révélé quelques spécificités
des protéines nucléaires (1). La corrélation entre la
positivité des tests ANA et le lupus érythémateux disséminé (LED) étant très élevée, un test ANA négatif
exclut, de fait, cette maladie (2).
Bien que la présence d’anticorps anti-ADN constitue toujours une forte présomption de LED (3), un
certain nombre de macromolécules nucléaires (4) et
cytoplasmiques (5-7) ont également été détectées
et associées à d’autres collagénoses (8-10). Certains
de ces anticorps ont une valeur diagnostique et/ou
pronostique, notamment en cas de sclérodermie
généralisée évolutive (11-12), de connectivité mixte (1315), de syndrome de Sjögren (16-17), de polymyosite
(18) et/ou de polyarthrite rhumatoïde (19). En raison de
ces associations cliniques, les tests ANA sont maintenant reconnus comme un outil d’analyse général de la
collagénose (20).
La sensibilité des tests ANA varie en fonction du type
de substrat utilisé, de la méthode de fixation et du type
d’ANA présent dans le sérum. Les milieux de culture
cellulaire sont généralement plus sensibles que les
coupes de tissu (21-24). La détection des auto-anticorps
anti- SSA/Ro est particulièrement variable. Les tissus de
rongeurs ne contiennent pas des niveaux d’antigènes
SSA/Ro (25) détectables et les résultats sur substrat cellulaire varient en sensibilité de 50 à 90 % (26-27).
Le système ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000® d’Immuno
Concepts, qui utilise comme substrat des cellules
épithélioïdes humaines transfectées présentant de
nombreuses figures mitotiques* (HEp-2), est l’un des
systèmes de pointe pour la détection des ANA. Les
cellules HEp-2 avec figures mitotiques montré une
sensibilité plus élevée et une identification plus précise
des divers motifs observables que le substrat de rein de
souris classique pour la détection des anticorps dans
la sclérodermie généralisée (28). Les figures mitotiques
aident à la différenciation des motifs mais permettent
également la détection d’antigènes nucléaires non
signalés précédemment et présents à des concentration plus élevées dans des cellules en phase active de
mitose (29-31). Les cellules HEp-2 de ce test ont été
transfectées avec de multiples copies de la séquence
d’ADN spécifique qui reconnaît l’information de
l’auto-antigène SSA/Ro. Environ 10 à 20 % des cellules
transfectées surexpriment cet antigène, aussi la détection des auto-anticorps SSA/Ro est-elle meilleure que
sur des cellules HEp-2 qui n’ont pas été transfectées. Les
auto-anticorps anti- SSA/Ro peuvent présenter un motif
fluorescent caractéristique sur les cellules transfectées.
Lorsque ce motif est présent, il est considéré comme
une preuve confirmant la présence d’anticorps antiSSA/Ro.
L’absence de ce motif caractéristique n’exclut pas
la présence éventuelle d’anticorps anti-SSA/Ro.
† Les cellules transfectées et leur application sont
protégées par le brevet 5,518,881 déposé aux États-Unis
ainsi que d’autres brevets en attente aux États-Unis et
à l’étranger.
* Mitose est un terme utilisé pour décrire le processus
10
COMPOSITION DES SYSTÈMES (MATÉRIELS FOURNIS)
Utilisation : Tous les composants sont prêts à l’emploi
et ne requièrent ni aliquotage ni reconstitution (sauf
pour le tampon PBS et le réactif coloré Colorzyme® qui
doivent être dissous dans de l’eau désionisée ou distillée avant utilisation).
Conservation : Tous les composants doivent être conservés au réfrigérateur entre 2 et 10 °C. Après reconstitution, le réactif tampon PBS doit être conservé dans un
récipient fermé, au réfrigérateur entre 2 et 10 °C.
Après reconstitution, le réactif coloré Colorzyme® doit
être conservé dans un récipient fermé à température
ambiante, pendant 30 jours maximum. En fonction
de la fréquence d’utilisation, 150 ml de réactif coloré
Colorzyme® peuvent être utilisés avec vingt lames
maximum.
Stabilité : Tous les composants sont stables pendant 12
mois à partir de la date de fabrication. Ne pas utiliser
les composants au-delà de leur date de péremption.
RÉACTIFS
Lames de substrat : ‡Réf. catalogue 2007-Ro (sept puits)
; 2013-Ro (treize puits). Lames de substrat ANA à sept
ou treize puits utilisant des cellules HEp-2000® (avec
figures mitotiques) dont la culture et la stabilisation sont
directement effectuées sur les puits de test. Ce sont
des cellules HEp-2 qui ont été transfectées de manière
stable avec l’auto-antigène SSA/Ro. Le concept unique
de lame recouverte de téflon (Moat™) évite toute contamination croisée entre les puits pendant le test. Les
lames comprennent également des puits de contrôle
supplémentaires (positif, négatif et PBS) pour faciliter
l’interprétation des résultats.
Contrôle positif SSA/Ro : Réf. catalogue 2035-Ro. Flacon
compte-gouttes prêt à l’emploi contenant 1,0 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifique à l’antigène SSA/Ro. On observe une image
fluorescente mouchetée fine typique de l’anti- SSA/Ro
du sérum sur le substrat cellulaire HEp-2000® d’Immuno
Concepts. L’expression de cet aspect est prédominante au niveau du noyau, avec un aspect nucléolaire
marqué. Le cytoplasme des cellules qui surexpriment
le SSA/Ro peut être légèrement marqué. On note une
fluorescence négative dans la région chromosomique
des cellules mitotiques. Ce réactif contient 0,1 %
d’azide de sodium (conservateur).
Contrôle positif homogène : Réf. catalogue 2021.
Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi contenant 1 ml
de sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléaires ADN et/ou DNP.
On observe une coloration homogène du sérum sur
le substrat cellulaire HEp-2000® d’Immuno Concepts,
que l’on retrouve dans la région chromosomique des
cellules mitotiques. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de
sodium (conservateur).
Contrôle positif moucheté : Réf. catalogue 2022. Flacon
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléaires Sm et/ou RNP. Ce
sérum présente l’une des fluorescences mouchetées les
plus courantes observées sur le substrat cellulaire HEp2000® d’Immuno Concepts. On note une fluorescence
négative dans la région chromosomique des cellules
mitotiques. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium
(conservateur).
5,0 ml de milieu de montage à base de glycérol, pH
9,1 ± 0,2. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium
(conservateur).
Lamelles couvre-objet : Réf. catalogue 1041. Chaque
paquet contient dix lamelles couvre-objet en verre n°1
de 24 x 60 mm.
MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE REQUIS (MAIS NON
FOURNI)
Contrôle positif nucléolaire : Réf. catalogue 2023. Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi contenant 0,5 ml
de sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléolaires. Ce sérum
présente une image nucléolaire sur le substrat cellulaire
HEp-2000® d’Immuno Concepts. Ce réactif contient 0,1
% d’azide de sodium (conservateur).
Contrôle positif centromérique : Réf. catalogue 2025.
Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi contenant 0,5
ml de sérum de contrôle humain positif riche en anticorps spécifiques aux centromères chromosomiques
(kinétochore). Ce sérum présente une fluorescence
mouchetée discrète sur le substrat cellulaire HEp-2000®
d’Immuno Concepts, que l’on retrouve dans la région
chromosomique des cellules mitotiques. Ce réactif
contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
Pipettes volumétriques permettant de prélever 20 à
25 µl
Trois jarres Coplin ou cuves à coloration
Pissette en plastique ou pipettes Pasteur
Pipettes sérologiques
Récipients à bouchon à vis d’un litre (pour tampon
PBS)
Récipients fermés pour conserver le réactif coloré
Colorzyme®
Eau désionisée ou distillée
Tubes à essai pour préparer les dilutions de sérum
Chambre d’incubation
Papier absorbant ou serviettes en papier
Gants en latex jetables
Chronomètre de laboratoire
Microscope classique à grossissement 200X et 400X.
PRÉCAUTIONS
Sérum de contrôle titrable : Réf. catalogue 2026. Flacon
prêt à l’emploi contenant 1,0 ml de sérum de contrôle
humain positif, qui doit être traité comme un échantillon de patient pur (non dilué). Ce réactif contient 0,1 %
d’azide de sodium (conservateur).
1. Tous les matériels d’origine humaine utilisés dans la
composition de ce produit ont été testés et se sont
révélés négatifs (non-réactivité répétée) vis-à-vis
des anticorps des virus de l’immunodéficience humaine 1 et 2 (vih 1 et 2), de l’anticorps du virus de
l’hépatite C (hcv) et de l’antigène de surface de
l’hépatite B (hbsag), selon les méthodes approuvées par la fda. Néanmoins, aucune méthode de
test ne peut assurer totalement l’absence de vih-1,
vih-2, hcv, hbv ou d’autres agents infectieux. Par
conséquent, tous les matériels du kit doivent être
manipulés de la même manière que des matériels
considérés comme potentiellement infectieux.
2. Tous les échantillons de patient doivent être manipulés conformément aux recommandations du
niveau de biosécurité 2 comme pour tout échantillon de sérum ou de sang humain potentiellement
infectieux, telles qu’indiquées dans le manuel du
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health : Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. La dilution des composants ou l’utilisation de composants autres que ceux fournis dans ce système
peut donner lieu à des résultats incohérents.
4. L’azide de sodium (0,1 %) est utilisé comme
conservateur. Il est possible que l’azide de sodium
réagisse au contact des canalisations en plomb
ou en cuivre et forme des sels d’azides métalliques
explosifs. Lors de l’élimination des réactifs, rincer
abondamment les canalisations avec de l’eau afin
d’éviter toute accumulation de résidus. L’azide de
sodium est un poison et peut être toxique en cas
d’ingestion.
5. Ce kit est destiné à une utilisation diagnostique in
vitro.
6. En cas d’utilisation de sérums hémolysés ou
lipémiques, il est conseillé de procéder à une
inactivation de 30 minutes à 56 °C pour obtenir
des résultats optimums. Ne pas utiliser les sérums
contaminés d’un point de vue microbien.
7. Il a été démontré que la liaison du Clq à l’ADN
peut générer des ANA faussement positifs,
indépendamment du type de substrat utilisé (32).
Cette interférence potentielle due au Clq peut être
éliminée par inactivation du sérum à 56 °C pendant
30 minutes, avant de procéder au test.
8. Le sérum de contrôle titrable est destiné à être
utilisé pour surveiller la reproductibilité inter-lot
et inter-analyse. Il n’est pas destiné à mesurer la
sensibilité ou la spécificité globale du dosage.
9. Ne pas fumer, manger ni boire dans les zones où
des échantillons ou des réactifs du kit sont manipulés.
10. Éviter toute éclaboussure ou pulvérisation
d’aérosols à tout moment.
11. Les durées et températures d’incubation autres
que celles spécifiées peuvent donner des résultats
erronés.
12. La contamination croisée des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats.
13. Avant utilisation, la verrerie réutilisable doit être
lavée et rincée soigneusement afin d’éliminer tout
détergent. Toute la verrerie doit être propre et
sèche avant utilisation.
14. Avant utilisation, porter les réactifs, lames et échantillons à température ambiante (18-24 °C).
Sérum de contrôle négatif : Réf. catalogue 2031. Flacon
sérum de contrôle humain négatif. Bien que le sérum
de contrôle négatif puisse présenter une faible fluorescence du cytoplasme et une fluorescence plus vive de
la région non chromosomique de la cellule mitotique,
on n’observe aucune fluorescence nucléaire. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
Réactif immuno-enzymatique : Réf. catalogue 4009-Ro
(9,0 ml), 4075-Ro (23 ml). Globuline de chèvre anti-IgG
humaine (chaînes lourdes et légères) couplée à de la
peroxydase de raifort (HRP). Les kits de test complets
comprennent des flacons compte-gouttes de précision
prêts à l’emploi. Chaque flacon contient 9,0 ml de
réactif, soit la quantité suffisante pour 10 lames.
Réactif coloré : *Réf. catalogue 4066. Poudre de
substrat enzymatique spécifique à la HRP, contenant du
4-chloro-1-naphtol. Chaque paquet contient suffisamment de poudre pour préparer 150 ml de réactif coloré
Colorzyme® auto-activant.
Préparation : Dissoudre le contenu d’un sachet dans
150 ml d’eau désionisée ou distillée. Bien mélanger
jusqu’à dissolution complète. Ce réactif coloré,
conservé dans un récipient fermé, est stable pendant
30 jours à température ambiante. Il peut être réutilisé
pendant 30 jours ou jusqu’à observation d’un changement de couleur ou d’un précipité. L’aspect trouble ou
l’opalescence, si aucun précipité n’est visible lors de
la réutilisation, est normal. En fonction de la fréquence
d’utilisation, 150 ml de réactif coloré Colorzyme® peuvent être utilisés avec vingt lames maximum.
‡Cette lame est protégée par un ou plusieurs des
brevets suivants déposés aux États-Unis et à l’étranger
: 4,387,972 ; D-274261 ; 0727046 ; D-273261 ; 5,518,881 ;
brevet canadien 1,171,302 et autres brevets en attente.
* Ce matériel est protégé par un ou plusieurs des
brevets suivants déposés aux États-Unis et à l’étranger
: 4615972, brevet canadien 1231633, brevet italien
1177110 et autres brevets en attente.
RÉACTIFS NÉGATIFS
Poudre tampon PBS : Réf. catalogue 1011. Solution
saline en poudre tamponnée au phosphate (0,01 M,
pH 7,4 ± 0,2). Chaque sachet contient une quantité suffisante de poudre tampon pour préparer 1 litre de solution. (Chaque kit de test complet contient un sachet de
poudre tampon pour cinq lames.)
Préparation : Dissoudre un sachet de poudre tampon
dans 1 litre d’eau désionisée ou distillée, couvrir puis
conserver au réfrigérateur entre 2 et 10 °C pendant
quatre semaines maximum ou jusqu’à ce que des
signes de contamination ou de modifications visibles
apparaissent.
Milieu de montage semi-permanent : Réf. catalogue
1111. Flacon compte-gouttes prêt à l’emploi contenant
11
15. Porter des gants en latex jetables pour manipuler
les échantillons et réactifs puis se laver soigneusement les mains par la suite.
16. La contamination microbienne des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats.
17. Ne pas pipeter avec la bouche et éviter tout
contact de la peau et des muqueuses avec les
réactifs et les échantillons. En cas de contact, laver
abondamment avec un savon germicide et de
l’eau.
18. Le réactif coloré peut être réutilisé pendant 30
jours ou jusqu’à observation d’un changement
de couleur ou d’un précipité. L’aspect trouble
ou l’opalescence, si aucun précipité n’est visible
lors de la réutilisation, est normal. En fonction de
la fréquence d’utilisation, 150 ml de réactif coloré
Colorzyme® peuvent être utilisés avec vingt lames
maximum.
PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS
Prélèvement : Le sérum est l’échantillon préférentiel.
Environ 5 ml de sang entier doivent être prélevés de
manière aseptique par ponction veineuse à l’aide d’un
tube à prélèvement sous vide stérile ou tout autre système de prélèvement adapté. Laisser le sang coaguler
à température ambiante (18-24 °C). Le sérum doit être
séparé du caillot par centrifugation aussi rapidement
que possible, de façon à limiter l’hémolyse.
Substances interférentes : Les sérums présentant un
degré élevé d’hémolyse, d’ictère, de lipémie ou de
prolifération microbienne doivent être écartés car ces
anomalies peuvent engendrer des résultats aberrants.
Les échantillons contenant des particules visibles doivent être clarifiés par centrifugation avant de procéder
au test.
Conservation : Les sérums peuvent être conservés entre
2 et 10 °C pendant une semaine maximum. Si le test est
reporté, ils doivent être congelés à -20 °C minimum. Le
sérum ne doit pas être conservé dans un réfrigérateur
ou un congélateur à dégivrage automatique.
ATTENTION : Les congélations et décongélations successives des échantillons de patient peuvent induire des
résultats faussement positifs ou faussement négatifs.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Les contrôles positif, négatif et PBS doivent être effectués dans les puits dédiés au contrôle qualité sur
chaque lame. Le contrôle positif doit présenter une
fluorescence bleu-violet sombre des noyaux des
cellules, avec un motif clairement visible et caractéristique du sérum de contrôle utilisé. Le cytoplasme peut
prendre une légère coloration bleu-violet dans le puits
du contrôle positif. Le contrôle négatif doit présenter
une légère fluorescence bleu-violet simultanée du
cytoplasme et du noyau, mais sans motif fluorescent
nucléaire visible. Le contrôle PBS est utilisé pour observer
la fluorescence non spécifique par le réactif immunoenzymatique et ne doit pas présenter de coloration
bleue. Si les contrôles n’apparaissent pas tel que décrit,
le test n’est pas valable et doit être recommencé. Si le
test ANA-Ro HEp-2000® doit être utilisé pour confirmer
la présence d’anticorps anti- SSA/Ro, le contrôle positif
SSA/Ro, référence catalogue 2035-Ro, doit être effectué sur au moins une lame le jour de l’analyse.
CONTRÔLE TITRABLE OPTIONNEL
Lors de la lecture des titres, de nombreux laboratoires
commencent par lire le puits qui contient l’échantillon
le plus dilué puis poursuivent « à rebours » jusqu’à la dilution 1:40. Le premier puits dans lequel une fluorescence
nucléaire clairement perceptible est visible est le résultat du titrage. Nous recommandons cette technique
pour la détermination des résultats de titrage.
Le titre moyen et la plage de titrage (± une dilution de
part et d’autre de la moyenne) déterminés ont été
établis dans notre laboratoire et sont communiqués à
titre indicatif. Ce contrôle est fourni pour permettre à
chaque laboratoire d’évaluer la reproductibilité (précision) de son test ANA. Étant donné que ce contrôle
n’est pas destiné à être un indicateur de la précision
du titrage, chaque laboratoire doit établir sa propre
référence de titrage moyen pour cet échantillon et
utiliser cette information pour évaluer la reproductibilité
inter-analyse (précision).
Par de multiples dosages de ce contrôle titrable réalisés
à l’aide du système de test ANA-Ro Colorzyme® HEp2000® d’Immuno Concepts, une valeur de titre moyen
a été établie pour chaque numéro de lot. Le numéro
de lot, le titre moyen et la plage de titrage (± une
12
double dilution de part et d’autre de la moyenne) sont
indiqués sur l’étiquette du flacon et doivent être utilisés
à titre indicatif.
Il est important de ne pas confondre intensité de la
fluorescence et présence ou absence d’anticorps antinucléaires. Le facteur clé à prendre en compte dans la
détermination de la positivité d’une dilution de sérum
donnée est l’apparition d’un motif clairement visible,
indépendamment de l’intensité de la fluorescence.
Ce contrôle titrable présentera l’image mouchetée typique associée aux anticorps RNP. On peut également
observer une seconde répartition de NSp I (plusieurs
mouchetures discrètes dans le noyau des cellules en interphase), mais c’est l’image mouchetée RNP classique
qui doit être utilisée pour la lecture du résultat.
Les valeurs obtenues dans notre laboratoire peuvent
différer de vos propres valeurs. De nombreux facteurs
peuvent affecter vos résultats, notamment les éléments
suivants :
1. Alignement correct de l’axe optique du microscope. Pour les instructions, se reporter au manuel
du microscope.
2. Ouverture numérique de l’objectif. L’ouverture numérique est liée au pouvoir collecteur de lumière et
à la résolution de l’objectif. Ce chiffre est imprimé
sur le côté de l’objectif.
3. Précision et exactitude de la technique de dilution,
de l’équipement et de la réalisation des procédures de test.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS DU PATIENT
Un grossissement total de 200X est recommandé pour
le test positif/négatif tandis qu’un grossissement total de
400X est conseillé pour l’identification de divers motifs et
la visualisation des cellules mitotiques.
Négatifs : Un sérum est considéré comme négatif aux
anticorps anti-nucléaires lorsque la fluorescence des
noyaux est inférieure ou égale à celle observée pour les
puits du contrôle négatif sans motif clairement visible.
Le cytoplasme peut présenter une légère fluorescence,
avec une fluorescence plus vive de la région non
chromosomique des cellules mitotiques, mais sans motif
nucléaire clairement visible.
Positifs : Un échantillon de sérum est considéré comme
positif lorsque le noyau présente un motif fluorescent
clairement visible pour une majorité de cellules interphasiques.
SSA/Ro : Un sérum est considéré comme positif aux
anticorps anti- SSA/Ro si 10 à 20 % des noyaux interphasiques présentent le motif SSA/Ro caractéristique, qui
apparaît comme une image mouchetée distincte avec
une fluorescence marquée des nucléoles. Ce sont les
cellules transfectées qui surexpriment le SSA/Ro. Les
80 à 90 % des noyaux interphasiques restants peuvent
présenter ou non une fluorescence finement mouchetée du noyau avec ou sans coloration des nucléoles.
Titres : Lors de la lecture des titres, de nombreux
laboratoires commencent par lire le puits qui contient
l’échantillon le plus dilué puis poursuivent « à rebours
» jusqu’à la dilution 1:40. Le premier puits dans lequel
une image clairement perceptible est visible constitue
le résultat du titrage. Nous recommandons cette
technique pour la détermination des résultats de
titrage. Il est important de ne pas confondre intensité
de la fluorescence et présence ou absence d’anticorps
anti-nucléaires. Le facteur clé à prendre en compte
dans la détermination de la positivité d’une dilution
de sérum donnée est l’apparition d’un motif nucléaire
clairement visible, indépendamment de l’intensité de
la fluorescence. En raison de l’augmentation de la concentration d’antigènes SSA/Ro dans les cellules qui les
surexpriment, il n’est pas rare d’observer la fluorescence
de ces cellules pour des titres très élevés. La signification
clinique de ces titres élevés est inconnue.
Attention : Certains sérums peuvent présenter une
fluorescence nucléaire et cytoplasmique sans motif
nucléaire apparent. Ce phénomène est généralement
attribué aux anticorps hétérophiles et doit être considéré comme négatif (33).
INTENSITÉ DE LA FLUORESCENCE ENZYMATIQUE
Le degré d’intensité de la fluorescence n’a pas de
valeur clinique avérée et n’est qu’un indicateur limité
du titre (34). Pour simplifier l’interprétation, enregistrer
les résultats du test comme étant fortement positifs ou
positifs et le titre en fonction de cela.
Réaction fortement positive : Fluorescence bleu-violet
sombre à très sombre, contour net des cellules, motif
nucléaire parfaitement défini.
Réaction positive : Fluorescence bleu-violet faible ou
voilée avec une plus grande variabilité de la fluorescence entre les cellules ; le contour des cellules peut
être moins bien défini pour certaines cellules avec une
majorité de cellules présentant toujours un motif fluorescent clairement visible.
REMARQUE : Les cellules étant directement cultivées
sur la lame, toutes ne se trouvent pas dans la même
phase du cycle cellulaire. Il n’est pas rare d’observer
des intensités de fluorescence variables d’une cellule
à l’autre en raison des différences de concentration et
d’emplacement des divers antigènes pendant le cycle
cellulaire.
COMMUNICATION DES RÉSULTATS
��
Test
: Les résultats doivent être notés fortement positifs
ou positifs à la dilution 1:40 et le motif fluorescent du
noyau doit être communiqué.
Titrage : Les résultats doivent être communiqués
comme la dernière des dilutions successives dans
laquelle une fluorescence est clairement visible. Les
résultats présentant une forte réaction à la dilution 1:
2560 doivent être notés supérieurs à 1:2560. Les titres
allant de 1:40 à 1:80 sont considérés comme des titres
faibles, ceux de 1:160 à 1:320 comme moyens et ceux
supérieurs ou égaux à 1:640 comme élevés.
��
��
DÉTECTION DES MOTIFS
��
��
Centromérique : Image fluorescente mouchetée
discrète suggérant fortement un syndrome CREST*,
variante de la sclérodermie (28). Les mouchetures
nucléaires sont très discrètes et généralement par
multiples de 46 (généralement 23-46 mouchetures par
noyau). Les centromères étant des constrictions où
les fibres fusiformes s’attachent aux chromosomes, les
cellules mitotiques présenteront la même réaction de
moucheture dans la région chromosomique (12).
Synonymes : ACA, mouchetée discrète.
Antigènes nucléaires : Centromères chromosomiques
(kinétochores).
Associations cliniques : Suggère fortement un syndrome CREST*, variante de la sclérodermie (28).
* CREST est une forme de sclérodermie avec calcinose
marquée, syndrome de Raynaud, trouble fonctionnel
de l’œsophage, sclérodactylie et télangiectasie.
SSA/Ro : Aspect moucheté très particulier avec fluorescence marquée des nucléoles dans 10 à 20 % des
noyaux��
interphasiques. Ce sont les cellules transfectées
qui surexpriment le SSA/Ro. Les 80 à 90 % des noyaux
interphasiques restants peuvent présenter ou non
une fluorescence finement mouchetée du noyau
avec ou sans coloration des nucléoles. La région non
chromosomique des cellules mitotiques en métaphase
présente une fluorescence, contrairement à la région
chromosomique (négative).
Antigènes nucléaires : SSA/Ro (60kD).
Associations cliniques : Observées chez 60 à 70 %
des patients souffrant du syndrome de Sjögren
primaire, chez 30 à 40 % des patients atteints d’un
��
��
LED et chez plus de 95 % des patients
présentant
�� subaigu (38). ��
un lupus cutané
Homogène
�� : Fluorescence uniforme du noyau avec
ou sans effacement apparent des nucléoles. La région
chromosomique des cellules mitotiques en métaphase
est clairement positive avec une intensité de fluorescence lisse ou périphérique supérieure ou égale aux
noyaux interphasiques.
Synonymes : Diffuse, uniforme.
Antigènes nucléaires : ADN double brin, ADNn, DNP,
histone.
Associations cliniques : Les titres élevés suggèrent un
LED.
Les titres plus faibles suggèrent un LED ou d’autres
��
�� (35). ��
collagénoses
��
��
��
��
��
Mouchetée : Fluorescence granulaire fine ou grossière
du noyau généralement sans coloration des nucléoles.
La région non chromosomique des cellules mitotiques
en��
métaphase présente une fluorescence, contrairement à la région chromosomique (négative).
Antigènes nucléaires : Sm, RNP, Scl-70, SS-B et
d’autres systèmes antigène-anticorps non encore
caractérisés.
LED (antigène Sm), une connectivité mixte (antigène RNP), une sclérodermie (antigène Scl-70) ou
un syndrome de Goujerot-Sjögren (antigène SS-B).
Les titres plus faibles peuvent suggérer d’autres
collagénoses (36).
��
Nucléolaire : Large fluorescence mouchetée grossière
��
��
dans le noyau, en général moins
de 6 par cellule, avec
ou sans fines mouchetures occasionnelles (entre 5 et
10).��
La région non chromosomique des cellules mitotiques en métaphase présente une forte fluorescence,
contrairement à la région chromosomique (faible
fluorescence). Les cellules en anaphase et télophase
peuvent présenter une fluorescence similaire à celles
des noyaux interphasiques.
Antigènes nucléaires : Généralement appelés ARN
4-6S et autres antigènes nucléaires, tels que fibrillarine, ARN polymérase I, NOR 90 et PM/Scl.
Associations cliniques : Titres élevés prévalant dans la
sclérodermie et le syndrome de Sjögren (37).
��
��
��
��
��
Périphérique : Fluorescence uniforme, principalement
autour de la région extérieure du noyau, avec une
fluorescence
�� plus faible vers le centre du noyau. La
région chromosomique des cellules mitotiques en métaphase est clairement positive avec une intensité de
fluorescence lisse ou périphérique supérieure ou égale
aux noyaux interphasiques.
Synonymes : Marginale, hérissée, membraneuse.
Antigènes nucléaires : ADN double brin, ADN simple
brin, ADNn, DNP, histone.
LED.
Les titres plus faibles suggèrent un LED ou d’autres
collagénoses (35).
��
��
��
��
��
��
CELLULES
MITOTIQUES
��
DÉTECTION
Les cellules mitotiques doivent être visibles sur chaque
champ aux grossissements inférieurs ou égaux à 200X.
Pour vérifier si une cellule est en mitose, utiliser un grossissement à 400X. Les cellules mitotiques présentent
une forme cellulaire arrondie caractéristique sans
membrane nucléaire détectable. La région chromosomique des cellules mitotiques présente généralement
une forme irrégulière, due à l’absence de membrane
nucléaire, ainsi qu’une constriction extrême des chromosomes.
��
��
Les sérums positifs
aux anticorps anti-ADN
et/ou DNP
��
��
et/ou anti-histones (cas du contrôle positif homogène
d’Immuno Concepts) présenteront une fluorescence
intense��
de la région chromosomique de ces cellules.
Dans les échantillons négatifs aux anticorps anti-ADN
et/ou DNP et/ou anti-histones (cas du contrôle positif
moucheté), les cellules mitotiques ne présenteront pas
de fluorescence chromosomique et peuvent s’avérer
difficiles à voir.
UTILISATION DES CELLULES MITOTIQUES
Distinction anticorps mouchetés/anticorps homogènes:
Une image fluorescente finement mouchetée est
parfois difficile à différencier d’une fluorescence
homogène. Si le motif est homogène, la fluorescence
��
��
des chromosomes
des cellules mitotiques
sera uniforme.
Si l’image��
est parfaitement mouchetée,
l’extérieur
��
des chromosomes présentera une réaction finement
mouchetée.
��
REMARQUE : Si la fine moucheture de la totalité de
la cellule mitotique survient en même temps qu’une
fluorescence uniforme de la région chromosomique,
il est fort probable qu’au moins deux anticorps soient présents. Noter la dilution de test comme étant
mouchetée/homogène et titrer chaque anticorps pour
obtenir un résultat.
Anticorps périphérique vs anticorps anti-membrane
nucléaire : Les anticorps qui présentent un motif
périphérique
sont généralement associés
à la présence
��
��
13
��
��
d’antigènes nucléaires anti-ADN/DNP. Les titres élevés
de ces anticorps suggèrent un LED. Dans les substrats
qui ne contiennent pas de cellules mitotiques, il peut
s’avérer difficile de distinguer le motif périphérique
de l’anticorps anti-membrane nucléaire. Ces motifs
peuvent être différenciés à l’aide des cellules en mitose
d’Immuno Concepts car la région chromosomique des
cellules mitotiques sera intensément colorée en cas de
motif périphérique mais ne sera pas colorée par les anticorps anti-membrane nucléaire. Cette distinction est
importante d’un point de vue clinique car l’anticorps
anti-membrane nucléaire n’a pas de spécificité ADN/
DNP et n’est pas associé au LED (39).
nucléoles. On n’observe aucune fluorescence dans
les régions chromosomiques des cellules mitotiques.
L’aspect nucléolaire se distingue par une large
fluorescence mouchetée grossière de l’ensemble des
noyaux, généralement moins de 6 par cellule. L’image
Scl-70 présente une fluorescence fine mouchetée, une
fluorescence nucléolaire de l’ensemble des noyaux
interphasiques, ainsi qu’une fluorescence de la région
chromosomique des cellules mitotiques en métaphase. Les anticorps anti-PCNA (antigènes nucléaires
de prolifération cellulaire) présente une moucheture
fine et grossière variable dans 30 à 50 % des noyaux
interphasiques.
Anticorps anti-centromères (ACA) vs. anticorps
mouchetés atypiques ressemblant au centromère :
Afin de vérifier l’anticorps anti-centromère, la région
chromosomique des cellules mitotiques doit être intensément colorée avec des mouchetures discrètes. Si la
région chromosomique ne se colore pas, l’anticorps
n’est pas anti-centromère et doit être noté comme
étant « moucheté atypique » (40).
FLUORESCENCES CYTOPLASMIQUES
Bien que les auto-anticorps anti-antigènes cytoplasmiques soient rarement associés aux collagénoses, ils
peuvent être détectés à l’aide de substrats de culture
de cellules épithéliales (41). Les anticorps anti-mitochondries et anti-muscles lisses figurent parmi les deux
types d’anticorps les plus détectés et sont généralement associés à une mononucléose infectieuse, à une
hépatite chronique active et à diverses pathologies
du foie (42, 43). Des anticorps anti-muscles lisses ont
également été décrits en utilisant un substrat de cellules
Hep-2 chez des patients qui ont des verrues (44).
Anticorps anti-mitochondries (AMA) : Mouchetures
discrètes concentrées dans la région périnucléaire de
la cellule et dispersées en densité plus faible vers les
régions externes du cytoplasme. Cela doit être distingué de l’anticorps dirigé contre l’appareil de Golgi,
qui ne colore généralement qu’un côté de la région
périnucléaire, ainsi que de l’anticorps anti-ribosome, qui
présente des mouchetures plus fines avec une apparence en forme de brin correspondant à l’emplacement
du réticulum endoplasmique dans la cellule.
SSA/Ro
REMARQUE : Il est plus aisé de différencier les mouchetures périnucléaires de la fluorescence nucléaire
périphérique du fait que les mouchetures mitochondriales forment une fluorescence mouchetée interrompue
à l’extérieur de la membrane nucléaire, tandis que les
sérums périphériques forment une fluorescence lisse
uniforme à l’intérieur de la membrane nucléaire.
ENREGISTRER LES SÉRUMS COMME ÉTANT NÉGATIFS AUX
ANTICORPS ANTI-NUCLÉAIRES ET VÉRIFIER LA POSITIVITÉ
AUX ANTICORPS ANTI-MITOCHONDRIES SUR SUBSTRAT
SPÉCIFIQUE AUX AMA.
Anticorps anti-muscles lisses (ASMA) : Fin réseau de
très fines fibres fluorescentes traversant entièrement le
cytoplasme. Contrairement aux anticorps anti-mitochondries, la fluorescence des anticorps anti-muscles
lisses est uniforme sur la totalité du cytoplasme et peut
également s’étendre sur le noyau. Dans les cellules mitotiques, on observe généralement de grosses mouchetures discrètes en dehors de la région chromosomique.
Il a été démontré que les anticorps anti-muscles lisses
comportaient une forte spécificité vis-à-vis de l’actine
(45, 46).
Nucleolare
ENREGISTRER LES SÉRUMS COMME ÉTANT NÉGATIFS AUX
ANTICORPS ANTI-NUCLÉAIRES ET VÉRIFIER LA POSITIVITÉ
AUX ANTICORPS ANTI-MUSCLES LISSES SUR SUBSTRAT
SPÉCIFIQUE AUX ASMA.
LIMITES DU TEST
PCNA
1. Le diagnostic ne peut pas être réalisé sur la base
de la détection des anticorps anti-nucléaires seuls.
Le médecin doit interpréter ces résultats au regard
des antécédents et des symptômes du patient, des
observations physiques et d’autres procédures de
diagnostic.
2. Le traitement ne doit pas débuter sur la seule base
d’un test positif aux anticorps anti-nucléaires. Les
indications cliniques, les autres analyses de laboratoire et le diagnostic clinique du médecin doivent
être pris en compte avant de commencer tout
traitement.
3. Certains médicaments (procaïnamide, hydralazine...) peuvent provoquer des pathologies
similaires au lupus érythémateux (47). Les patients
souffrant de lupus érythémateux induit par des médicaments peuvent présenter des ANA homogènes
ou homogènes/périphériques positifs généralement
dirigés contre les histones nucléaires (48).
4. Il est possible que la méthode immuno-enzymatique indirecte ne détecte pas la présence d’ANA
chez un faible pourcentage de patients souffrant
de LED mais que celle-ci soit détectée par d’autres
techniques (49).
5. Bien qu’un ANA à titrage élevé fasse indéniablement penser à une collagénose, il ne doit pas être
Scl-70
SSA/Ro opposé aux images qui peuvent ressembler à
la fluorescence SSA/Ro : La fluorescence SSA/Ro caractéristique apparaît comme une image mouchetée
intense distincte avec une coloration marquée des
nucléoles dans 10 à 20 % des noyaux interphasiques.
Les 80 à 90 % des noyaux interphasiques restants
peuvent présenter ou non une fluorescence finement
mouchetée du noyau avec ou sans coloration des
14
6.
7.
8.
9.
considéré comme un élément diagnostique mais
plutôt comme faisant partie des antécédents
cliniques d’un patient.
Les motifs fluorescents changent souvent au cours
des titrages successifs des sérums. Ce phénomène
est généralement dû à la présence de plusieurs
anticorps anti-nucléaires.
On note la présence d’un certain nombre d’ANA
positifs chez un faible pourcentage de patients
développant des néoplasmes et/ou des infections
(9).
Les auto-anticorps anti- SSA/Ro présentent une
image fluorescente caractéristique sur les cellules transfectées HEp-2000®. Lorsque ce motif
est présent, il est considéré comme une preuve
confirmant la présence d’anticorps anti- SSA/Ro.
L’absence de ce motif n’exclut pas la présence
éventuelle d’anticorps anti- SSA/Ro.
En raison de la surexpression de l’auto-antigène
SSA/Ro dans les cellules HEp-2000®, les échantillons qui contiennent des anticorps anti- SSA/Ro
présentent des valeurs de titrage plus élevées sur
ces cellules que les valeurs obtenues sur cellules
HEp-2 non transfectées. Étant donné qu’aucun des
autres auto-antigènes dans les cellules HEp-2000®
n’est affecté par le processus de transfection,
les sérums avec d’autres spécificités d’auto-anticorps ne présentent pas de différences de titrage
significatives entre la gamme de cellules HEp-2000®
transfectées et les cellules HEp-2 non transfectées.
VALEURS ESCOMPTÉES
Une étude, réalisée pendant 2 ans dans un grand centre hospitalier universitaire, a donné les résultats suivants
sur substrat ANA de cellules HEp-2 (50). Tableau 1.
PERFORMANCES
ÉCHANTILLONS NORMAUX
Le sérum de 500 donneurs de sang sains (242 femmes et
258 hommes), dont aucun ne présentait d’antécédent
connu de maladies rhumatismales, a été testé en
parallèle sur cellules HEp-2 non transfectées et avec le
système de test ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000®. Dans
cette population, les tests d’anticorps anti-nucléaires
de 36 échantillons (7,2%) se sont révélés positifs pour
une dilution de sérum à 1:40. Les motifs fluorescents
sont identiques sur les deux substrats pour 34 des 36
sérums positifs. Les deux sérums discordants sont des
sérums féminins et la présence d’anticorps anti- SSA/Ro
dans ceux-ci a été confirmée. Le premier présente
une faible fluorescence mouchetée sur cellules HEp-2
non transfectées et un aspect typique de SSA/Ro avec
le système de test ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000® .
Diagnosissérum est négatif sur cellules HEp-2 non
Le deuxième
transfectées mais présente un aspect typique de
Abnormal
SSA/Ro
avec lePopulation
système de test ANA-Ro Colorzyme®
(Over 4,500
Sera Tested):
HEp-2000®
. La spécificité
des anticorps SSA/Ro de ces
Systemic lupus
erythematosus
deux échantillons
est confirmée
par les méthodes Elisa
Rheumatoid
arthritis
et Western-Blot.
Les échantillons
négatifs lors des tests
connectiveavec
tissue
ANA leMixed
sont également
la disease
méthode ELISA.
test ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000®, avec cet aspect
typique moucheté du SSA/Ro.
ÉCHANTILLONS AVEC AUTO-ANTICORPS AUTRES QUE LE
SSA/Ro
230 échantillons de sérum de patients présentant un
grand nombre de maladies rhumatismales ou non ont
été testés en parallèle sur cellules HEp-2 non transfectées et par test ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000®. Un seul
aspect a été identifié sur 120 sérums. Des aspects mixtes
ont été identifiés sur 110 sérums. Sur les 230 échantillons sériques, 333 aspects ont été identifiés sur les deux
substrats : 29 échantillons de sérum présentent l’aspect
typique du SSA/Ro par test ANA-Ro Colorzyme® HEp2000®, 23 présentent un aspect moucheté sur cellules
HEp-2 non transfectées. Les 6 sérums discordants
(positifs sur HEp-2000® mais négatifs sur HEp-2 non transfectées) contiennent tous des anticorps anti- SSA/Ro,
ainsi que le confirme l’aspect typique du SSA/Ro, par
les méthodes Elisa et Western-Blot.
COMPARAISON DE TITRES
En raison de la surexpression de l’auto-antigène
SSA/Ro dans les cellules HEp-2000®, les échantillons qui
contiennent des anticorps anti- SSA/Ro présentent des
valeurs de titrage plus élevées sur ces cellules que les
valeurs obtenues sur cellules HEp-2 non transfectées.
Étant donné qu’aucun des autres auto-antigènes dans
les cellules HEp-2000® n’est affecté par le processus
de transfection, les sérums avec d’autres spécificités
d’auto-anticorps ne présentent pas de différences de
titre significatives entre la gamme de cellules HEp-2000®
transfectées et les cellules HEp-2 non transfectées.
REPRODUCTIBILITÉ DU TITRE
10 échantillons de sérum, choisis parmi les contrôles
CDC et d’autres sérums internes parfaitement caractérisés, sont testés sur 3 numéros de lots différents de
lames HEp-2000®, à 3 occasions différentes. À aucun
moment un échantillon négatif ne s’est révélé positif.
Toutes les valeurs de titre se situent dans une double
dilution de la valeur de titre moyenne établie pour tous
les échantillons testés.
CONFIRMATION DES ANTICORPS SSA/Ro
Dans un grand laboratoire de rhumatologie de
référence, les échantillons de sérum de 349 patients
dont les tests ANA sont connus pour être positifs ont
été analysés à l’aide du test ANA-Ro Colorzyme®
HEp-2000®. Dans cette population sélectionnée, 239
échantillons présentent l’aspect typique SSA/Ro. Des
tests ELISA positifs aux anticorps SSA/Ro ont été obtenus
pourPattern
238 (99,6 %) de ces échantillons. 79%échantillons
Segregation présentent des aspectsPositive
supplémentaires
fortement
mouchetés et/ou homogènes et ont obtenu des tests
ELISA positifs aux anticorps SSA/Ro. Par conséquent,
si l’aspect typique SSA/Ro est observé, il confirme
S,P+H,H,P
93
la présence
d’anticorps SSA/Ro mais l’absence
de
S,H
cet aspect
ne permet pas d’écarter leur40éventuelle
S
99 nous avons
présence.
Dans les études susmentionnées,
S,N 429 sérums contenant les anticorps
85 SSA/Ro,
Progressive systemic sclerosis-diffuse
examiné
systemic
ACA par les méthodes ELISA et/ou 93
Progressive
ÉCHANTILLONS
POSITIFS
AUX sclerosis-CREST
ANTICORPS SSA/Ro
confirmés
Western-Blot, et
Juvenile rheumatoid arthritis
SEULEMENT
présentant l’aspect typique SSA/Ro sur la gamme de
S HEp-2000® transfectées. Nous avons
14 égaleSystemicde sérum de patients souffrant de LED
46 échantillons
cellules
Polyarticular
13
ou du syndrome
de Sjögren ont été testés sur cellules
mentS observé des échantillons sériques contenant
Pauciarticular-B27+
HEp-2 non
transfectées et sur le test ANA-Ro Coldes anticorps
SSA/Ro mais ne présentant0 pas le motif
DM/PM
S
25 élevés
orzyme®
HEp-2000®. Tous ont été confirmés positifs en
de coloration
typique SSA/Ro car les niveaux
Vasculitis
S auto-anticorps (généralement 20
anticorps
anti-autoantigènes SSA/Ro par les méthodes
d’autres
des anticorps
Population
(Overautre
9,000auto-anticorps
Sera Tested): n’a
ELISANormal
et Western-Blot.
Aucun
anti-ADN ou anti-Sm/RNP) masquaient l’aspect SSA/Ro.
20-60 dans
Yearsces échantillons. 36 de ces échantilS
2 est observé,
été détecté
Par conséquent,
si l’aspect typique SSA/Ro
Years
S
3.5 mais
lons (7870-80
%) sont
positifs (image mouchetée) sur cellules
il confirme
la présence des anticorps SSA/Ro
HEp-2
non transfectées
et 46 (100 %)
positifs au P = Peripheral,
l’absence N
de=cet
aspect ne
permet
pas d’écarter leur
Abbreviations:
S = Speckled,
H =sont
Homogenous,
Nucleolar,
ACA
= anti-Centromere
éventuelle présence.
TABLEAU 1
Diagnostic
Lupus érythémateux disséminé
Polyarthrite rhumatoïde
Connectivité mixte (MCTD)
Sclérodermie généralisée évolutive - diffuse
Sclérodermie généralisée évolutive - CREST ACA
Arthrite rhumatoïde juvénile
Disséminée
Polyarticulaire
Pauciarticulaire B27+
DM/PM
Vascularite
Population saine
20-60 ans
70-80 ans
Motif
Ségrégation
%
Positif
M,P+H,H,P
M,H
M
M,N
ACA
93
40
99
85
93
M
M
M
M
14
13
0
25
20
M
M
2
3.5
Abréviations : M = Moucheté, H = Homogène, P = Périphérique, N = Nucléolaire, ACA = anti-Centromère
15
PROCÉDURE DE TEST ANA-Ro
COLORZYME® HEp-2000®
1.
RECONSTITUTION DU TAMPON (PBS)
8.
Dissoudre le contenu d’un sachet de tampon
dans un litre d’eau désionisée ou distillée. Le
tampon peut être couvert et conservé à 2-10 °C
pendant quatre semaines.
2.
puits avec 12 à 14 gouttes)
Retirer les lames une à une du tampon PBS et
les immerger 3 à 5 fois dans de l’eau désionisée
ou distillée. Tapoter la tranche de la lame sur du
papier absorbant ou des serviettes en papier pour
éliminer l’excès d’eau. Remettre immédiatement
la lame dans la chambre d’incubation et recouvrir complètement les puits de réactif immunoenzymatique. Commencer par placer une goutte
sur chaque puits. Recommencer l’opération pour
chaque lame. Le réactif immuno-enzymatique a
été titré de façon à compenser l’eau désionisée
ou distillée résiduelle restant sur la lame après le
rinçage.
REMARQUE : Il est important que les puits de la
lame ne se dessèchent pas pendant cette procédure sous peine d’altérer le substrat.
NE PAS SÉCHER LA LAME OU OUBLIER DE LA
RECOUVRIR DE RÉACTIF IMMUNO-ENZYMATIQUE
PENDANT PLUS DE 15 SECONDES.
RECONSTITUTION DU RÉACTIF COLORÉ
Dissoudre le contenu d’un sachet dans 150 ml
d’eau désionisée ou distillée. Bien mélanger
jusqu’à dissolution complète. Ce réactif coloré,
conservé dans un récipient fermé, est stable pendant 30 jours à température ambiante. Il peut être
réutilisé pendant 30 jours ou jusqu’à observation
d’un changement de couleur ou d’un précipité.
L’aspect trouble ou l’opalescence, si aucun
précipité n’est visible lors de la réutilisation, est
normal. En fonction de la fréquence d’utilisation,
150 ml de réactif coloré Colorzyme® peuvent être
utilisés avec vingt lames maximum.
3.
DILUTION DES ÉCHANTILLONS DES PATIENTS
Diluer les échantillons à 1:40 en ajoutant 0,05 ml
(50 µl) de sérum à 1,95 ml de PBS reconstitué.
Titrage semi-quantitatif : Procéder à des dilutions
doubles successives du ou des échantillons à
analyser (ex. : 1:80, 1:160, 1:320...1:2560) à l’aide
du PBS.
4.
9.
PRÉPARATION DES LAMES DE SUBSTRAT (20-25
RINÇAGE EN TAMPON PBS
Sortir les lames du plateau de l’incubateur et les
rincer rapidement avec le tampon PBS à l’aide
d’un flacon gicleur ou d’une pipette Pasteur ou
sérologique. Ne pas asperger le tampon directement sur les puits.
REMARQUE : Afin d’éviter toute contamination
croisée sur les lames à 13 puits, diriger le jet du
tampon PBS le long de la ligne médiane de la
lame, en l’inclinant d’abord vers les puits 1 à 5 et
puis vers les puits 6 à 10.
7.
10.
LAVAGE EN TAMPON PBS (10 minutes)
Laver la ou les lames pendant 10 minutes avec
du PBS dans une cuve à coloration ou une jarre
Coplin. Il est recommandé d’agiter légèrement
la cuve au moment de l’immersion et du retrait
de la lame ainsi qu’à mi-parcours. Ce lavage
peut être prolongé de 10 à 30 minutes sans que
les résultats des tests finaux n’en soient affectés.
Jeter la solution de lavage PBS après utilisation.
Pour obtenir des résultats optimums, changer le
tampon PBS à mi-parcours et utiliser un agitateur
magnétique.
Sortir les lames du plateau de l’incubateur et les
rincer rapidement avec du PBS. Ne pas asperger
le tampon directement sur les puits.
11.
LAVAGE EN TAMPON PBS (10 minutes)
Laver la ou les lames pendant 10 minutes avec
du PBS dans une cuve à coloration ou une jarre
Coplin. Il est recommandé d’agiter légèrement
la cuve au moment de l’immersion et du retrait
de la lame ainsi qu’à mi-parcours. Ce lavage
peut être prolongé de 10 à 30 minutes sans que
les résultats des tests finaux n’en soient affectés.
12.
INCUBATION DU RÉACTIF COLORÉ (30 minutes
à température ambiante, soit 18-24° C)
Retirer les lames une à une du tampon PBS et les
immerger 3 à 5 fois dans de l’eau désionisée ou
distillée puis tapoter la tranche de la lame sur
du papier absorbant ou des serviettes en papier
pour éliminer l’excès d’eau. Placer immédiatement les lames dans une jarre Coplin contenant
du réactif coloré activé et laisser incuber pendant
30 minutes.
13.
Sortir les lames une à une de la cuve à rainures
et en rincer chaque côté 4 à 5 secondes avec
du PBS. Ne pas asperger le tampon directement
sur les puits. Placer chaque lame rincée au PBS
dans une jarre Coplin remplie d’eau désionisée
ou distillée jusqu’à ce que toutes les lames soient
sorties du réactif coloré. Passer immédiatement à
l’étape 14.
INCUBATION DES LAMES (30 minutes ±5 minutes
Placer les lames dans une chambre humide
couverte (une boîte de Pétri avec des serviettes
en papier humidifiées conviendra). Mettre à
incuber, couvercle fermé, pendant 30 minutes (±5
minutes) à température ambiante (18-24° C).
6.
INCUBATION DES LAMES (30 minutes ±5 minutes
Placer le couvercle sur la chambre d’incubation
et laisser les lames incuber pendant 30 minutes
(±5 minutes) à température ambiante (18-24° C).
µl/puits)
Sortir les lames des sachets et placer les sérums
de contrôle sur les puits de contrôle comme suit :
retourner le flacon compte-gouttes du contrôle et
le presser légèrement jusqu’à ce qu’une goutte
apparaisse à l’extrémité de l’embout. Mettre
soigneusement la goutte en contact avec le puits
de contrôle approprié en évitant tout contact
direct de l’embout du compte-gouttes avec la
surface de la lame. Placer le contrôle positif sur le
puits marqué « + », le contrôle négatif sur le puits
marqué « - » et une goutte de tampon PBS sur le
puits marqué « PBS ». Ajouter 1 goutte (20-25 µl)
d’échantillon du patient dans les puits numérotés.
REMARQUE : Pour le test général, le contrôle positif
homogène est recommandé. Pour le titrage
semi-quantitatif, sélectionner le contrôle positif
illustrant l’image fluorescente la plus proche de
l’échantillon à analyser (ex. : pour un échantillon
patient induisant une image mouchetée lors du
test, utiliser le contrôle positif moucheté). Si le test
ANA-Ro HEp-2000® doit être utilisé pour la confirmation de la présence d’anticorps anti- SSA/Ro,
le contrôle positif SSA/Ro, référence catalogue
2035-Ro, doit être effectué au moins sur une lame
le jour de cette série de tests.
ATTENTION : LE CONTACT DIRECT DE L’EMBOUT DU
COMPTE-GOUTTES AVEC LA SURFACE DE LA LAME
PEUT ALTÉRER LE SUBSTRAT ANTIGÉNIQUE.
5.
RÉACTIF IMMUNO-ENZYMATIQUE (couvrir les
14.
MONTAGE DE LA LAMELLE COUVRE-OBJET
Retirer les lames une à une du tampon PBS et
les immerger 3 à 5 fois dans de l’eau désionisée
ou distillée. Tapoter la tranche de la lame sur du
papier absorbant ou des serviettes en papier pour
éliminer l’excès d’eau. NE PAS SÉCHER LA LAME
OU OUBLIER DE LA RECOUVRIR DE LA LAMELLE
COUVRE-OBJET PENDANT PLUS DE 15 SECONDES.
Ajouter 4 à 5 gouttes de milieu de montage
semi-permanent sur la ligne médiane de chaque
lame. Mettre soigneusement la lamelle couvreobjet en place en évitant la formation de bulles
d’air ; pour cela, abaisser doucement la lamelle
d’un côté de la lame vers l’autre.
REMARQUE : Un excès de milieu de montage sur
la lame peut entraîner un manque de résolution des cellules (image floue). Afin d’éliminer
l’excès de milieu de montage sur la lame, essuyer
soigneusement la lamelle couvre-objet avec du
papier absorbant ou un nettoyant optique tout
en évitant de déplacer la lamelle. Les lames
peuvent être lues immédiatement ou conservées
pendant une période prolongée entre 2 et 10 °C
sans perte de réactivité.
POUR L’ASSISTANCE TECHNIQUE :
+1 916-363-2649
ou messagerie électronique :
[email protected]
16
SISTEMA DI ANALISI DEGLI ANA-Ro COLORZYME®
HEp-2000®
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
RIEPILOGO E INFORMAZIONI DI BASE
USO PREVISTO: analisi enzimatica indiretta degli anticorpi per la determinazione semiquantitativa degli anticorpi antinucleari nel siero umano. Questo sistema di
analisi usa cellule HEp-2 transfette†, che consentono la
specifica identificazione di anticorpi contro l’antigene
SSA/Ro. Gli anticorpi contro l’ SSA/Ro possono mostrare
un disegno caratteristico nella colorazione delle cellule
transfette. Quando è presente questo pattern, viene
considerato come una prova che conferma la presenza di anticorpi anti- SSA/Ro.
L’assenza di questo pattern caratteristico non assicura la totale assenza di possibili anticorpi anti-SSA/Ro.
Questo sistema di analisi deve essere usato come
ausilio nella determinazione di anticorpi associati alla
malattia reumatica sistemica.
Anticorpo antinucleare (ANA) è un termine generico
usato per descrivere gli anticorpi contro varie nucleoproteine cellulari. I primi studi su questi anticorpi, con
l’uso di tecniche di immunofluorescenza, rivelarono
alcune specificità proteiche nucleari selezionate.(1)
A causa dell’alta correlazione dell’ANA positivo con il
lupus eritematoso sistemico (SLE), un ANA negativo fu
principalmente escluso dalla patologia.(2)
Sebbene anticorpi specifici del DNA continuino a
dimostrare un’elevata correlazione della patologia
con SLE,(3) è stato anche scoperto un certo numero di
macromolecole nucleari (4) e citoplasmatiche(5-7) associate ad altre patologie del tessuto connettivo.(8-10)
Alcuni di questi anticorpi sembrano avere un significato
diagnostico e/o prognostico nella sclerosi sistemica
progressiva,(11-12) nella patologia mista del connettivo,(13-15) nella sindrome di Sjögren,(16-17) nella
polimiosite(18) e/o nell’artrite reumatoide.(19) A causa
delle associazioni tra queste patologie, il test ANA è ora
riconosciuto come uno strumento di screening generale
per le malattie del tessuto connettivo.(20)
La sensibilità del test ANA varia a seconda del tipo di
substrato usato, delle procedure di fissaggio e dei tipi di
ANA presenti nei sieri. I substrati della coltura cellulare
in genere mostrano una maggiore sensibilità rispetto
alle sezioni di tessuto.(21-24) Il rilevamento di anticorpi
all’antigene SSA/Ro è particolarmente variabile. I tessuti
dei roditori non contengono livelli rilevabili di antigene
SSA/Ro(25) e la rilevazione di anticorpi anti-SSA/Ro in
substrati da coltura cellulare viene riportata con una
variazione nella sensibilità dal 50% al 90%.(26-27)
Il sistema di analisi ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme®
della Immuno Concepts con cellule epitelioidi umane
mitotiche* transfette (HEp-2) rappresenta una tecnica
avanzata di analisi immunoenzimatica per il rilevamento di ANA. È stato dimostrato che, nel rilevamento di
anticorpi nella sclerosi sistemica progressiva (PSS)(28), le
cellule HEp-2 con figure mitotiche hanno una maggiore
sensibilità e danno un pattern di riconoscimento più
nitido rispetto al classico substrato di rene di topo. Le
figure mitotiche agevolano il riconoscimento del pattern differenziale come pure il rilevamento di antigeni
nucleari non riportati precedentemente, presenti in
concentrazioni più elevate nelle cellule mitoticamente
attive.(29-31) Le cellule HEp-2 in questo sistema di
analisi sono state transfette con copie multiple della
specifica sequenza di DNA che trasporta le informazioni
per l’autoantigene SSA/Ro. Circa il 10-20% delle cellule
transfette sovraproduce questo antigene, quindi il
rilevamento di anticorpi diretti contro l’ SSA/Ro è più
coerente di quanto lo sia su cellule HEp-2 che non siano
state transfette. Gli anticorpi contro l’ SSA/Ro possono
mostrare un disegno caratteristico nella colorazione
delle cellule transfette. Quando è presente questo pattern, viene considerato come una prova che conferma
la presenza di anticorpi anti- SSA/Ro.
La negatività di un campione invece non garantisce la totale assenza di tali anticorpi.
† Le cellule transfette e la loro applicazione sono
protette dal brevetto statunitense 5,518,881 e da altri
brevetti statunitensi e stranieri in corso di registrazione.
*Mitosi è un termine usato per descrivere il processo di
suddivisione cellulare.
Per lo più si suddivide in sei fasi, ovvero interfase,
profase, metafase, anafase, telofase e citocinesi.
PRINCIPIO DEL TEST
Il sistema di analisi degli ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme®
della Immuno Concepts utilizza una tecnica di analisi
enzimatica indiretta degli anticorpi. I campioni diluiti
del paziente sono incubati con substrato antigene per
consentire lo specifico legame degli autoanticorpi ai
nuclei delle cellule. Se gli ANA sono presenti, si forma
un complesso stabile antigene-anticorpo. Dopo il
lavaggio per rimuovere anticorpi non specificamente
legati, il substrato è incubato con un anticorpo antiumano coniugato con HRP (Horseradish peroxidase,
perossidasi di rafano). Quando i risultati sono positivi, avviene la formazione di un complesso stabile in tre parti
composto dall’anticorpo antiumano coniugato con
HRP legato all’anticorpo antinucleare umano che è
legato all’antigene nucleare. Questo complesso viene
visualizzato incubando il vetrino in reagente colorato
contenente uno specifico substrato enzimatico. La
reazione tra l’anticorpo etichettato come enzimatico
e il substrato specifico dell’enzima origina una reazione
colorata, visibile mediante normale microscopia ottica
sul vetrino. Nei campioni positivi, i nuclei delle cellule
mostreranno una fluorescenza blu-viola con un pattern
di colorazione caratteristico della particolare distribuzione dell’antigene nucleare nelle cellule. Se il campione
è negativo per l’ANA, il nucleo non mostrerà un pattern
di colorazione nucleare chiaramente distinguibile. Il
citoplasma può mostrare una debole colorazione mentre la regione non cromosomica delle cellule mitotiche
può mostrare una colorazione più intensa.
COMPONENTI DEL SISTEMA (MATERIALI FORNITI)
Uso: tutti i componenti sono pronti per l’uso senza che
siano necessarie la suddivisione in aliquote o la ricostituzione (eccetto il tampone PBS e il reagente colorato
Colorzyme® che devono essere sciolti in acqua deionizzata o distillata prima dell’uso).
Conservazione: tutti i componenti possono essere
conservati alla temperatura
di 2-10°C. Dopo la ricostituzione, il reagente tampone
PBS deve essere conservato in contenitore chiuso refrigerato alla temperatura di 2-10°C.
Dopo la ricostituzione, il reagente colorato Colorzyme®
deve essere conservato in un contenitore chiuso a
temperatura ambiente per un massimo di 30 giorni. A
seconda della frequenza d’uso, è possibile utilizzare
fino a venti vetrini con 150 ml di reagente colorato
Colorzyme®.
Stabilità: tutti i componenti restano stabili per almeno 12
mesi dalla data di produzione. Non usare alcun componente oltre la data di scadenza.
REAGENTI REATTIVI
Vetrini del substrato: ‡ numero di catalogo 2007-Ro
(con sette pozzetti); 2013-Ro (con tredici pozzetti).
Vetrini per substrato ANA con sette o tredici pozzetti
che usano cellule HEp-2000® (con figure mitotiche)
coltivate e stabilizzate direttamente sui pozzetti per
analisi. Queste sono cellule HEp-2 che sono state
stabilmente transfette con l’autoantigene SSA/Ro.
L’esclusivo design a fossa del vetrino minimizza la
contaminazione incrociata dei pozzetti durante
l’analisi. I vetrini comprendono anche ulteriori pozzetti
di controllo positivo, negativo e PBS per favorire l’esatta
interpretazione dei risultati.
Controllo positivo SSA/Ro: numero di catalogo 2035-Ro.
Fiala contagocce pronta per l’uso contenente 1,0
ml di siero di controllo umano positivo con anticorpo
specifico per antigeni SSA/Ro. Questo siero mostra la
reazione con colorazione a chiazze sottili che è tipica
dell’anti- SSA/Ro visto sul substrato cellulare HEp-2000®
della Immuno Concepts. La produzione si trova in modo
predominante nel nucleo con colorazione nucleolare
prominente. Nelle cellule sovrapproduttrici può anche
essere vista una debole colorazione citoplasmatica. La
regione cromosomica delle cellule mitotiche mostra
una reazione a colorazione negativa. Questo reagente
contiene sodio azide allo 0,1% come conservante.
Controllo positivo omogeneo: numero di catalogo
2021. Fiala contagocce pronta all’uso contenente 1,0
specifico per il DNA e/o antigeni nucleari DNP. Questo
siero dimostra una reazione a colorazione omogenea
sul substrato cellulare HEp-2000® della Immuno Concepts. La regione cromosomica delle cellule mitotiche
mostra la stessa reazione alla colorazione omogenea.
Questo reagente contiene sodio azide allo 0,1% come
17
conservante.
Controllo positivo a chiazze: numero di catalogo 2022.
specifico per antigeni nucleari Sm e/o RNP. Questo siero
mostra una delle reazioni con colorazione a chiazze più
comunemente viste sul substrato cellulare HEp-2000®
della Immuno Concepts. La regione cromosomica delle
cellule mitotiche mostra una reazione a colorazione
negativa. Questo reagente contiene sodio azide allo
0,1% come conservante.
Controllo positivo nucleolare: numero di catalogo 2023.
specifico per antigeni nucleolari. Questo siero dimostra
una reazione con colorazione nucleolare sul substrato
cellulare HEp-2000® della Immuno Concepts. Questo
reagente contiene sodio azide allo 0,1% come conservante.
Controllo positivo centromero: numero di catalogo
2025. Fiala contagocce pronta per l’uso contenente
0,5 ml di siero di controllo umano positivo con anticorpo
specifico per centromeri cromosomici (cinetocore).
Questo siero dimostra una discreta reazione con
colorazione a chiazze sul substrato cellulare HEp-2000®
della Immuno Concepts. La regione cromosomica delle
cellule mitotiche mostra la stessa discreta reazione con
colorazione a chiazze. Questo reagente contiene sodio
azide allo 0,1% come conservante.
Siero di controllo titolabile: numero di catalogo 2026.
Fiala pronta per l’uso contenente 1,0 ml di siero di controllo umano positivo da trattare come campione del
paziente, non diluito. Questo reagente contiene sodio
azide allo 0,1% come conservante.
di 2-10°C per massimo quattro settimane o fino a che
compaiano segni di contaminazione o altri cambiamenti visibili.
Mezzo di fissaggio semipermanente: numero di catalogo 1111. Fiala contagocce pronta per l’uso contenente
5,0 ml di mezzo di fissaggio a base di glicerolo, pH 9,1
± 0,2. Questo reagente contiene sodio azide allo 0,1%
come conservante.
Vetrini coprioggetto: numero di catalogo 1041. Ciascuna confezione contiene dieci vetrini coprioggetto 24
x 60 mm N. 1.
ALTRI MATERIALI NECESSARI (MA NON FORNITI)
Pipette volumetriche per l’erogazione di volumi da
20-25 µl.
Vaschette Coplin o capsule di colorazione.
Flacone morbido o pipette di Pasteur.
Pipette sierologiche.
Contenitori con tappo a vite da un litro (per tampone PBS).
Contenitori chiusi per la conservazione del reagente
colorato Colorzyme®.
Acqua deionizzata o distillata.
Provette per preparare le diluizioni dei sieri.
Camera per incubazione.
Carta bibula o assorbente.
Guanti a perdere in lattice.
Timer da laboratorio.
Microscopio luminoso capace di ingrandimenti da
200X e 400X.
PRECAUZIONI
Siero di controllo negativo: numero di catalogo 2031.
Fiala contagocce pronta per l’uso contenente 1,0 ml
di siero di controllo umano negativo. Sebbene il siero di
controllo negativo possa dimostrare una leggera colorazione del citoplasma con colorazione più brillante
della regione non cromosomica della cellula mitotica,
esso dimostra un pattern non distinguibile di colorazione
nucleare. Questo reagente contiene sodio azide allo
0,1% come conservante.
Reagente anticorpo enzimatico: numero di catalogo
4009-Ro (9,0 ml), 4075-Ro (23 ml). Anti-IgG umana di
capra (catene pesanti e leggere) coniugata con HRP.
Il reagente è pronto all’uso e si presenta in flaconi
contagocce di precisione con 9,0 ml per ogni 10 vetrini
in kit di analisi completi.
Reagente colorato: * numero di catalogo 4066. Polvere
di substrato enzimatico specifico dell’HRP, contenente
4 cloro 1-naftolo. Ogni confezione contiene polvere
per preparare 150 ml di reagente colorato Colorzyme®
autoattivante.
Preparazione: sciogliere il contenuto di una busta in
un litro di acqua deionizzata o distillata. Mescolare
bene fino al completo dissolvimento. Questo reagente
colorato è stabile per 30 giorni a temperatura ambiente
in un contenitore chiuso. Questo reagente colorato
può essere riutilizzato fino a 30 giorni o fino a che non è
visibile un cambiamento di colore o un precipitato. Torbidezza o opalescenza, senza alcun precipitato visibile
al momento del riutilizzo, sono normali. A seconda della
frequenza d’uso, è possibile utilizzare fino a venti vetrini
con 150 ml di reagente colorato Colorzyme®.
‡ Questo vetrino è protetto da uno o più dei seguenti
brevetti statunitensi e stranieri: 4,387,972; D-274261;
0727046; D-273261; 5,518,881; brevetto canadese
1,171,302 ed altri brevetti in corso di registrazione.
* Questo materiale è protetto da uno o più dei seguenti
brevetti statunitensi e stranieri: 4615972; brevetto
canadese 1231633; brevetto italiano 1177110 ed altri
brevetti in corso di registrazione.
REAGENTI NON REATTIVI
Tampone impregnato di polvere PBS: numero di
catalogo 1011. Polvere salina tamponata al fosfato
(0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Ciascuna busta contiene polvere
tamponata sufficiente a fare 1 litro. (Nei kit di analisi
completi, viene fornita una busta di polvere tamponata
per cinque vetrini).
Preparazione: sciogliere una bustina di polvere tamponata in un (1) litro di acqua deionizzata o distillata,
coprire, e conservare in frigorifero ad una temperatura
18
1. Tutti i materiali di origine umana usati per questo
prodotto sono stati analizzati e trovati negativi (non
ripetutamente reattivi) per gli anticorpi del virus
dell’immunodeficienza umana tipo 1 (HIV-1), del
virus della immunodeficienza umana tipo 2 (HIV-2),
del virus dell’epatite C (HCV) e per l’antigene di
superficie dell’epatite B (HBsAg) con metodi approvati dalla FDA. Nessun metodo di analisi può garantire con completa sicurezza che siano assenti HIV-1,
HIV-2, epatite C, epatite B o altri agenti infettivi.
Quindi, tutti i componenti del kit vanno maneggiati
secondo le stesse modalità utilizzate per i materiali
potenzialmente infettivi.
2. Tutti i campioni dei pazienti devono essere maneggiati osservando le precauzioni di sicurezza biologica di livello 2, come raccomandato per ogni siero
umano potenzialmente infettivo o per campioni di
sangue nel manuale pubblicato per i CDC/NIHM
(Centers for Disease Control/National Institutes of
Health Manual, Centri per il Controllo delle Infezioni/
Istituti Nazionali per la Sanità): Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Edizione 1984.
3. La diluizione di componenti o la sostituzione di componenti diversi da quelli forniti in questo sistema può
dare risultati non coerenti.
4. Il sodio azide (0,1%) viene usato come conservante.
Il sodio azide può reagire nelle tubature di piombo
o rame formando sali metallici di azide esplosivi.
Quando si eliminano i reagenti, far scorrere grandi
quantità di acqua del rubinetto per evitare la
formazione di potenziali residui nelle tubature. Il
sodio azide è un veleno e può essere tossico se
ingerito.
5. Questo kit è per uso diagnostico in vitro.
6. Nel caso debbano essere usati sieri emolizzati o
lipemici, per risultati ottimali, inattivare a caldo i sieri
per 30 minuti a 56°C. Non usare sieri contaminati
microbicamente.
7. È stato dimostrato che possono presentarsi ANA
positivi falsi a causa del legame della frazione
C1q al DNA, indipendentemente dal substrato
usato.(32) Per eliminare la potenziale interferenza
della frazione C1q, inattivare regolarmente a caldo
tutti i sieri dei pazienti a 56°C per 30 minuti prima del
test.
8. Il siero di controllo titolabile è destinato ad essere
usato nel monitoraggio da lotto a lotto e nella
riproducibilità interfase. Non è destinato alla misurazione della sensibilità complessiva o della specificità
del dosaggio.
9. Non fumare, non mangiare o non bere nelle aree in
cui sono maneggiati i campioni o i reagenti del kit.
10. Evitare sempre gli spruzzi e la formazione di aerosol.
11. Tempi e temperature di incubazione diversi da
quelli specificati possono dare risultati errati.
12. La contaminazione incrociata dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi.
13. Prima dell’uso, la vetreria di laboratorio riutilizzabile
deve essere lavata e sciacquata a fondo e completamente liberata da ogni residuo di detergente.
Prima dell’uso, tutta la vetreria di laboratorio deve
essere pulita e asciutta.
14. Prima dell’uso, portare tutti i reagenti, i vetrini e i
campioni a temperatura ambiente (18-24°C).
15. Indossare guanti a perdere in lattice quando si
maneggiano campioni e reagenti e dopo lavare
accuratamente le mani.
16. La contaminazione microbica dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi.
17. Non pipettare mai con la bocca ed evitare il
contatto dei reagenti e dei campioni con la cute e
le mucose. In caso di contatto, lavare abbondantemente con un sapone germicida e acqua.
18. Il reagente colorato può essere riutilizzato fino a 30
giorni o fino a che non è visibile un cambiamento di
colore o un precipitato. Torbidezza o opalescenza,
senza alcun precipitato visibile al momento del
riutilizzo, sono normali. A seconda della frequenza
d’uso, è possibile utilizzare fino a venti vetrini con
150 ml di reagente colorato Colorzyme®.
RACCOLTA DI CAMPIONI
Raccolta: il siero è il campione preferito. Devono
essere prelevati con tecnica asettica circa 5 ml di
sangue intero per venopuntura usando una provetta
di raccolta sterile a vuoto o un altro sistema di raccolta
adatto. Lasciare che il sangue si coaguli a temperatura
ambiente (18-24°C). Non appena possibile, il siero deve
essere separato dal coagulo per centrifugazione in
modo da minimizzare l’emolisi.
Sostanze interferenti: non vanno usati sieri che mostrano
un alto grado di emolisi, ittero, lipemia o crescita microbica, perché queste condizioni possono provocare
risultati atipici. Campioni contenenti sostanze particellari visibili vanno chiariti per centrifugazione prima
dell’analisi.
Conservazione: i sieri possono essere conservati a
2-10°C fino ad una settimana. Se l’analisi viene ulteriormente rimandata, i sieri devono essere conservati
congelati a -20°C o a una temperatura inferiore. Il siero
non deve essere conservato in frigoriferi autosbrinanti
o in freezer.
ATTENZIONE: il ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni dei pazienti può dare origine a falsi
risultati positivi o a falsi risultati negativi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
I controlli positivo, negativo e PBS devono essere
analizzati nei pozzetti previsti per il controllo qualità su
ciascun vetrino. Il controllo positivo dovrebbe mostrare
una colorazione luminosa blu scuro-viola nei nuclei
delle cellule, con un pattern chiaramente distinguibile,
caratteristico del siero di controllo usato. Nel pozzetto
di controllo positivo il citoplasma può colorarsi di blu
chiaro-viola. Il controllo negativo dovrebbe mostrare
una colorazione blu chiaro-viola sia del citoplasma
che del nucleo, ma senza alcun pattern distinguibile
della colorazione nucleare. Il controllo PBS si usa per
osservare la colorazione non specifica del reagente
anticorpo enzimatico, e non dovrebbe mostrare alcuna
colorazione blu. Se i controlli non appaiono come
descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto. Se si
deve usare l’analisi ANA-Ro HEp-2000® per confermare
la presenza di anticorpi anti- SSA/Ro, il controllo positivo
SSA/Ro, numero di catalogo 2035-Ro, deve essere
eseguito su almeno un vetrino nella sessione di lavoro
di quel giorno.
CONTROLLO TITOLABILE OPZIONALE
Nel leggere i titoli, molti laboratori iniziano a leggere dal
pozzetto contenente il campione più diluito e leggono
“all’indietro” fino alla diluizione 1:40. Il primo pozzetto
in cui è visibile un pattern di colorazione nucleare
chiaramente distinguibile è il punto di equivalenza della
reazione. Raccomandiamo questa tecnica per determinare i punti di equivalenza della reazione.
Il titolo medio e la gamma del titolo (± una diluizione
su ciascun lato della media) determinati sono stati
stabiliti nel nostro laboratorio e sono indicati come
guida. Questo controllo è fornito per consentire a
ciascun laboratorio di valutare la riproducibilità (di
precisione) del proprio test ANA. Dal momento che
questo controllo non è destinato ad essere un indicatore dell’accuratezza del titolo, ciascun laboratorio
deve stabilire il proprio punto medio di equivalenza
della reazione per questo campione e deve usare tali
informazioni per valutare la riproducibilità interfase (di
precisione).
Attraverso analisi multiple di questo controllo titolabile,
usando il sistema di analisi degli ANA-Ro HEp-2000®
Colorzyme® della Immuno Concepts, è stato stabilito
un valore medio del titolo per ciascun numero di lotto. Il
numero di lotto, il titolo medio e la gamma del titolo (±
una duplice diluizione su ciascun lato della media) sono
indicati sull’etichetta della fiala e vanno usati come
guida della performance del sistema di analisi.
È importante che l’intensità della colorazione non
venga confusa con la presenza o l’assenza di anticorpi
antinucleari. Il fattore chiave da considerare nel
determinare se una data diluizione del siero è positiva
è l’aspetto del pattern chiaramente distinguibile, senza
tener conto dell’intensità della colorazione.
Questo controllo titolabile mostrerà il tipico pattern a
chiazze associato all’anticorpo RNP. Può essere presente, però, anche un secondo pattern di NSp I (parecchie
chiazze discrete nel nucleo delle cellule interfase), che
comunque è il tipico pattern a chiazze RNP da usare
per leggere il punto di equivalenza della reazione.
I valori ottenuti nel nostro laboratorio possono essere
diversi dai vostri. Di seguito sono indicati alcuni tra i fattori che possono influenzare i risultati.
1. Il giusto allineamento del percorso ottico del
microscopio. Per istruzioni, consultare il manuale del
proprio microscopio.
2. L’apertura numerica dell’obiettivo. L’apertura numerica è correlata alla capacità di captazione della luce ed alla risoluzione dell’obiettivo. L’apertura
numerica è stampata sul lato dell’obiettivo.
3. La precisione e l’accuratezza della tecnica di diluizione, dell’apparecchiatura e della performance
delle procedure di analisi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL PAZIENTE
Per screening positivo/negativo si raccomanda un
ingrandimento di 200X totali, mentre per il riconoscimento del pattern e per visualizzare le cellule mitotiche
si raccomanda un ingrandimento di 400X totali.
Negativo: un siero si considera negativo per gli anticorpi antinucleari se la colorazione nucleare è minore
o uguale al pozzetto di controllo negativo con nessun
pattern chiaramente distinguibile. Il citoplasma può
mostrare una debole colorazione con colorazione più
brillante della regione non cromosomica delle cellule
mitotiche, ma senza alcun pattern nucleare chiaramente distinguibile.
Positivo: un siero si considera positivo se il nucleo mostra
un pattern di colorazione chiaramente distinguibile
nella maggior parte delle cellule interfase.
SSA/Ro: un siero si considera positivo per gli anticorpi
SSA/Ro se il 10-20% dei nuclei interfase mostra il caratteristico pattern di colorazione SSA/Ro che appare
come caratteristico a chiazze con un pattern di
colorazione prominente dei nucleoli. Queste sono le
cellule transfette sovrapproduttrici. Il restante 80-90% dei
nuclei interfase può mostrare o meno una colorazione
a chiazze sottili del nucleo con o senza colorazione dei
nucleoli.
Titoli: nel leggere i titoli, molti laboratori iniziano a leggere dal pozzetto contenente il campione più diluito
e leggono “all’indietro” fino alla diluizione 1:40. Il primo
pozzetto in cui è visibile un pattern chiaramente distinguibile è il punto di equivalenza della reazione. Raccomandiamo questa tecnica per determinare i punti di
equivalenza della reazione. È importante che l’intensità
della colorazione non venga confusa con la presenza
o l’assenza di anticorpi antinucleari. Il fattore chiave
da considerare nel determinare se una data diluizione
del siero è positiva è l’aspetto del pattern chiaramente
distinguibile, indipendentemente dall’intensità della
colorazione. A causa della accresciuta concentrazione
di antigene SSA/Ro nelle cellule sovrapprodutttrici,
non è insolito vedere la colorazione di queste cellule in
titoli molto alti. Il significato clinico di questi titoli alti è
sconosciuto.
Attenzione: alcuni sieri possono mostrare una colorazione nucleare e citoplasmatica senza alcun pattern
nucleare apparente. Questo fenomeno in genere è
dovuto agli anticorpi eterofili e deve essere riportato
come negativo.(33)
INTENSITà DELLA COLORAZIONE ENZIMATICA
Il grado di intensità della colorazione non ha valore
clinico dimostrato e il suo valore si limita ad essere indicatore del titolo.(34) Per semplificare l’interpretazione,
registrare i risultati dello screening come fortemente
19
positivi o positivi, e titolare di conseguenza.
sistemica progressiva.(28) Le chiazze nucleari sono
molto discrete e in genere in qualche modo multiple
di 46 (in genere 23-46 chiazze per nucleo). Poiché i
centromeri
sono restringimenti in cui le fibre del fuso si
��
fissano ai cromosomi, le cellule mitotiche mostreranno
la stessa reazione a chiazze nella regione cromosomica.(12)
Sinonimi: ACA; a chiazze discrete.
Antigeni nucleari: centromero cromosomico (cinetocoro).
Associazione con patologie: fortemente indicativo
della sindrome CREST*, variante della sclerosi
sistemica progressiva.(28)
Reazione fortemente positiva: colorazione blu-viola
da scura
a molto scura, profilo cellulare netto, pattern
��
nucleare ben definito.
Reazione positiva: colorazione blu sbiadita o smorzata
con maggiore variabilità di colorazione tra le cellule;
il profilo cellulare può essere meno definito in alcune
cellule con una maggioranza di cellule che ancora
mostrano un pattern della colorazione chiaramente
distinguibile.
NOTA: poiché le cellule sono coltivate direttamente
sulla superficie del vetrino, non tutte sono nella stessa
��
��
fase
del ciclo cellulare. Non è insolito
vedere diverse
��
intensità di colorazione
tra le cellule��
dovute alle differenze nella concentrazione e nella posizione di diversi
antigeni durante il ciclo cellulare.
��
RIPORTO DEI RISULTATI
Screening: i risultati vanno riportati come fortemente
positivi o positivi alla diluizione 1:40 e va riportato il pattern della colorazione nucleare.
Titoli: i risultati vanno riportati come ultima diluizione del
siero in cui si vede un pattern chiaramente distinguibile. I risultati con una forte reazione alla diluizione di
1:2560 vanno riportati come maggiori di 1:2560. Titoli
�� considerati
da 1:40��
a 1:80 sono
da 1:160 a 1:
��bassi;
��
320 sono
considerati medi e da
1:640 e maggiori sono
��
��
considerati alti.
RILEVAMENTO
�� DEL PATTERN
*CREST è una forma di PSS con calcinosi prominente,
��
��
come pure
di fenomeno di Raynaud, disfunzione
esofagea, sclerodattilia ��
e teleangectasia.
��
SSA/Ro: caratteristico
pattern a chiazze con colora��
zione prominente dei nucleoli nel 10-20% dei nuclei
interfase. Queste sono le cellule transfette sovrapproduttrici. Il restante 80-90% dei nuclei interfase può
mostrare o meno una colorazione a chiazze sottili del
nucleo con o senza colorazione dei nucleoli. La regione
non cromosomica delle cellule mitotiche metafase
mostra colorazione, mentre la regione cromosomica è
negativa.
Antigeni nucleari: SSA/Ro (60kD).
Associazione con patologie: rilevata nel 60-70% dei
pazienti con sindrome di Sjögren primaria, nel 3040% di��
pazienti��
con SLE e in più del
di pazienti
��95%
��
con��
lupus cutaneo sub-acuto.(38)
��
��
Omogeneo: una colorazione del nucleo uniforme, con
o senza mascheramento apparente dei nucleoli. La
regione cromosomica delle cellule mitotiche metafase
è chiaramente positiva con una intensità di colorazione
uniforme o periferica maggiore o uguale ai nuclei
interfase.
Sinonimi: diffuso; uniforme.
Antigeni nucleari: dsDNA; nDNA; DNP; istone.
Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono
SLE (Systemic Lupus Erythematosus, lupus eritema��
��
toso
sistemico).
��
Titoli
bassi suggeriscono SLE o altre
patologie del tes��
suto connettivo.(35)
Periferico:
una colorazione uniforme, principalmente
��
intorno alle regione esterna del nucleo con colorazione più debole verso il centro del nucleo. La regione
cromosomica delle cellule mitotiche metafase è
chiaramente positiva con una intensità di colorazione
uniforme o periferica maggiore o uguale ai nuclei
interfase.
Sinonimi: bordato, scabro, membranoso.
Antigeni nucleari: dsDNA, ssDNA, nDNA; DNP; istone.
SLE (Systemic Lupus Erythematosus, lupus eritematoso sistemico).
��
Titoli bassi
suggeriscono SLE o��
altre patologie del tes��
��
suto connettivo.(35)
A chiazze: una colorazione grossolana o finemente
��
granulare del nucleo in genere senza colorazione dei
nucleoli. La regione non cromosomica delle cellule mitotiche metafase mostra colorazione, mentre la regione
cromosomica è negativa alla colorazione.
Antigeni nucleari: Sm; RNP; Scl-70; SS-B; e altri sistemi
antigeni/anticorpo non ancora caratterizzati.
SLE (antigene Sm), malattia mista del tessuto connettivo (antigene RNP), sclerodermia (antigene
Scl-70) o complesso sindrome di Sjögren-sicca
(antigene SSA/Ro o SS-B). Titoli bassi possono
��
suggerire SLE o altre patologie
del tessuto con��
nettivo.(36)
��
��
Nucleolare: grande colorazione a chiazze grossolana
all’interno
del nucleo, in genere meno di 6 per cellula,
��
con o senza chiazze sottili occasionali in numero di 5-10.
La regione non cromosomica delle cellule mitotiche
metafase mostra una forte colorazione, mentre la
regione cromosomica può mostrare una colorazione
tenue. Cellule anafase e telofase possono mostrare una
colorazione simile ai nuclei interfase.
Antigeni nucleari: in genere chiamati 4-6s RNA e altri
antigeni nucleari come fibrillarina, RNA polimerasi
I, NOR 90 e PM/Scl.
Associazione con patologie: titoli alti prevalenti nella
sclerodermia e nella sindrome di Sjögren.(37)
��
��
��
�� fortemente
Centromero: un pattern a chiazze discreto
indicativo della sindrome CREST* variante della sclerosi
20
��
��
��
��
CELLULE MITOTICHE
��
RILEVAMENTO
Le cellule mitotiche dovrebbero essere visibili su ogni
campo se visualizzate con ingrandimento 200X o
inferiore. Per verificare se una cellula è in mitosi, visualizzare con ingrandimento 400X. Le cellule mitotiche
mostrano una caratteristica forma cellulare rotonda
senza alcuna membrana nucleare rilevabile. La regione
cromosomica delle cellule mitotiche in genere mostra
una forma irregolare all’interno della cellula dovuta
alla mancanza di membrana nucleare ed un estremo
restringimento dei cromosomi.
��
��
Sieri positivi per
DNA e/o DNP e/o istone
(come il
��
��
controllo positivo omogeneo della Immuno Concepts)
mostreranno una colorazione brillante della regione
��
cromosomica
di queste cellule. In campioni negativi
per DNA e/o DNP e/o istone (come il controllo positivo
a chiazze della Immuno Concepts), le cellule mitotiche
non mostreranno una colorazione cromosomica e
saranno difficili da vedere.
USO DELLE CELLULE MITOTICHE
Distinzione tra anticorpi a chiazze ed omogenei: il pattern di colorazione a chiazze sottili è talvolta difficile da
differenziare da una colorazione omogenea. Se il pattern è omogeneo,
avverrà una colorazione uniforme
��
��
dei cromosomi delle cellule mitotiche. Se il pattern
��
��
è proprio a chiazze, la regione fuori dai cromosomi
mostrerà una sottile reazione a chiazze.
��
NOTA: se si presenta una chiazzatura sottile dell’intera
cellula mitotica con colorazione uniforme della regione
cromosomica, è molto probabile che siano presenti
due o più anticorpi. Riportare la diluizione dello screening come a chiazze/omogenea e titolare ciascun
anticorpo al punto di equivalenza.
Anticorpo della membrana periferica contro anticorpo
della membrana nucleare: un anticorpo che mostra un
pattern periferico che in genere si associa con antigeni
nucleari DNA/DNP. Titoli alti di questi anticorpi suggeris��
��
cono SLE. In substrati
che non comprendono
cellule
mitotiche, il pattern periferico
�� può essere difficile
�� da
distinguere dall’anticorpo della membrana nucleare.
Usando le cellule mitotiche della Immuno Concepts,
questi pattern possono essere differenziati, perché la
regione cromosomica delle cellule mitotiche verrà
colorata intensamente in un pattern periferico senza
però essere colorata dall’anticorpo della membrana
nucleare. Questa distinzione è clinicamente importante
perché l’anticorpo della membrana nucleare non ha
specificità DNA/DNP e non è associata all’SLE.(39)
Anticorpo Anti-Centromero (ACA) contro anticorpo
atipico a chiazze somigliante al centromero: per verificare l’anticorpo anti-centromero la regione cromosomica delle cellule mitotiche dovrebbe avere un colore
brillante con chiazze discrete. Se la regione cromosomica non si colora, l’anticorpo non è anti-centromero e
va riportato come “a chiazze atipico”.(40)
regione cromosomica delle cellule mitotiche metafase.
Gli anticorpi contro l’antigene PCNA (Proliferating Cell
Nuclear Antigen, Antigene nucleare delle cellule aggressive) mostrano una chiazzatura variabile grossolana
e sottile nel 30-50% dei nuclei interfase.
COLORAZIONE CITOPLASMATICA
Sebbene gli anticorpi degli antigeni citoplasmatici non
siano comunemente associati a patologie del tessuto
connettivo, questi anticorpi possono essere rilevati
usando substrati di coltura di cellule epiteliali.(41) Gli anticorpi mitocondriali e del muscolo liscio sono i due anticorpi rilevati più di frequente e sono in genere associati
a mononucleosi, epatite cronica attiva e patologie al
fegato.(42, 43) Usando il substrato cellulare HEp-2, è
stato anche dimostrato l’anticorpo del muscolo liscio in
pazienti con verruche.(44)
Anticorpo anti-micondriale (AMA): chiazze discrete
concentrate nella regione perinucleare della cellula ed
estese in bassa densità nelle regioni esterne del citoplasma. Vanno distinte dall’anticorpo anti-Golgi, che in
genere colora solo un lato della regione perinucleare e
dall’anticorpo anti-ribosomico che mostra chiazze più
sottili con un aspetto filiforme in linea con la posizione
del reticolo endoplasmatico all’interno della cellula.
SSA/Ro
NOTA: le chiazze perinucleari possono essere molto
facilmente distinguibili dalla colorazione nucleare
periferica notando che le chiazze mitocondriali
formano una colorazione a chiazze ininterrotta intorno
alla parte esterna della membrana nucleare mentre i
sieri periferici formano una colorazione uniforme e liscia
all’interno della membrana nucleare.
RIPORTARE I SIERI COME NEGATIVI PER GLI ANTICORPI
ANTINUCLEARI E VERIFICARE I POSITIVI PER L’ANTICORPO
ANTIMITOCONDRIALE SU SPECIFICO SUBSTRATO AMA.
Nucleolar
Anticorpo anti-muscolo liscio (ASMA): colorazione fibrosa molto sottile sull’intero citoplasma delle cellule con
aspetto a “tela di ragno”. A differenza dell’anticorpo
mitocondriale, la colorazione dell’anticorpo del muscolo liscio è uniforme in tutto il citoplasma e può anche
estendersi al di sopra del nucleo. Le cellule mitotiche
in genere mostrano grandi chiazze discrete al di fuori
della regione cromosomica. È stato dimostrato che
l’anticorpo del muscolo liscio ha un’alta specificità
dell’actina.(45-46)
RIPORTARE I SIERI COME NEGATIVI PER GLI ANTICORPI
ANTINUCLEARI E VERIFICARE I POSITIVI PER L’ANTICORPO
ANTI-MUSCOLO LISCIO SU SPECIFICO SUBSTRATO ASMA.
LIMITI DEL TEST
1. Le diagnosi non possono essere fatte solo sulla base
del rilevamento dell’anticorpo antinucleare. Il medico deve interpretare questi risultati confrontandoli
con l’anamnesi e i sintomi del paziente, i dati fisici e
altre procedure diagnostiche.
2. La cura non va iniziata sulla sola base di un test positivo per gli anticorpi antinucleari. Prima di iniziare
qualunque trattamento devono essere considerate
indicazioni cliniche, altri risultati di laboratorio e
l’impressione clinica del medico.
3. Certi farmaci, tra cui la procainamide e la idralazina, possono indurre una patologia del tipo lupus
eritematoso.(47) Pazienti con lupus eritematoso
indotto da farmaci possono mostrare ANA positivi
omogenei o omogenei/periferici comunemente
diretti contro gli istoni nucleari.(48)
4. Una piccola percentuale di pazienti con SLE può
non dimostrare degli ANA per mezzo di immunoenzima indiretto anche se può mostrare ANA mediante
altre tecniche.(49)
5. Sebbene un ANA con titolo alto possa essere
fortemente indicativo di una malattia del tessuto
connettivo, ciò non deve essere considerato come
diagnostico ma esaminato piuttosto come parte
della complessiva storia clinica del paziente.
6. I pattern della colorazione spesso cambiano con
la progressiva titolazione dei sieri. Generalmente,
questo fenomeno è dovuto alla presenza di più di
un anticorpo nucleare.
7. Gli ANA positivi sono osservabili anche in una piccola percentuale di pazienti con malattie infettive
e/o neoplastiche.(9)
8. Gli anticorpi contro l’ SSA/Ro possono mostrare un
pattern caratteristico nella colorazione delle cellule
transfette HEp-2000®. Quando è presente questo
pattern, viene considerato come una prova che
conferma la presenza di anticorpi anti- SSA/Ro.
L’assenza di questo particolare pattern non esclude
l’eventuale presenza di anticorpi anti- SSA/Ro.
PCNA
Scl-70
SSA/Ro contro pattern che possono somigliare alla
colorazione SSA/Ro: la caratteristica colorazione
SSA/Ro è vista come un pattern brillante a chiazze con
colorazione prominente dei nucleoli nel 10-20% dei nuclei interfase. Il restante 80-90% dei nuclei interfase può
mostrare o meno una colorazione a chiazze sottili del
nucleo con o senza colorazione dei nucleoli. La regione
cromosomica delle cellule mitotiche metafase non
mostra colorazione. Il pattern nucleolare può essere
differenziato dalla grande colorazione a chiazze grossolane in tutti i nuclei, in genere meno di 6 per cellula. Il
disegno Scl-70 mostra una sottile colorazione a chiazze
e colorazione nucleolare in tutti i nuclei interfase della
21
9. A causa della sovrapproduzione dell’antigene SSA/
Ro nelle cellule HEp-2000®, campioni che contengono anticorpi anti- SSA/Ro mostrano valori dei titoli
più alti su queste cellule rispetto ai valori ottenuti
su cellule HEp-2 non transfette. Poiché nessun altro
autoantigene nelle cellule HEp-2000® è influenzato
dal processo di transfezione, i sieri con altre specificità auto-anticorpi non mostrano una significativa
differenza di titolo tra la linea cellulare transfetta
HEp-2000® e le cellule HEp-2 non transfette.
VALORI ATTESI
In un grande centro medico universitario, usando il substrato ANA cellulare HEp-2, sono stati generati i seguenti
dati in un periodo di due anni.(50) Tabella 1.
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI
rilevati in 110 campioni. Nel totale dei 230 campioni,
333 pattern della colorazione sono risultati identici su
entrambi i substrati. Ventinove campioni mostravano
il caratteristico pattern della colorazione “ SSA/Ro” sul
sistema di analisi ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000®. Ventitre di questi campioni mostravano pattern a chiazze
sulle cellule HEp-2 non transfette. I sei campioni discrepanti (positivi su HEp-2000®, ma negativi su cellule HEp-2
non transfette) avevano tutti anticorpi SSA/Ro, come
dimostrato dal caratteristico pattern della colorazione “
SSA/Ro”, dai test ELISA e dalla conferma della tecnica
Western blot.
CONFRONTO DEI TITOLI
A causa della sovrapproduzione dell’antigene SSA/Ro
nelle cellule HEp-2000®, campioni che contengono
anticorpi anti- SSA/Ro mostrano valori dei titoli più alti
su queste cellule rispetto ai valori ottenuti su cellule
HEp-2 non transfette. Poiché nessun altro autoantigene
nelle cellule HEp-2000® è influenzato dal processo di
transfezione, i sieri con altre specificità auto-anticorpi
non mostrano una significativa differenza di titolo tra la
lineaPattern
cellulare transfetta HEp-2000® e le%cellule HEp-2
Positive
non Segregation
transfette.
CAMPIONI NORMALI
Usando sistemi di analisi disponibili in commercio, e
sistemi di analisi con cellule HEp-2 non transfette e
sistema di analisi degli ANA-Ro Colorzyme® HEp-2000®,
sonoDiagnosis
stati testati in parallelo sieri di 500 donatori di
sangue sani, 242 femmine e 258 maschi, nessuno dei
Population
qualiAbnormal
aveva una
storia nota di patologia reumatica. In
RIPRODUCIBILITÀ DEI TITOLI
(Over
4,500 36
Sera
Tested):(7,2%) hanno dimostrato
questa
gruppo,
campioni
Dieci campioni scelti da controlli CDC (Cell Division
S,P+H,H,P
93sieri ben
Systemicantinucleari
lupus erythematosus
test anticorpo
positivi ad una diluizione
Cycle,
ciclo di divisione cellulare) ed altri
arthritis
S,H
di sieroRheumatoid
di 1:40. Per 34
campioni positivi su 36 i pattern
caratterizzati,
sono stati elaborati su tre 40
diversi numeri
tissue disease
S di vetrini HEp-2000® in tre occasioni
99 diverse. In
Mixed connective
della colorazione
erano identici
sui due substrati. I due
di lotto
systemicdifferenze
sclerosis-diffuse
S,Ncaso un campione negativo ha 85
Progressive
campioni
che mostravano
erano entrambi di nessun
mostrato risultati
sclerosis-CREST
ACAPer tutti i campioni analizzati, tutti
93i valori dei
Progressive
pazienti
femmine esystemic
fu confermato
che entrambi conte- positivi.
rheumatoid
arthritis
Juvenile
nevano
anticorpi
anti- SSA/Ro.
Uno di questi campioni
titoli sono risultati entro una diluizione doppia del valore
S stabilito del titolo.
14
Systemic
mostrava
una debole reazione a chiazze sottili sulle
medio
S
13
cellulePolyarticular
HEp-2 non transfette e la tipica colorazione “
Pauciarticular-B27+
SSA/Ro”
sul sistema di analisi degli ANA-Ro Colorzyme®
CONFERMA
DEGLI ANTICORPI SSA/Ro 0
DM/PM
S il sistema di analisi ANA-Ro Colorzyme®
25
HEp-2000®.
L’altro campione era negativo sulle cellule
Usando
HEpS in un grande laboratorio reumatologico,
20
HEp-2 Vasculitis
non transfette ma mostrava la tipica colora2000®,
sono
Normal
Population
(Over
9,000 degli
Sera Tested):
zione
“ SSA/Ro”
sul sistema
di analisi
ANA-Ro
stati saggiati campioni di siero provenienti da 349
20-60 Years
S con test ANA positivi noti. In questo
2 gruppo
Colorzyme®
HEp-2000®. La specificità SSA/Ro di questi
pazienti
70-80 Years
S
due campioni
è stata confermata dal test ELISA e dalla
selezionato,
239 campioni mostravano il3.5
caratteristico
tecnica
Western immunoblot.
I campioni
negativi nelle
pattern della
SSA/Ro.
Sono stati ottenute
Abbreviations:
S = Speckled,
H = Homogenous,
P = Peripheral,
N =colorazione
Nucleolar, ACA
= anti-Centromere
analisi ANA sono risultati negativi anche con l’analisi
analisi ELISA positive per gli anticorpi SSA/Ro 238 (99,6%)
ELISA.
di questi campioni. Altri 79 campioni hanno mostrato
Motiffortemente chiazzati e/o omogenei
%
pattern
e hanno
Diagnostic
Ségrégation
Positif
SIERI
DI PAZIENTI CON SOLO ANTICORPI SSA/Ro
dato
origine a analisi ELISA positivi per gli
anticorpi
Usando sistemi di test disponibili in commercio, cellule
SSA/Ro. Quindi, se si osserva il caratteristico pattern
Population
pathologique
HEp-2
non transfette
e il sistema di analisi ANA-Ro
SSA/Ro, ciò conferma la presenza di anticorpi SSA/Ro
(plus de 4HEp-2000®,
500 échantillons
de sérum
testés)
Colorzyme®
sono stati
analizzati
i sieri: di 46
ma l’assenza del pattern non esclude la possibile
M,P+H,H,P
93precedenteLupus
pazienti
conérythémateux
SLE o sindromedisséminé
di Sjögren. È stato conferpresenza
di anticorpi SSA/Ro. Negli studi
M,Hdescritti, abbiamo esaminato un
40totale di 429
matoPolyarthrite
dal test ELISArhumatoïde
e dalla tecnica Western immunoblot mente
Connectivité
(MCTD) anticorpi contro
che tutti
questi sierimixte
contenevano
sieriMcontenenti anticorpi SSA/Ro come99
confermato
M,N
85 Immunoblot,
Sclérodermie
généralisée
évolutive
- diffuse
l’autoantigene
SSA/Ro.
In nessuno
di questi
campioni
dall’analisi
ELISA e/o dalla tecnica Western
93
ACAil caratteristico pattern della colorazione
évolutivedi- questi
CRESTcamACA
sono Sclérodermie
stati rilevati altrigénéralisée
anticorpi. Trentasei
e con
SSA/Ro
rhumatoïde
juvénile
pioni Arthrite
(78%) sono
risultati positivi
(disegno a chiazze) con
sulla linea cellulare HEp-2000®. Abbiamo anche notato
M
Disséminée
le cellule
HEp-2 non transfette e tutti (100%) sono risultati campioni
contenenti anticorpi SSA/Ro,14
ma senza il
M
Polyarticulaire
positivi
(caratteristico disegno della colorazione SSA/Ro
caratteristico
pattern della colorazione13
SSA/Ro perché
0
Pauciarticulaire
B27+ Colorzyme® HEp-2000®.
col sistema
di analisi ANA-Ro
alti -livelli di altri anticorpi, (in genere anticorpi
anti-DNA
M
DM/PM
o anticorpi
anti-Sm/RNP) mascherano il25
pattern SSA/Ro.
M se si vede il caratteristico pattern
20 SSA/Ro, ciò
Vascularite
SIERI DI
PAZIENTI CON ANTICORPI DIVERSI DA SSA/Ro
Quindi,
Population
Usando
sistemi saine
di analisi disponibili in commercio, celconferma la presenza di anticorpi SSA/Ro ma l’assenza
denon
9 000
échantillons
de sérum
testés)
:
lule(plus
HEp-2
transfette
e il sistema
di analisi
ANA-Ro
del pattern non esclude la possibile presenza di antiM SSA/Ro.
2
20-60 ans
Colorzyme®
HEp-2000®, sono stati testati sieri di 230
corpi
M
3.5
70-80
pazienti
conans
una serie di patologie reumatiche e non
reumatiche. In 120 campioni è stato rilevato un solo
Abréviations
: M = Moucheté,
= Homogène,
pattern
della colorazione
e patternHmisti
sono stati P = Périphérique, N = Nucléolaire, ACA = anti-Centromère
TABELLA 1
Diagnosi
Popolazione anormale (oltre 4.500 sieri analizzati)
Artrite reumatoide
Malattia mista del tessuto connettivo
Sclerosi sistemica progressiva-diffusa
Sclerosi sistemica progressiva-CREST
Artrite reumatoide giovanile
Sistemica
Poliarticolare
DM/PM
Vasculite
Popolazione normale (oltre 9.000 sieri analizzati)
20-60 anni
70-80 anni
Pattern
Isolamento
%
Positivo
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
Abbreviazioni: S = Puntegtiato, H = Omogeneo, P = Periferico, N = Nucleolare, ACA = anti-Centromero
Diagnóstico
Población anómala (más de 4.500 sueros evaluados):
22
Tipos de
patrón
%
Positivo
PROCEDURA DI ANALISI IN COLORZYME®
DEGLI ANA-Ro HEp-2000®
1. RICOSTITUZIONE DEL TAMPONE (PBS)
Sciogliere il contenuto di una busta di tampone in
un litro di acqua deionizzata o distillata. Il tampone
PBS può essere coperto e conservato a 2-10°C fino
a quattro settimane.
etere l’operazione per ciascun vetrino. Il reagente
anticorpo enzimatico è stato titolato al fine di
compensare l’acqua deionizzata o distillata residua
che resta sul vetrino dopo il risciacquo.
NOTA: è importante che i pozzetti dei vetrini non si
asciughino durante questa procedura onde evitare
il danneggiamento del substrato.
TAMPONARE O ASCIUGARE IL VETRINO IN MANIERA
CHE LO STESSO NON RESTI SENZA REAGENTE ANTICORPO ENZIMATICO PER PIÙ DI 15 SECONDI.
2. RICOSTITUZIONE DEL REAGENTE COLORATO
Mescolare bene fino al completo dissolvimento.
Questo reagente colorato è stabile per 30 giorni a
temperatura ambiente in un contenitore chiuso.
Questo reagente colorato può essere riutilizzato fino
a 30 giorni o fino a che non è visibile un cambiamento di colore o un precipitato. Torbidezza o
opalescenza, senza alcun precipitato visibile al momento del riutilizzo, sono normali. A seconda della
frequenza d’uso, è possibile utilizzare fino a venti vetrini con 150 ml di reagente colorato Colorzyme®.
9. INCUBAZIONE DEI VETRINI (30±5 minuti a temperatura ambiente, ovvero 18-24°C)
Mettere il coperchio sulla camera di incubazione.
Lasciare incubare il/i vetrino/i per 30 minuti (±5
minuti) a temperatura ambiente (18-24°C).
10. RISCIACQUO COL PBS
Rimuovere il/i vetrino/i dal piatto dell’incubatore e
sciacquare brevemente con PBS. Non far zampillare il tampone direttamente sui pozzetti.
3. DILUIZIONE DEI CAMPIONI DEI PAZIENTI
Screening: diluire i campioni dei pazienti a 1:40
aggiungendo 0,05 ml (50 µl) di siero a 1,95 ml di PBS
ricostituito.
Titolo semi-quantitativo: fare delle diluizioni seriali
del/i campione/i dello screening (ad es. 1,80, 1,160,
1,320...1:2560) usando il PBS.
11. LAVAGGIO COL PBS (10 minuti)
Lavare il/i vetrino/i per 10 minuti con PBS in un piatto per la colorazione del vetrino o una vaschetta
Coplin. Si raccomanda di agitare con delicatezza
all’immersione del vetrino, al punto mediano e alla
rimozione. Questo lavaggio può durare fino a 10-30
minuti senza che i risultati finali dell’analisi varino.
4. PREPARAZIONE DEI VETRINI DEL SUBSTRATO
(20-25 µl/pozzetto)
Rimuovere il/i vetrino/i dal contenitore/i e porre
i sieri di controllo sui pozzetti di controllo come
descritto di seguito. Capovolgere il flacone contagocce di controllo e premere delicatamente fino
a che in punta non è visibile la goccia. Appoggiare
delicatamente la goccia sul pozzetto di controllo
appropriato evitando il contatto diretto della punta
del contagocce con la superficie del vetrino. Mettere il controllo positivo sul pozzetto marcato “+”, il
controllo negativo sul pozzetto marcato “-” e una
goccia di tampone PBS sul pozzetto marcato “PBS”.
Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) di campione del
paziente ai pozzetti numerati.
NOTA: per uno screening generale, si raccomanda
il controllo positivo omogeneo. Per titolazione
semi-quantitativa scegliere il controllo positivo che
mostra il pattern di colorazione più simile al campione dello screening (ad es., per un campione
del paziente che nello screening dà un pattern di
colorazione a chiazze, usare il controllo positivo a
chiazze).
ATTENZIONE: IL CONTATTO DIRETTO DELLA PUNTA DEL
CONTAGOCCE CON LA SUPERFICIE DEL VETRINO
PUÒ DANNEGGIARE IL SUBSTRATO ANTIGENE.
12. INCUBAZIONE DEL REAGENTE COLORATO (30±5
minuti a temperatura ambiente, ovvero 18-24°C)
Rimuovere uno alla volta i vetrini dal PBS e immergerli 3-5 volte in acqua deionizzata o distillata
e tamponare il vetrino sul lato con carta bibula o
carta assorbente in modo da rimuovere l’acqua
in eccesso. Mettere immediatamente il/i vetrino/i
in una vaschetta Coplin contenente il reagente
colorato attivato ed incubare per 30 minuti.
Rimuovere un vetrino alla volta dalla vaschetta
Coplin e sciacquare ciascun lato del vetrino per
4-5 secondi con PBS. Non far zampillare il tampone
direttamente sui pozzetti. Mettere ciascun vetrino
risciacquato con PBS in una vaschetta Coplin piena
di acqua deionizzata o distillata fino a che tutti i
vetrini sono stati tolti dal reagente colorato. Passare
subito al punto 14.
14. MONTAGGIO DEL VETRINO COPRIOGGETTI
Rimuovere uno alla volta i vetrini dal PBS e immergerli 3-5 volte in acqua deionizzata o distillata.
Tamponare il vetrino sul lato con carta bibula o con
carta assorbente in modo da eliminare l’acqua
in eccesso. NON TAMPONARE O NON ASCIUGARE
IL VETRINO IN MANIERA CHE RIMANGA SENZA
COPRIVETRINO PER PIÙ DI 15 SECONDI. Aggiungere
4-5 gocce di mezzo di fissaggio semipermanente lungo la linea mediana di ciascun vetrino.
Posizionare con attenzione il vetrino coprioggetto,
evitando vuoti d’aria, abbassando delicatamente
il vetrino coprioggetto da un estremo all’altro del
vetrino.
NOTA: un eccesso di mezzo di fissaggio sul
vetrino può avere come risultato la mancanza di
risoluzione chiara delle cellule (immagine sfocata).
L’eccesso del mezzo di fissaggio può essere
eliminato dal vetrino tamponando delicatamente il
vetrino coprioggetto con carta assorbente o carta
per pulire lenti evitando qualsiasi movimento diretto
del vetrino coprioggetto. I vetrini possono essere
letti immediatamente oppure possono essere
conservati per lungo tempo ad una temperatura di
2-10°C senza alcuna perdita di reattività.
5. INCUBAZIONE DEI VETRINI (30±5 minuti a
temperatura ambiente, ovvero 18-24°C) Mettere il/i
vetrino/i in una cella umida, coperta (una capsula
di Petri con carta assorbente inumidita andrà
bene). Incubare, col coperchio, per 30 minuti (±5
minuti) a temperatura ambiente (18-24°C).
Rimuovere il/i vetrino/i dal piatto dell’incubatore
e sciacquare brevemente con PBS usando una
bottiglia a zampillo, una pipetta di Pasteur o una
pipetta sierologica. Non far zampillare il tampone
direttamente sui pozzetti.
NOTA: per evitare la contaminazione incrociata sui
vetrini con 13 pozzetti, orientare il flusso di PBS lungo
la linea mediana del vetrino, inclinando prima
verso le provette 1-5 e poi verso quelle 6-10.
7. LAVAGGIO COL PBS (10 minuti)
Lavare il/i vetrino/i per 10 minuti con PBS in un piatto per la colorazione del vetrino o una vaschetta
Coplin. Si raccomanda di agitare con delicatezza
all’immersione del vetrino, al punto mediano e
alla rimozione. Questo lavaggio può durare fino
a 10-30 minuti senza che i risultati finali dell’analisi
varino. Eliminare la soluzione di lavaggio PBS dopo
l’uso. Per risultati ottimali, cambiare il PBS al punto
mediano e usare un agitatore magnetico.
PER ASSISTENZA TECNICA:
+1 916-363-2649
oppure a mezzo e-mail:
[email protected]
8. REAGENTE ANTICORPO ENZIMATICO (Coprire i
pozzetti con 12-14 gocce)
Rimuovere un vetrino alla volta dal PBS ed immergerlo 3-5 volte in acqua deionizzata o distillata.
Tamponare il vetrino sul lato con carta bibula o con
carta assorbente in modo da eliminare l’acqua in
eccesso. Riportare immediatamente il vetrino nella
camera di incubazione e coprire completamente
i pozzetti usando il reagente anticorpo enzimatico;
iniziare mettendo una goccia su ogni pozzetto. Rip23
SISTEMA DE ANÁLISIS DE ANA-Ro
HEp-2000® COLORZYME®
protegidas por la patente estadounidense 5,518,881 y
otras patentes en trámite, en los Estados Unidos y en
otros países.
PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
USO PREVISTO: Se trata de una determinación indirecta de anticuerpos enzimáticos para la detección
semicuantitativa de anticuerpos antinucleares en
suero humano. En este sistema de análisis se emplean
células HEp-2 transfectadas†, lo que permite identificar
los autoanticuerpos contra el antígeno SSA/Ro. Los
autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un
patrón de tinción distintivo en las células transfectadas.
Si se observa este patrón, el mismo se considera como
prueba confirmadora de la presencia de anticuerpos
contra el SSA/Ro.
La ausencia de este patrón distintivo no descarta la
posible presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro.
Este sistema de análisis ha de emplearse como ayuda
en la detección de anticuerpos asociados a las enfermedades reumáticas sistémicas.
“Anticuerpo antinuclear (ANA)” es un término general
que se emplea para referirse a los autoanticuerpos
dirigidos contra diversas proteínas del núcleo celular.
En los primeros estudios sobre estos autoanticuerpos
realizados con técnicas de inmunofluorescencia, se
observaron determinados detalles de unas pocas
proteínas del núcleo (1). A la vista de la elevada correlación entre la presencia de ANA y el lupus eritematoso
sistémico (LES), basta con que no estén presentes para
descartar la enfermedad (2).
Aunque los anticuerpos específicos del ADN siguen
mostrando una elevada correlación con el LES (3),
también se han detectado algunas macromoléculas
nucleares (4) y citoplásmicas (5-7) asociadas a otras
enfermedades del tejido conjuntivo (8-10). Parece que
algunos de estos autoanticuerpos tienen un significado
diagnóstico y/o pronóstico en la esclerosis sistémica
progresiva (11-12), las enfermedades mixtas del tejido
conjuntivo (13-15), el síndrome de Sjögren (16-17), la
polimiositis (18) y/o la artritis reumatoide (19). Debido a
estas asociaciones a enfermedades, en la actualidad
se considera que la detección de ANA constituye una
herramienta general para la detección selectiva de las
enfermedades del tejido conjuntivo (20).
La sensibilidad de la prueba varía con el tipo de sustratos utilizado, el procedimiento de fijación y los tipos de
ANA presentes en los sueros. Por lo general, los sustratos
de cultivos celulares muestran mayor sensibilidad que
los cortes de tejido (21-24). La detección de autoanticuerpos contra el antígeno SSA/Ro es especialmente
variable. Los tejidos de roedores no contienen niveles
detectables del antígeno SSA/Ro (25), y la sensibilidad
de detección de anticuerpos contra el SSA/Ro en
sustratos de cultivos celulares varía según los informes,
del 50 al 90% (26-27).
El sistema de análisis de ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme® de Immuno Concepts con células epitelioides
humanas (HEp-2) mitóticas* transfectadas representa
un avanzado sistema inmunoenzimático para la detección de ANA. Se ha demostrado que las células HEp-2
con figuras mitóticas son más sensibles y proporcionan un modelo de reconocimiento más preciso que
el clásico sustrato de riñón de ratón, para detectar
anticuerpos en la esclerosis sistémica progresiva (ESP)
(28). Las figuras mitóticas mejoran el reconocimiento
diferencial del modelo y ayudan a detectar antígenos
nucleares no notificados anteriormente que alcanzan
concentraciones superiores en las células que se
encuentran en mitosis (29-31). Las células HEp-2 de
este sistema de análisis han sido transfectadas† con
varias copias de la secuencia de ADN específica que
transporta la información del autoantígeno SSA/Ro.
Aproximadamente el 10-20 % de las células transfectadas expresan este antígeno en exceso, por lo que la
detección de autoanticuerpos contra el SSA/Ro es más
homogénea que en células HEp-2 no transfectadas.
Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un
patrón de tinción distintivo en las células transfectadas.
Si se observa este patrón, el mismo se considera como
prueba confirmadora de la presencia de anticuerpos
contra el SSA/Ro.
La ausencia de este patrón distintivo no descarta la
posible presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro.
† Las células transfectadas y su aplicación están
24
*Mitosis es un término que se emplea para describir el
proceso de división de las células.
En general, se divide en seis fases, a saber, interfase,
profase, metafase, anafase, telofase y citocinesia.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El sistema de análisis de ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme® de Immuno Concepts emplea la técnica
indirecta de anticuerpos enzimáticos. Las muestras de
pacientes se incuban con un sustrato antigénico que
permite la unión específica de los autoanticuerpos
a los núcleos de las células. Si hay ANA, se forma un
complejo antígeno-anticuerpo estable. Tras el lavado
para retirar los anticuerpos unidos de forma inespecífica, se incuba el sustrato con anticuerpos antihumanos
conjugados con peroxidasa de rábano (HRP). Si los
resultados son positivos, se forma un complejo estable
con tres partes: el anticuerpo antihumano conjugado
con HRP unido al anticuerpo antinuclear humano, que
se une a su vez al antígeno nuclear. Este complejo se
puede ver incubando el portaobjetos en el reactivo de
color Colorzyme®, que contiene un sustrato específico
de la enzima. La reacción entre el anticuerpo marcado
con la enzima y el sustrato específico de la enzima da
una reacción de color visible en el portaobjetos con un
microscopio óptico estándar. En las muestras positivas,
los núcleos celulares se teñirán de color azul-púrpura,
con un patrón de tinción característico de la particular
distribución del antígeno nuclear en las células. Si no
hay ANA en las muestras, el núcleo no presentará un
patrón de tinción nuclear claramente discernible.
Puede que el citoplasma se tiña débilmente y que la
región no cromosómica de las células mitóticas lo haga
de forma más oscura.
COMPONENTES DEL SISTEMA (MATERIALES SUMINISTRADOS)
Utilización: Todos los componentes se entregan listos
para su empleo, sin necesidad de fragmentarlos ni
prepararlos (excepto el tampón PBS y el reactivo de
color Colorzyme®, que deben ser disueltos en agua
desionizada o destilada antes de utilizarlos).
Conservación: Todos los componentes se pueden conservar en refrigerador a 2-10 ºC. Una vez preparado,
el reactivo tampón PBS debe conservarse en envase
cerrado, en refrigerador a 2-10 ºC.
Una vez preparado, el reactivo de color Colorzyme®
debe conservarse en un envase cerrado a temperatura ambiente durante 30 días como máximo. Dependiendo de la frecuencia de utilización, se pueden
utilizar 150 ml de reactivo de color Colorzyme® con un
máximo de 20 portaobjetos.
Estabilidad: Todos los componentes son estables al
menos durante 12 meses a partir de la fecha de fabricación. No utilice los componentes pasada la fecha
de caducidad.
REACTIVOS
Portaobjetos de sustrato: ‡Nº de catálogo 2007 (siete
pocillos); 2013-Ro (trece pocillos). Portaobjetos con
siete o trece pocillos con sustrato para ANA con células
HEp-2000® (con figuras mitóticas) cultivadas y estabilizadas directamente en los pocillos del análisis. Son
células HEp-2 transfectadas de manera estable con el
autoantígeno SSA/Ro. El exclusivo diseño de los fosos
del portaobjetos reduce al mínimo la contaminación
cruzada de los pocillos durante la prueba. Además,
los portaobjetos llevan pocillos de control designados
como positivo, negativo y PBS, que ayudan a interpretar adecuadamente los resultados.
Control positivo de SSA/Ro: Nº de catálogo 2035-Ro.
Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0
ml de suero de control humano positivo con anticuerpo
específico contra los antígenos SSA/Ro. Este suero da
una reacción de tinción moteada fina, típica del antiSSA/Ro que se observa en el sustrato de células HEp2000® de Immuno Concepts. La expresión se localiza
predominantemente en el núcleo, con destacada
tinción nucleolar. También se puede observar una
débil tinción citoplásmica en las células que expresan
el antígeno en exceso. La región cromosómica de
las células mitóticas muestra una reacción de tinción
negativa. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1 %
como conservante.
Control positivo homogéneo: Nº de catálogo 2021. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml
de suero de control humano positivo con anticuerpo
específico contra el ADN y/o los antígenos nucleares
DNP. Este suero da una reacción de tinción homogénea con el sustrato de células HEp-2000® de IC. La
región cromosómica de las células mitóticas muestra la
misma reacción de tinción homogénea. Este reactivo
contiene azida sódica al 0,1 % como conservante.
Control positivo moteado: Nº de catálogo 2022. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 0,5 ml de
suero de control humano positivo con anticuerpo específico contra el Sm y/o los antígenos nucleares DNP.
Este suero da una de las reacciones de tinción moteada más habituales que se observan con el sustrato de
células HEp-2000® de IC. La región cromosómica de
las células mitóticas muestra una reacción de tinción
negativa. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1 %
como conservante.
bolsa contiene polvo tampón suficiente para formar 1
litro. (Los kits de análisis completos llevan una bolsa de
polvo tampón por cada cinco portaobjetos).
Preparación: Disuelva una bolsa de polvo tampón
en 1 litro de agua desionizada o destilada, tápelo y
consérvelo en refrigerador a 2-10 ºC durante 4 semanas
como máximo, o hasta que aparezcan signos de
contaminación u otros cambios visibles.
Medio para preparaciones microscópicas semipermanentes: Nº de catálogo 1111. Vial con cuentagotas
listo para usar, que contiene 5,0 ml de medio para
preparaciones microscópicas a base de glicerol, pH 9,1
± 0,2. Este reactivo contiene azida sódica al
0,1 % como conservante.
Cubreobjetos: Nº de catálogo 1041. Cada envase contiene diez cubreobjetos de vidrio nº 1 de 24x60 mm.
OTROS MATERIALES NECESARIOS (PERO QUE NO SE
SUMINISTRAN)
Control positivo nucleolar: Nº de catálogo 2023. Vial
de suero de control humano positivo con anticuerpo
específico contra los antígenos del nucléolo. Este suero
da una reacción de tinción nucleolar con el sustrato de
células HEp-2000® de IC. Este reactivo contiene azida
sódica al 0,1 % como conservante.
Pipetas volumétricas para dispensar volúmenes de
20-25 µl
Tres jarras Coplin o platillos de tinción
Frasco para exprimir o pipetas de Pasteur
Pipetas serológicas
Envases de un litro con tapón de rosca (para el
tampón PBS)
Envases cerrados para conservar el reactivo de color
Colorzyme®
Agua desionizada o destilada
Probetas para preparar las diluciones de suero
Cámara de incubación
Papel secante o toallas de papel
Guantes de látex desechables
Cronómetro
Microscopio óptico estándar capaz de proporcionar
aumentos de 200x y 400x.
Control positivo del centrómero: Nº de catálogo 2025.
Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 0,5
ml de suero de control humano positivo con anticuerpo
específico contra los centrómeros cromosómicos
(cinetocentro). Este suero da una reacción de tinción
moteada discreta con el sustrato de células HEp-2000®
de IC. La región cromosómica de las células mitóticas
muestra la misma reacción discreta de tinción moteada. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1 % como
conservante.
Suero de control titulable: Nº de catálogo 2026. Vial
listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de control
humano positivo que será tratado como si fuera una
muestra de paciente sin diluir. Este reactivo contiene
azida sódica al 0,1 % como conservante.
PRECAUCIONES
1. Todos los materiales de procedencia humana
utilizados en este producto han sido analizados en
busca de anticuerpos con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de la hepatitis
C (VHC) y el antígeno de superficie de la hepatitis
B (HBsAG) con métodos homologados por la FDA,
obteniendo resultados negativos (no reactivos en
varias ocasiones) en todos los casos. Pero no existe
ningún método de análisis que pueda garantizar
por completo la ausencia de VIH-1, VIH-2, hepatitis
C, hepatitis B u otros agentes infecciosos. Por eso,
todos los materiales del kit deben ser manipulados
como si fueran infecciosos.
2. Todas las muestras de pacientes deben ser manipuladas según el nivel 2 de bioseguridad, según
se recomienda en el manual de los Centers for
Disease Control/National Institutes of Health para
toda muestra de suero o sangre humana potencialmente infecciosa: Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. La disolución de los componentes o su sustitución
por otros distintos de los suministrados con el
sistema puede arrojar resultados incoherentes.
4. Se emplea azida sódica (0,1 %) como conservante.
La azida sódica puede reaccionar con el plomo
o con las conducciones de cobre y formar sales
de azidas metálicas explosivas. Al eliminar los
reactivos, lavar con grandes volúmenes de agua
del grifo para evitar que queden residuos en las
tuberías. La azida sódica es venenosa y puede ser
tóxica en caso de ingestión.
5. Este kit es para uso diagnóstico in vitro.
6. Si fuera necesario utilizar sueros hemolizados o
lipémicos, caliéntelos para inactivarlos a 56 ºC durante 30 minutos para obtener resultados óptimos.
No utilice sueros con contaminación microbiana.
7. Se ha demostrado que se pueden producir resultados falsos positivos con respecto a los ANA debido
a la unión del C1q al ADN, independientemente
del sustrato utilizado (32). Para eliminar la posible interferencia con C1q, todos los sueros de pacientes
serán inactivados calentándolos a 56 ºC durante
30 minutos antes de su evaluación.
8. El suero de control titulable debe utilizarse para
controlar la reproducibilidad entre lotes y entre ciclos. No está concebido para medir la sensibilidad
o la especificidad generales del ensayo.
9. Esta prohibido fumar, comer o beber en las zonas
de manipulación de las muestras o los reactivos del
kit.
10. Evite salpicaduras y la generación de aerosoles en
todo momento.
11. Si los tiempos de incubación y las temperaturas
Suero de control negativo: Nº de catálogo 2031. Vial
de suero de control humano negativo. Aunque el suero
de control negativo puede producir cierta tinción del
citoplasma al teñirse de forma más brillante la región
no cromosómica de la célula mitótica, no presenta
un patrón de tinción nuclear discernible. Este reactivo
contiene azida sódica al 0,1 % como conservante.
Reactivo con anticuerpos enzimáticos: Nº de catálogo
4009-Ro (9,0 ml), 4075-Ro (23 ml). IgG de cabra antihumana (cadenas pesadas y ligeras) conjugadas con
peroxidasa de rábano (HRP). El reactivo se presenta
listo para usar en frascos con cuentagotas de precisión,
con 9,0 ml por cada 10 portaobjetos, en kits de análisis
completos.
Reactivo de color: *Nº de catálogo 4066. Polvo de
sustrato enzimático específico de HRP, que contiene
4 cloro 1-naftol. Cada envase contiene polvo para
formar 150 ml de reactivo de color Colorzyme® autoactivable.
Preparación: Disuelva el contenido de una bolsa en 150
ml de agua desionizada o destilada. Mezcle bien hasta
que se disuelva por completo. Este reactivo de color
es estable durante 30 días a temperatura ambiente en
un envase cerrado. Este reactivo de color puede ser
reutilizado durante 30 días como máximo, o hasta que
se aprecie un cambio de color o alguna precipitación.
Es normal que al volverlo a utilizar presente turbidez u
opalescencia, sin precipitado visible. Dependiendo de
la frecuencia de utilización, se pueden utilizar 150 ml
de reactivo de color Colorzyme® con un máximo de 20
portaobjetos.
‡Este portaobjetos está protegido por una o más de las
siguientes patentes estadounidenses y de otros países:
4,387,972; D-274261; 0727046; D-273261; 5,518,881; patente canadiense 1.171.302, y otras patentes en trámite.
*Este material está protegido por una o más de las
siguientes patentes estadounidenses y de otros países:
4615972, patente canadiense 1231633, patente italiana
1177110, y otras patentes en trámite.
ELEMENTOS NO REACTIVOS
Polvo tampón PBS: Nº de catálogo 1011. Polvo salino
tamponado con fosfato (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Cada
25
no son los especificados, los resultados pueden ser
erróneos.
12. La contaminación cruzada de los reactivos o de las
muestras puede dar resultados falsos.
13. Los elementos de vidrio reutilizables deben ser
lavados y enjuagados a fondo para eliminar los
detergentes antes de su uso. Todos los elementos
de vidrio deben estar limpios y secos antes de su
uso.
14. Todos los reactivos, portaobjetos y muestras deben
estar a temperatura ambiente
(18-24 ºC) antes de su uso.
15. Para manipular las muestras y los reactivos debe
utilizar guantes de látex desechables, y cuando
acabe deberá lavarse bien las manos.
16. La contaminación microbiana de los reactivos o de
las muestras puede dar resultados falsos.
17. No pipetee nunca con la boca y evite el contacto
de los reactivos y las muestras con la piel y las mucosas. En caso de contacto, lávese con un jabón
germicida y agua abundante.
18. El reactivo de color puede ser reutilizado durante
30 días como máximo, o hasta que se aprecie un
cambio de color o alguna precipitación. Es normal
que al volverlo a utilizar presente turbidez u opalescencia, sin precipitado visible. Dependiendo de la
frecuencia de utilización, se pueden utilizar 150 ml
de reactivo de color Colorzyme® con un máximo
de 20 portaobjetos.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Obtención: La muestra ideal es suero. Se obtendrán
aproximadamente 5 ml de sangre por venipunción
aséptica, con un tubo de vacío estéril u otro sistema de
obtención adecuado. Deje que la sangre coagule a
temperatura ambiente (18-24 ºC). Se separará el suero
del coágulo por centrifugado cuanto antes, para que
la hemólisis sea mínima.
Sustancias que interfieren: No se utilizarán sueros que
muestren grados elevados de hemólisis, ictericia,
lipemia o crecimiento microbiano, pues en todas esas
circunstancias se pueden producir resultados aberrantes. Si la muestra presenta partículas visibles, deben ser
eliminadas por centrifugado antes de la prueba.
no ha sido diseñado como indicador de la exactitud
de la titulación, cada laboratorio deberá establecer
su propio criterio de valoración del título medio para
cada muestra, utilizando esta información para evaluar
la reproducibilidad (precisión) de unos ciclos a otros.
Mediante la reiterada evaluación de este control
titulable utilizando el sistema de análisis de ANA-Ro
HEp-2000® Colorzyme® de Immuno Concepts, se ha
establecido un título medio para cada número de lote.
El número de lote, el título medio y el rango de títulos (±
una dilución doble a cada lado de la media) figuran
en la etiqueta del vial y deben servir como guía para el
funcionamiento del sistema de análisis.
Es importante no confundir la intensidad de la tinción
con la presencia o ausencia de anticuerpos antinucleares. La clave para determinar si una determinada
dilución de suero es positiva radica en la aparición
de un patrón claramente discernible, sea cual sea la
intensidad de la tinción. Este control titulable mostrará
el típico patrón moteado que se asocia al anticuerpo
RNP. También puede aparecer un segundo patrón de
NSp I (varias manchas aisladas en el núcleo de las células que se encuentran en la interfase); pero el patrón
que se empleará como criterio de valoración será el
típico moteado correspondiente a RNP.
Puede que los valores obtenidos en nuestro laboratorio
difieran de los suyos. He aquí algunos de los muchos
factores que pueden afectar a sus resultados:
1. Correcta alineación del haz de luz del microscopio.
Consulte las instrucciones del manual del microscopio.
2. La apertura numérica del objetivo. La apertura
numérica está relacionada con la capacidad de
absorción de luz y con la resolución del objetivo.
La apertura numérica va impresa a un lado del
objetivo.
3. Precisión y exactitud de la técnica de dilución, del
equipo y de la realización de los procedimientos
de análisis.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL
PACIENTE
Conservación: Los sueros se pueden conservar a 2-10
ºC durante una semana como máximo. Si el análisis se
posterga, los sueros deben conservarse congelados a
una temperatura de –20 ºC o inferior. No se utilizarán
refrigeradores ni congeladores con sistema “auto-frost”
(eliminación automática de la escarcha).
PRECAUCIÓN: Si las muestras son sucesivamente
congeladas y descongeladas, se pueden obtener
resultados falsos positivos y negativos.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
CONTROL DE CALIDAD
Para el control de calidad se dispondrán los controles
positivo, negativo y de PBS en los pocillos al efecto que
se encuentran en todos los portaobjetos. El control positivo debe dar una tinción de color azul-púrpura oscuro
en los núcleos de las células, con un patrón claramente
discernible característico del suero de control utilizado.
El citoplasma puede teñirse de color azul-púrpura claro
en el pocillo de control positivo. El control negativo
debe mostrar una tinción de color azul-púrpura pálido
del citoplasma y el núcleo, sin patrón discernible de
tinción nuclear. El control PBS se emplea para observar
la tinción inespecífica del reactivo de anticuerpos enzimáticos, y no debe mostrar tinción azul. Si los controles
no se ven como se ha descrito, la prueba no es válida
y debe repetirse. Si se emplea el análisis de ANA-Ro
HEp-2000® para confirmar la presencia de anticuerpos
anti- SSA/Ro, el control positivo de SSA/Ro, número
de catálogo 2035-Ro, debe realizarse en al menos un
portaobjetos de los utilizados ese día.
CONTROL TITULABLE OPCIONAL
Para interpretar los títulos, muchos laboratorio empiezan por el pocillo que contiene la muestra más diluida,
y van “hacia atrás” hasta la dilución 1:40. El primer
pocillo en el que se aprecie un patrón discernible de
tinción nuclear corresponde al título que se considera
como criterio de valoración. Recomendamos utilizar
esta técnica para determinar los criterios de valoración
de los títulos.
El título medio y el rango de títulos (± una dilución
a cada lado de la media) determinados han sido
establecidos en nuestro laboratorio y se consideran
la norma. Este control se facilita para que cada laboratorio pueda evaluar la reproducibilidad (precisión)
de sus análisis de ANA. Como quiera que este control
Se recomienda un aumento total de 200X para la
detección selectiva de positivos y negativos, y de 400X
para el reconocimiento de patrones y la visualización
de células mitóticas.
Negativos: Se considera que un suero es negativo para
la presencia de anticuerpos antinucleares si la tinción
es igual o inferior a la del pocillo de control negativo,
sin patrón claramente discernible. Puede que el
citoplasma muestre una tinción débil, más brillante en
la región no cromosómica de las células mitóticas, pero
sin patrón nuclear claramente discernible.
Positivos: Se considera que un suero es positivo si el núcleo muestra un patrón de tinción claramente discernible en una mayoría de las células que se encuentran
en la interfase.
SSA/Ro: Se considera que un suero es positivo para los
anticuerpos SSA/Ro si el 10-20% de los núcleos de la
interfase muestra el patrón de tinción distintivo de SSA/
Ro, que aparece como un patrón moteado distintivo
con una llamativa tinción de los nucléolos. Son células
transfectadas que expresan el antígeno en exceso.
El restante 80-90 % de los núcleos en interfase puede
presentar una fina tinción moteada del núcleo, con o
sin tinción de los nucléolos.
Títulos: Para interpretar los títulos, muchos laboratorio
empiezan por el pocillo que contiene la muestra más
diluida, y van “hacia atrás” hasta la dilución 1:40. El
primer pocillo en el que se aprecie un patrón discernible corresponde al título que se considera como
criterio de valoración. Recomendamos utilizar esta
técnica para determinar los criterios de valoración de
los títulos. Es importante no confundir la intensidad de
la tinción con la presencia o ausencia de anticuerpos antinucleares. La clave para determinar si una
determinada dilución de suero es positiva radica en
la aparición de un patrón claramente discernible, sea
cual sea la intensidad de la tinción. Debido al aumento
de la concentración del antígeno SSA/Ro en las células
que lo expresan en exceso, no es raro ver que estas células se tiñen con títulos muy elevados. Se desconoce la
importancia clínica de estos títulos elevados.
Precaución: Algunos sueros pueden presentar tinción
en núcleos y citoplasmas sin patrón nuclear evidente.
Este fenómeno suele deberse a los anticuerpos heterófilos, y se considerará resultado negativo (33).
26
prevalecen en la esclerodermia y el síndrome de
Sjögren (37).
INTENSIDAD DE LA TINCIÓN ENZIMÁTICA
No se ha observado que la intensidad de la tinción
tenga un valor clínico; sólo tiene un valor limitado
��
��
como indicador del título (34). Para simplificar la
�� anote los resultados
��
interpretación,
de la selección
que sean muy positivos o muy negativos, y efectúe la
titulación
en consecuencia.
��
Reacción muy positiva: Tinción de color azul-púrpura
oscuro a muy oscuro, perfil celular bien definido, patrón
nuclear claramente definido.
Reacción positiva: Tinción de color azul-púrpura tenue
o amortiguada, con gran variabilidad de la tinción de
unas células a otras; puede que el perfil celular esté
peor definido en alguna células, aunque la mayoría
presente un patrón de tinción claramente discernible.
��células crecen
��
NOTA:��
Como las
directamente en la
superficie
del portaobjetos, ��
no todas se encuentran en
��
la misma fase del ciclo celular. No es raro ver diferentes
intensidades de tinción en unas y otras células, debido
a la��
diferencia en la concentración y la localización de
los diferentes antígenos durante el ciclo celular.
NOTIFICACIÓN DE RESULTADOS
Selección: Los resultados deben ser notificados como
muy positivos o positivos en la dilución 1:40; y hay que
informar del patrón de tinción del núcleo.
Titulación: El resultado que se notifica es el de la última
dilución en la que se observa una tinción claramente
discernible. Si el resultado se observa con la dilución 1:
��
2560, se notificará como superior a��
1:2560. Los títulos
��
��
de 1:40 a 1:80 se consideran bajos;
de 1:160 a 1:320,
medios; y de 1:640 en adelante, elevados.
Centrómero: Un patrón de tinción discretamente
moteado es muy sugerente de la variante de la
��
esclerosis
sistémica progresiva que se ��
conoce como
�� Las manchas nucleares
síndrome CREST* (28).
son
��
muy discretas y su número suele ser múltiplo de 46
(habitualmente
��23-46 manchas por núcleo). Dado
que los centrómeros son constricciones en las que la
fibras fusiformes se unen a los cromosomas, las células
mitóticas mostrarán la misma reacción de moteado en
la región cromosómica (12).
Sinónimos: ACA; moteado discreto.
Antígenos nucleares: Centrómero cromosómico
(cinetocoro).
Asociación a enfermedades: Muy sugerentes de la
variante de la esclerosis sistémica progresiva que
se conoce como síndrome CREST* (28).
��
��
��
*CREST es una
forma
de ESP con calcinosis
importante,
fenómeno
de Raynaud, disfunción esofágica,
esclero��
��
dactilia y telangiectasias.
��
SSA/Ro: Patrón
moteado evidente con tinción destacada de los nucléolos en el 10-20 % de los núcleos
en interfase. Son células transfectadas que expresan el
antígeno en exceso. El restante 80-90 % de los núcleos
en interfase puede presentar una fina tinción moteada
del núcleo, con o sin tinción de los nucléolos. La región
no cromosómica de las células mitóticas en metafase
se tiñe, mientras que la región cromosómica no lo
hace.
Antígenos nucleares: SSA/Ro (60kD).
Asociación a enfermedades: Se observa en el 60-70
% de los pacientes con síndrome de Sjögren pri��
��
mario, en el 30-40 % de los pacientes
con LES y en
��
más del 95 % con lupus cutáneo ��
subagudo (38).
��
DETECCIÓN
�� DEL PATRÓN
Homogéneo: Tinción sólida del núcleo, con o sin
enmascaramiento evidente de los nucléolos. La región
cromosómica de las células mitóticas en metafase es
claramente positiva, con una intensidad de la tinción
suave o periférica superior o igual a la de los núcleos
en interfase.
Sinónimos: Difuso; sólido.
Antígenos nucleares: ADNbc; ADNn; DNP; histona.
Asociación a enfermedades: Los títulos elevados
sugieren LES.
��
��
Los títulos bajos sugieren LES u otras enfermedades
��
��
del tejido conjuntivo (35).
Periférico:
Tinción sólida, sobre todo alrededor de la
��
región externa del núcleo, con tinción más débil del
centro de éste. La región cromosómica de las células
mitóticas en metafase es claramente positiva, con una
intensidad de la tinción suave o periférica superior o
igual a la de los núcleos en interfase.
Sinónimos: Borde, áspero, membranoso.
Antígenos nucleares: ADNbc, ADNmc,
ADNn, DNP, histona.
Asociación a enfermedades: Los títulos
elevados sugieren LES.
Los títulos bajos sugieren LES u otras enfermedades del
��
��
tejido
conjuntivo (35).
��
��
Moteado: Tinción granular áspera o fina del núcleo,
generalmente sin tinción fluorescente de los nucléolos.
��
La región
no cromosómica de las células mitóticas en
metafase se tiñe, mientras que la región cromosómica
no lo hace.
Antígenos nucleares: Sm; RNP; Scl-70; SS-B; y otros
sistemas de antígenos/anticuerpos aún no
caracterizados.
Asociación a enfermedades: Los títulos elevados sugieren LES (antígeno Sm), enfermedades mixtas del
tejido conjuntivo (antígeno RNP), esclerodermia
(antígeno Scl-70) o síndrome de Sjögren-complejo
seco (antígeno SS-B). Los títulos bajos sugieren
otras enfermedades del tejido
conjuntivo (36).
��
��
��
��
Nucleolar: Tinción moteada grosera de grandes
dimensiones, generalmente menos de 6 manchas por
célula, con o sin manchas finas ocasionales, entre 5 y
10. La región no cromosómica de las células mitóticas
en metafase se tiñe mucho, mientras que la región cromosómica lo hace débilmente. Las células en anafase
y en telofase pueden teñirse de forma similar a como lo
hacen los núcleos en interfase.
Antígenos nucleares: Se suelen denominar ARN 4-6s,
y otros antígenos nucleares como fibrilarina,
polimerasa I de ARN, NOR 90 y PM/Sc1.
Asociación a enfermedades: Los títulos elevados
��
��
��
��
CÉLULAS ��
MITÓTICAS
DETECCIÓN
Las células mitóticas deben ser visibles en todos los
campos con una ampliación de 200X o inferior. Para
comprobar si una célula se encuentra en mitosis debe
utilizarse la ampliación de 400X. Las células mitóticas
muestran una forma redondeada característica, sin
membrana nuclear detectable. Por lo general, la
región cromosómica de las células mitóticas muestra
una forma irregular en el seno de la célula debido a
la ausencia de membrana nuclear, y una extrema
��
constricción de los cromosomas.
��
��
Los sueros positivos para ADN y/o DNP y/o histona
(como el control positivo homogéneo de IC) presen��
tarán una tinción brillante de la región cromosómica
de estas células. En las muestras negativas para ADN
y/o DNP y/o histona (como el control positivo moteado
de IC) los cromosomas de las células mitóticas no se
teñirán, y será difícil verlos.
USO DE CÉLULAS MITÓTICAS
Distinción entre anticuerpos moteados y homogéneos:
En ocasiones es difícil distinguir un patrón de tinción
moteado fino de otro homogéneo. Si el patrón es homogéneo, habrá
una tinción sólida de los
cromosomas
��
��
de las células mitóticas.
Si el patrón es estrictamente
��
��
moteado, la región situada fuera de los cromosomas
presentará una reacción de moteado fino.
NOTA: Si se presenta un moteado fino de toda la
célula mitótica junto con la tinción sólida de la región
cromosómica, es muy probable que haya dos o más
anticuerpos. Designe la dilución de selección como
moteada/homogénea, y titule cada anticuerpo hasta
el criterio de valoración.
Anticuerpo periférico frente a anticuerpo contra la
membrana nuclear: En general, los anticuerpos que
27
muestran un patrón periférico se asocian a antígenos
nucleares de ADN/DNP. Los títulos elevados de estos
anticuerpos sugieren LES. En sustratos que no incluyen
células mitóticas puede ser difícil distinguir el patrón
periférico del de los anticuerpos contra la membrana
nuclear. Con las células mitóticas de Immuno Concepts
es posible distinguir estos patrones, pues la región
cromosómica de las células mitóticas se teñirá intensamente con un patrón periférico, pero no será teñida
por el anticuerpo contra la membrana nuclear. Esta
distinción es importante desde el punto de vista clínico,
pues los anticuerpos contra la membrana nuclear
carecen de especificidad ADN/DNP y no se asocian
al LES (39).
Anticuerpo anticentrómero (ACA) frente a centrómero
atípico con aspecto de anticuerpo moteado: Para
verificar la presencia de ACA, la región cromosómica
de las células mitóticas debe teñirse brillantemente
con manchas discretas. Si la región cromosómica no se
tiñe, el anticuerpo no es ACA y debe designarse como
“moteado atípico” (40).
se tiñe. El patrón nucleolar se distingue por la tinción
moteada grosera y grande de todos los núcleos, por
lo general menos de 6 por célula. El patrón de Scl-70
corresponde a una tinción moteada fina y una tinción
nucleolar de todos los núcleos en interfase, y la tinción
de la región cromosómica de las células mitóticas
en metafase. Los anticuerpos contra el antígeno
nuclear de células en proliferación (PCNA) muestra un
moteado variable grosero y fino en el 30-50 % de los
núcleos en interfase.
TINCIÓN DEL CITOPLASMA
Aunque los anticuerpos contra antígenos citoplásmicos
no suelen asociarse a enfermedades del tejido conjuntivo, se pueden detectar con sustratos de cultivos de
células epiteliales (41). Los anticuerpos que se detectan
con más frecuencia son los dirigidos contra las mitocondrias y el músculo liso; suelen asociarse a la mononucleosis, la hepatitis activa crónica y las hepatopatías
(42, 43). Con el sustrato de células HEp-2 también se
han demostrado anticuerpos contra el músculo liso en
pacientes con verrugas (44).
Anticuerpos anti-mitocondriales (AMA): Manchas
discretas, concentradas en la región perinuclear de la
célula y que se extienden, con menor intensidad, a las
regiones exteriores del citoplasma. Hay que distinguirlo
de los anticuerpos anti-Golgi, que suelen teñir sólo
un lado de la región perinuclear, y de los anticuerpos
anti-ribosomas, que muestran manchas más finas con
aspecto filamentoso compatible con la localización del
retículo endoplásmico en el interior de la célula.
NOTA: La forma más fácil de distinguir las manchas perinucleares de la tinción periférica del núcleo consiste
en observar que las manchas mitocondriales forman
una tinción moteada discontinua en torno al exterior
de la membrana nuclear, mientas que en los sueros
periféricos se forma una tinción lisa sólida en el interior
de la membrana nuclear.
SSA/Ro
DESIGNE LOS SUEROS COMO NEGATIVOS PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES, Y VERIFIQUE LA PRESENCIA DE
ANTICUERPOS ANTI-MITOCONDRIALES EN EL SUSTRATO
ESPECÍFICO CORRESPONDIENTE.
Anticuerpos anti-músculo liso (ASMA): Tinción fibrosa
muy fina en todo el citoplasma, con aspecto de tela
de araña. Al contrario que los anticuerpos antimitocondriales, la tinción de los anticuerpos anti-músculo
liso es uniforme en todo el citoplasma, y puede llegar
al núcleo. Por lo general, las células mitóticas muestran
grandes manchas discretas en el exterior de la región
cromosómica. Se ha demostrado que los anticuerpos
anti-músculo liso son muy específicos de la actina (45,
46).
Nucleolar
DESIGNE LOS SUEROS COMO NEGATIVOS PARA ANTICUERPOS ANTINUCLEARES, Y VERIFIQUE LA PRESENCIA
DE ANTICUERPOS ANTI-MÚSCULO LISO EN EL SUSTRATO
ESPECÍFICO CORRESPONDIENTE.
LIMITACIONES DE LA PRUEBA
PCNA
Scl-70
Patrón de SSA/Ro que se puede parecer a la tinción
de SSA/Ro: La tinción distintiva de SSA/Ro adopta un
patrón moteado brillante y delimitado con tinción
destacada de los nucléolos en el 10-20 % de los
núcleos en interfase. El restante 80-90 % de los núcleos
en interfase puede presentar una fina tinción moteada
del núcleo, con o sin tinción de los nucléolos. La región
cromosómica de las células mitóticas en metafase no
28
1. No es posible hacer un diagnóstico basándose sólo
en la detección de anticuerpos antinucleares. El
médico debe interpretar estos resultados en el contexto de la historia y los síntomas del paciente, los
hallazgos físicos y otros procedimientos diagnósticos.
2. No se debe iniciar un tratamiento basándose
exclusivamente en un resultado positivo del análisis
de anticuerpos antinucleares. Antes de iniciar un
tratamiento hay que tener en cuenta las indicaciones clínicas, otros hallazgos de laboratorio y la
impresión clínica del médico.
3. Determinados fármacos, como procainamida e
hidralazina, pueden inducir un trastorno similar al lupus eritematoso (47). Los pacientes con LE inducido
por fármacos pueden dar positivo para los ANA
homogéneos u homogéneos/periféricos que suelen
ir dirigidos contra las histonas nucleares (48).
4. Un pequeño porcentaje de pacientes con LES
puede no presentar ANA mediante la técnica
inmunoenzimática indirecta, pero sí empleando
otras técnicas (49).
5. Aunque una titulación elevada de ANA puede ser
muy sugerente de enfermedad del tejido conjuntivo, no debe considerarse diagnóstica, sino parte
de la historia clínica general de un paciente.
6. A menudo, los patrones de tinción cambian con la
progresiva titulación de los sueros. Este fenómeno
suele deberse a la presencia de más de un anticuerpo antinuclear.
7. También se observan ANA en un pequeño porcen-
taje de pacientes con enfermedades infecciosas
y/o neoplásicas (9).
8. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro muestran un
patrón de tinción distintivo en las células HEp-2000®
Diagnosis
transfectadas. Si se observa este patrón, el mismo
se considera como prueba confirmadora de la
Abnormal
presenciaPopulation
de anticuerpos contra el SSA/Ro. La
(Over
4,500de
Sera
Tested):
ausencia
este
patrón distintivo no descarta la
Systemic
lupus erythematosus
posible
presencia
de anticuerpos contra el SSA/Ro.
Rheumatoid
arthritis
9. Debido
al exceso
de expresión del autoantígeno
connective
tissue
diseaselas muestras que
Mixed en
SSA/Ro
las células
HEp-2000®,
systemic sclerosis-diffuse
Progressive
contienen
anticuerpos
anti- SSA/Ro muestran títulos
sclerosis-CREST
Progressive
superiores
ensystemic
estas células
que los que se obtienen
rheumatoid
Juvenile
en
las células
HEp-2 noarthritis
transfectadas. Como quiera
Systemic
que
ninguno de los demás autoantígenos de las
Polyarticular
células
HEp-2000® se ve afectado por el proceso
Pauciarticular-B27+
de
transfección, los sueros con otras especificiDM/PM
dades
de autoanticuerpos no muestran diferencias
Vasculitis en los títulos entre la línea de células
significativas
Normal
Population
(OverHEp-2
9,000no
Sera
Tested):
HEp-2000® y las células
transfectadas.
enfermedades (reumáticas y no reumáticas) en paralelo con células HEp-2 no transfectadas comercializadas y el sistema de análisis de ANA-Ro HEp-2000®
Pattern
Colorzyme®..
Se observó un patrón de%tinción aislado
enSegregation
120 muestras, y patrones mixtos en Positive
110 muestras. En
la población total de 230 muestras, 333 patrones de
tinción fueron idénticos en los dos sustratos. Veintinueve
muestras presentaron el patrón de tinción distintivo de “
S,P+H,H,P
93
SSA/Ro”
en el sistema de análisis de ANA-Ro
HEp-2000®
S,H
40 mostraron paColorzyme®.
Veintitrés de estas muestras
S moteados en las células HEp-2 no
99 transfectadas.
trones
85en HEp-2000®,
LasS,N
seis muestras discrepantes (positivas
ACA
93
pero
negativas en células HEp-2 no transfectadas)
tenían anticuerpos contra SSA/Ro, como se demostró
S
14de “ SSA/Ro”,
mediante
el patrón de tinción distintivo
S tests y confirmación por inmunotransferencia
13
ELISA
de
0
Western.
S
25
S
20
COMPARACIONES
DE LOS TÍTULOS
Debido al exceso de expresión del autoantígeno
20-60 Years
S
2
SSA/Ro
en las células HEp-2000®, las muestras
que
70-80 ESPERADOS
Years
S
3.5
VALORES
contienen
anticuerpos anti- SSA/Ro muestran
títulos
superiores
estas células
que
los que se obtienen
Abbreviations: S = Speckled, H = Homogenous, P = Peripheral,
N en
= Nucleolar,
ACA
= anti-Centromere
En un gran centro médico universitario se obtuvieron los en las células HEp-2 no transfectadas. Como quiera
siguientes datos en un período de 2 años, utilizando el
que ninguno de los demás autoantígenos de las
Motif HEp-2000® se ve afectado por%el proceso de
sustrato de células HEp-2 para ANA (50). Tabla 1.
células
Diagnostic
Ségrégationlos sueros con otras especificidades
Positif
transfección,
de
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
autoanticuerpos no muestran diferencias significativas
en los títulos entre la línea de células HEp-2000® y las
(plus de 4NORMALES
500 échantillons de sérum testés) :
MUESTRAS
células HEp-2 no transfectadas.
M,P+H,H,P
93
Lupus érythémateux
disséminé
Se evaluaron
sueros de 500
donantes de sangre sanos,
M,H
Polyarthrite
rhumatoïde
242 mujeres y 258 varones, ninguno de los cuales preREPRODUCIBILIDAD
DE LOS TÍTULOS 40
M muestras elegidas entre los controles
99 de los CDC y
Connectivité
mixte de
(MCTD)
sentaba
antecedentes
enfermedades reumáticas,
Diez
M,Nsueros locales bien caracterizados,
85 fueron sometiSclérodermie
généralisée
évolutive
- diffusecomer- otros
en paralelo
con células
HEp-2 no
transfectadas
ACA
Sclérodermie
généralisée
évolutive
- CREST
ACA
cializadas
y el sistema
de análisis
de ANA-Ro
HEp-2000®
das
a tres números de lote diferentes 93
de portaobjetos
juvénile36 muestras (7,2 %)
Arthrite rhumatoïde
Colorzyme®..
En esta población,
HEp-2000®, en tres ocasiones diferentes. No se dio
M caso de que una muestra negativa
14
Disséminée
dieron
positivo en el análisis de anticuerpos antinucleningún
diera
M
13 inferiores al
aresPolyarticulaire
con una dilución sérica de 1:40. Los patrones de
resultados
positivos. Todos los títulos fueron
0
Pauciarticulaire
B27+
tinción
fueron idénticos
con los dos sustratos en 34 de
doble
de dilución del título medio establecido
para
M las muestras evaluadas.
25
DM/PM
las 36
muestras que dieron positivo. Las dos muestras
todas
M
20
queVascularite
ofrecieron diferencias correspondieron a mujeres, y
saine
enPopulation
ambas se confirmó
que contenían anticuerpos antiCONFIRMACIÓN DE ANTICUERPOS SSA/Ro
(plus de
9 000
échantillons
sérumuna
testés)
SSA/Ro.
Una
de estas
muestrasdemostró
débil: reacEn un gran laboratorio de reumatología de referencia,
2 de ANA-Ro
ans fina en las células HEp-2 no transfectación20-60
moteada
seManalizaron con el sistema de análisis
M
3.5 de 349
ans tinción “ SSA/Ro” en el sistema de análisis HEp-2000®
das 70-80
y la típica
Colorzyme® muestras de suero
de ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme®. La otra muestra dio pacientes que habían dado positivo en la detección
Abréviations
M = Moucheté,
H = Homogène,
P = Périphérique,
N=
Nucléolaire,
= anti-Centromère
negativo
en las: células
HEp-2 no transfectadas,
pero
de ANA. En
esta
poblaciónACA
seleccionada,
239 muestras
mostró la típica tinción “ SSA/Ro” en el sistema de análi- presentaron el patrón de tinción distintivo de SSA/Ro. Se
sis de ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme®. La especificidad obtuvieron resultados ELISA positivos para anticuerpos
de estas dos muestras por el SSA/Ro fue confirmada por SSA/Ro en 238 (99,6 %) de estas muestras). Otras 79
ELISA e inmunotransferencia de Western. Las muestras
muestras presentaron intensos patrones moteados y/o
Pattern
que dieron negativo en las pruebas de ANA también lo homogéneos,
y dieron positivo en el%ELISA para anticuDiagnosi
Isolamento
dieron
en las de ELISA.
erpos
SSA/Ro. Por consiguiente, si sePositivo
observa el patrón
distintivo de SSA/Ro, el mismo confirma la presencia de
SUEROS
DE PACIENTES
CON4.500
ANTICUERPOS
SSA/Ro
anticuerpos SSA/Ro, pero la ausencia de dicho patrón
anormale (oltre
sieri analizzati)
Popolazione
EXCLUSIVAMENTE
no descarta la presencia de esos anticuerpos.
En los
S,P+H,H,P
93
Se Artrite
evaluaron
sueros de 46 pacientes con LES o sínestudios que hemos descrito, hemos40examinado un
reumatoide
S,H
drome
de mista
Sjögren
células
HEp-2 no transfectadas
SSA/Ro
Malattia
delcon
tessuto
connettivo
Stotal de 429 sueros que contenían anticuerpos
99
comercializadas
y el
sistema de análisis de ANA-Ro
confirmado por ELISA y/o inmunotransferencia
de WestSclerosi sistemica
progressiva-diffusa
S,N
85
HEp-2000®
Colorzyme®..
Mediante ELISA e inmunoern, y que presentaron el patrón de93
tinción distintivo
Sclerosi sistemica
progressiva-CREST
ACA
transferencia
de Western
se confirmó que todos los
de SSA/Ro en la línea de células HEp-2000® transfectagiovanile
Artrite reumatoide
sueros
contenían anticuerpos contra el autoantígeno
que contienen
Sistemica
Sdas. También hemos visto muestras 14
SSA/Ro.
No se detectaron otros autoanticuerpos en nin- Santicuerpos SSA/Ro pero no que muestren
el patrón de
Poliarticolare
13
guna
de estas muestras. Treinta y seis de estas muestras -tinción distintivo de SSA/Ro, porque0los elevados niveles
(78%)
fueron positivas (patrón moteado) con las células Sde otros autoanticuerpos (habitualmente
anticuerpos
DM/PM
25
HEp-2
no transfectadas, y las 46 (100%) fueron positivas
Vasculite
Santi-ADN o anti-Sm/RNP) enmascaran
20 el patrón SSA/Ro.
(patrón
de tinción
de SSA/Ro)
con el sistema
Por consiguiente, si se observa el patrón distintivo de
normaledistintivo
(oltre 9.000
sieri analizzati)
Popolazione
de20-60
análisis
de ANA-Ro HEp-2000® Colorzyme®.
anni
SSSA/Ro, el mismo confirma la presencia
2 de anticuerpos
patrón no descarta
70-80 anni
SSSA/Ro, pero la ausencia de dicho 3.5
SUEROS DE PACIENTES CON AUTOANTICUERPOS DISTINla presencia de esos anticuerpos.
TOS
DE SSA/RoS = Puntegtiato, H = Omogeneo, P = Periferico, N = Nucleolare, ACA = anti-Centromero
Abbreviazioni:
Se evaluaron sueros de 230 pacientes con diversas
TABLA 1
Diagnóstico
Población anómala (más de 4.500 sueros evaluados):
Lupus eritematoso sistémico
Artritis reumatoide
Enfermedad mixta del tejido conjuntivo
Esclerosis sistémica progresiva-difusa
Esclerosis sistémica progresiva-CREST
Artritis reumatoide juvenil
Sistémica
Poliarticular
Pauciarticular-B27+
DM/PM
Vasculitis
Población normal (más de 9.000 sueros evaluados):
20-60 años
70-80 años
Tipos de
patrón
%
Positivo
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
Abreviaturas: S = Moteado, H = Homogéneo, P = Periférico, N = Nucleolar, ACA = anti-Centrómero
29
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE ANA-Ro
POR COLORZYME® HEp-2000®
1. PREPARACIÓN DEL TAMPÓN (PBS)
Disuelva el contenido de una bolsa de tampón en
un litro de agua desionizada o destilada. El tampón
PBS se puede tapar y conservar a 2-10 ºC durante
cuatro semanas como máximo.
2. PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE COLOR
Disuelva el contenido de una bolsa en 150 ml de
agua desionizada o destilada. Mezcle bien hasta
que se disuelva por completo. Este reactivo de
color es estable durante 30 días a temperatura ambiente en un envase cerrado. Puede ser reutilizado
durante 30 días como máximo, o hasta que se
aprecie un cambio de color o alguna precipitación. Es normal que al volverlo a utilizar presente
turbidez u opalescencia, sin precipitado visible.
Dependiendo de la frecuencia de utilización, se
pueden utilizar 150 ml de reactivo de color Colorzyme® con un máximo de 20 portaobjetos.
3. DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE PACIENTES
Selección: Disuelva las muestras de pacientes a 1:
40 añadiendo 0,05 ml (50 µl) de suero a 1,95 ml de
PBS preparado.
Titulación semicuantitativa: Prepare series de diluciones dobles de la muestra o muestras de selección (p. ej. 1:80, 1:160, 1:320...1:2560) utilizando PBS.
4. PREPARACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS CON
SUSTRATO (20-25 µl/pocillo)
Saque los portaobjetos de las bolsas y disponga
los sueros de control en los pocillos de control,
como se indica: Invierta el frasco cuentagotas de
control y apriete hasta que se vea una gota en la
punta. Toque suavemente el pocillo de control con
la gota, evitando que la punta del cuentagotas
entre en contacto directo con la superficie del
portaobjetos. Ponga el control positivo en el pocillo
marcado con “+”, el negativo en el marcado con
“-“ y una gota de tampón PBS en el pocillo
marcado con “PBS”. Añada una gota (20-25 µl) de
muestra de paciente a los pocillos numerados.
NOTA: Para la selección general se recomienda
el control positivo homogéneo. Para la titulación
semicuantitativa, elija el control positivo que sea
más parecido al patrón de tinción de la muestra
de selección (p. ej., para una muestra de paciente
que presente un patrón de tinción moteado en la
selección, utilice un control positivo moteado). Si
se emplea el análisis de ANA-Ro HEp-2000® para
confirmar la presencia de anticuerpos anti- SSA/Ro,
el control positivo de SSA/Ro, número de catálogo
2035-Ro, debe realizarse en al menos un portaobjetos de los utilizados ese día.
PRECAUCIÓN: SI LA PUNTA DEL CUENTAGOTAS TOCA
DIRECTAMENTE LA SUPERFICIE DEL PORTAOBJETOS,
SE PUEDE DAÑAR EL SUSTRATO DE ANTÍGENO.
5. INCUBACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS (30±5
minutos a temperatura ambiente, es decir, 18-24
°C)
Ponga los portaobjetos en una cámara cubierta y
húmeda (bastará con una placa de Petri con una
toalla de papel humedecida). Incube con la tapa
puesta durante 30 minutos (±5 minutos) a temperatura ambiente (18-24 °C).
6. ENJUAGUE CON PBS
Saque los portaobjetos de la bandeja de la
incubadora y aclárelos un poco con PBS utilizando
una jeringa o una pipeta de Pasteur o serológica.
No utilice la jeringa directamente sobre los pocillos.
NOTA: Para evitar la contaminación cruzada de
los portaobjetos con 13 pocillos, dirija el chorro de
PBS a la línea media del portaobjetos, inclinándolo
primero hacia los pocillos 1-5 y luego hacia los
pocillos 6-10.
7. LAVADO CON PBS (10 minutos)
Lave los portaobjetos con PBS durante 10 minutos,
en una placa de tinción de portaobjetos o en una
jarra Coplin. Se recomienda agitar suavemente al
sumergir el portaobjetos, cuando haya pasado la
mitad del tiempo y al sacarlo. Este lavado puede
durar 10-30 minutos sin que varíen los resultados
finales. Una vez utilizada, tire la solución de lavado
PBS. Para que los resultados sean óptimos cambie
el PBS cuando haya pasado la mitad del tiempo, y
utilice un agitador magnético.
sumérjalos 3-5 veces en agua desionizada o destilada. Pase un papel secante o una toalla de papel
por el borde del portaobjetos para retirar el agua
sobrante. Vuelva a colocar de inmediato el portaobjetos en la cámara de incubación y cubra los pocillos por completo con el reactivo enzimático para
detectar anticuerpos; empiece por poner una
gota en cada pocillo. Repita la operación en cada
portaobjetos. El reactivo enzimático para detectar
anticuerpos ha sido titulado para compensar el
agua desionizada o destilada residual que queda
en el portaobjetos tras el enjuague.
NOTA: Es importante que los pocillos del portaobjetos no se sequen durante este procedimiento, pues
se podría dañar el sustrato.
NO SEQUE EL PORTAOABJETOS NI DEJE QUE PASEN
MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN AÑADIR EL REACTIVO.
9. INCUBACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS (30±5
minutos a temperatura ambiente, es decir, 18-24
°C)
Ponga la tapa de la cámara de incubación. Deje
que los portaobjetos se incuben 30 minutos (±5
minutos) a temperatura ambiente (18-24 ºC).
10. ENJUAGUE CON PBS
Retire los portaobjetos de la bandeja de la incubadora y enjuáguelos un poco con PBS. No utilice la
jeringa directamente sobre los pocillos.
11. LAVADO CON PBS (10 minutos)
Lave los portaobjetos con PBS durante 10 minutos,
en una placa de tinción de portaobjetos o en una
jarra Coplin. Se recomienda agitar suavemente al
sumergir el portaobjetos, cuando haya pasado la
mitad del tiempo y al sacarlo. Este lavado puede
durar 10-30 minutos sin que varíen los resultados
finales.
12. INCUBACIÓN DEL REACTIVO DE COLOR (30
minutos a temperatura ambiente, es decir, 18-24°C)
Saque los portaobjetos del PBS de uno en uno,
sumérjalos 3-5 veces en agua desionizada o destilada Y pase un papel poroso o una toalla de papel
por el borde del portaobjetos, para retirar el agua
sobrante. Coloque los portaobjetos inmediatamente en una jarra Coplin con reactivo de color
activado, y deje incubar durante 30 minutos.
13. ENJUAGUE CON PBS
Saque los portaobjetos de la jarra Coplin de uno en
uno, y enjuáguelos por ambos lados durante 4-5 segundos con PBS. No utilice la jeringa directamente
sobre los pocillos. Ponga cada portaobjetos enjuagado con PBS en una jarra Coplin llena de agua
destilada o desionizada, hasta que el reactivo de
color desaparezca de todos los portaobjetos. Pase
inmediatamente al paso 14.
14. PREPARACIÓN DE LOS CUBREOBJETOS
Saque los portaobjetos del PBS de uno en uno
y sumérjalos 3-5 veces en agua desionizada o
destilada. Pase un papel secante o una toalla de
papel por el borde del portaobjetos para retirar el
agua sobrante. NO SEQUE EL PORTAOABJETOS NI
DEJE QUE PASEN MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN PONER
EL CUBREOBJETOS. Añada 4-5 gotas de medio de
preparación semipermanente en la línea media de
cada portaobjetos. Coloque el cubreobjetos con
cuidado, evitando que se formen bolsas de aire,
haciendo bajar suavemente el cubreobjetos de un
lado del portaobjetos al otro.
NOTA: Si pone demasiado medio de preparación
en el portaobjetos puede que la resolución de las
células no sea clara (imagen borrosa). Si ha puesto
demasiado medio de preparación puede retirarlo
del portaobjetos secando suavemente el cubreobjetos con papel secante o para lentes, evitando
cualquier movimiento directo del cubreobjetos. Los
portaobjetos se pueden interpretar de inmediato,
o conservarlos durante algún tiempo a 2-10 ºC sin
que se pierda la reactividad.
ASISTENCIA TÉCNICA:
916-363-2649
o correo electrónico:
[email protected]
8. REACTIVO ENZIMÁTICO PARA DETECTAR ANTICUERPOS (cubra los pocillos con 12-14 gotas)
Saque los portaobjetos del PBS de uno en uno y
30
HEp-2000® COLORZYME® ANA-Ro TESTSYSTEM
NUR ZUR IN VITRO-DIAGNOSTIK
ZUSAMMENFASSENDE ERKLÄRUNG DES TESTS
INDIKATION: Dies ist ein indirekter Enzym-Antikörpertest
für den semiquantitativen Nachweis von antinukleären
Antikörpern in humanem Serum. Das Testsystem arbeitet
mit transfizierten† HEp-2 Zellen, welche die spezifische
Identifikation von Autoantikörpern gegen SSA/Ro
Antigen ermöglichen. Autoantikörper gegen SSA/Ro
weisen auf den transfizierten Zellen u.U. ein spezielles
Verfärbungsmuster auf. Ist dieses Muster vorhanden, so
ist dies als Bestätigung für das Vorhandensein von antiSSA/Ro Antikörpern zu werten.
Andererseits ist durch das Fehlen eines solchen
speziellen Musters das Vorhandensein von anti-SSA/
Ro Antikörpern nicht auszuschließen.
Der Test dient als Hilfestellung beim Nachweis von
Antikörpern, die mit systemischen rheumatischen
Erkrankungen assoziiert werden.
Der Terminus antinukleäre Antikörper (ANA) ist ein
Oberbegriff zur Beschreibung von Autoantikörpern
gegen verschiedene Zellkernproteine. Frühere Studien
dieser Autoantikörper, die mit Immunofluoreszenztechniken arbeiteten, haben einige wenige Spezifitäten
von Zellkernproteinen aufgezeigt (1). Wegen der hohen
Korrelation positiver ANA mit systemischem Lupus
erythematosus (SLE) ist diese Erkrankung bei negativen
ANA grundsätzlich auszuschließen (2).
Auch wenn DNA-spezifische Antikörper weiterhin eine
hohe Korrelation mit SLE (3) aufweisen, wurde eine
Reihe nukleärer (4) und zytoplasmischer (5-7) Makromoleküle nachgewiesen und mit anderen Bindegewebserkrankungen in Verbindung gebracht (8-10). Einige
dieser Antikörper haben offenbar einen diagnostischen
und/oder prognostischen Wert bei progressiver systemischer Sklerose (11-12), gemischter Bindegewebskrankheit (13-15), Sjögren-Syndrom (16-17), Polymyositis
(18) und/oder rheumatoider Arthritis (19). Aus diesem
Grunde werden ANA Tests mittlerweile als allgemeine
Screening-Methode zum Nachweis von Bindegewebskrankheit anerkannt (20).
Die Sensitivität des ANA Tests hängt von verschiedenen
Faktoren ab, wie Art des verwendeten Substrats,
Fixierungsverfahren und den im Serum vorhandenen
ANA-Typen. Zellkultursubstrate weisen im Allgemeinen
eine höhere Sensitivität als Gewebeteile auf (21-24). Der
Nachweis von Autoantikörpern gegen das SSA/Ro Antigen vollzieht sich sehr unterschiedlich. Nagetiergewebe
enthält keine nachweisbaren Mengen von SSA/Ro
Antigen (25); über unterschiedliche Sensitivität von 50
bis 90 % beim Nachweis von anti-SSA/Ro Antikörpern in
Zellkultursubstraten wurde berichtet (26-27).
Das Immuno Concepts HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Testsystem mit transfizierten mitotischen* Humanepitheloiden Zellen (HEp-2) stellt ein fortgeschrittenes
Immunoenzymsystem zum Nachweis von ANA dar.
Es hat sich gezeigt, dass HEp-2 Zellen mit mitotischer
Ausprägung eine höhere Sensitivität aufweisen und eine
bessere Mustererkennung als die klassischen Nierensubstrate von Mäusen beim Nachweis von Antikörpern
in progressiver systemischer Sklerose (PSS) bieten (28).
Die mitotische Ausprägung hilft bei der Differenzierung
der Mustererkennung sowie beim Nachweis von zuvor
unbekannten nukleären Antigenen, die in mitotisch
aktiven Zellen in höheren Konzentrationen vorhanden
sind (29-31). Die HEp-2 Zellen in diesem Testsystem wurden mehreren Kopien der spezifischen DNA-Sequenz
transfiziert, welche die Informationen für das SSA/Ro
Autoantigen trägt. Etwa 10-20 % der transfizierten Zellen
reagieren auf dieses Antigen überdeutlich, so dass
der Nachweis der Autoantikörper gegen SSA/Ro eine
höhere Konsistenz als auf nicht transfizierten HEp-2 Zellen
aufweist. Autoantikörper gegen SSA/Ro weisen auf
den transfizierten Zellen u.U. ein spezielles Verfärbungsmuster auf. Ist dieses Muster vorhanden, so ist dies als
Bestätigung für das Vorhandensein von anti-SSA/Ro
Antikörpern zu werten.
Andererseits ist durch das Fehlen eines solchen
speziellen Musters das Vorhandensein von anti-SSA/
Ro Antikörpern nicht auszuschließen.
† Die transfizierten Zellen und deren Verwendung sind
durch US-Patent 5,518,881 und weitere US- und internationale Patente geschützt.
*Der Terminus Mitose wird zur Beschreibung des Zell-
teilungsprozesses verwendet. Dieser Prozess lässt sich
in sechs grundsätzliche Phasen gliedern: Interphase,
Prophase, Metaphase, Anaphase, Telophase und
Zytokinese.
TESTPRINZIP
Das HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Testsystem von
Immuno Concepts arbeitet mit dem Verfahren der
indirekten Enzym-Antikörper. Dabei werden verdünnte
Patientenproben mit Antigensubstrat inkubiert, um
spezifische Bindungen von Autoantikörpern an Zellkerne
zu ermöglichen. Wenn ANA vorhanden sind, bildet sich
ein stabiler Antigen-Antikörperkomplex. Nach dem
Waschen, bei dem nicht-spezifische Antikörper entfernt
werden, wird das Substrat mit einem anti-Human-Antikörperreagens, das an Meerrettich-Peroxidase (HRP)
konjugiert ist, inkubiert. Bei positivem Ergebnis bildet
sich ein stabiler dreiteiliger Komplex, bestehend aus
an human-antinukleäre Antikörper gebundenen HRPkonjugierten anti-Human-Antikörpern, welche ihrerseits
an Zellkern-Antigen gebunden sind. Dieser Komplex
kann durch Inkubation des Objektträgers in Colorzyme®
Farbreagens, das ein enzymspezifisches Substrat enthält, sichtbar gemacht werden. Die Reaktion zwischen
enzymmarkiertem Antikörper und enzymspezifischem
Substrat führt zu einer Farbreaktion auf dem Objektträger, die unter einem gewöhnlichen Lichtmikroskop
sichtbar ist. In positiven Proben weisen die Zellkerne
eine dunkelblau bis purpurne Verfärbung mit einem
für diese Zellkern-Antigenverteilung charakteristischen
Muster innerhalb der Zellen auf. Wenn die Probe für
ANA negativ ist, zeigt der Zellkern keine deutliche
Zellkernverfärbung. Das Zytoplasma kann eine schwache Verfärbung aufweisen, wobei der außerhalb des
Chromosomen liegende Bereich mitotischer Zellen eine
dunklere Verfärbung aufweisen kann.
SYSTEMKOMPONENTEN (IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Verwendung: Sämtliche Komponenten werden
gebrauchsfertig geliefert, ohne dass Aliquotieren oder
eine Rekonstitution erforderlich sind (mit Ausnahme
von PBS-Puffer und Colorzyme® Farbreagens, die vor
Gebrauch in deionisiertem oder destilliertem Wasser
aufgelöst werden müssen).
Aufbewahrung: Alle Komponenten können gekühlt bei
2-10 °C aufbewahrt werden. Nach Rekonstitution sollte
PBS-Puffer in geschlossenen Behältern bei 2-10 °C im
Kühlschrank aufbewahrt werden.
Nach Rekonstitution kann Colorzyme® Farbreagens in
einem geschlossenen Behälter bei Zimmertemperatur
bis zu 30 Tage lang aufbewahrt werden. Je nach Gebrauchshäufigkeit können 150 ml Colorzyme® Farbreagens mit bis zu 20 Objektträgern verwendet werden.
Stabilität: Alle Komponenten sind bis mindestens
12 Monate nach Herstellungsdatum stabil. Keine
Komponenten nach Überschreiten des Verfallsdatums
verwenden.
REAKTIVE REAGENZIEN
Substratträger: ‡Katalognummer 2007-Ro (sieben Vertiefungen); 2013-Ro (dreizehn Vertiefungen). Objektträger
mit HEp-2000® Zellen (mit mitotischer Ausprägung) für
ANA-Substrat mit sieben bzw. dreizehn Vertiefungen,
direkt in den Testvertiefungen kultiviert und stabilisiert. Es
handelt sich dabei um HEp-2 Zellen, die stabil mit dem
SSA/Ro Autoantigen transfiziert wurden. Durch eine
spezielle Konstruktion wird die Gefahr der Kreuzkontamination der Vertiefungen bei den Tests minimiert.
Die Objektträger beinhalten Kontrollvertiefungen für
positive, negative und PBS-Reagenzien zur Erleichterung
der korrekten Interpretation der Ergebnisse.
SSA/Ro Positivkontrolle: Katalognummer 2035-Ro.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 1,0 ml positivem HumanKontrollserum mit SSA/Ro-spezifischen Antikörpern.
Dieses Serum weist eine für anti-SSA/Ro typische fleckige
Verfärbung auf HEp-2000® Zell-Substrat von Immuno
Concepts auf. Die Ausprägung ist, auf den Standort
bezogen, vorherrschend nukleär, mit deutlichen
nukleolaren Verfärbungen. In Zellen mit Überreaktion ist
u.U. auch eine schwache Verfärbung des Zytoplasma
festzustellen. Der Chromosombereich mitotischer Zellen
zeigt eine negative Färbung. Dieses Reagens enthält 0,1
% Natriumazid als Konservierungsmittel.
Homogenes Positivkontrollserum: Katalognummer 2021.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 1,0 ml positivem HumanKontrollserum mit DNA- und/oder DNP-Zellkern-spezifischen Antikörpern. Dieses Serum zeigt eine homogene
31
Färbung auf HEp-2000® Zell-Substrat von Immuno Concepts. Der Chromosombereich mitotischer Zellen zeigt
dieselbe homogene Färbung. Dieses Reagens enthält
0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
Veränderungen zu erkennen sind.
Gefleckte Positivkontrolle: Katalognummer 2022.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 0,5 ml positivem HumanKontrollserum mit Sm- und/oder RNP-Zellkern-Antigenspezifischen Antikörpern. Dieses Serum weist eine häufig
anzutreffende fleckige Verfärbung auf HEp-2000®
Zell-Substrat von Immuno Concepts auf. Der Chromosombereich mitotischer Zellen zeigt eine negative
Färbung. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Konservierungsmittel.
Nukleolus-Positivkontrolle: Katalognummer 2023.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 0,5 ml positivem Human-Kontrollserum mit Nukleolus-Antigen-spezifischen
Antikörpern. Dieses Serum zeigt eine nukleolare Färbung
auf HEp-2000® Zell-Substrat von Immuno Concepts.
Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
Zentromer-Positivkontrolle: Katalognummer 2025.
Gebrauchsfertiger Tropfer mit 0,5 ml positivem HumanKontrollserum mit Chromosom-Centromer-spezifischen
Antikörpern (Kinetochor). Dieses Serum zeigt eine
diskrete fleckige Färbung auf HEp-2000® Zell-Substrat
von Immuno Concepts. Der Chromosombereich mitotischer Zellen zeigt dieselbe diskrete Fleckenbildung und
Färbung. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Titrierbares Kontrollserum: Katalognummer 2026.
Gebrauchsfertiges Fläschchen mit 1,0 ml positivem
Human-Kontrollserum zur unverdünnten Verwendung
als Patientenprobe. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
Negativkontrollserum: Katalognummer 2031. Gebrauchsfertiger Tropfer mit 1,0 ml negativem HumanKontrollserum. Auch wenn das Negativkontrollserum
eine schwache Verfärbung des Zytoplasma aufweist,
wobei der außerhalb des Chromosomen liegende
Bereich der mitotischen Zelle eine hellere Färbung
aufweist, zeigt sich kein deutliches Färbungsmuster im
Zellkern. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Enzym-Antikörperreagens: Katalognummer 4009-Ro
(9,0 ml), 4075-Ro (23 ml). Anti-human-IgG, (schwere und
leichte Ketten) von der Ziege, an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert. Gebrauchsfertiges Reagens in
Präzisions-Tropffläschchen mit 9,0 ml für alle 10 Objektträger im Lieferumfang des Testkits.
Farbreagens: *Katalognummer 4066. HRP-spezifisches
Enzym-Substratpulver, enthält 4 Chloro 1-Naphthol. Jede
Packung enthält Pulver für 150 ml selbstaktivierendes
Colorzyme® Farbreagens.
Herstellung: Inhalt eines Beutels mit 150 ml deionisiertem
oder destilliertem Wasser auflösen. Gut durchmischen,
bis das Pulver völlig aufgelöst ist. Dieses Farbreagens
ist 30 Tage stabil, wenn es bei Raumtemperatur in
einem geschlossenen Behälter aufbewahrt wird. Dieses
Farbreagens kann bis zu 30 Tage lang, oder bis eine
Farbänderung oder Ausfällung zu beobachten ist,
wiederverwendet werden. Trübungen oder Schimmern
bei Wiederverwendung, ohne sichtbare Ausfällungen,
sind normal. Je nach Gebrauchshäufigkeit können 150
ml Colorzyme® Farbreagens mit bis zu 20 Objektträgern
verwendet werden.
‡ Dieser Objektträger ist durch mindestens eines der folgenden US- und anderen Patente geschützt: 4.387,972;
D-274261; 0727046; D-273261; 5,518,881; Patent
1,171,302 in Kanada, andere Patente angemeldet.
* Dieses Material ist durch mindestens eines der folgenden US- und anderen Patente geschützt: 4615972;
Patent 1231633 in Kanada. Patent 1177110 in Italien,
andere Patente angemeldet.
NICHT-REAKTIVE REAGENZIEN
PBS-Waschpuffer: Katalognummer 1011. Phosphat-gepuffertes Kochsalzpulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Jeder
Beutelinhalt reicht für 1 Liter gebrauchsfertigen Puffer.
(Ein Beutel Pufferpulver für je fünf Objektträger ist im
Lieferumfang des Testkits enthalten).
Herstellung: Einen Beutel Pufferpulver in 1 Liter deionisiertem oder destilliertem Wasser auflösen und gekühlt
bei 2-10 °C bis zu 4 Wochen aufbewahren, oder bis
Anzeichen von Kontamination oder andere sichtbare
32
Semipermanentes Eindeckmedium: Katalognummer
1111. Gebrauchsfertiges Tropf-Fläschchen mit 5,0 ml
Glycerol-basiertem Montagemedium, pH 9,1 ± 0,2.
Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
Deckgläser: Katalognummer 1041. Jede Packung
enthält zehn Deckgläser 24x60 mm Nr. 1.
ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHE MATERIALIEN (NICHT
IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Präzisionspipetten für Volumina von 20-25 µl.
Drei Coplin-Glaszylinder oder Färbungsschalen
Spritzflasche oder Pasteur-Pipetten
Serologische Pipetten.
Mehrere 1-Liter-Behälter mit Schraubverschluss (für
PBS-Waschpuffer).
Geschlossene Behälter zur Aufbewahrung von Colorzyme® Farbreagens.
Deionisiertes oder destilliertes Wasser.
Teströhrchen zur Herstellung von Serumverdünnungen.
Inkubationskammer
Saugpapier oder Papierhandtücher.
Einmal-Latexhandschuhe.
Laborstoppuhr.
Standard-Lichtmikroskop mit 200- und 400-facher
Vergrößerung.
SICHERHEITSHINWEISE
1. Sämtliche für dieses Produkt verwendeten Materialien menschlichen Ursprungs wurden nach von
der FDA anerkannten Methoden negativ (nicht wiederholt reaktiv) auf Antikörper gegen HIV-1, HIV-2,
Hepatitis-C (HCV) und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) getestet. Keine Testmethode kann
jedoch mit absoluter Sicherheit nachweisen, dass
keine HIV-1, HIV-2, Hepatitis-C oder Hepatitis-B-Viren
oder andere infektiöse Agenten vorhanden sind.
Daher sollten alle Kitbestandteile wie potenziell
infektiöse Materialien gehandhabt werden.
2. Alle Patientenproben sollten nach den Anforderungen für Biosafety Level 2 behandelt werden, wie für
potenziell infektiöses humanes Serum und andere
Blutbestandteile empfohlen in: Centers for Disease
Control / National Institutes of Health Manual:
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Ausgabe 1984.
3. Ein Verdünnen der Bestandteile oder eine Zugabe
von nicht zum Kit gehörenden Reagenzien kann die
Qualität der Ergebnisse beeinträchtigen.
4. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid (0,1 %) als
Konservierungmittel. Natriumazid kann mit Blei- oder
Kupferinstallationen reagieren und hochexplosive
Metallazidsalze bilden. Beim Entsorgen der Reagenzien mit reichlich Leitungswasser nachspülen, damit
im Abfluss keine Rückstände verbleiben. Natriumazid ist giftig und kann bei Verschlucken toxisch
wirken.
5. Der Kit ist ausschließlich zur In vitro-Diagnostik
bestimmt.
6. Falls hämolysierte oder lipämische Seren verwendet
werden müssen, die Seren durch Hitzeeinwirkung
(30 Minuten bei 56 °C) inaktivieren, um optimale
Ergebnisse zu erzielen. Mikrobiell kontaminierte
Seren dürfen nicht verwendet werden.
7. Es hat sich gezeigt, dass falsch-positive ANA durch
Bindung von C1q an DNA, unabhängig vom verwendeten Substrat, auftreten kann (32). Um mögliche Beeinträchtigungen durch C1q zu unterbinden,
sollten vor dem Test sämtliche Patientenseren routinemäßig bei 56 °C für 30 Minuten durch Erhitzung
inaktiviert werden.
8. Das titrierbare Kontrollserum ist für die Überwachung der Chargen- und Testlauf-übergreifenden
Reproduzierbarkeit bestimmt. Es ist nicht zur Messung der Gesamtsensibilität oder Spezifität des Tests
bestimmt.
9. In Bereichen, in denen mit Patientenproben oder
Kitreagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, essen
oder trinken.
10. Verspritzen von Reagenzien und Erzeugung von
Aerosolen vermeiden.
11. Die angegebenen Inkubationszeiten und Temperaturwerte genau einhalten, andernfalls könnten die
Ergebnisse verfälscht werden.
12. Eine Kreuzkontamination der Reagenzien oder Proben kann ebenfalls zu falschen Ergebnissen führen.
13. Wiederverwendbare Glasartikel müssen vor
Gebrauch gewaschen und gründlich ausgespült
werden, um sämtliche Waschmittelrückstände zu
entfernen. Die Glasartikel müssen vor Gebrauch
sauber und trocken sein.
14. Vor der Testdurchführung müssen alle Reagenzien,
Objektträger und Proben auf Zimmertemperatur
(18-24 °C) gebracht werden.
15. Beim Arbeiten mit Proben und Reagenzien sind
grundsätzlich Einmal-Latexhandschuhe zu tragen.
Danach gründlich Hände waschen.
16. Eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien
oder Proben kann das Ergebnis verfälschen.
17. Niemals mit dem Mund pipettieren und Kontakt der
Reagenzien und Proben mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Bei Kontakt mit viel Wasser und
desinfizierender Seife waschen.
18. Dieses Farbreagens kann bis zu 30 Tage lang,
oder bis eine Farbänderung oder Ausfällung zu
beobachten ist, wiederverwendet werden. Trübungen oder Schimmern bei Wiederverwendung,
ohne sichtbare Ausfällungen, sind normal. Je nach
Gebrauchshäufigkeit können 150 ml Colorzyme®
Farbreagens mit bis zu 20 Objektträgern verwendet
werden.
PROBENGEWINNUNG
Probenentnahme: Nach Möglichkeit sollten Serumproben hergestellt werden. Dazu durch Venenpunktion in
ein steriles Vakuumröhrchen oder durch ein anderes
geeignetes Blutentnahmesystem aseptisch ca. 5 ml
Vollblut entnehmen. Das Blut bei Zimmertemperatur (1824 °C) gerinnen lassen. Danach muss das Serum so bald
wie möglich durch Zentrifugation abgetrennt werden,
um Hämolyse zu vermeiden.
sollte diese Informationen zur Bewertung der Reproduzierbarkeit (Präzision) ihrer Testläufe heranziehen.
Für jede Chargennummer wurde durch mehrere Testläufe mit dieser titrierbaren Kontrolle, unter Verwendung des HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Testsystems
von Immuno Concepts, ein mittlerer Titrierungswert
ermittelt. Chargennummer, mittlere Titrierung und Titrierungsbereich (± eine Zweifach-Verdünnung nach oben
oder unten, ausgehend vom Mittel) sind auf dem Etikett
des Fläschchens verzeichnet und sollten zur Messung
der Systemleistung herangezogen werden.
Es ist wichtig, die Intensität der Verfärbung nicht mit
dem Vorhandensein bzw. Fehlen von antinukleären
Antikörpern zu verwechseln. Der entscheidende Faktor,
ob die Bestimmung einer gegebenen Serumverdünnung als positiv zu werten ist, ist das Vorhandensein
eines deutlichen Musters, unabhängig von der Intensität
der Verfärbung. Diese titrierbare Kontrolle zeigt die mit
RNP-Antikörpern assoziierte typische Fleckenbildung. Es
kann auch ein zweites Muster von NSp I auftreten (mehrere diskrete Flecken im Nukleus der Interphase-Zellen),
entscheidend für den Endpunkt ist jedoch das typische
RNP-Fleckenmuster.
Die in unserem Labor ermittelten Werte können von
Ihren eigenen Werten abweichen. Zahlreiche Faktoren
können Einfluss auf Ihre Ergebnisse nehmen; hier einige
Beispiele:
1. Korrekte Ausrichtung des Lichtwegs im Mikroskop.
Dazu die Anweisungen in der Gebrauchsanweisung
zu Ihrem Mikroskop lesen.
2. Die Blendenöffnung des Objektivs. Die Blendenöffnung bestimmt die Menge des aufgenommenen
Lichts und die Auflösung des Objektivs. Die
Blendenöffnung ist seitlich am Objektiv aufgedruckt.
3. Präzision und Genauigkeit der Verdünnungstechnik,
der Ausrüstung und der Ausführung der Testverfahren.
Störsubstanzen: Stark hämolytische, lipämische oder
durch Mikrobenwachstum verunreinigte Seren sowie
Seren von Ikteruspatienten dürfen nicht verwendet
werden, weil diese Zustände zu falschen Ergebnissen
führen können. Proben mit sichtbaren Verunreinigungen
müssen vor Verwendung zentrifugiert werden.
Aufbewahrung: Serumproben können bei einer Temperatur von 2-10 °C maximal eine Woche lang aufbewahrt
werden. Sollen die Proben länger aufbewahrt werden,
müssen sie bei mindestens –20 °C eingefroren werden.
Serum darf nicht in einem Kühlschrank oder Gefrierschrank mit Abtauautomatik gelagert werden.
ACHTUNG: Wiederholtes Einfrieren / Auftauen von
Patientenproben ist zu vermeiden. Andernfalls können falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse
auftreten.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
QUALITÄTSSICHERUNG
In den für die Qualitätssicherung vorgesehenen
Vertiefungen sollten für jeden Objektträger Positiv-,
Negativ- und PBS-Kontrollläufe durchgeführt werden.
Die positive Kontrollvertiefung sollte eine dunkelblau bis
purpurne Verfärbung im Zellkern aufweisen, mit einem
deutlichen Muster wie es für das verwendete Kontrollserum charakteristisch ist. Das Zytoplasma kann in der
positiven Kontrollvertiefung eine hellblau bis purpurne
Färbung annehmen. Die Negativkontrolle sollte eine
hellblau bis purpurne Verfärbung in Zytoplasma und
Nukleus aufweisen, jedoch ohne deutliches Muster einer
Verfärbung des Zellkerns. Die PBS-Kontrollvertiefung wird
zur Beobachtung nicht-spezifischer Verfärbungen durch
das Enzym-Antikörper-Reagens verwendet und sollte
keine Blaufärbung aufweisen. Wenn die Kontrollvertiefungen nicht die beschriebenen Merkmale aufweisen,
ist der Test ungültig und muss wiederholt werden.
Falls der HEp-2000® ANA-Ro Test zur Bestätigung des
Vorhandenseins von anti-SSA/Ro Antikörpern dient,
muss die SSA/Ro Positivkontrolle, Katalognummer 2035Ro, auf mindestens einem Objektträger am selben Tag
mitlaufen.
OPTIONALE TITRIERBARE KONTROLLE
Beim Auswerten der Titrierungen beginnen viele Labore
mit der Vertiefung, die die Probe mit der größten
Verdünnung enthält, und fahren mit der Auswertung
„nach hinten” zur 1:40-Verdünnung fort. Die erste Vertiefung, in der eine deutliche Verfärbung des Zellkerns
sichtbar ist, ist der Titrierungsendpunkt. Wir empfehlen
diese Vorgehensweise zur Bestimmung des Titrierungsendpunkts.
In unserem Labor wurde der mittlere Titrierungsbereich
(± eine Verdünnung nach oben oder unten, vom Mittel
ausgehend) festgelegt; dieser gilt als Richtwert. Mit Hilfe
dieser Kontrolle kann jedes Labor die Reproduzierbarkeit
(Präzision) seiner ANA-Tests selbst einschätzen. Da diese
Kontrolle nicht als Indikator für die Titrierungsgenauigkeit
vorgesehen ist, muss jedes Labor seinen eigenen mittleren Titrierungsendpunkt für diese Probe festlegen und
INTERPRETATION DER PATIENTENERGEBNISSE
Für das Positiv-/Negativ-Screening wird eine 200-fache
Vergrößerung empfohlen, eine 400-fache Vergrößerung hingegen wird zur Mustererkennung und zum
Betrachten mitotischer Zellen empfohlen.
Negative Reaktion: Ein Serum ist als negativ für antinukleäre Antikörper zu werten, wenn die Verfärbung des
Nukleus geringer als oder gleich der negativen Kontrollvertiefung und kein deutliches Muster zu erkennen
ist. Das Zytoplasma kann eine schwache Verfärbung
aufweisen, wobei der außerhalb des Chromosomen
liegende Bereich mitotischer Zellen eine hellere Verfärbung zeigt und kein deutliches Muster im Nukleus zu
erkennen ist.
Positive Reaktion: Ein Serum ist als positiv zu werten,
wenn der Zellkern der meisten Interphase-Zellen eine
deutlich sichtbare Verfärbung aufweist.
SSA/Ro: Ein Serum ist als positiv für SSA/Ro Antikörper
zu werten, wenn 10-20 % der Interphasen-Nuclei das
charakteristische SSA/Ro Verfärbungsmuster aufweisen,
ein hell geflecktes Muster mit deutlicher Verfärbung
der Nucleoli. Dabei handelt es sich um transfizierte
Zellen mit Überreaktion. Die übrigen 80-90 % der Interphasen-Nuclei weisen manchmal eine fein gefleckte
Verfärbung des Nukleus auf, mit oder ohne Verfärbung
der Nucleoli.
Titrierungen: Beim Auswerten der Titrierungen beginnen viele Labore mit der Vertiefung, die die Probe mit
der größten Verdünnung enthält, und fahren mit der
Auswertung „nach hinten” zur 1:40-Verdünnung fort. Die
erste Vertiefung, in der eine deutliche Verfärbung sichtbar ist, ist der Titrierungsendpunkt. Wir empfehlen diese
Vorgehensweise zur Bestimmung des Titrierungsendpunkts. Es ist wichtig, die Intensität der Verfärbung nicht
mit dem Vorhandensein bzw. Fehlen von antinukleären
Antikörpern zu verwechseln. Der entscheidende Faktor,
ob die Bestimmung einer gegebenen Serumverdünnung als positiv zu werten ist, ist das Vorhandensein
eines deutlich erkennbaren Musters, unabhängig von
der Intensität der Verfärbung. Aufgrund der erhöhten
Konzentration von SSA/Ro Antigen in den Zellen mit
Überreaktion ist es nicht ungewöhnlich, wenn bei sehr
hohen Titrierungen eine Verfärbung der Zellen auftritt.
Die klinische Bedeutung dieser hohen Titrierungen ist
nicht bekannt.
Achtung: Einige Seren können eine Verfärbung des
Nukleus und des Zytoplasma ohne deutliches Muster
aufweisen. Dieses Phänomen ist im Allgemeinen auf
33
��
��
heterophile Antikörper zurückzuführen und ist als negativ zu werten (33).
Verfärbung. Anaphase- und Telophase-Zellen weisen
u.U. eine ähnliche Verfärbung wie Interphase-Zellkerne
auf.
Nukleäre Antigene: Im Allgemeinen als 4-6s RNAs
bezeichnet sowie andere nukleäre Antigene wie
Fibrillarin, RNA Polymerase I, NOR 90 und PM/Scl.
Assoziierte Erkrankung: Hohe Titrierungen, vor allem
bei Sklerodermie und Sjögren-Syndrom (37).
ENZYM-VERFÄRBUNGSINTENSITÄT
Der Grad der Verfärbungsintensität hat keinen nachweisbaren klinischen Wert und nur begrenzten Wert
als Titrierungs-Indikator (34). Um die Interpretation zu
vereinfachen, Screening-Ergebnisse als stark positiv
oder positiv werten und entsprechend titrieren.
��Reaktion:
��
��
Stark positive
Dunkelblau
bis stark dunkelblaupurpurne
Verfärbung mit klar��
erkennbarer Zellkontur und
��
klar definiertem Zellkernmuster.
Positive
Reaktion: Schwache oder unterschwellige
��
Blau- bis Purpurfärbung mit größeren Abweichungen
zwischen den Zellen. Die Zellkontur kann bei einigen Zellen weniger klar definiert sein, wobei die Mehrzahl der
Zellen immer noch eine deutlich sichtbare Verfärbung
aufweist.
HINWEIS: Da die Zellen direkt auf der Oberfläche des
Objektträgers kultiviert werden, durchlaufen nicht
alle Zellen die gleiche Zyklusphase. Unterschiedliche
Verfärbungsintensität zwischen den Zellen ist auf Grund
der unterschiedlichen Konzentrationen und Standorte
��
��
der verschiedenen Antigene im Verlauf
eines Zellzyklus
��
��
nicht
ungewöhnlich.
*CREST ist eine Form von PSS, mit hervorragender Kalzi��
��
nose, Raynaud’sches Phänomen, Ösophagus-Dysfunk��
tion, Sklerodaktylie
und Teleangiektasie.��
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
SSA/Ro: Ein charakteristisches Fleckenmuster mit
��
deutlicher
Verfärbung der Nucleoli in 10-20 % der Interphasen-Nuclei. Dabei handelt es sich um transfizierte
Zellen mit Überreaktion. Die übrigen 80-90 % der Interphasen-Nuclei weisen manchmal eine fein gefleckte
Verfärbung des Nukleus auf, mit oder ohne Verfärbung
der Nucleoli. Der Bereich außerhalb des Chromosoms
mitotischer Metaphasezellen zeigt eine Verfärbung, der
Chromosombereich ist jedoch negativ.
Nukleäre Antigene: SSA/Ro (60kD).
Assoziierte Erkrankung: Festzustellen bei 60-70 % der
Patienten mit primärem Sjögren-Syndrom, 30-40
% der Patienten mit SLE und mehr als 95 % der
��
��
Patienten mit subakutem kutanem Lupus (38).
��
Screening: Die Ergebnisse sind bei der 1:40-Verdünnung
als stark positiv oder positiv zu werten, die Verfärbungscharakteristik des Nukleus ist festzuhalten.
Titrierung: Die letzte Reihenverdünnung, in der eine
deutliche Verfärbung sichtbar ist, ist als Ergebnis
anzugeben. Ergebnisse mit einer starken Reaktion bei
der 1:2560-Verdünnung sind als größer als 1:2560 zu
werten. Titrierungen von 1:40 bis 1:80 sind als niedrige
Titrierungen anzusehen; Titrierungen von 1:160 bis 1:320
sind als mittlere Titrierungen und Titrierungen von 1:640
��
��
und größer sind als hohe Titrierungen anzusehen.
��
Zentromer: Eine diskrete fleckige Verfärbung, die stark
auf das CREST* Syndrom schließen lässt, eine Variante
��
��
��
der progressiven
systemischen
Sklerose��
(28).
Die Flecken
im Nukleus
sind sehr diskret und in der Regel
ein Viel��
��
faches von 46 (meist 23-46 Flecken pro Nukleus). Da es
sich bei Zentromeren um Bündelungen handelt, wobei
��
Spindelfasern
an den Chromosomen anhaften, weisen
mitotische Zellen im Chromosombereich dieselbe Fleckenbildung auf (12).
Synonyme Bezeichnung: ACA; diskrete Fleckenbildung.
Nukleäre Antigene: Chromosomen-Zentromer
(Kinetochor).
Assoziierte Erkrankung: Deutliches Indiz für CREST*
Syndrom, eine Variante der progressiven systemischen Sklerose (28).
��
��
��
MUSTERERKENNUNG
��
��
Homogen: Eine deutliche Verfärbung des Nukleus mit
oder ohne sichtbare Maskierung der Nucleoli. Der
Chromosombereich von mitotischen Metaphase-Zellen ist deutlich positiv, mit einer gleichmäßigen oder
peripheren Verfärbungsintensität, größer oder gleich
dem Interphasen-Nukleus.
Synonyme Bezeichnung: Diffus; fest.
Nukleäre Antigene: dsDNA; nDNA; DNP; Histon.
Assoziierte Erkrankung: Hohe Titrierungen lassen auf
SLE schließen.
Niedrige Titrierungen lassen auf SLE oder andere
��
Bindegewebskrankheiten ��
schließen (35).
��
��
Peripher: Eine deutliche Verfärbung, vor allem im
Außenbereich des Nukleus, mit schwächerer Verfärbung��
zur Zellkernmitte hin. Der Chromosombereich von
mitotischen Metaphase-Zellen ist deutlich positiv, mit
einer gleichmäßigen oder peripheren Verfärbungsintensität, größer oder gleich dem Interphasen-Nukleus.
Synonyme Bezeichnung: Rand, zottelig, membranös.
Nukleäre Antigene: dsDNA; ssDNA, nDNA; DNP;
Histon.
Assoziierte Erkrankung: Hohe Titrierungen lassen
auf SLE schließen; niedrigere Titrierungen lassen
auf SLE oder andere Bindegewebskrankheiten
schließen (35).
��
��
��
��
��
��
MITOTISCHE
ZELLEN
��
NACHWEIS:
Mitotische Zellen sollten bei 200-facher Vergrößerung oder niedriger in jedem Feld zu sehen sein. Zur
Überprüfung, ob eine Zelle sich in Mitose befindet, ist
eine 400-fache Vergrößerung notwendig. Mitotische
Zellen zeigen eine charakteristische runde Zellform
ohne sichtbare Zellkernmembran. Der Chromosombereich mitotischer Zellen weist, wegen der fehlenden
Zellkernmembran, im Allgemeinen eine unregelmäßige
Form innerhalb der Zelle sowie eine extreme Zusammenschnürung der Chromosomen auf.
��
Fleckig: Eine grobe oder feine Granularverfärbung des
��
��
Nukleus, im Allgemeinen ohne Verfärbung der Nucleoli.
Der Bereich außerhalb des Chromosoms mitotischer
Metaphasezellen zeigt eine Verfärbung, der Chromosombereich ist jedoch negativ ohne Verfärbung.
Nukleäre Antigene: Sm; RNP; Scl-70; SS-B sowie
andere noch nicht näher beschriebene Antigen/Antikörpersysteme.
Assoziierte Erkrankung: Hohe Titrierungen lassen
auf SLE (Sm Antigen), gemischte Bindegewebskrankheit (RNP Antigen), Sklerodermie (Scl-70
Antigen) oder Sjögren-Syndrom-Siccakomplex
(SS-B Antigen) schließen. Niedrigere Titrierungen
lassen auf andere Bindegewebskrankheiten
schließen (36).
��
Seren, die für DNA und/oder
Histon
�� DNP und/oder ��
positiv sind (wie etwa die homogene Positivkontrolle
von Immuno Concepts) weisen eine helle Verfärbung
der Zellen im Chromosombereich auf. Bei Proben, die
für DNA und/oder DNP und/oder Histon negativ sind
(wie etwa die gefleckte Positivkontrolle von Immuno
Concepts), weisen die mitotischen Zellen keine Verfärbung im Chromosombereich auf und sind u.U. schwer
zu erkennen.
VERWENDUNG MITOTISCHER ZELLEN
Unterscheidung von gefleckten vs. homogenen
Antikörpern: Feine Fleckenstrukturen sind u.U. schwer
von homogenen Verfärbungen zu unterscheiden.
Kennzeichen einer homogenen Struktur ist eine durchgehende Verfärbung der Chromosomen mitotischer
Zellen. Zeigt das Muster deutliche Fleckenbildung, dann
weist der Bereich außerhalb der Chromosomen eine
zarte Fleckenreaktion auf.
Nukleolar: Große grobfleckige Verfärbungen des
Nukleus, im Allgemeinen weniger als 6 pro Zelle, mit
oder ohne kleinere feine Flecken, 5-10 an der Zahl.
Der Bereich außerhalb des Chromosoms mitotischer
Metaphase-Zellen zeigt eine starke Verfärbung, der
Chromosombereich zeigt jedoch nur eine schwache
34
HINWEIS: Wenn die gesamte mitotische Zelle eine
feine Fleckenbildung und der Chromosombereich
eine durchgehende Verfärbung aufweisen, dann
sind höchstwahrscheinlich zwei oder mehr Antikörper
vorhanden. Die Screening-Verdünnung ist als gefleckt/
homogen zu werten und jeder Antikörper ist zum Endpunkt zu titrieren.
Periphere vs. Kernmembran-Antikörper: Antikörper, die
ein peripheres Muster aufweisen, werden im Allgemeinen mit DNA/DNP nukleären Antigenen assoziiert. Hohe
Titrierungen dieser Antikörper lassen auf SLE schließen.
In Substraten, die keine mitotischen Zellen enthalten, ist
das periphere Muster u.U. schwer von KernmembranAntikörpern zu unterscheiden. Wenn die mitotischen
Zellen von Immuno Concepts verwendet werden, sind
diese Muster zu unterscheiden, da der Chromosombereich der mitotischen Zellen eine intensive periphere
Verfärbung aufweist, es tritt jedoch keine Verfärbung
durch Zellkernmembran-Antikörper ein. Diese Unterscheidung ist klinisch sehr wichtig, da ZellkernmembranAntikörper keine DNA-/DNP-Spezifität aufweisen und
nicht mit SLE assoziiert werden (39).
Anti-Zentromer-Antikörper (ACA) vs. atypisch gefleckte,
Zentromer-ähnliche Antikörper: Um auf Anti-ZentromerAntikörper zu kontrollieren, sollte der Chromosombereich der mitotischen Zellen eine helle Verfärbung mit
diskreten Flecken aufweisen. Tritt im Chromosombereich
keine Fleckenbildung auf, dann ist der Antikörper nicht
anti-zentromer und sollte auch nicht als „atypisch
gefleckt“ gewertet werden (40).
SSA/Ro vs. Muster, die u. U. einer SSA/Ro Verfärbung
ähneln: Die charakteristische SSA/Ro-Färbung ist als
deutliches helles Fleckenmuster mit starker Verfärbung
der Nucleoli in 10-20 % der Interphasen-Zellkerne zu
sehen. Die übrigen 80-90 % der Interphasen-Zellkerne
weisen manchmal eine fein gefleckte Verfärbung des
Zellkerns auf, mit oder ohne Färbung der Nucleoli. Der
Chromosombereich mitotischer Metaphasezellen zeigt
keine Verfärbung. Das nukleolare Muster kann durch
eine große grobfleckige Verfärbung aller Zellkerne,
meist weniger als 6 pro Zelle, identifiziert werden. Das
Scl-70 Muster weist eine feine fleckige Verfärbung und
eine nukleolare Verfärbung aller Interphasen-Zellkerne
auf und eine Verfärbung im Chromosombereich mitotischer Metaphasezellen. Antikörper gegen Proliferierendes Zellkern-Antigen (PCNA) weisen unterschiedliche
grobe und feine Flecken in 30-50 % der InterphasenZellkerne auf.
ZYTOPLASMA-VERFÄRBUNG
Auch wenn Autoantikörper gegen Zytoplasma-Antigene im Allgemeinen nicht mit Bindegewebskrankheit
assoziiert werden, können diese Antikörper mithilfe von
Epithel-Zellkultursubstraten nachgewiesen werden (41).
Mitochondrien- und gleichmäßige Muskel-Antikörper
sind die beiden am häufigsten nachgewiesenen Antikörper und werden im Allgemeinen mit Mononukleose,
chronischer aktiver Hepatitis und Lebererkrankung assoziiert (42, 43). Mithilfe des HEp-2 Zellsubstrats konnten
gleichmäßige Muskel-Antikörper auch in Patienten mit
Warzen nachgewiesen werden (44).
Anti-Mitochondrien-Antikörper (AMA): Diskrete Flecken,
im perinukleären Bereich der Zelle konzentriert sowie
in niedrigerer Dichte auf die Außenbereiche des Zytoplasma verteilt. Diese sind von Anti-Golgi Antikörpern
zu unterscheiden, welche im Allgemeinen nur auf
einer Seite des perinukleären Bereichs Flecken bilden,
sowie von Anti-Ribosomen-Antikörpern, welche feinere
Flecken mit einem strangartigen Erscheinungsbild
aufweisen, das mit dem Standort des endoplasmischen
Retikulums innerhalb der Zelle konsistent ist.
SSA/Ro
HINWEIS: Perinukleäre Flecken sind am leichtesten
von peripheren nukleären Flecken zu unterscheiden,
wenn berücksichtigt wird, dass die Mitochondrien eine
ungleichmäßig gefleckte Verfärbung an der Außenseite
der Zellkernmembran bilden, während periphere Seren
durch eine durchgängige, gleichmäßige Verfärbung in
der Zellkernmembran gekennzeichnet sind.
SEREN SIND ALS NEGATIV FÜR ANTINUKLEÄRE ANTIKÖRPER ZU WERTEN UND FÜR ANTIMITOCHONDRIEN-ANTIKÖRPER POSITIVE SEREN SIND AUF AMA-SPEZFISCHEN
SUBSTRATEN ZU PRÜFEN.
Nukleolar
Anti-gleichmäßige Muskel-Antikörper (ASMA): Sehr
feine fibröse Verfärbungen der Zellen über das ganze
Zytoplasma mit „Spinnweb“-ähnlichem Aussehen. Im
Gegensatz zu Mitochondrien-Antikörpern, sind Verfärbungen von gleichmäßigen Muskel-Antikörpern gleichmäßig über das ganze Zytoplasma verteilt und können
sich über den Nukleus hinaus ausdehnen. Mitotische
Zellen weisen im Allgemeinen große diskrete Flecken
außerhalb des Chromosombereichs auf. Gleichmäßige
Muskel-Antikörper haben erwiesenermaßen eine hohe
Spezifität mit Aktin (45, 46).
SEREN SIND ALS NEGATIV FÜR ANTINUKLEÄRE
ANTIKÖRPER ZU WERTEN UND FÜR ANTI-SMOOTH
MUSKEL-ANTIKÖRPER POSITIVE SEREN SIND AUF
ASMA-SPEZFISCHEN SUBSTRATEN ZU PRÜFEN.
EINSCHRÄNKUNGEN DES TESTS
1. Es ist nicht möglich, lediglich auf der Basis des
Nachweises antinukleärer Antikörper eine Diagnose
zu stellen. Der Arzt muss die Ergebnisse im Zusammenhang mit Krankengeschichte und Symptomen
des Patienten, den Ergebnissen der körperlichen
Untersuchung und anderen diagnostischen Methoden interpretieren.
2. Lediglich auf Grund eines positiven Testergebnisses
für antinukleäre Antikörper mit diesem Test sollte
keine Behandlung initiiert werden. Für eine Behandlung müssen auch klinische Symptome, andere
Laborergebnisse und der Gesamteindruck des
Patienten auf den behandelnden Arzt herangezogen werden.
3. Einige Medikamente, darunter Procainamid und
Hydralazin, können eine Lupus erythematosusähnliche Erkrankung induzieren (47). Patienten mit
medikamenteninduziertem LE können u.U. positiv
homogene oder homogen/periphere ANA auf-
PCNA
Scl-70
35
4.
5.
6.
7.
8.
9.
weisen, die direkt gegen nukleäre Histone gerichtet
sind (48).
Bei einem kleinen Prozentsatz der Patienten mit SLE
sind durch indirekte Immunoenzyme u.U. keine ANA
nachweisbar, sie können jedoch mithilfe anderer
Techniken nachgewiesen werden (49).
Auch wenn ein hoch-titriertes ANA als starkes Indiz
für Bindegewebskrankheit zu sehen ist, ist der diagnostische Wert gering. Das Ergebnis sollte vielmehr
in Zusammenhang mit dem klinischen Gesamtprofil
des Patienten bewertet werden.
Die Muster von Verfärbungen ändern sich oft mit
fortschreitender Titrierung der Seren. Dieses Phänomen ist in der Regel auf das Vorhandensein von
mehr als einem Antikörper zurückzuführen.
Bei einem geringen Prozentsatz von Patienten mit
infektiösen und/oder neoplastischen Krankheiten
sind auch positive ANA sichtbar (9).
Autoantikörper gegen SSA/Ro weisen auf den
HEp-2000® transfizierten Zellen ein typisches Verfärbungsmuster auf. Ist dieses Muster vorhanden, so
ist dies als Bestätigung für das Vorhandensein von
anti-SSA/Ro Antikörpern zu werten. Andererseits ist
durch das Fehlen eines solchen speziellen Musters
das Vorhandensein von anti-SSA/Ro Antikörpern
nicht auszuschließen.
Aufgrund der Überreaktion des SSA/Ro Autoantigens in den HEp-2000® Zellen, weisen Proben mit
anti-SSA/Ro Antikörpern höhere Titrierungswerte in
den Zellen auf, als die auf nicht-transfizierten HEp-2
Zellen ermittelten Werte. Da keines der übrigen Autoantigene in den HEp-2000® Zellen vom Transfektionsprozess betroffen ist, weisen Seren mit anderen
Autoantikörper-Spezifitäten keine signifikanten
Titrierungsunterschiede zwischen transfizierten HEp2000® Zellen und nicht-transfizierten HEp-2 Zellen
auf.
ZU ERWARTENDE WERTE
Die folgenden Daten wurden im Verlauf von zwei
Jahren in einem medizinischen Zentrum einer großen
Universität mithilfe eines Hep-2 ANA Zellsubstrats erstellt
(50). Tabelle 1.
SEREN VON PATIENTEN MIT ANDEREN AUTOANTIKÖRPERN
ALS SSA/Ro
Serumproben von 230 Patienten mit verschiedenen
rheumatischen und nicht-rheumatischen Erkrankungen
wurden mit im Handel erhältlichen, nicht-transfizierten
Hep-2 Zellen und dem HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Testsystem parallel getestet. Bei 120 Proben war ein
einzelnes Verfärbungsmuster festzustellen, 110 Proben
wiesen Mischungen auf. Von der Gesamtpopulation
von 230 Proben waren auf beiden Substraten 333
Verfärbungsmuster identisch. Auf dem HEp-2000®
Colorzyme® ANA-Ro Testsystem wiesen 29 Proben das
typische „SSA/Ro“ Verfärbungsmuster auf. 23 dieser
Proben zeigten auf den nicht-transfizierten HEp-2 Zellen
fleckige Muster. Alle sechs Proben mit Diskrepanzen
(positiv auf HEp-2000® und negativ auf nicht-transfizierten HEp-2 Zellen) hatten SSA/Ro Antikörper, wie
durch das typische „SSA/Ro“ Verfärbungsmuster sowie
durch ELISA-Tests und Western Immunoblotting bestätigt
wurde.
VERGLEICHEN VON TITRIERUNGEN
Aufgrund der Überreaktion des SSA/Ro Autoantigens in
den HEp-2000® Zellen, weisen Proben mit anti-SSA/Ro
Antikörpern höhere Titrierungswerte in den Zellen auf,
als die auf nicht-transfizierten HEp-2 Zellen ermittelten
Werte. Da keines der übrigen Autoantigene in den
HEp-2000® Zellen vom Transfektionsprozess betroffen ist,
weisen Seren mit anderen Autoantikörper-Spezifitäten
keine signifikanten Titrierungsunterschiede zwischen
transfizierten HEp-2000® Zellen und nicht-transfizierten
HEp-2 Zellen auf.
REPRODUZIERBARKEIT VON TITRIERUNGEN
Zehn Proben, aus CDC-Kontrollen und anderen gut
beschriebenen hauseigenen Seren ausgewählt, wurden
auf drei verschiedenen Chargennummern von HEp2000® Objektträgern bei drei verschiedenen Gelegenheiten getestet. In keinem Fall wies eine negative Probe
positive Ergebnisse auf. Alle Titrierungswerte lagen
innerhalb der zweifachen Verdünnung des für alle getesteten Proben errechneten mittleren Titrierungswerts.
BESTÄTIGUNG DER SSA/Ro ANTIKÖRPER
In einem großen rheumatologischen Referenzlabor
wurden Serumproben von 349 Patienten mit bekannten
positiven ANA-Tests mithilfe des HEp-2000® Colorzyme®
ANA-Ro Testsystems getestet. In dieser ausgewählten
Population wiesen 239 Proben das typische SSA/Ro
Verfärbungsmuster auf. Bei 238 (99,6 %) dieser Proben
wurden auf SSA/Ro Antikörper positive ELISA-Tests erzielt.
Weitere 79 Proben wiesen stark gefleckte und/oder
homogene Muster auf und waren bei den ELISA-Tests
positiv auf SSA/Ro Antikörper. Wenn also das typische
SSA/Ro Muster zu erkennen ist, so ist dies eine Bestätigung für das Vorhandensein von SSA/Ro Antikörpern;
andererseits ist durch das Fehlen dieses Musters das
mögliche Vorhandensein von SSA/Ro Antikörpern nicht
auszuschließen. In den oben beschriebenen Studien
wurden insgesamt 429 Seren überprüft, die laut ELISATests und/oder Western Immunoblotting SSA/Ro Antikörper enthielten und auf den transfizierten HEp-2000®
Zellen das typische SSA/Ro Verfärbungsmuster aufwiesen. Außerdem waren Proben vorhanden, die SSA/Ro
Antikörper enthielten, jedoch nicht das typische SSA/Ro
Verfärbungsmuster aufwiesen, da hohe Anteile andere
Autoantikörper (in der Regel anti-DNA Antikörper oder
anti-Sm/RNP Antikörper) das SSA/Ro Muster überdecken
können. Wenn also das typische SSA/Ro Muster zu
erkennen ist, so ist dies eine Bestätigung für das Vorhandensein von SSA/Ro Antikörpern; andererseits ist durch
das Fehlen dieses Musters das mögliche Vorhandensein
von SSA/Ro Antikörpern nicht auszuschließen.
LEISTUNGSFÄHIGKEIT DES TESTS
NORMALE PROBEN:
Seren von 500 gesunden Blutspendern, 242 Frauen
und 258 Männer, bei denen keine rheumatische
Erkrankung bekannt war, wurden parallel mit im Handel
erhältlichen, nicht-transfizierten HEp-2 Zellen und dem
HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Testsystem getestet.
In dieser Population wiesen 36 Proben (7,2 %) positive
antinukleäre Antikörper bei einer Serumverdünnung
von 1:40 auf. Die Verfärbungsmuster waren auf beiden
Substraten bei 34 der 36 positiven Proben identisch.
Die zwei Proben, die Unterschiede aufwiesen, stammten beide von weiblichen Patienten, und bei beiden
wurde das Vorhandensein von anti-SSA/Ro-Antikörpern
bestätigt. Eine dieser Proben zeigte eine schwache
feine Sprenkelung auf den nicht-transfizierten HEp-2
Zellen und die typische „SSA/Ro“ Verfärbung auf dem
HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Testsystem. Die andere
Probe war auf den nicht-transfizierten Hep-2 Zellen
negativ, wies jedoch die typische „SSA/Ro“ Verfärbung
auf dem HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro Testsystem
auf. Die SSA/Ro Spezifität dieser beiden Proben wurde
durch ELISA-Tests und durch Western Immunoblotting
bestätigt. In den ANA Tests negative Proben waren
auch im ELISA-Assay negativ.
SEREN VON PATIENTEN MIT AUSSCHLIEßLICH SSA/Ro
ANTIKÖRPERN
Seren von 46 Patienten mit SLE oder Sjögren-Syndrom
wurden mit im Handel erhältlichen, nicht-transfizierten
Hep-2 Zellen und dem HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
Testsystem getestet. Bei allen diesen Seren wurde das
Vorhandensein von Antikörpern gegen das SSA/Ro
Autoantigen durch ELISA-Tests und durch Western
Immunoblotting bestätigt. In keiner der Proben waren
weitere Antikörper festzustellen. 36 dieser Proben (78 %)
waren auf den nicht-transfizierten Hep-2 Zellen positiv
(Sprenkelung) und alle 46 (100 %) waren auf dem HEp2000® Colorzyme® ANA-Ro Testsystem positiv (typische
SSA/Ro Verfärbung).
36
70-80 años
S
3.5
Abreviaturas: S = Moteado, H = Homogéneo, P = Periférico, N = Nucleolar, ACA = anti-Centrómero
TABELLE 1
Diagnose
Anormale Population (über 4.500 Seren getestet):
Systemischer Lupus erythematosus
Rheumatoide Arthritis
Gemischte Bindegewebskrankheit
Progressive systemische Sklerose – diffus
Progressive systemische Sklerose – CREST
Juvenile rheumatoide Arthritis
Systemisch
Polyartikulär
Pauciartikulär – B27+
DM/PM
Vaskulitis
Normale Population (über 9.000 Seren getestet):
20-60 Jahre
70-80 Jahre
Muster
Segregation
%
positiv
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
Abkürzungen: S = Gefleckt, H = Homogen, P = Peripher, N = Nucleolar, ACA = Anti-Zentromer
Diagnos
Onormal population (över 4500 sera testade):
Systemisk lupus erytematosus
Reumatoid artrit
Blandad bindvävssjukdom
Progressiv diffus systemisk skleros
Progressiv systemisk skleros-CREST
Reumatoid artrit hos barn
Systemisk
Polyartikularis
Pauciartikularis-B27+
DM/PM
Vaskulit
Normal population (över 9000 sera testade):
20-60 år
70-80 år
Mönsterfördelning
%
positiv
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
Förkortningar: S = Fläckig, H = Homogen, P = Perifer, N = Nukleolär, ACA = Anticentromer
37
HEp-2000® ANA-Ro
COLORZYME®-TESTVERFAHREN
1. PUFFER REKONSTITUIEREN (PBS)
Inhalt eines Pufferbeutels in einem Liter deionisiertem oder destilliertem Wasser auflösen. Die PBSWaschpufferlösung kann verschlossen und gekühlt
bei 2-10 °C bis zu vier Wochen aufbewahrt werden.
2. FARBREAGENS REKONSTITUIEREN
Inhalt eines Beutels mit 150 ml deionisiertem oder
destilliertem Wasser auflösen. Gut durchmischen, bis
das Pulver völlig aufgelöst ist. Dieses Farbreagens ist
30 Tage stabil, wenn es bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Behälter aufbewahrt wird. Dieses Farbreagens kann bis zu 30 Tage lang, oder bis
eine Farbänderung oder Ausfällung zu beobachten
ist, wiederverwendet werden. Trübungen oder
Schimmern bei Wiederverwendung, ohne sichtbare
Ausfällungen, sind normal. Je nach Gebrauchshäufigkeit können 150 ml Colorzyme® Farbreagens mit
bis zu 20 Objektträgern verwendet werden.
3. PATIENTENPROBEN VERDÜNNEN
Screening: Patientenproben 1:40 verdünnen, indem
0,05 ml (50 µl) Serum zu 1,95 ml rekonstituiertem PBS
zugegeben werden.
Semiquantitative Titrierung: Für die weitere Titrierung
Reihenverdünnungen der Serumprobe(n) (z. B. 1:
80, 1:160, 1:320...1:2560) unter Verwendung von PBS
herstellen.
4. SUBSTRATTRÄGER VORBEREITEN (20-25 µl
Vertiefung)
Objektträger aus der Folie entnehmen und
Kontrollseren wie folgt in den Kontrollvertiefungen
platzieren: Tropfflasche mit Kontrollserum umdrehen
und vorsichtig drücken, bis an der Spitze ein Tropfen
austritt. Den Tropfen vorsichtig in die entsprechende
Kontrollvertiefung geben, dabei direkten Kontakt
der Tropferspitze mit der Oberfläche des Objektträgers vermeiden. Das positive Kontrollserum in
die mit “+” markierte Vertiefung, das negative
Kontrollserum in die mit “-” markierte Vertiefung und
einen Tropfen PBS-Puffer in die mit “PBS” markierte
Vertiefung geben. 1 Tropfen (20-25 µl) Patientenprobe in die nummerierten Vertiefungen geben.
HINWEIS: Für allgemeine Screening-Verfahren
wird die homogene Positivkontrolle empfohlen.
Für die semiquantitative Titrierung wählen Sie die
Positivkontrolle aus, deren Verfärbungsmuster die
meiste Ähnlichkeit mit der Screening-Probe hat
(z.B. ist für Patientenproben, die beim Screening
eine fleckige Verfärbung ergeben, eine gefleckte
Positivkontrolle zu verwenden). Falls der HEp-2000®
ANA-Ro Test zur Bestätigung des Vorhandenseins
von anti-SSA/Ro Antikörpern dient, muss die SSA/Ro
Positivkontrolle, Katalognummer 2035-Ro, auf
mindestens einem Objektträger am selben Tag
mitlaufen.
ACHTUNG: DIREKTER KONTAKT DER TROPFERSPITZE
MIT DEM OBJEKTTRÄGER KANN DAS ANTIGEN-SUBSTRAT BESCHÄDIGEN.
5. OBJEKTTRÄGER INKUBIEREN (30±5 Minuten bei
Zimmertemperatur,
18-24 °C) Objektträger in eine feuchte, bedeckte
Schale legen (z. B. Petrischale mit angefeuchtetem
Papierhandtuch). 30 Minuten (±5 Minuten) bei
Zimmertemperatur (18-24 °C) abgedeckt inkubieren
lassen.
6. PBS-SPÜLUNG
Objektträger aus der Inkubationsschale nehmen
und mit Spritzflasche, Pasteur- oder serologischer
Pipette kurz mit PBS spülen. Den Puffer nicht direkt in
die Vertiefungen einspritzen.
HINWEIS: Um bei Objektträgern mit 13 Vertiefungen
eine Kreuzkontamination zu vermeiden, den PBS auf
die Mittellinie des Objektträgers spritzen, dabei den
Träger zuerst in Richtung Vertiefungen 1-5 neigen,
anschließend in Richtung Vertiefungen 6-10.
7. PBS-WASCHGANG (10 Minuten)
Objektträger in einem entsprechenden Gefäß 10
Minuten mit PBS waschen (Glaszylinder, Schale).
Beim Eintauchen, in der Mitte des Waschvorgangs
und beim Herausnehmen leicht hin- und herbewegen. Der Waschvorgang kann ohne Auswirkung auf
die Testergebnisse auf 10-30 Minuten ausgedehnt
werden. PBS-Waschlösung nach Gebrauch entsorgen. Für optimale Ergebnisse sollte nach Ablauf der
halben Waschzeit der PBS-Waschpuffer gewechselt
und ein magnetischer Rührer verwendet werden.
38
8. ENZYM-ANTIKÖRPER-REAGENS (Vertiefungen mit
12-14 Tropfen bedecken)
Jeweils einen Objektträger aus dem PBS-Puffer
nehmen und 3-5 Mal in deionisiertes oder destilliertes Wasser tauchen. Überschüssiges Wasser
durch seitliches Ausklopfen auf Saugpapier oder
Papierhandtuch entfernen. Objektträger sofort
wieder in die Inkubationskammer geben und die
Vertiefungen vollständig mit Enzym-Antikörperreagens füllen; beginnend mit einem Tropfen pro Vertiefung. Vorgang für alle Objektträger wiederholen.
Das Enzym-Antikörperreagens wurde titriert, um das
auf dem Objektträger verbliebene deionisierte oder
destillierte Wasser zu kompensieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Vertiefungen auf
dem Objektträger während dieses Vorgangs nicht
austrocknen, andernfalls kann das Substrat beschädigt werden. DEN OBJEKTTRÄGER NICHT TROCKEN
TUPFEN ODER WISCHEN, ODER LÄNGER ALS 15
SEKUNDEN OHNE ENZYM-ANTIKÖRPERREAGENS
STEHEN LASSEN.
9. OBJEKTTRÄGER INKUBIEREN (30±5 Minuten bei
Zimmertemperatur, 18-24 °C)
Inkubationskammer abdecken. Objektträger 30
Minuten (±5 Minuten) bei Zimmertemperatur (18-24
°C) inkubieren lassen.
10. PBS-SPÜLUNG
Objektträger aus der Inkubationsschale nehmen
und kurz mit PBS spülen. Den Puffer nicht direkt in
die Vertiefungen einspritzen.
11. PBS-WASCHGANG (10 Minuten)
Objektträger in einem entsprechenden Gefäß 10
Minuten mit PBS waschen (Glaszylinder, Schale).
Beim Eintauchen, in der Mitte des Waschvorgangs
und beim Herausnehmen leicht hin- und herbewegen. Der Waschvorgang kann ohne Auswirkung auf
die Testergebnisse auf 10-30 Minuten ausgedehnt
werden.
12. INKUBATION DES FARBREAGENS (30 Minuten bei
Zimmertemperatur, 18-24 °C)
Jeweils einen Objektträger aus dem PBS entnehmen, 3-5 Mal in deionisiertes oder destilliertes Wasser
tauchen und Objektträger seitlich auf Saugpapier
oder Papierhandtuch ausklopfen, um verbliebenes
Wasser zu entfernen. Objektträger sofort in einen
Coplin-Glaszylinder mit aktiviertem Farbreagens
einlegen und 30 Minuten inkubieren.
13. PBS-Spülung
Jeweils einen Objektträger aus dem Coplin-Glaszylinder nehmen und auf allen Seiten 4-5 Sekunden
lang mit PBS spülen. Den Puffer nicht direkt in die
Vertiefungen einspritzen. Jeden mit PBS gespülten
Objektträger in einen mit destilliertem oder deionisiertem Wasser gefüllten Coplin-Glaszylinder einlegen, bis alle Objektträger aus dem Farbreagens
entfernt sind. Sofort mit Schritt 14 weiter machen.
14. DECKGLAS AUFSETZEN
Jeweils einen Objektträger aus dem PBS-Puffer
nehmen und 3-5 Mal in deionisiertes oder destilliertes Wasser tauchen. Überschüssiges Wasser
durch seitliches Ausklopfen auf Saugpapier oder
Papierhandtuch entfernen. DEN OBJEKTTRÄGER
NICHT TROCKEN TUPFEN ODER WISCHEN, ODER
LÄNGER ALS 15 SEKUNDEN OHNE DECKGLAS STEHEN
LASSEN. 4-5 Tropfen semipermanentes Montagemedium entlang der Mittellinie jedes Objektträgers
hinzugeben. Deckglas vorsichtig in Position bringen;
dabei Lufteinschlüsse vermeiden; hierzu das Deckglas vorsichtig an einem Ende des Objektträgers
aufsetzen und auf das andere Ende herablassen.
HINWEIS: Überschüssiges Montagemedium auf dem
Objektträger kann zu ungenügender Auflösung der
Zellen (verschwommenes Bild) führen. Überschüssiges Montagemedium kann vom Objektträger
entfernt werden, indem das Deckglas mit Saugpapier abgetupft wird, ohne es dabei zu bewegen.
Die Objektträger können sofort ausgewertet oder
für längere Zeit bei 2-10 °C ohne Reaktivitätsverlust
aufbewahrt werden.
TECHNISCHE UNTERSTÜTZUNG:
+916-363-2649
oder via E-Mail:
[email protected]
HEp-2000® COLORZYME® ANA-Ro TESTSYSTEM
FÖR DIAGNOSTISK ANVÄNDNING IN VITRO
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET
AVSEDD ANVÄNDNING: Detta är ett indirekt enzymantikropptest för halvkvantitativ detektion av antinukleär
antikropp i humanserum. Detta testsystem använder
transfekterade† HEp-2 celler, som gör det möjligt att
specifikt identifiera autoantikroppar mot SSA/Ro-antigen. Autoantikroppar mot SSA/Ro kan uppvisa ett
distinkt färgningsmönster på de transfekterade cellerna.
När ett sådant mönster föreligger betraktas det som ett
bevis på att det finns anti-SSA/Ro-antikroppar.
Om det saknas ett sådant distinkt mönster, utesluter
inte detta att det finns anti-SSA/Ro-antikroppar.
Detta testsystem skall användas som ett hjälpmedel
vid detektion av antikroppar som är associerade med
systemisk reumatisk sjukdom.
Antinukleär antikropp (ANA) är en allmän term som
används för att beskriva autoantikroppar mot olika
cellnukleära proteiner. Tidiga studier av sådana autoantikroppar med immunofluorescerande teknik påvisar ett
litet antal nukleärproteinspecificiteter (1). På grund av
det höga sambandet mellan positiv ANA och systemisk
lupus erytematosus (SLE) utesluter negativ ANA i huvudsak sjukdomen (2).
Även om DNA-specifika antikroppar fortfarande har ett
högt sjukdomssamband med SLE (3), har även ett antal
nukleära (4) och cytoplasmiska (5-7) makromolekyler
upptäckts och associerats med andra bindvävssjukdomar (8-10). Vissa av dessa antikroppar verkar ha diagnostisk och/eller prognostisk betydelse vid progressiv
systemisk skleros (11-12), blandad bindvävssjukdom (1315) Sjögrens syndrom (16-17), polymyosit (18) och/eller
reumatoid artrit (19). På grund av dessa sjukdomsassociationer har ANA-analys nu etablerats som ett allmänt
screeningredskap för bindvävssjukdom (20).
ANA-testkänsligheten varierar beroende på vilken typ
av substrat och vilka fixativmetoder som används samt
vilka ANA-typer som finns i sera. Cellkultursubstrat uppvisar i allmänhet större känslighet än vävnadssektioner
(21-24). Detektionen av autoantikroppar mot SSA/Roantigenen varierar i högsta grad. Gnagarvävnad
uppvisar inga påvisbara nivåer av SSA/Ro-antigen (25),
och rapporter om detektion av anti-SSA/Ro-antikroppar
i cellkultursubstrat varierar i känslighet mellan 50 och 90
procent (26-27).
Immuno Concepts HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro-testsystem med transfekterade mitotiska* humanepiteloidceller (HEp-2) är ett avancerat immunenzymsystem för
detektion av ANA. HEp-2-celler med mitotiska former
har visats sig ha större känslighet och ge skarpare
mönsterigenkänning än klassiskt musnjuresubstrat för
detektion av antikroppar vid progressiv systemisk skleros
(PSS) (28). Mitotiska former bidrar till urskiljandet av
olika mönster och detektion av tidigare orapporterade
nukleära antigener som förekommer i högre koncentrationer i mitotiskt aktiva celler (29-31). HEp-2-cellerna i
detta testsystem har transfekterats† med flera kopior av
den specifika DNA-sekvens som bär informationen för
SSA/Ro-autoantigenen. Cirka 10-20 % av de transfekterade cellerna överexpresserar denna antigen så att
detektionen av autoantikroppar mot SSA/Ro är mer
jämn än för HEp2-celler som inte har transfekterats.
Autoantikroppar mot SSA/Ro kan uppvisa ett distinkt
färgningsmönster på de transfekterade cellerna. När
ett sådant mönster föreligger betraktas detta som ett
bekräftande bevis på att det förekommer anti-SSA/Roantikroppar.
Att ett sådant distinkt mönster saknas utesluter inte
att det finns anti-SSA/Ro-antikroppar.
† De transfekterade cellerna och deras användning
är skyddade genom USA-patent 5518881 och andra
planerade amerikanska och utländska patent.
* Mitos är en term som används för att beskriva celldelningsprocessen.
Den indelas vanligtvis i sex faser: interfas, profas, metafas, anafas, telofas och cytokines.
TESTPRINCIP
Immuno Concepts HEp-2000® Colorzyme® ANA-Ro
testsystem använder sig av indirekt enzymantikroppmetod. Spädda patientprover odlas med antigensubstrat
för att tillåta specifik bindning av autoantikroppar till
cellkärnorna. Om det förekommer ANA bildas ett stabilt
antigen/antikroppkomplex. Efter tvättning för att avlägsna obundna antikroppar odlas substratet med en
antihuman antikropp konjugerad med pepparrotsperoxidas (HRP). Om resultatet är positivt bildas ett stabilt
komplex i tre delar bestående av en HRP-konjugerad
antihuman antikropp bunden till en human antinukleär
antikropp, som i sin tur är bunden till en nukleär antigen.
Detta komplex kan visualiseras genom att objektglaset odlas i Colorzyme® färgreagens innehållande ett
enzymspecifikt substrat. Reaktionen mellan den enzymmärkta antikroppen och det enzymspecifika substratet
leder till en färgreaktion som är synlig på objektglaset i
standardljusmikroskop. I positiva prover får cellkärnorna
en blålila färgning med ett färgningsmönster som är
karaktäristiskt för den aktuella nukleära antigenfördelningen i cellerna. Om provet är ANA-negativt uppvisar
cellkärnan inget klart urskiljningsbart mönster av nukleär
färgning. Cytoplasman kan uppvisa en svag färgning,
medan det icke-kromosoma området i de mitotiska
cellerna kan uppvisa en mörkare färgning.
SYSTEMKOMPONENTER (MATERIAL SOM INGÅR)
Användning: Alla komponenter levereras bruksfärdiga
utan krav på delning eller rekonstitution (förutom
PBS-bufferten och Colorzyme® färgreagensen som
måste lösas upp i avjoniserat eller destillerat vatten före
användning).
Förvaring: Alla komponenter kan kylförvaras i 2-10 °C.
Efter rekonstitution skall PBS-buffertreagensen förvaras i
en stängd behållare under kylning i 2-10 °C.
Efter rekonstitution skall Colorzyme® färgreagens
förvaras i en stängd behållare i rumstemperatur i upp
till 30 dagar. Beroende på användningstakten kan 150
ml Colorzyme® färgreagens användas med maximalt
tjugo objektglas.
Stabilitet: Alla komponenter är stabila i minst tolv
månader från tillverkningsdatum. Använd ingen komponent efter dess utgångsdatum.
REAKTIVA REAGENSER
Objektglas för substrat: ‡Katalognr 2007-Ro (sjubrunnars), 2013-Ro (trettonbrunnars). Sju- eller trettonbrunnars ANA-objektglas för substrat med HEp-2000®-celler
(med mitotiska former) som är odlade och stabiliserade
direkt på testbrunnarna. Detta är HEp-2-celler som stabilt har transfekterats med SSA/Ro-antigenen. Ett unikt
vallgravsformat objektglas minimerar korskontamination
mellan brunnarna under analysen. Objektglasen har
även extra kontrollbrunnar som är positivt eller negativt
betecknade samt PBS för att underlätta korrekt tolkning
av resultat.
SSA/Ro positiv kontroll: Katalognr 2035-Ro. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 1,0 ml positivt humankontrollserum med antikropp specifik för SSA/Ro-antigener.
Detta serum uppvisar en finfläckig färgningsreaktion
som är typisk för anti- SSA/Ro, vilket Immuno Concepts
HEp-2000® cellsubstrat är ett exempel på. Uttrycket är
till övervägande grad nukleärt lokaliserat, med framträdande nukleolär färgning. Svag cytoplasmisk färgning
kan även noteras i de överexpresserande cellerna.
De mitotiska cellernas kromosomområde uppvisar en
negativ färgreaktion. Denna reagens innehåller 0,1 %
natriumazid som konserveringsmedel.
Homogen positiv kontroll: Katalognr 2021. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 1,0 ml positivt humankontrollserum med antikropp specifik för DNA och/eller
DNP-nukleära antigener. Detta serum uppvisar en
homogen färgningsreaktion på Immuno Concepts HEp2000®-cellsubstrat. De mitotiska cellernas kromosomområde uppvisar samma homogena färgreaktion. Denna
reagens innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
Fläckig positiv kontroll: Katalognr 2022. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 0,5 ml positivt humankontrollserum med antikropp som är specifik för Sm
och/eller RNP-nukleära antigener. Detta serum uppvisar
en av de mest vanliga fläckiga färgreaktioner som
noterats på Immuno Concepts HEp-2000®-cellsubstrat.
De mitotiska cellernas kromosomområde uppvisar en
negativ färgreaktion. Denna reagens innehåller 0,1 %
natriumazid som konserveringsmedel.
Nukleolär positiv kontroll: Katalognr 2023. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 0,5 ml positivt humankontrollserum med antikropp som är specifik för nukleolära
antigener. Detta serum uppvisar en nukleolär färgningsreaktion på Immuno Concepts HEp-2000®-cellsubstrat.
39
Denna reagens innehåller 0,1 % natriumazid som
konserveringsmedel.
Laboratorietidur
Ljusmikroskop (standardutförande) med kapacitet för
200 och 400 gångers förstoring.
Centromer positiv kontroll: Katalognr 2025. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 0,5 ml positivt humankontrollserum med antikropp som är specifik för kromosomala centromerer (kinetochore). Detta serum uppvisar en
åtskiljd fläckig färgningsreaktion på Immuno Concepts
HEp-2000®-cellsubstrat. De mitotiska cellernas kromosomområde uppvisar samma åtskiljda fläckiga färgningsreaktion. Denna reagens innehåller 0,1 % natriumazid
som konserveringsmedel.
Titrerbart kontrollserum: Katalognr 2026: Bruksfärdig
ampull innehållande 1,0 ml positivt humankontrollserum
som skall behandlas som ett outspätt patientprov.
Denna reagens innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
Negativt kontrollserum: Katalognr 2031. Bruksfärdig
pipettampull innehållande 1,0 ml negativt humankontrollserum. Även om det negativa kontrollserumet kan
uppvisa en svag färgning av cytoplasma med en
ljusare färgning av den mitotiska cellens icke-kromosomområde, uppvisar det ingen urskiljningsbar nukleär
färgning. Denna reagens innehåller 0,1 % natriumazid
som konserveringsmedel.
Enzymantikroppreagens: Katalognr 4009-Ro (9,0 ml),
4075-Ro (23 ml). Getantihuman IgG (tunga och lätta
kedjor) konjugerade med pepparrotsperoxidas (HRP).
Reagensen levereras bruksfärdig i precisionspipettflaskor med 9,0 ml för vart tionde objektglas i kompletta
testsatser.
Färgreagens: *Katalog nr 4066. HRP-specifikt enzymsubstratpulver innehållande 4-kloro 1-naftol. Varje
förpackning innehåller pulver för framställning av 150 ml
självaktiverande Colorzyme® färgreagens.
Framställning: Lös upp innehållet i en påse i 150 ml
avjoniserat eller destillerat vatten. Blanda väl tills preparatet har lösts upp helt och hållet. Denna färgreagens
är stabil i 30 dagar i rumstemperatur i försluten behållare. Färgreagensen kan återanvändas under högst 30
dagar, eller tills det syns någon färgförändring eller fällning. Grumling eller opalescens utan synlig fällning vid
återanvändning är normalt. Beroende på användningstakten kan 150 ml Colorzyme® färgreagens användas
med maximalt tjugo objektglas.
‡ Detta objektglas är skyddat genom en eller flera av
följande amerikanska eller utländska patent: 4387972,
D-274261, 0727046, D-273261, 5518881, kanadensiskt
patent 1171302 och övriga inplanerade patent.
* Detta material är skyddat genom ett eller flera av
följande amerikanska eller utländska patent: 4615972,
kanadensiskt patent 1231633, italienskt patent 1177110
och övriga inplanerade patent.
ICKE-REAKTIVA REAGENSER
PBS buffertpulver: Katalognr 1011. Fosfatbuffrat saltlösningspulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0.2). Varje påse innehåller
tillräckligt med buffertpulver för att ge 1 liter. (En påse
med buffertpulver levereras för vart femte objektglas i
kompletta testsatser).
Preparering: Lös upp en påse buffertpulver i 1 liter avjoniserat eller destillerat vatten, täck och förvara avkylt i
2-10 °C i upp till fyra veckor, eller tills det syns tecken på
kontamination eller andra synliga förändringar.
Halvpermanent monteringsmedel: Katalognr 1111.
Bruksfärdig pipettampull innehållande 5,0 ml glycerolbaserat monteringsmedel, pH 9,1 ± 0,2. Denna reagens
innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
FÖRSIKTIGHET
1. Allt material av humant ursprung som använts i
denna produkt har testats med FDA-godkända
metoder och visat sig vara negativt (inte upprepat
reaktivt) för antikroppar mot humant immunbristvirus-1 (HIV-1), humant immunbristvirus-2 (HIV-2), hepatit C-virus (HCV) och hepatit B-ytantigen (HBsAg).
Ingen testmetod kan emellertid helt garantera att
det inte förekommer något HIV-1, HIV-2, hepatit C,
hepatit B eller andra smittämnen. Därför skall allt
satsmaterial hanteras som potentiellt smittsamt.
2. Alla patientprover på biosäkerhetsnivå 2 skall
hanteras enligt rekommendationerna för eventuellt
smittsamt humanserum eller blodprov i manualen från Centrum för Sjukdomskontroll/Nationella
hälsoinstitut: Biosäkerhet i mikrobiologiska och
biomedicinska laboratorier, 1984 års upplaga.
3. Spädning av komponenter eller byte till andra komponenter än de som medföljer detta system kan ge
motsägande resultat.
4. Natriumazid (0,1 %) används som konserveringsmedel. Natriumazid kan reagera med bly- eller
kopparrör och bilda explosiva metallazidsalter.
När reagenser kasseras skall man spola med stora
mängder kranvatten för att avlägsna eventuella
rester i avloppssystemet. Natriumazid är ett gift och
kan vara toxiskt vid förtäring.
5. Denna sats är avsedd för diagnostisk användning in
vitro.
6. Om hemolyserat eller lipemiskt sera måste användas skall inaktivt sera värmas i 30 minuter i 56° C för
optimala resultat. Mikrobiellt kontaminerat sera skall
inte användas.
7. Det har visats att falskt positivt ANA kan inträffa
på grund av C1q-bindning till DNA, oavsett vilket
substrat som används (32). För att eliminera eventuell C1q-störning skall all patientsera rutinmässigt
värmas i 56 °C i 30 minuter före analysen.
8. Det titrerbara kontrollserumet är avsett för övervakning av reproducerbarheten mellan olika loter
eller serier. Det är inte avsett för mätning av den
totala sensitiviteten eller analysens specificitet.
9. Undvik att röka, äta eller dricka i områden där
prover eller satsreagenser hanteras.
10. Undvik alltid stänk eller alstring av aerosoler.
11. Andra inkubationstider och temperaturer än de
angivna kan ge felaktiga resultat.
12. Korskontaminationer mellan reagenser och prover
kan ge felaktiga resultat.
13. Återanvändningsbart glas måste tvättas och sköljas
noggrant för att avlägsna rengöringsmedel före
användning. Allt glas måste rengöras och torkas
före användning.
14. Placera alla reagenser, objektglas och prover i
rumstemperatur (18-24 °C) före användning.
15. Använd engångshandskar av latex vid hantering
av prover och reagenser, och tvätta händerna
noggrant efteråt.
16. Mikrobisk kontamination mellan reagenser eller
prover kan ge felaktiga resultat.
17. Pipettera aldrig med munnen och undvik att
komma i kontakt med reagenser och prov med
hud eller slemhinnor. Tvätta med bakteriedödande
tvål och rikligt med vatten om kontakt ändå skett.
18. Färgreagens kan återanvändas i högst 30 dagar,
eller tills det syns någon färgförändring eller fällning.
Grumling eller opalescens utan synlig fällning vid
återanvändning är normalt. Beroende på användningstakten kan 150 ml Colorzyme® färgreagens
användas med maximalt tjugo objektglas.
PROVTAGNING
Skyddsremsor: Katalog nr 1041. Varje bunt innehåller tio
24 x 60 mm skyddsremsor nr 1 av glas.
Provtagning: Serum rekommenderas som prov. Cirka 5
ml helblod skall tas aseptiskt genom venpunktion med
hjälp av ett sterilt vakuumblodtagningsrör eller annat
lämpligt blodtagningssystem. Låt blodet koagulera i
rumstemperatur (18-24 °C). Serum skall så snart som
möjligt separeras från koagler genom centrifugering för
att minimera hemolys.
YTTERLIGARE MATERIAL SOM BEHÖVS (MEDFÖLJER
EJ)
Volymetriska pipetter för pipettering av 20-25 µl
volymer
Tre Coplin-kärl eller färgningsskålar
Klämflaska eller Pasteur-pipetter
Serologiska pipetter
Enliters skruvlockbehållare (för PBS-buffert)
Stängda behållare för att förvara Colorzyme®
färgreagens
Avjoniserat eller destillerat vatten
Provrör för att framställa serumspädningar
Inkubationskammare
Läskpapper eller pappershanddukar
Engångshandskar av latex
Störande ämnen: Sera som uppvisar en hög grad av
hemolys, ikterus, lipemi, eller mikrobiell tillväxt bör inte
användas, eftersom dessa betingelser kan leda till avvikande resultat. Prover som innehåller synliga partiklar
bör klargöras genom centrifugering före analysen.
Förvaring: Sera kan förvaras i 2-10 °C i högst en vecka.
Om analysen fördröjs ytterligare skall sera frysas i –20
°C eller lägre. Serum bör inte förvaras i självavfrostande
40
kylskåp eller fryslagerrum.
bart nukleärt mönster.
VARNING: Upprepad frysning/upptining av patientprover kan ge felaktigt positiva eller negativa resultat.
Positivt: Ett serum betraktas som positivt om kärnan
uppvisar ett klart urskiljningsbart mönster av färgning i
flertalet interfasceller.
TOLKNING AV RESULTATET
KVALITETSKONTROLL
Positiva, negativa och PBS-kontroller bör köras i de
brunnar som tillhandahålls för kvalitetskontroll på varje
objektglas. Den positiva kontrollen bör uppvisa mörkblå/
lila färgning i cellkärnorna, med ett klart urskiljningsbart
mönster som är karaktäristiskt för det kontrollserum som
använts. Cytoplasman kan få ljusblå/lila färg i den
positiva kontrollbrunnen. Den negativa kontrollen skall
uppvisa ljusblå/lila färgning av både cytoplasman och
kärnan, men utan ett urskiljningsbart nukleärt färgningsmönster. PBS-kontrollen används för att observera
ospecifik färgning av enzymantikroppreagensen och
skall inte uppvisa blå färgning. Om kontrollerna inte ser
ut enligt beskrivningarna är testet ogiltigt och bör göras
om. Om HEp-2000® ANA-Ro-test skall användas för
att bekräfta förekomsten av anti- SSA/Ro-antikroppar
måste SSA/Ro positiv kontroll, katalognummer 2035-Ro,
köras på minst ett objektglas under den dagens körning.
TILLHÖRANDE TITRERBAR KONTROLL
Vid avläsning av antikroppnivåerna börjar många laboratorier med att läsa den brunn som innehåller det mest
spädda provet och läser “baklänges” till spädningen
1:40. Den första brunnen med ett klart urskiljningsbart
nukleärt färgningsmönster är antikroppnivåns ändpunkt.
Vi rekommenderar denna teknik för att fastställa antikroppsnivåns ändpunkter.
Medelvärdet och spridningsområdet för antikroppnivån
(± en spädning på var sin sida om medelvärdet) har
fastställts i vårt laboratorium och uppges som vägledning. Denna kontroll tillhandahålls för att varje laboratorium skall ha tillgång till ANA-testningens reproducerbarhet (precision). Eftersom kontrollen inte är avsedd
att vara en indikator på antikroppnivåns precision,
bör varje laboratorium etablera sitt eget medelvärde
för antikroppnivåns ändpunkt för provet i fråga och
använda denna information för att få tillgång till reproducerbarheten (precisionen) mellan olika serier.
Genom upprepade analyser av denna titrerbara
kontroll med användande av Immuno Concepts HEp2000® Colorzyme® ANA-Ro-testsystem har ett medelantikroppvärde fastställts för varje lotnummer. Lotnumret,
medelvärdet och spridningsområdet för antikroppnivån
(± en dubbel spädning på vardera sidan om medelvärdet) anges på ampullens etikett och bör användas som
vägledning för testsystemets prestanda.
Det är viktigt att inte blanda ihop färgningens intensitet
med förekomst respektive avsaknad av antinukleära
antikroppar. Den viktigaste faktorn att ta hänsyn till vid
fastställande av om en viss serumspädning är positiv
eller ej är om det förekommer ett klart urskiljningsbart
mönster, oavsett färgningens intensitet.
Denna titrerbara kontroll uppvisar det typiska fläckiga
mönster som är associerat med RNP-antikroppen.
Det kan även finnas ett andra mönster av NSp I (flera
åtskiljda fläckar i interfascellernas kärna), men det är
det typiska RNP-fläckmönstret som skall användas för
att avläsa ändpunkterna.
De värden som erhålls i vårt laboratorium kan skilja sig
från era. Några av de många faktorer som kan påverka
resultaten är, men är inte begränsat till:
1. Korrekt justering av mikroskopljusets bana. Se bruksanvisningen till mikroskopet för mer information.
2. Objektivets numeriska bländaröppning. Den
numeriska bländaröppningen hänger ihop med
ljussamlingskapaciteten och objektivets upplösning.
Den numeriska bländaröppningen står angiven på
sidan av objektivet.
3. Precision och exakthet i spädningsteknik, utrustning
och testmetodernas prestanda.
TOLKNING AV TESTRESULTAT
200 gångers total förstoring rekommenderas för
screening av positiv/negativ, medan 400 gångers total
förstoring rekommenderas för mönsterigenkänning och
påvisande av mitotiska celler.
Negativt: Ett serum betraktas som negativt för antinukleära antikroppar om nukleärfärgningen är mindre än
eller lika med den negativa kontrollbrunnen, utan klart
urskiljningsbart mönster. Cytoplasman kan uppvisa svag
färgning, med ljusare färgning i de mitotiska cellernas
icke-kromosomområde, men utan ett klart urskiljnings-
SSA/Ro: Ett serum betraktas som positivt för SSA/Ro-antikroppar om 10-20 procent av interfaskärnorna uppvisar
det distinkta SSA/Ro färgningsmönstret, det vill säga ett
åtskiljt fläckigt mönster med en framträdande färgning av nukleolerna. Dessa är de överexpresserande
transfekterade cellerna. Återstående 80-90 procent av
interfaskärnorna kan, men behöver inte, uppvisa en
finfläckig färgning av kärnan, med eller utan färgning
av nukleolerna.
Antikroppnivåer: Vid avläsning av antikroppnivåerna
börjar många laboratorier med att läsa den brunn som
innehåller det mest spädda provet och läser “baklänges” till spädningen 1:40. Den första brunnen med ett
klart urskiljningsbart mönster är antikroppnivåns ändpunkt. Vi rekommenderar denna teknik för att fastställa
antikroppsnivåns ändpunkter. Det är viktigt att inte blanda ihop färgningens intensitet med förekomst respektive
avsaknad av antinukleära antikroppar. Den viktigaste
faktorn att ta hänsyn till vid fastställande av om en viss
serumspädning är positiv är om det föreligger ett klart
urskiljningsbart nukleärt mönster, oavsett färgningens
intensitet. På grund av den ökade koncentrationen av
SSA/Ro-antigen i de överexpresserande cellerna är det
inte ovanligt att man ser färgning av dessa celler med
mycket höga antikroppnivåer. Den kliniska betydelsen
av sådana höga antikroppnivåer är inte känd.
Varning: En del sera kan uppvisa nukleär och cytoplasmisk färgning utan ett synligt nukleärt mönster. Detta
fenomen beror i allmänhet på heterofila antikroppar
och bör rapporteras som negativt (33).
ENZYMFÄRGNINGENS INTENSITET
Färgningsgradens intensitet har inget bevisat kliniskt
värde och endast begränsat värde som indikator på
antikroppnivån (34). För att förenkla tolkningen skall
screeningresultaten registreras som starkt positiva eller
positiva och titreras därefter.
Starkt positiv reaktion: Mörk till mycket mörkblå färgning, tydlig cellkontur, klart definierat nukleärt mönster.
Positiv reaktion: Svag eller dämpad blå/mörklila färgning med större färgningsvariation mellan cellerna.
Cellkonturen kan vara mindre väldefinierad i vissa celler,
medan majoriteten av cellerna ändå uppvisar ett klart
urskiljningsbart färgningsmönster.
OBSERVERA: Eftersom cellerna odlas direkt på objektglasytan, befinner sig inte alla celler i samma skede i
cellcykeln. Det är inte ovanligt att man ser olika grad av
färgningsintensitet från cell till cell på grund av skillnaderna i koncentration och plats för de olika antigenerna
under cellcykeln.
RAPPORTERING AV RESULTATEN
Screening: Resultaten skall rapporteras som starkt positiva eller positiva vid spädning 1:40, och det nukleära
färgningsmönstret skall rapporteras.
Bestämning av antikroppnivå: Resultatet skall rapporteras som den sista seriespädningen med ett klart
urskiljningsbart färgningsmönster. Resultat med en stark
reaktion vid spädning 1:2560 skall rapporteras som större
än 1:2560. Antikroppnivåer på 1:40 till 1:80 betraktas
som låga. 1:160 till 1:320 betraktas som medelhöga antikroppnivåer och 1:640 och mer betraktas som höga.
MÖNSTERDETEKTION
Homogen: En fast färgning av kärnan med eller utan
synbar maskering av nukleolerna. De metafasmitotiska
cellernas kromosomområde är klart positivt med en
jämn eller perifer färgningsintensitet större än, eller lika
med, interfaskärnornas.
Synonymer: Diffus, fast.
Nukleära antigener: dsDNA, nDNA, DNP, histon.
Sjukdomssamband: Höga antikroppnivåer tyder på
SLE.
Lägre antikroppnivåer tyder på SLE eller annan
bindvävssjukdom (35).
Perifer: En fast färgning, främst runt kärnans yttre
område, med svagare färgning mot kärnans mitt. De
metafasmitotiska cellernas kromosomområde är klart
positivt med en jämn eller perifer färgningsintensitet
större än, eller lika med, interfaskärnornas.
41
Synonymer: Kantig, raggig, hinnaktig.
Nukleära antigener: dsDNA, ssDNA, nDNA, DNP,
histon.
SLE.
��
��
Lägre antikroppnivåer tyder på SLE eller annan bind��
��
vävssjukdom (35).
och kromosomerna är extremt sammandragna.
Fläckig. ��
En grov- eller finkornig färgning av kärnan i
allmänhet utan färgning av nukleolerna. De metafasmitotiska cellernas icke-kromosomområde uppvisar
färgning, medan kromosomområdet reagerar negativt
på färg.
Nukleära antigener: Sm; RNP; Scl-70; SS-B och andra
antigen-/antikroppsystem som ännu inte är
karaktäriserade.
SLE (Sm-antigen), blandad bindvävssjukdom
(RNP-antigen), sklerodermia (Scl-70-antigen), eller
Sjögrens
syndrom,
��
�� även kallat Sicca-syndromet
��
(SS-B-antigen). Lägre antikroppnivåer kan tyda på
��
��
annan bindvävssjukdom (36).
Nukleolär: Stor, grovfläckig färgning inuti kärnan, i
��
allmänhet mindre än sex stycken per cell, med eller
utan enstaka fina fläckar, 5-10 stycken till antalet. De
metafasmitotiska cellernas icke-kromosomområde
uppvisar stark färgning, medan kromosomområdet kan
uppvisa svag färgning. Anafasa och telofasa celler kan
uppvisa liknande färgning som interfaskärnorna.
Nukleära antigener: Benämns i allmänhet 4-6s RNA
och andra nukleära antigener, t ex fibrillarin, RNA
polymeras I, NOR 90 och PM/Scl.
Sjukdomssamband: Höga antikroppnivåer vid sklerodermia och Sjögrens syndrom (37).
��
Sera som är positiva för DNA, DNP och/eller histon (t
ex Immuno Concepts homogena positiva kontroll)
uppvisar ljus färgning av dessa cellers kromosomområde. I negativa DNA-, DNP- och/eller histonprov (t ex
Immuno Concepts fläckiga positiva kontroll) uppvisar
de mitotiska cellerna inte någon kromsomfärgning, och
kan därför vara svåra att upptäcka.
ANVÄNDNING AV MITOTISKA CELLER
Urskiljning av fläckig kontra homogen antikropp: Ett
finfläckigt färgningsmönster är ibland svårt att skilja
från homogen färgning. Om mönstret är homogent, är
de mitotiska cellernas kromosomer fast färgade. Om
mönstret är strikt fläckigt, visar området utanför kromosomerna en finfläckig reaktion.
OBSERVERA: Om hela den mitotiska cellen är finfläckig
samtidigt som kromosomområdet har en fast färgning,
är det högst troligt att det finns två eller flera antikroppar. Rapportera screeningspädningen som fläckig/
homogen och titrera varje antikropp till dess ändpunkt.
Perifer kontra nukleär membranantikropp: Antikroppar som uppvisar ett perifert mönster associeras i
allmänhet med DNA/DNP-nukleära antigener. Höga
antikroppnivåer av sådana antikroppar tyder på SLE.
I substrat som inte innehåller mitotiska celler kan det
perifera mönstret vara svårt att särskilja från nukleär
membranantikropp. Genom att använda Immuno
��
Centromer: Ett��
åtskiljt fläckigt färgningsmönster som
��
i hög grad tyder på CREST*-syndromvarianten av
progressiv systemisk skleros (28). De nukleära fläckarna
är mycket åtskiljda och vanligtvis någon multipel av 46
��
(vanligtvis 23-46 fläckar per kärna). Eftersom centromerer är sammandragningar där spindelfibrer binds till
kromosomer, uppvisar mitotiska celler samma fläckreaktion i kromosomområdet (12).
Synonymer: ACA, åtskiljt fläckig.
Nukleära antigener: Kromosom centromer (kinetochore).
Sjukdomssamband: Tyder i hög grad på CREST*-syndromvarianten av progressiv systemisk skleros (28).
SSA/Ro
*CREST är en form av PSS med framskriden kalcinos,
liksom Raynaud-fenomen,
�� esofageal dysfunktion,
�� sklerodactylo och��
telangiektasi.
��
SSA/Ro: Ett distinkt fläckigt mönster med framträ��
dande färgning
av nukleolerna i 10-20 procent av
interfaskärnorna. Dessa är de överexpresserande transfekterade cellerna. De återstående 80-90 procenten
av interfaskärnorna kan, men behöver inte, uppvisa en
finfläckig färgning av kärnan, med eller utan färgning
av nukleolerna. De metafasmitotiska cellernas icke-kromosomområde uppvisar sfärgning, medan kromosomområdet är negativt.
Nukleära antigener: SSA/Ro (60kD).
Sjukdomssamband: Noterat hos 60-70 % av patienter
med primärt Sjögrens syndrom, 30-40 % av patienter
med SLE och mer än 95 % av patienter med
��
��
subakut kutan lupus (38).
��
Nukleolärt
��
��
PCNA
��
��
��
��
MITOTISKA CELLER
DETEKTION
Mitotiska celler bör kunna synas i varje fält om man studerar dem i 200 gångers förstoring eller lägre. Studera
cellen i 400 gångers förstoring för att bekräfta att en cell
är i mitos. Mitotiska celler har en karaktäristisk rund form
utan påvisbart nukleärt membran. Kromosomområdet
i mitotiska celler har i allmänhet en oregelbunden form
inuti cellen på grund av att nukleärmembran saknas
42
Scl-70
Concepts mitotiska celler går det att urskilja dessa mönster, eftersom de mitotiska cellernas kromosomområde
färgas intensivt i ett perifert mönster, men inte färgas
av en nukleär membranantikropp. Skillnaden är kliniskt
betydelsefull, eftersom nukleära membranantikroppar
inte har någon DNA-/DNP-specificitet och inte är associerade med SLE (39).
4.
Anti-cetromer antikropp (ACA) kontra atypiskt färgad
antikropp som liknar en centromer: För att bekräfta
anticentromerantikroppen bör kromosomregionen i
de mitotiska cellerna färgas ljust med diskreta fläckar.
Om kromosomområdet inte färgas är antikroppen inte
en anticentromer och skall därför rapporteras som
„atypiskt fläckig“ (40).
5.
6.
7.
SSA/Ro kontra mönster som kan likna SSA/Ro-färgning:
Den distinktiva SSA/Ro-färgningen ses som ett distinkt
ljusfläckigt mönster med framträdande färgning av
nukleolerna i 10-20 % av interfaskärnorna. De återstående 80-90 % av interfaskärnorna kan, men måste
inte, uppvisa en finfläckig färgning av kärnan med eller
utan färgning av nukleolerna. Kromosomområdet i de
metafasmitotiska cellerna uppvisar inte någon färgning.
Det nukleolära mönstret kan särskiljas genom storfläckig
färgning av hela kärnorna, i allmänhet färre än sex per
cell. Scl-70-mönstret har finfläckig färgning och nukleolär färgning i alla interfaskärnor samt färgning av de
metafasmitotiska cellernas kromosomala område. Antikroppar mot cellnukleär antigen i celldelning (PCNA)
uppvisar varierande grova och fina fläckmönster i 30-50
procent av interfaskärnorna.
8.
9.
CYTOPLASMISK FÄRGNING
Även om autoantikroppar mot cytoplasmiska antigener
inte vanligtvis associeras med bindvävssjukdom, kan
sådana antikroppar detekteras genom epiteliala cellstruktursubstrat (41). Mitokondriala och glatta muskelantikroppar är de två antikroppar som vanligtvis upptäcks
och allmänt associeras med mononukleos, kroniskt aktiv
hepatit och leversjukdom (42, 43). Med hjälp av HEp-2cellsubstratet har den glatta muskelantikroppen även
påvisats hos patienter med vårtor (44).
Antimitokondrial antikropp (AMA): Åtskiljda fläckar som
är koncentrerade i cellens perinukleära område och
utvidgade i lägre densitet till cytoplasmans yttre områden. Detta bör skiljas från anti-Golgi-antikroppen, som
i allmänhet endast färgar ena sidan av det perinukleära området, och från antiribosomal antikropp, som
uppvisar finare fläckar med ett nätformigt utseende
som överensstämmer med platsen för endoplasmisk
reticulum inuti cellen.
OBSERVERA: Perinukleära fläckar kan enkelt särskiljas
från perifer nukleärfärgning genom att de mitokondriska fläckarna bildar en avbruten fläckig färgning runt
utsidan på det nukleära membranet, medan perifera
sera bildar en fast och jämn färgning inuti det nukleära
membranet.
RAPPORTERA SERA SOM NEGATIVT FÖR ANTINUKLEÄRA
ANTIKROPPAR OCH BEKRÄFTA POSITIVT SVAR FÖR ANTIMITOKONDRISK ANTIKROPP PÅ AMA-SPECIFIKT SUBSTRAT.
Antiglatt muskelantikropp (ASMA): Mycket fin fibrös
färgning över hela cellcytoplasman med ett spindelvävsliknande utseende . Till skillnad från mitokondrisk
antikropp är glatt muskelantikroppfärgning likformig
över hela cytoplasman och kan även sträcka sig över
kärnan. Mitotiska celler uppvisar i allmänhet stora,
åtskiljda fläckar utanför kromosomområdet. Glatt
muskelantikropp har visat sig ha hög specificitet för
aktin (45, 46).
RAPPORTERA SERA SOM NEGATIVT FÖR ANTINUKLEÄR ANTIKROPP OCH BEKRÄFTA POSITIVT SVAR FÖR
ANTIGLATT MUSKELANTIKROPP MED ASMA-SPECIFIKT
SUBSTRAT.
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
1. Diagnos kan inte ställas enbart på grundval av detektion av antinukleär antikropp. Resultaten måste
tolkas av läkaren med hänsyn till patientens historia
och symptom, de fysiska upptäckterna och övriga
diagnostiska metoder.
2. Behandling bör inte påbörjas enbart på grundval
av ett positivt test för antinukleära antikroppar.
Kliniska symptom, andra laboratorieupptäckter
och läkarens kliniska intryck måste beaktas innan
eventuell behandling påbörjas.
3. Speciella läkemedel, inklusive procainamid och hydralazin, kan orsaka en lupus erytematos-liknande
sjukdom (47). Patienter med läkemedelsinducerad
LE kan uppvisa positiv homogen eller homogen/
perifer ANA som i allmänhet är riktad mot nukleära
histoner (48).
En liten procentandel patienter med SLE uppvisar
eventuellt inte ANA med indirekt immunoenzymmetod, men kan uppvisa ANA med andra metoder
(49).
Även om en högt titrerad ANA i hög grad kan tyda
på bindvävssjukdom, bör detta inte betraktas diagnostiskt, utan snarare ses som en del av patientens
totala sjukdomshistoria.
Färgningsmönstren ändras ofta i och med fortlöpande titrering av sera. Detta beror i allmänhet på
att det finns mer än en nukleär antikropp.
Positiva ANA kan även ses hos en liten procentandel patienter med smittsamma och/eller neoplastiska
sjukdomar (9).
Autoantikroppar mot SSA/Ro uppvisar ett distinkt
färgningsmönster i de HEp-2000®-transfekterade
cellerna. När ett sådant mönster föreligger
betraktas detta som ett bekräftande bevis på att
det förekommer anti- SSA/Ro-antikroppar. Att ett
sådant mönster saknas utesluter emellertid inte att
det förekommer anti- SSA/Ro-antikroppar.
Eftersom SSA/Ro- antigenen har en överexpression i HEp-2000®-cellerna, uppvisar prover som
innehåller anti- SSA/Ro-antikroppar högre antikroppnivåvärden med dessa celler än de värden
som erhållits på icke-transfekterade HEp-2-celler.
Eftersom ingen av de andra autoantigenerna i HEp2000®-cellerna påverkas av transfektionsbehandlingen, uppvisar sera med andra autoantikroppspecificiteter inga avsevärda skillnader i antikroppnivå
mellan den transfekterade HEp-2000®-cellinjen och
de icke-transfekterade HEp-2 cellerna.
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
I ett stort medicincentrum på ett universitet framställdes
följande data över en tvåårsperiod med hjälp av HEp-2cell ANA-substrat (50). Tabell 1.
PRESTANDA
NORMALA PROVER
Sera från 500 friska bloddonatorer, 242 kvinnor och
258 män, av vilka ingen har haft någon känd historia
av reumatiska sjukdomar, testades parallellt med
användande av kommersiellt tillgängliga, icke-transfekterade HEp-2-celler och HEp-2000® Colorzyme®ANA-Ro
testsystem. I denna population uppvisade 36 prover (7,2
%) positiva antinukleära antikropptester vid 1:40 spädning av serum. Färgningsmönstren var identiska för de
båda substraten för 34 av de 36 positiva proverna. De
båda prover som uppvisade skillnader kom båda från
kvinnliga patienter, och för båda proverna bekräftades
att de innehöll anti- SSA/Ro-antikroppar. Ett av dessa
prover uppvisade en svag finfläckig reaktion med de
icke-transfekterade HEp-2-cellerna och den typiska
„ SSA/Ro“-färgningen med HEp-2000® Colorzyme®
ANA-Ro testsystem. Det andra provet var negativt
med de icke-transfekterade HEp-2-cellerna, men
uppvisade typisk „ SSA/Ro“-färgning med HEp-2000®
Colorzyme®ANA-Ro testsystem. De båda provernas
SSA/Ro-specificitet bekräftades genom ELISA-analys
och Western immnunoblot. Prover som var negativa vid
ANA-testerna var även negativa vid ELISA-analysen.
Sera från patienter med enbart SSA/Ro-antikroppar
Sera från 46 patienter med SLE eller Sjögrens syndrom
testades med hjälp av kommersiellt tillgängliga icketransfekterade HEp-2-celler och HEp-2000® Colorzyme®
ANA-Ro-testsystem. Genom ELISA-analys och Western
immunoblot bekräftades att all denna sera innehöll
antikroppar mot SSA/Ro-autoantigenen.Inga andra
autoantikroppar upptäcktes i något av dessa prov. Av
dessa prover testades 36 (78 %) positiva (med fläckigt
mönster) med de icke-transfekterade HEp-2-cellerna
och alla 46 (100 %) testades positiva (distinkt SSA/Rofärgningsmönster) med HEp-2000® Colorzyme® ANARo-testsystem.
SERA FRÅN PATIENTER MED ANDRA AUTOANTIKROPPAR
ÄN SSA/Ro
Serumprover från 230 patienter med olika reumatiska
och icke-reumatiska sjukdomar testades parallellt med
hjälp av kommersiellt tillgängliga icke-transfekterade
HEp-2-celler och HEp-2000® Colorzyme® ANA-Rotestsystem. Ett enkelt färgningsmönster noterades i
120 prover och blandade mönster i 110 prover. I den
totala populationen av 230 prover var 333 färgningsmönster identiska med båda substraten. 29 prover
uppvisade det distinkta „ SSA/Ro“-färgningsmönstret
med HEp-2000®- Colorzyme® ANA-Ro testsystem. 23
av dessa prover uppvisade fläckiga mönster med de
43
Artritis reumatoide juvenil
Sistémica
icke-transfekterade
HEp-2-cellerna. De sex avvikande
Poliarticular
proverna
(positiva med HEp-2000®, men negativa med
Pauciarticular-B27+
icke-transfekterade
HEp-2 celler) hade alla SSA/Ro-antiDM/PM
kroppar,
vilket det distinkta „ SSA/Ro“-färgningsmönstret,
Vasculitis
ELISA-analyserna
Población normal och
(másWestern
de 9.000blot-bekräftelsen
sueros evaluados):visar.
20-60 años
JÄMFÖRELSE
70-80 añosMELLAN OLIKA ANTIKROPPNIVÅER
S
14
bekräftade
positiva ANA-tester med 13
hjälp av HEpS
2000®
Colorzyme® ANA-Ro testsystem.
0 I denna utvalda
population
uppvisade 239 prover det25distinkta SSA/RoS
färgningsmönstret.
Positiva ELISA-analyser
S
20 för SSA/Roantikroppar erhölls för 238 (99,6 %) av dessa prover.
Ytterligare
79 prover uppvisade starkt2 fläckiga och/eller
S
homogena
mönster och gav positiva3.5
ELISA-analyser
S
Eftersom SSA/Ro- antigenen har en överexpression i
för SSA/Ro-antikroppar. Om man ser det distinkta
HEp-2000®-cellerna
uppvisar prover
som innehåller
SSA/Ro-mönstret
detta= därför
en bekräftelse på att
H = Homogéneo,
P =antiPeriférico,
N = Nucleolar,ärACA
anti-Centrómero
Abreviaturas: S = Moteado,
SSA/Ro-antikroppar högre antikroppnivåvärden med
det förekommer SSA/Ro-antikroppar, medan avsaknad
dessa celler än med icke-transfekterade HEp-2-celler.
av mönstret inte utesluter att det kan finnas SSA (R0)Eftersom ingen av de andra autoantigenerna i HEpantikroppar i provet. I de studier som skisserats ovan
Muster
%
2000®-cellerna påverkas av transfektionsbehandlingen
har vi undersökt totalt 429 sera innehållande SSA/RoDiagnose
Segregation
positiv
uppvisar sera med andra autoantikroppspecificiteter
antikroppar. Dessa kan anses vara bekräftade genom
inga avsevärda skillnader i antikroppnivå mellan den
ELISA-testning och/eller Western Immunoblots och de
Anormale Population (über 4.500 Seren getestet):
transfekterade HEp-2000®-cellinjen och de icke-transuppvisar det distinkta SSA/Ro-färgningsmönstret på den
Systemischer Lupus erythematosus
S,P+H,H,P
93
fekterade HEp-2 cellerna.
transfekterade HEp-2000® cellinjen. Vi har även sett
Rheumatoide Arthritis
S,H
40
prover som innehåller SSA/Ro-antikroppar, men som inte
Gemischte Bindegewebskrankheit
S
99
ANTIKROPPNIVÅS REPRODUCERBARHET
uppvisar det distinkta SSA/Ro-färgningsmönstret, efterProgressive systemische Sklerose – diffus
S,N
85
Tio prover tagna från CDC-kontroller och andra väl
som höga nivåer av andra autoantikroppar (vanligtvis
Progressive systemische Sklerose – CREST
93
ACA
karaktäriserade interna sera kördes på tre olika lotnumanti-DNA-antikroppar eller anti-Sm/RNP-antikroppar)
Juvenile
rheumatoide
Arthritis
mer av Hep-2000®-objektglas, vid tre olika tillfällen.
maskerar SSA/Ro-mönstret. Om man ser det distinkta
Systemisch
S
14
Inte i något fall gav ett negativt prov positiva resultat.
SSA/Ro-mönstret, är detta därför en bekräftelse på att
Polyartikulär
S
13
Alla antikroppnivåvärden inom en dubbel spädning av
det förekommer SSA/Ro-antikroppar i provet, medan
Pauciartikulär – B27+
0
det fastställda medelantikroppvärdet för alla prover
avsaknad av mönstret inte utesluter att det kan finnas
DM/PM
S
25
testades.
SSA/Ro-antikroppar.
Vaskulitis
Normale Population
(über 9.000 Seren getestet):
BEKRÄFTELSE
PÅ SSA/Ro-ANTIKROPPAR
20-60reumatologiskt
Jahre
I ett stort
referenslaboratorium
70-80 Jahre
analyserades
serumprover från 349 patienter med
S
20
S
S
2
3.5
Abkürzungen: S = Gefleckt, H = Homogen, P = Peripher, N = Nucleolar, ACA = Anti-Zentromer
TABELL 1
Diagnos
Onormal population (över 4500 sera testade):
Systemisk lupus erytematosus
Reumatoid artrit
Blandad bindvävssjukdom
Progressiv diffus systemisk skleros
Progressiv systemisk skleros-CREST
Reumatoid artrit hos barn
Systemisk
Polyartikularis
Pauciartikularis-B27+
DM/PM
Vaskulit
Normal population (över 9000 sera testade):
20-60 år
70-80 år
Mönsterfördelning
%
positiv
S,P+H,H,P
S,H
S
S,N
ACA
93
40
99
85
93
S
S
S
S
14
13
0
25
20
S
S
2
3.5
Förkortningar: S = Fläckig, H = Homogen, P = Perifer, N = Nukleolär, ACA = Anticentromer
44
HEp-2000® COLORZYME®
ANA-Ro TESTPROCEDUR
1.
REKONSTITUERA BUFFERT (PBS)
8.
2.
REKONSTITUERA FÄRGreagenS
Lös upp innehållet i en påse i 150 ml avjoniserat
eller destillerat vatten. Blanda väl tills preparatet
har lösts upp helt och hållet. Denna färgreagens
är stabil i 30 dagar i rumstemperatur i försluten behållare. Färgreagensen kan återanvändas i högst
30 dagar, eller tills det syns någon färgförändring
eller fällning. Grumling eller opalescens utan synlig
fällning vid återanvändning är normalt. Beroende
på användningstakten kan 150 ml Colorzyme®
färgreagens användas med maximalt tjugo
objektglas.
3.
SPÄD PATIENTPROV
Screening: Späd patientprover till 1:40 genom att
tillsätta 0,05 ml (50 µl) serum till 1,95 ml rekonstituerad PBS.
Semikvantitativ bestämning av antikroppnivå:
Gör dubbla seriespädningar av screeningprov (t
ex 1:80, 1:160, 1:320...1:2560) med användande
av PBS.
4.
FRAMSTÄLL SUBSTRATOBJEKTGLAS (20-25
µl/brunn)
Tag bort objektglas(en) från påsen(-arna) och
placera kontrollserat på kontrollbrunnarna på
följande sätt: Vänd upp och ned på pipettflaskan
och kläm försiktigt tills det syns en droppe på
spetsen. För försiktigt droppen till rätt kontrollbrunn, men undvik direktkontakt mellan pipettspetsen och objektglasets yta. Placera den positiva
kontrollen på den brunn som är markerad „+“,
den negativa kontrollen på den brunn som är
markerad „-“ och en droppe PBS-buffert på den
brunn som är markerad „PBS“. Tillsätt 1 droppe
(20-25 µl) patientprov i de numrerade brunnarna.
OBSERVERA: För allmän screening rekommenderas den homogena positiva kontrollen. För
semikvantitativ bestämning av antikroppnivå skall
den positiva kontroll väljas som åskådliggör det
färgningsmönster som är mest likt screeningprovet
(använd t ex den fläckiga positiva kontrollen för
patientprover som ger ett fläckigt färgningsmönster i screening). Om HEp-2000® ANA-Ro-test
skall användas för att bekräfta förekomst av
anti-SSA/Ro-antikroppar måste den SSA/Ro-positiva kontrollen, katalognummer 2035-Ro, köras på
minst ett objektglas under den dagens körning.
VARNING: DIREKTKONTAKT MELLAN PIPETTSPETSEN
OCH OBJEKTGLASETS YTA KAN LEDA TILL ATT ANTIGENSUBSTRATET TAR SKADA.
5.
6.
9.
10.
PBS SKÖLJNING
Avlägsna objektglaset/-n från inkubatorbrickan
och skölj hastigt med PBS. Spruta inte buffert
direkt på brunnarna.
11.
PBS-TVÄTTNING (10 minuter)
Tvätta objektglaset/-n i 10 minuter med PBS i en
objektglasfärgskål eller ett Coplin-kärl. Försiktig
omskakning rekommenderas vid nedsänkningen
av objektglaset, vid dess mittpunkt samt vid avlägsnandet. Denna tvättning kan förlängas med
10-30 minuter utan att de slutliga testresultaten
påverkas.
12.
INKUBATION AV FÄRGREAGENS (30 minuter i
rumstemperatur, det vill säga 18-24 °C)
Avlägsna ett objektglas åt gången från PBS och
doppa 3-5 gånger i avjoniserat eller destillerat
vatten. Knacka därefter objektglasets sida
mot läskpapper eller pappershandduk för att
avlägsna överskottsvatten. Placera omedelbart
objektglaset(n) i ett Coplin-kärl med aktiverad
färgreagens och odla i 30 minuter.
13.
PBS-SKÖLJNING
Avlägsna ett objektglas åt gången från Coplinkärlet och skölj varje sida av objektglaset 4-5
sekunder med PBS. Spruta inte buffert direkt på
brunnarna. Placera varje PBS-sköljt objektglas i
ett Coplin-kärl fyllt med destillerat eller avjoniserat
vatten tills alla objektglas har avlägsnats från
färgreagensen. Gå direkt till steg 14.
14.
MONTERA SKYDDSREMSA
Avlägsna ett objektglas åt gången från PBS och
vatten. Knacka objektglasets sida mot läskpapper eller pappershandduk för att avlägsna
överskottsvatten. TORKA ALDRIG OBJEKTGLASET
MED LÄSKPAPPER ELLER ANNAT FÖREMÅL OCH LÅT
ALDRIG OBJEKTGLASET STÅ UTAN SKYDDSREMSA
LÄNGRE ÄN FEMTON SEKUNDER. Tillsätt 4-5 droppar halvpermanent monteringsmedium längs
mittlinjen på varje objektglas. Sätt skyddsremsan
försiktigt på plats och undvik luftfickor genom att
försiktigt lägga ned skyddsremsan från objektglasets ena ände till den andra.
OBSERVERA: Överflödigt monteringsmedium på
objektglaset kan leda till att cellerna inte får en
tydlig upplösning (suddig bild). Överflödigt monteringsmedium kan avlägsnas från objektglaset
genom att försiktigt torka skyddsremsan med läskpapper eller linspapper. Undvik att röra direkt vid
skyddsremsan. Objektglasen kan avläsas direkt
eller förvaras under en längre tid i 2-10° C utan att
förlora reaktivitet.
PBS-SKÖLJNING
Avlägsna objektglaset/-n från inkubatorbrickan
och skölj hastigt med PBS genom att använda en
sprutflaska, Pasteur, eller serologisk pipett. Spruta
inte buffert direkt på brunnarna.
OBSERVERA: Led PBS-flödet längs objektglasets
mittlinje för att undvika korskontamination på trettonbrunnars objektglas genom att först luta glaset
mot brunnarna 1-5 och därefter mot brunnarna
6-10.
7.
ODLA OBJEKTGLASEN (30±5 minuter i rumstemperatur, dvs 18-24 °C)
Placera lock på inkubationskammaren. Odla
objektglaset/-n under trettio minuter (±5 minuter) i
rumstemperatur (18-24° C).
ODLING AV OBJEKTGLAS (30±5 minuter i rumstemperatur, det vill säga 18-24 °C)
Placera objektglas(en) i en fuktig täckt kammare
(en petriskål med fuktad pappershandduk
duger). Odla, med locket på, i 30 minuter (±5
minuter) i rumstemperatur (18-24 °C).
ENZYMEANTIKROPPREAGENS (Täck brunnarna
med 12-14 droppar)
Flytta ett objektglas åt gången från PBS och
vatten. Knacka objektglasets sida mot läskpapper eller pappershandduk för att avlägsna
överskottsvatten. Återför omedelbart objektglaset
till inkubationskammaren och täck brunnarna
helt med enzymantikroppreagens. Börja med att
placera en droppe i varje brunn. Upprepa detta
för varje objektglas. Enzymantikroppreagensen
har titrerats för att kompensera för det avjoniserade eller destillerade vatten som finns kvar på
objektglaset efter sköljning.
OBSERVERA: Det är viktigt att objektglasbrunnarna inte torkar under detta förfarande, annars
tar substratet skada.
TORKA ALDRIG OBJEKTGLASET MED LÄSKPAPPER
ELLER ANNAT FÖREMÅL OCH LÅT ALDRIG OBJEKTGLASET STÅ UTAN ENZYMANTIKROPPREAGENS
LÄNGRE ÄN FEMTON SEKUNDER.
Lös upp innehållet i en buffertpåse i en liter
avjoniserat eller destillerat vatten. PBS-bufferten
kan täckas och förvaras i 2-10 °C i maximalt fyra
veckor.
PBS-TVÄTTNING (10 minuter)
Tvätta objektglaset/-n under tio minuter med PBS i
en objektglasfärgskål eller ett Coplin-kärl. Försiktig
omskakning rekommenderas vid nedsänkningen av objektglaset, vid mittpunkten samt vid
avlägsnandet. Denna tvättning kan förlängas
med 10-30 minuter utan att de slutliga testresultaten påverkas. Kassera PBS-tvättlösningen efter
användning. För optimala resultat skall PBS ändras
vid mittpunkten och en magnetisk blandare
användas.
TEKNISK HJÄLP: +1-916- 363-2649
eller e-mail: [email protected]
45
BIBLIOGRAPHY
1. Robbins, W.C., Holman, H.R., Delcher, H., et al. Complement Fixation with Cell Nuclei and DNA in Lupus Erythematosus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 96:575-579, 1979.
2. Barnett. E.V. Antinuclear Antibodies and Nuclear Antigens. California Medicine 104:463-469, 1966.
3. Casals, S.P., Friou, G. J., Myers, L. L. Significance of Antibody to DNA in Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis
Rheum. 7:379-390, 1964.
4. Tan, E. M. Autoimmunity to Nuclear Antigens. In: The Cell Nucleus, Volume VII, Chromatin, Part D. Ed. by H.
Busch, pp. 457-477, New York, Academic Press, 1979.
5. Mathy, J. P., Baum, R., Toh, B. H. Autoantibody to Ribosomes and Systemic Lupus Erythematosus. Clin. Exp.
Immunol. 41:73-80, 1980.
6. Rekvig, O. P., Hannestad, K. The Specificity of Human Autoantibodies That React with Both Cell Nuclei and
Plasma Membranes: The Nuclear Antigen is Present on Core Mononucleosomes. J. Immunol. 123:2673-2681,
1979.
7. Sondag-Tschroots, I. R. M. J., Aaij, C., Smit, J. W., et al. The Antiperinuclear Factor. 1. The Diagnostic Significance of the Antiperinuclear Factor for Rheumatoid Arthritis. Ann. Rheum. Dis. 38:248-251, 1979.
8. Nakamura, R.M., Tan, E.M. Recent Progress in the Study of Autoantibodies to Nuclear Antigens. Hum. Pathol. 9:
85-91, 1978.
9. Fernandez-Madrid, F., Mattioli, M. Antinuclear Antibodies (ANA): Immunologic and Clinical Significance.
Semin. Arthritis Rheum. 6:83-124, 1976.
10. Burnham, T.K., Bank, P. W. Antinuclear Autoantibodies 1. Patterns of Nuclear Immunofluorescence. J. Invest.
Dermatol. 62:526-534, 1974.
11. Douvas, A.S., Achten, M., Tan, E.M. Identification of a Nuclear Protein (Scl-70) as a Unique Target of Human
Antinuclear Antibodies in Scleroderma. Biol. Chem. 245:10514 - 10522, 1979.
12. Moroi, Y., Peebles, C., Fritzler, M. J., et al. Autoantibody to Centromere (Kinetochore) in Scleroderma Sera.
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:1627-1631, 1980.
13. Cohen, M. L., Dawkins, B., Dawkins, R. L., et al. Clinical Significance of Antibodies to Ribonucleoprotein. Ann.
Rheum. Dis. 38:74-78, 1979.
14. Sharp, G. C., Irwin, W. S., Tan, E.M., et al. Mixed Connective Tissue Disease—An Apparently Distinct Rheumatic
Disease Syndrome Associated with a Specific Antibody to Extractable Nuclear Antigen (ENA). Am. J. Med. 52:
148-159, 1972.
15. Sharp, G. C., Irwin, W. S., May, L. M., et al. Association of Antibodies to Ribonucleoprotein and Sm antigens with
Mixed Connective Tissue Disease, Systemic Lupus Erythematosus and Other Rheumatic Disease. N. Engl. J. Med.
295:1149-1154, 1976.
16. Alspaugh, M. A., Tan, E. M. Antibodies to Cellular Antigens in Sjögren’s Syndrome. J. Clin. Invest. 55:1067-1073,
1975.
17. Alspaugh, M. A., Talal, N., Tan, E.M. Differentiation and Characterization of Autoantibodies and Their Antigens
in Sjögren’s Syndrome. Arthritis Rheum. 19:216-222, 1976.
18. Wolfe, J. F., Adelstein, E., Sharp, G. C. Antinuclear Antibody with Distinct Specificity for Polymyositis. J. Clin.
Invest. 59:176-178, 1977.
19. Alspaugh, M. A., Tan, E. M. Serum Antibody in Rheumatoid Arthritis Reactive with a Cell-Associated Antigen.
Demonstration of Precipitation and Immunofluorescence. Arthritis Rheum. 19:711-719, 1976.
20. Nakamura, R. M., Greenwald, C. A., Peebles, C. L., et al. Autoantibodies to Nuclear Antigens (ANA): Immunochemical Specificities and Significance in Systemic Rheumatic Disease. Chicago, American Society of Clinical
Pathologists, 1978.
21. Kozin, F., Fowler, M., Koeth, S.M. A Comparison of the Sensitivities and Specificities of Different Substrates for the
Fluorescent Antinuclear Antibody Test. Am. J. Clin. Pathol. 74:785-790, 1980.
22. McCarty, G.A., Rice, J. R. Characterization and Comparison of Available Antinuclear Antibody Kits Using Single
Pattern Index Sera. J. Rheum. 7:339-347, 1980.
23. Hahon, N., Eckert, H. L., Stewart, J. Evaluation of Cellular Substrates for Antinuclear Antibody Determinations. J.
Clin. Microbiol. 2:42-45, 1975.
24. Cleymaet, J. E., Nakamura, R.M. Indirect Immunofluorescent Antinuclear Antibody Tests: Comparison of Sensitivity and Specificity of Different Substrates. Am. J. Clin. Pathol. 58:388-393, 1972.
25. Harmon C.E., Deng J.S., Peebles C.L., Tan E.M.: The importance of tissue substrate in the SSA/Ro/Ro antigen-antibody system. Arthritis Rheum. 27:166-173, 1984.
26. Maddison P.J., Provost T.T., Reichlin M.: Serological findings in patients with “ANA negative” systemic lupus
erythematosus. Medicine 60:87-94, 1981.
27. Itoh Y., Rader M.D., Reichlin M.: Heterogeneity of the Ro/SSA/Ro antigen and autoanti-Ro/SSA response:
evidence of the four antigenically distinct forms. Clin. Exp. Immunol. 81:45-51,1990.
28. Tan, E.M., Rodnan, G. P., Garcia, I., et al. Diversity of Antinuclear Antibodies in Progressive Systemic Sclerosis.
Arthritis Rheum. 23:617-625, 1980.
29. Miyachi, K., Fritzler, M. J., Tan, E.M. Autoantibody to a Nuclear Antigen in Proliferating Cells. J. Immuno. 121:
2228-2234, 1978.
30. McCarty, G. A., Barada, F. A., Snyderman, R., et al. A New Autoantibody Staining Pattern, the Mitotic Spindle
Apparatus: Immunologic Characteristics, Clinical Occurrence, and Cytoskeletal Studies. Arthritis Rheum. 24:
S109, 1981.
31. McCarty, G. A., Valencia, D. W., Fritzler, M. J. Antibody to Mitotic Spindle Apparatus: Immunologic Characteristics and Cytological Studies. J. Rheum. 11:213-218, 1984.
32. Nairn, R.C. Fluorescent Protein Tracing. Ch 6 and 9. London, E.S. Livingstone Ltd., 1969.
33. Peter, V.B., Dawkins, R. L. Evaluating Autoimmune Disease. Diagnostic Medicine. Sept. - Oct. 1979.
34. Nakamura, R. M., Peebles, C. L. Molden, D. P., Tan, E. M., Advances in Laboratory Tests for Autoantibodies to
Nuclear Antigens in Systemic Rheumatic Diseases. Laboratory Medicine 15 (No. 3): 190-198 (1984).
35. Notman, D.D., Kurata, N., Tan, E.M. Profiles of Antinuclear Antibodies in Systemic Rheumatic Diseases. Ann. Int.
Med. 83:464-469, 1975.
36. McDuffie, F. C., Burch, T.N. Immunologic Tests in the Diagnosis of Rheumatic Diseases. Bull. Rheum. Dis. 27:900911, 1976.
37. Ritchie, R.F. Antinucleolar Antibodies. Their Frequency and Diagnostic Application. N.Engl. J. Med. 282:11741178, 1970.
38. Chan, E. K. L., Andrade, L. E. C. Antinuclear Antibodies in Sjögren’s Syndrome. Rheum. Dis. Clin. North Am. 18:
551-570, 1992.
39. Nakamura, R.M., Peebles, C.L., Penn, G.M. Antibodies to Nuclear Antigens (ANA): Atypical Indirect Immunofluorescent Test for Antibodies to Nuclear Antigens (ANA) in a Case of Idiopathic Thrombocytopenia. Clinical
Immunology Check Sample No. C-1-20. American Society of Clinical Pathologists, 1980.
40. Fritzler, M. J., Valencia, D.W., McCarty. G.A. Speckled Pattern Antinuclear Antibodies Resembling Anticentromere Antibodies. Arthritis Rheum. 27:92-96, 1984.
46
41. Gabbiani, G., Ryan, G.B., Lamelin, J.P., et al. Human Smooth Muscle Antibody. Am. J. Pathol. 72:473-488, 1973.
42. Mead, G.M., Cowin, P., Whitehouse, J.M.A. Antitubulin Antibody in Healthy Adults and Patients with Infectious
Mononucleosis and its Relationship to Smooth Muscle Antibody (SMA). Clin. Exp. Immunol. 39:328-336, 1980.
43. Klatskin, G., Kantor, F.S. Mitochondrial Antibody in Primary Biliary Cirrhosis and Other Diseases. Ann. Int. Med. 77:
553-541, 1972.
44. McMillan, S.A., Haire, M. Smooth Muscle Antibody in Patients with Warts. Clin. Exp. Immunol. 21:339-344, 1975.
45. Anderson, P., Small, J.V., Sobieszek, A. Studies on the Specificity of Smooth Muscle Antibodies. Clin Exp. Immunol. 26:57-66, 1976.
46. Lidman, K., Biberfeld, G., Fagraeus, A., et al. Anti-actin Specificity of Human Smooth Muscle Antibodies in
Chronic Active Hepatitis. Clin. Exp. Immunol. 24:266-272, 1976.
47. Lee, S.L., Rivero, I., Siegel, M. Activation of Systemic Lupus Erythematosus by Drugs. Arch. Int. Med 117:620-626,
1966.
48. Fritzler, M.J., Tan, E.M. Antibodies to Histones in Drug-Induced and Idiopathic Lupus Erythematosus. J. Clin.
Invest. 62:560-567, 1978.
49. Gladman, D.D., Chalmers, A., Urowitz, M.B. Systemic Lupus Erythematosus with Negative LE Cells and Antinuclear Factors. J. Rheum. 5:142-147, 1978.
50. Data on file. Duke University Medical Center, Durham, North
47
��
��
��
��
��
��
Manufacturer
Constructeur
Fornitore
Fabricante
Hersteller
Fabrikant
Authorized Representative in the European Community
Représentant autorisé dans le Communauté européen
Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Autorisierter Repräsentant in der Europäischen Gemeinschaft
Auktoriserad Representant europeiska unionen
Temperature Limitation
Limitation de la Température
Limitazione Di Temperatura
Limitación De la Temperatura
Temperatur-Beschränkung
Temperatur begränsning
Contains Sufficient for <n> tests
Contient suffisamment pour <n> essais
Contiene sufficiente per <n> test
Contiene suficiente para <n> pruebas
Enthält genügendes für <n> Tests
Innehåller tillräckligt för <n> test
Consult Instructions for Use
Consultez les instructions pour l'usage
Leggere le istruzioni per l'uso
Consulte las instrucciones de uso
Beachten Sie die Anwendungsvorschriften
Se instruktionerna
In Vitro Diagnostic Medical Device
Dispositif Médical Diagnostique In vitro
Dispositivo Medico Diagnostico In vitro
Dispositivo Médico De diagnóstico In vitro
In-vitrocMedizinische Diagnoseeinheit
In Vitro diagnostiska medicinapparat
MDSS
Burckhardtstr. 1
30163 Hannover, Germany
Immuno Concepts N.A. Ltd 9779 D Business Park Drive Sacramento, CA 95827
Technical Support USA: 1.800.251.5115 Outside USA: 1.916.363.2649
Email: [email protected]
CAT. E4000-Ro-I, 4.11.02.003.092 Rev 0.0 © Copyright 2003

Descargue aquí el inserto

Transcription

Documents pareils

AVVISO AI PASSEGGERI - INNALZAMENTO DELLE MISURE DI

muniqué nu. Conseil et Genève, lo 7 j envier 1933. Memb r e s de l c

La ricerca empirica in materia di droga La recherche

CO NS EIL ET SOCI AL - Repositorio Digital CEPAL

GOHINEAU E NIETZSCHE IN ITALIA souvenirs

Untitled

PHOENIX

PROGRAMMA - Istituto Romano Bruni

TABLE DES MATIÈRES / ÍNDICE

Articolo sulla rivista Images – n° 31 Estate 2013