Méthode Hettich Préparation cytologie urinaire
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Méthode Hettich Préparation cytologie urinaire
de ho h ét c M etti H Préparation de lames porte-objets pour la cytologie urinaire Préparation d’urine native Préparation de lames porte-objets pour la cytologie urinaire Il ne suffit pas de centrifuger de l’urine native sur une lame porte-objets usuelle pour obtenir une bonne préparation cytologique à partir de celle-ci. L’urine contient peu de cellules, lesquelles adhèrent en outre très mal à la lame porte-objets. Ainsi, il en résulterait une préparation très pauvre en cellules et donc de qualité insuffisante. Pour augmenter le rendement cellulaire, il faut enduire la lame porte-objets ou utiliser un liquide fixateur approprié. Pour cela, on utilise en particulier la poly-L-lysine (PLL, société Sigma, cat. n° P8920) comme agent de revêtement et le liquide de Saccomano comme agent de fixation. Avantages de la méthode Hettich 1. Haut rendement cellulaire · grâce au revêtement de la lame porte-objets · grâce au liquide de fixation qui améliore l‘adhésivité des cellules 2. Bonne représentation des cellules · · · La solution de Saccomano permet d’obtenir des sédiments bien identifiables. Les cellules urothéliales s’étalent sur un niveau. Le revêtement PLL permet de représenter, en plus des cellules, des particules de petite taille telles que les bactéries. Préparation A) Obtention d’une préparation cytologique avec une lame porte-objets enduite 1. Préparation de la lame porte-objets Deux procédés peuvent être utilisés pour enduire les lames porte-objets de poly-L-lysine : le trempage ou le revêtement en centrifugeuse. Le revêtement par trempage est simple et rapide à réaliser, mais le film obtenu sur la lame peut quelquefois être irrégulier. À l’inverse, le revêtement en centrifugeuse dure un peu plus longtemps mais permet d‘obtenir à chaque fois de très bons résultats. a) Trempage · Diluer à 1:10 la PLL avec de l‘eau distillée et verser dans une cuvette. · Plonger des lames porte-objets usuelles sans traite- ment préalable dans cette solution et laisser tremper pendant 5 minutes. La PLL doit être à température ambiante. · Sortir les lames porte-objets et les laisser sécher dans une étuve à env. 60 °C (pendant env. 15 minutes). Pour le séchage à l‘air libre, rallonger la durée en conséquence. La lame porte-objet peut être utilisée dès que le film de PLL est sec. b) Revêtement en centrifugeuse · Diluer à 1:10 la PLL. · Placer les lames porte-objets non lavées sur la plaque de fixation (réf. 1662) puis y fixer une chambre de 8 ml (réf. 1666). · Verser 100 µl de PLL diluée dans la chambre de cytologie. · Centrifuger le système de cytologie à 1100 x g pendant une heure (cela correspond à 3.000 min-1 avec le rotor 6 places, et à 3.200 min-1 avec le rotor 4 places). L’échantillon peut ensuite être directement versé dans ce système de cytologie. 2. Choix des accessoires adaptés Pour la centrifugation de l’urine, il est recommandé d‘utiliser nos plus grandes chambres de cytologie d’un volume de 8 ml et d’une surface de sédimentation de 240 mm2. Dans beaucoup de cas, cela permet d‘éviter la centrifugation préalable dans un tube. 3. Assemblage du système de cytologie Pour l’assemblage du système de cytologie, veuillez vous reporter à notre schéma « Des préparations parfaites en un tour de main – le système de cytologie HETTICH ». La préparation de lames porte-objets à partir d’urine requiert en règle générale une fixation humide. Pour cette raison, le système cytologique doit être monté sans carte-filtre (cf. schéma, point A1). Pour la centrifugation d’échantillons infectieux, il est recommandé d’utiliser le couvercle réf. 1661 (cf. schéma, point A2). 4. Centrifugation a) Sédimentation Centrifuger les chambres de cytologie pendant 5 minutes à 1100 x g (ce qui correspond à 3.000 min-1 avec le rotor 6 places, et à 3.200 min-1 avec le rotor 4 places). b) Retrait du surnageant acellulaire Après la centrifugation, le surnageant acellulaire se trouve encore dans la chambre et doit être déversé avec prudence ou aspiré. Il est important de ne pas remuer le sédiment au cours de l’aspiration, car cela pourrait influencer sa qualité et entraîner une perte de cellules. 2 c) Fixation et coloration Une fois le surnageant retiré, la préparation humide peut immédiatement être fixée (dans de l‘éthanol à 99 % par exemple) puis colorée. B) Obtention d’une préparation cytologique à l‘aide de la solution de Saccomano 1. Travail préparatoire a) Préparation de l’échantillon d’urine · Centrifuger l’échantillon d’urine dans un tube pendant 10 minutes à 1700 x g (ce qui correspond à 3.600 min-1 avec le rotor 6 places, et à 4.000 min-1 avec le rotor 4 places). · Déverser le surnageant. Important : Aérer le culot se trouvant au fond du tube avant d’y ajouter la solution de Saccomano (de préférence en tapotant précautionneusement le fond du tube contre une surface dure). · Ajouter la solution de Saccomano et laisser agir pendant 30 minutes à température ambiante. 4. Centrifugation a) Sédimentation Centrifuger les chambres de cytologie pendant 5 minutes à 1100 x g (ce qui correspond à 3.000 min-1 avec le rotor 6 places, et à 3.200 min-1 avec le rotor 4 places). b) Retrait du surnageant acellulaire Après la centrifugation, le surnageant acellulaire se trouve encore dans la chambre et doit être entièrement déversé. c) Fixation et coloration Une fois le surnageant vidé, retirer la chambre de cytologie et laisser sécher le sédiment à l’air libre jusqu’à ce qu’un dépôt cireux se soit formé. La préparation peut être envoyée en l’état. Avant la coloration, le dépôt cireux formé sur le sédiment doit être retiré par trempage dans de l’éthanol à 50 % (pendant env. 10 minutes). Références pour la commande b) Préparation de la solution de Saccomano Pour préparer 100 ml de solution de Saccomano, il faut mélanger 43 ml d’eau distillée, 53 ml d’éthanol à 95 % et 4 ml de solution mère de polyéthylène glycol. Réf. ROTOFIX 32 A 1206 UNIVERSAL 320 / UNIVERSAL 320 R c) Préparation de la solution mère de polyéthylène glycol : · Chauffer le polyéthylène glycol 1500 (Merck Darmstadt, réf. 807489) et l’eau distillée à 60 °C. · Mélanger des volumes respectivement égaux (par exemple 50 ml de polyéthylène glycol et 50 ml d’eau distillée) lorsque ceux-ci ont atteint la bonne température. · Laisser refroidir la solution mère à température ambiante avant de l’utiliser pour préparer la solution de Saccomano. 2. Choix des accessoires adaptés Centrifugeuse Accessoires sélectionnés 1) Réf. Rotor 4 places 1624 Rotor 6 places 1626 Nacelle de cytologie 1660 Couvercle pour réf. 1660 1661 Plaque de fixation avec bague de serrage 1662 Chambre de cytologie 1 x 4 ml (120 mm²) 1665 Chambre de cytologie 1 x 8 ml (240 mm²) 1666 1) 1401 / 1406 Vous trouverez notre gamme complète d’accessoires pour la cytologie dans notre catalogue de cytologie que vous pouvez obtenir gratuitement sur demande. Cf. page 2. 3. Assemblage du système de cytologie Cf. page 2. Andreas Hettich GmbH & Co. KG Föhrenstr. 12 D -78532 Tuttlingen Allemagne www.hettichlab.com [email protected] [email protected] Tél.+49 (0)7461 / 7 05 -0 Fax+49 (0)7461 / 7 05 -11 22 Ventes nationales : Ventes internationales : Service clients pour l‘Allemagne Service clients pour l‘étranger : -12 00 -12 01 :-12 02 -12 03 M-Urine-F.0814 © by Andreas Hettich GmbH & Co. KG Préparation de lames porte-objets pour la cytologie urinaire