Préparation de lames porte-objets de liquide

Méthode Hettich
Préparation de lames porte-objets
de liquide céphalorachidien pour
l’examen cytologique
Préparation de lames porte-objets de liquide céphalorachidien pour l’examen cytologique
En matière de diagnostic du liquide céphalorachidien,
l’examen cytologique classique du liquide céphalorachidien joue un rôle particulièrement important pour
la détection et la caractérisation des maladies
inflammatoires infectieuses du SNC, pour la mise en
évidence d’hémorragies sous-arachnoïdiennes et
pour la détection de cellules néoplasiques. En outre,
les préparations cytologiques sont utilisées pour
1)
les examens de suivi et le contrôle des thérapies.
Le liquide céphalorachidien étant généralement un
liquide pauvre en cellules et en protéines, les cellules
commencent à se détériorer seulement quelques
heures après la ponction. Pour cette raison, les
échantillons de liquide céphalorachidien utilisés
pour préparer une lame porte-objets ne doivent
2)
pas avoir plus de 2 heures.
Outre l’âge des échantillons, la technique de
préparation est elle aussi déterminante pour la qualité
du diagnostic établi à partir des préparations
cytologiques. Il faut pour cette raison veiller à obtenir
un rendement cellulaire optimal et éviter absolument
toute perte sélective de cellules lors de la préparation
du liquide céphalorachidien. La morphologie des cellules
doit rester intacte pour permettre une identification
fiable des différentes populations de cellules.
Avantages de la méthode Hettich
1. Traitement direct de l’échantillon de LCR
en préparation cytologique
·
·
·
·
Traitement direct de l’échantillon de LCR en
préparation cytologique
Utilisation du surnageant acellulaire pour d’autres
analyses
2. Obtention de préparations de très bonne qualité
· Préservation optimale de la morphologie
· Répartition optimale des cellules
· Rendement optimal
Préparation
1. Préparation de l‘échantillon
La qualité des préparations à base de liquide
céphalorachidien pauvre en cellules et en protéines
étant souvent insuffisante, il est recommandé
d’ajouter du sérum humain ou une solution d’albumine
à l’échantillon. L’adjonction de protéines est d’ailleurs
considérée comme nécessaire à la stabilisation des
cellules lorsque le nombre de cellules est inférieur à
10/µl et la teneur en protéines inférieure à 3 000 mg/l.
Pour garantir une concentration protéinique supérieure
à 3 000 mg/l, on ajoute, pour un échantillon de liquide
céphalorachidien de 400 µl, 50 µl de sérum normal
d’une teneur totale en protéines d’environ 70 g/l.
3)
Aucun sérum autologue n’est ici nécessaire.
L’utilisation de lames enduites permet en outre
d’augmenter le rendement cellulaire. Pour les
travaux routiniers et la coloration conventionnelle,
il est recommandé d‘utiliser de lames enduites
de PolysineTM, pour la mise en évidence immunocytologique de marqueurs de surfaces cellulaires,
en particulier de marqueurs tumoraux, il est
4)
recommandé d‘utiliser de lames Super Frost® Color.
(PolysineTM et Super Frost® sont marques déposées
de la société Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk
GmbH & Co. KG).
2. Choix des accessoires adaptés
La chambre est choisie en fonction de la quantité
disponible et de la teneur en cellules de l’échantillon.
Pour des échantillons de liquide céphalorachidien,
il est généralement recommandé d’utiliser des
chambres de 1 et 2 ml présentant une surface de
sédimentation de 30 mm² ou de 60 mm².
Cellules/
échantillon
Jusqu’à
2 000
2 000 – 20 000
À partir de
20 000
Taille de la chambre
30 mm²
30 mm²
60 mm²
100 µl – 1 ml
100 µl – 1 ml
400 µl – 2 ml
oui
non
non
Volume
Adjonction de
protéines
3. Assemblage du système de cytologie
Pour l’assemblage du système de cytologie, veuillez
vous reporter à notre schéma « Perfect preparations –
with the HETTICH cyto-system all it takes is a turn ».
1)
2)
3)
4)
Kluge et al., Stellenwert der praktischen (klassischen) Liquorzytologie im Gesamtspektrum der Liquordiagnostik, in Kluge et al. (Hrsg.)
Atlas der praktischen Liquorzytologie, Stuttgart 2005, p. 2-3.
Ibidem, p. 7.
Ibidem, p. 8.
Recommandation du laboratoire d’examen du liquide céphalorachidien de l’institut de chimie clinique et de diagnostic de laboratoire
(Prof. Dr Kluge, Dr Roskos), clinique de l’université de Jena.
2
Préparation de lames porte-objets de liquide céphalorachidien pour l’examen cytologique
La préparation de lames porte-objets de liquide céphalorachidien requiert généralement une fixation sèche. Il faut
donc utiliser une carte-filtre dans le système cytologique
(cf. schéma, point B1). Pour la centrifugation d’échantillons
infectieux, utiliser le couvercle réf. 1661 (cf. schéma, point B2).
4. Centrifugation
a) Sédimentation
Centrifuger les chambres de cytologie pendant 3 minutes
à 275 x g (ce qui correspond à 1 500 min-1 avec le rotor
6 places, et à 1 700 min-1 avec le rotor 4 places). Cette
première phase de centrifugation permet la sédimentation
de toutes les cellules sur la lame porte-objets.
b) Retrait du surnageant acellulaire
Après la centrifugation, le surnageant acellulaire se trouve
encore dans la chambre et doit être retiré avec prudence
en prenant soin de laisser un peu de liquide résiduel. Il
est important de ne pas remuer le sédiment au cours de
l’aspiration, car cela pourrait influencer sa qualité et
entraîner une perte de cellules. Il est donc recommandé
de retirer le surnageant de haut en bas en suivant la
surface du liquide à l’aide d’une pipette Pasteur. Le bout
de la pipette ne doit pas toucher la lame porte-objets mais
laisser une petite goutte de liquide résiduel sur le sédiment !
Si aucune solution protéinique n’est ajoutée, le surnageant
ainsi obtenu peut être utilisé pour les analyses biochimiques.
d) Fixation et coloration
La préparation sèche peut ensuite immédiatement
être fixée et colorée.
Bon à savoir :
Après coloration au Giemsa ou au May-GrünwaldGiemsa, les lames porte-objets sont rincées à l’aide
d’un tampon (Weise, Sörensen). Elles doivent ensuite
être séchées. Le système de maintien Labora
pour 6 lames porte-objets (réf. 1285) permet de
réaliser ces étapes de manière simple et rapide :
· Placer les lames porte-objets rincées avec le tampon Weise
· dans les supports puis les mettre dans la centrifugeuse.
· Centrifuger pendant 1 minute à 275 x g
-1
· (ce qui correspond à 1 500 min avec le rotor 6
-1
· places, et à 1 700 min avec le rotor 4 places).
· Sortir les supports contenant les lames porte-objets
·sèches de la centrifugeuse.
· Les préparations peuvent maintenant être observées
· au microscope et/ou recouvertes.
· Essuyer les nacelles
Le rotor 6 places permet de sécher jusqu’à 36 lames
porte-objets simultanément.
Références pour la commande
c) Séchage du sédiment
Le sédiment doit ensuite être séché pour pouvoir utiliser
les très répandus colorants Giesma. Le séchage a lieu
au cours d’une seconde centrifugation. Après avoir retiré
le surnageant, détacher la bague de serrage et la retirer
en même temps que la chambre (cf. schéma, point B4).
Replacer la nacelle avec la plaque de fixation, la lame
porte-objets et le carte-filtre dans la centrifugeuse et
centrifuger pendant 1 minute à 1 100 x g (ce qui
correspond à 3 000 min-1 avec le rotor 6 places, et à 3
400 min-1 avec le rotor 4 places). Le liquide résiduel est
extrait sous l’effet de la force centrifuge et absorbé par la
carte-filtre. Les cellules restent sur la lame porte-objets sous
forme de sédiment. Elles sont parfaitement conservées et
réparties de manière idéale. Le séchage par centrifugation
permet d’éviter les effets entraînés par l’évaporation, tels
que le rétrécissement des leucocytes et la cristallisation.
Centrifugeuse
1206
ROTOFIX 32 A
UNIVERSAL 320 / UNIVERSAL 320 R
Quelques accessoires
5)
1401 / 1406
Réf.
Rotor 4 places
1624
Rotor 6 places
1626
Nacelle de cytologie
1660
Couvercle pour réf. 1660
1661
Plaque de fixation avec bague de serrage
1662
Chambre de cytologie 1 x 1 ml (30 mm²)
1663
Chambre de cytologie 1 x 2 ml (60 mm²)
1664
Cartes-filtres pour réf. 1663 et 1664,
paquet de 200 unités.
1675
Système de maintien Labora pour 6 lames porte-objets
1285
5)
Vous trouverez notre gamme complète d’accessoires pour la cytologie dans notre catalogue de cytologie que vous pouvez obtenir gratuitement sur demande.
Andreas Hettich GmbH & Co. KG
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