Spectrométrie de masse

Transcription

Qui etaient les lauréats du prix Nobel de 2002 en
chimie?
Importance de la spectrométrie de masse dans l’analyse de
biomolécules
"for the development of methods for
identification and structure analyses
of biological macromolecules“
"for their development of soft desorption
ionisation methods for mass
spectrometric analyses of biological
macromolecules“
"for his development of nuclear magnetic
resonance spectroscopy for determining
the three-dimensional structure of
biological macromolecules in solution“
Koichi Tanaka
Kurt Wüthrich
1/4 of the prize
1/2 of the prize
Japan
Switzerland
John B. Fenn
1/4 of the prize
USA
CHM 3102
1
A quoi sert la spectrométrie de masse dans la
vie de tous les jours?
Détection et identification de stéroides anabolisants chez
les athlètes
Haleine des patients anesthésies lors de chirurgie
Composition d’espèces moléculaires dans l’espace
Miel dénaturé avec du sirop de maïs
Localisation d’huile à partir de précurseurs présents dans
les roches
Procédés de fermentation dans l’industrie biotechnologique
Dioxines dans les poissons contaminés
Modification génétique dû à un stress environnemental
Composition élémentaire de matériaux semi-conducteurs
Explosifs dans les aéroports
Études pharmacocinétiques sur les nouveaux composés
pharmaceutiques
CHM 3102
2
Composantes d’un spectromètre de masse
e-
Introduction de
l’échantillon
Ionisation
Analyseur
Détection
Chromato. (GC, HPLC)
Injection directe
Electrophorèse capillaire
Neb. Electro. (ESI)
Des. Laser (MALDI)
Bomb. Atomes rap.
Ion. Chim.
Impact elect.
Quadrupole
Trappe ion.
Temps d’envol
Res. Ion. Cyclo.
Secteurs (B, E)
Mult. Electron
Dynode de conv.
Réseau mult. elect.
(MCP)
Sous vide
CHM 3102
3
Technologie du vide
Gamme de
pression (Pa)
Gamme de
pression (mbar)
Gamme de
pression (mtorr)
Vide
Débit de
gaz
105 -102
1 bar - 1 mbarr
750 torr - 750 mtorr
Vide primaire
Débit
visqueux
102 -10-1
100 -10-3
750-0.75
Vide
intermédiaire
Débit de
Knudsen
10-1 -10-5
10-3 -10-7
0.75 – 7.5 .10-5
Vide élevé
Débit
moléculaire
< 10-5
< 10-7
< 7.5 .10-5
Ultravide
Débit
moléculaire
Vide en deux étapes:
• Pompes rotatives: 4-16 m3/h, assure le vide primaire nécessaire à l’opération de
pompes moléculaires (backing pumps).
• Ultravide obtenue à partir de pompes turbomoléculaires (200-500 L/s), pompes à
diffusion (600-2000L/s), pompes cryogéniques.
CHM 3102
4
Notions de base – mesure de masse
Spectre de masse nebulisation electrostatique
en mode + et – d’un pesticide
220.06
222.06
218.04
220.05
L’espece ionisée correspond à la molécule
avec un proton supplémentaire ou un
proton en moins.
Dans la littérature, la masse moléculaire
peut être exprimée de différente façon:
Masse moyenne: 219.67
Masse nominale: 219
Masse précise: 219.0563
Formule empirique: C11H10N3Cl1
Pourquoi on observe plus d’une espèce ionique (ie m/z 221.06 et 222.06)?
CHM 3102
5
Une molécule est representée par sa distribution atomique
(formule empirique).
Chaque atome a une distribution d’isotope naturel. Par
exemple le carbone et le chlore:
12
6
C : 12.0000u,
13
6
35
17
Cl : 34.9689u,
C : 13.0034u
37
17
Cl : 36.9659u
Chaque isotope a une abondance naturelle qui lui est
propre. Par exemple le carbone
12
6
C : 100 %,
13
6
C : 1.08 %
Les atomes monoisotopiques tels ceux du fluor ou du
sodium 199 F : 18.9984u, 23
sont identifiés
11 Na : 22.9984u
comme A et les atomes multi-isotopiques (carbone,
chlore, hydrogène, etc…) A+1, A+2, etc…
CHM 3102
6
Par définition l’atome A du carbone a une masse de
12.00000u
L’unité de masse u, est définit comme étant 1/12 de la
masse du nuclide 12C et correspond à:
1u: 1.66055 x 10-27 kg
Certains atomes ont une masse légèrement supérieure
(excédent) à la masse nominale alors que d’autres sont
légèrement inférieures (déficit). Par exemple:
1
1
H : 1.0078u,
16
8
O : 15.9949u
Comment se traduit cette subtilité pour les masses
moléculaires élevées?
CHM 3102
7
2.5
Excedent (Da)
y = 0.0002x + 7E-15
Poly-Asp
2
Poly-Leu
y = 0.0007x + 2E-14
1.5
1
0.5
Gamme de masse excedentaire
pour peptides
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
M asse (Da)
Poly-aspatate et poly-leucine représentent les polypeptides ayant respectivement le contenu
de proton le plus faible et le plus elevé parmi les acides aminés. La poly-cystéine (plus faible
contenue de proton/masse) n’a pas été considerée car le frequence de l’acide aminé Cys par
protéine n’est pas elevée.
CHM 3102
8
Notions de base – abondance
Chaque isotope naturel a une abondance relative
caractéristique.
Quel serait la variation du rapport isotopique avec
l’augmentation du nombre d’atome de carbone?
12C
12C
monoisotopique
C60
monoisotopique
C90
12C
monoisotopique
C120
Comment varie la progression du rapport isotopique avec la
masse moléculaire?
CHM 3102
9
Si un élément A possède deux isotopes naturels dont l’un
(A’) est plus abondant que l’autre (A’’). Le rapport de leur
abondance est donné par:
A' ' /(100 - A' ' )
où: A’ est l’abondance naturelle
(%) du constituant mineur
Par exemple si on a un total de 1000 molécules de CH4, il y
aura 11 molécules contenant 13C plutôt que 12C; alors que le
reste (989) aura la composition 12CH4. Leur rapport relatif
d’intensité sera 989/11. De façon plus générale, la
probabilité de n’avoir que des isotopes 12C pour une
molécule possédant Z atomes de carbones est:
⎡100 - A' ' ⎤
P=⎢
⎥
⎣ 100 ⎦
CHM 3102
Z
10
De la même façon, pour les éléments C H N O S, la
probabilité PM que tous les atomes ne contiennent aucun
isotope lourd est donné par:
a
b
c
d
⎡100-13 C ⎤ ⎡100-2 H⎤ ⎡100-17 O-18 O ⎤ ⎡100-15 N⎤ ⎡100-33 S-34 S ⎤
PM = ⎢
⎥
⎥ •⎢
⎥ •⎢
⎥ •⎢
⎥ •⎢
100
100
100
100
100
⎦
⎦ ⎣
⎦ ⎣
⎦ ⎣
⎦ ⎣
⎣
où:
e
13C, 2H, 17O, 18O, 15N, 33S
et 34S sont les
abondances relatives des différents isotopes
lourds des éléments considerés.
a, b, c, d, e représentent le nombre d’atome pour
le carbone, l’hydrogène, l’oxygène, l’azote et le
soufre
CHM 3102
11
De la même façon, la probabilité d’avoir un atome 13C
pour une molécule contenant Z atomes est donné par:
⎡ 13C ⎤ ⎡100-13 C ⎤
•⎢
PM + 1 = z • ⎢
⎥
13 ⎥
100
100C
⎦
⎦ ⎣
⎣
Z
Donc le rapport d’intensité M+1/M correspondant
uniquement à une molécule ne contenant que des
atomes de carbone est:
⎡ 13C ⎤
PM+1
=z•⎢
13 ⎥
PM
100C⎦
⎣
CHM 3102
12
En tenant compte de chacunes des combinaisons d’isotopes
M+1 de chacune des atomes C, H, N, O et S, on obtient le
rapport d’intensité relative suivant:
M +1
= 100 • (a • A + b • B + c • C + d • D + e • E )
M
où: a: # atome de carbone
A:
13C/(100-13C):
0.011
d: # atome d’azote
D:
15N/(100-15N):
3.70 x 10-3
b: # atome d’hydrogène
e: # atome de soufre
B: 2H/(100-2H): 1.15 x 10-4
E:
33S/(100-33S):
7.89 x 10-3
c: # atome d’oxygène
C:
CHM 3102
17O/(100-17O):
3.80 x 10-4
13
Aussi la probabilité d’avoir exactement A atomes 13C (PM+A)
sur un total de z atomes est décrit par la relation:
P
M+ A
Z
A -Z
Z
A
⎡ 13 C ⎤
⎡100−13C ⎤
A!
=
•⎢
⎥ •⎢
⎥
Z!( A − Z )! ⎣100−13C ⎦
⎣ 100 ⎦
⎡ 13 C ⎤
⎡100−13C ⎤
A!
=
•⎢
⎥ •⎢
⎥
A!( A − Z )! ⎣100-13 C ⎦
⎣ 100 ⎦
⎡100−13C ⎤
PM + A
A!
=
•⎢
⎥
PM
A!( A − Z )! ⎣ 100 ⎦
CHM 3102
A
14
Symbole
#atomique
Masse nom.
Comp. isoto.
Masse isoto.
Mass moy.
H
1
1
2
100
0.0115
1.007825
2.014101
1.00795
Na
11
23
100
22.989769
22.989769
P
15
31
100
30.973762
30.973762
C
6
12
13
100
1.08
12.000000
13.003355
12.0108
N
7
14
15
100
0.369
14.003070
15.000109
14.00675
O
8
16
17
18
100
0.038
0.205
15.994915
16.999132
17.999116
15.9994
S
16
32
33
34
36
100
0.8
4.52
0.02
31.972071
32.971459
33.967867
35.967081
32.067
Cl
17
35
37
100
31.96
34.968853
36.965903
35.4528
Br
35
79
81
100
97.28
78.918338
80.916291
79.904
CHM 3102
15
Quelle variation de rapport isotopique peux t’on prévoir pour un
peptide moyen?
% of monoisotopic 12C
Formule empirique pour l’acide aminé “averagine”: (C4.95H7.8N1.47O1.35S0.039)
140
120
100
80
M + 1 /M
y = 0 . 0 5 5 6 x - 9 E -1 4
M + 2 /M
y = 0 .0 0 0 2 x
M + 3 /M
y = 2 E -0 7 x
1.6907
2.451
60
40
20
0
0
500
1000
1500
2000
2500
M a ss (D a )
CHM 3102
16
Des-Arg Bradykinine
904.46
Angiotensine I
1296.69
Renin substrate
1758.93
ACTH clip (18-39)
2465.20
• Variation du rapport isotopique avec la masse
• Variation de l’excédent de masse moyen de 0.0005Da/Da
CHM 3102
17
Notions de base – résolution
∆M
M
R=
∆M
50 %
5%
R: 500
1u
50
CHM 3102
51
10 %
1u
1u
500 501
1000 1001
m/z
18
Comment la distribution isotopique varie avec la résolution du
spectromètre de masse?
CHM 3102
19
Résolution et son impact sur l’identification d’espèce ionique
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+
C19H7N+
C20H9+
C13H19N3O2+
Instrument de
faible résolution
R: 1000
Instrument de
grande résolution
R> 10,000
249
249.0580 249.0700
249.1479
Analyseurs de masse de plus grande résolution (> 10,000) sont les
appareils à secteurs, temps d’envol, résonance cyclotronique ionique
CHM 3102
20
Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Impulsion laser de 4 ns (λ337 nm , N2)
[M+H]+
To MS
± 30 kV
Échantillon + matrice
10000
m/z
15000
Caractéristiques:
Analytes:
Sensibilité:
Précision:
Résolution:
Purete de l’ech.:
Matrice:
CHM 3102
Biomolecules jusqu’à - 500 kDa
10-100 pg (-10-100 fmoles)
Avec TOF ± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.)
Avec TOF 15,000 (<10kDa), <1000 @ >20 kDa
Moindre susceptibilité à la présence de sels (mM)
Absorbe en UV, dépend de l’analyte, peut causer un
bruit de fond < 800 Da
21
Laser
λ
UV/visible regions
Excimer gaz rares:
ArF
KrF
XeCl
XeF
Azote
193
248
307
351
nm
nm
nm
nm
337 nm
Infrarouge
Er:YAG
CO2
fondamentale
2.94 µm
9.6 nm, 10.6 µm
Plus communs
Laser Science Inc. VSL-337ND nitrogen laser. Specifications : 250µJ/impulsion, 3 ns
temps d’impulsion. Duree de vie ~ 2-4 ans.
CHM 3102
22
Matrices pour laser à l’azote
OH
COOH
• 2,5-dihydroxy benzoic acid (DHB)
CN
CH=C
• α-cyano-4-hydroxycinnaminic acid (CHCA)
1, 2, 3, 4, 5
OH
COOH
1, 2
HO
OH
• 3-hydroxypiconilic acid (HPA)
N
4
COOH
COOH
• HABA
N=N
H
• 6-aza-2-thiothymine (non acide)
OH
CH
N
S
1, 4
N
N
H
OH
O
2
3
OH
• Dithranol (non acide)
5
• Trans-indoleacrylic acid
CH=CH COOH
5
N
H
• Sinnapinic acid
CH
3
O
CH=C
H
COOH
2
HO
• 2’,4’,6’-trihydroxyacetophenone
O CH
OH
(non acide)
HO
2, 3
3
O
C CH
3
HO
(1: peptides, 2: protéines, 3: oligosaccharides, 4: acides nucléiques, 5: polymères)
CHM 3102
23
A. Evaporation
Préparation de l’échantillon
• Désaler l’échantillon (Zip tip). Utiliser au besoin des billes échangeuse d’ions pour réduire la
formation d’adduits alcalins.
• Préparer solution ~ 10 µM de l’échantillon dans une solution aqueuse d’acétonitrile.
• Préparer une solution de 0.1 M solution de matrice (DHB ou CHCA) in 1:1 Acétonitrile:eau.
• Mélanger la solution de matrice et l’echantillon 1:1 (v:v).
• Appliquer 0.5 µL de l’echantillon/matrice sur la plaque et sécher.
S.L. Cohen, B.T. Chait, Anal. Chem. 68, 31-37 (1996)
B. Couche mince
• Dissoudre la matrice dans l’acétone avec 1-2% eau et appliquer sur la plaque.
• Rinser la plaque légerement avec l’eau pour enlever les sels.
• Appliquer l’échantillon.
O. Volm, P. Roepstorff, M. Mann, Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994)
C. Sandwich
• Préparer une couche mince comme decrit en B.
• Appliquer analyte/matrice sur la couche mince celle-ci formant de cristaux de germination.
F. Xiang, R.C. Beavis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 199-204 (1994)
CHM 3102
24
Impulsion laser
Un faisceau moléculaire
supersonique occasionne la
sublimation de l’analyte/matrice
Analyte + matrice
± 30 kV
Modèle de desorption avec matrice
La matrice absorbe la radiation dans la gamme d’émission du laser.
L’énergie absorbée occasionne la dissociation de la matrice.
La zone irradiée s’etend sur une zone de 300 µm x 600 µm, 25 Å profondeur, et déplète
environ 4.5 x 10-10 cm3 de solide.
La dissociation rapide de la matrice libère des molécules neutres et des analytes en phase
gazeuse et produit une région de plus haute pression dans le voisinage de la surface
irradiée.
Cette haute pression se traduit par une expansion supersonique amenant avec elle les
analytes desorbés.
CHM 3102
25
Modèle d’ionisation avec matrice

La matrice joue un rôle important dans l’ionisation en plus du processus de
désorption.

La photoionisation de la matrice est suivie par une multitude de réactions
impliquant à la fois des transferts radicalaires et de protons.

Les molécules de matrice ne doivent pas former de radicaux ou espèces protonées
stables afin de favoriser l’ionisation de l’analyte.
H. Ehring, M. Karas, F. Hillenkamp, Org. Mass Spectrom., 27, 472-480 (1992).
Plus acide lors
de l’excitation
CH3 O
CH=C
H
COOH
HO
Réaction photochimique:
H-DHB* + P
(H+P)+ + DHB
H-DHB*
H+ + DHB-
O CH3
Moins acide lors
de l’excitation
CHM 3102
P + H+
(P-H)+
26
Distribution de velocité de l’acide sinnapinique
Distribution d’intensité de l’acide
sinnapinique selon le délai après
l’impulsion laser
Intensite (unite arb.)
Intensite (unite arb.)
Distribution de velocité de l’acide
sinnapinique calculée selon le
déplacement du temps d’envol
800
600
400
200
Velocite (m/sec)
10
20
Delai (µsec)
L’impulsion laser occasionne une large distribution d’énergie cinétique des analytes
Cette distribution est plus étroite suite a un délai après l’impulsion bien que
l’intensité diminue.
CHM 3102
27
Influence du délai sur la résolution
Pulsing scheme PerSeptive
Extraction
region
Acceleration
region
20 kV, pulse
Ue
da
Ue
Source
plate
d0
Ua
Intermediate
grid
Uf
Final
grid
16 kV
Ua 0
18 kV, constant
Uf 0
ground, constant
Delay
Time
Adapte de R. Cotter, Anal. Chem. 445A, 1999
CHM 3102
28
Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
⇑ Champ électrique
↓
↓
↓
↓
↓
Nébulisation des
gouttelettes
↓
↓
Echantillon/
phase mobile
↓
Air
Evaporation du solvant
↓
ESI voltage (5 kV)
↓
Ejection des ions
Caractéristiques:
Analytes:
Sensibilité:
Précision:
Résolution:
Hybride:
CHM 3102
Biomolécules jusqu’à - 500 kDa
1-10 pg (-1-10 fmoles pour 1000 Da)
± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.)
Avec TOF 15,000, >100,000 avec FTMS
Couplage en ligne avec EC, CLHP, infusion
29
Caractéristiques du spectre de masse ESI
8+
9+
1112.1
1251.0
+H
10+
7+
Protéine de 10,000 Da
1429.6
6+
1667.7
1001.0
1500
1000
m/z
Apparition d’ions multiplement chargés ie [M-nH]n- ou [M+nH]n+
Espacement entre deux série d’ion multiplement chargés correspond a
l’ajout ou l’abstraction d’un proton de la molécule.
Comment peux t’on determiner la masse moléculaire?
m / z1 =
CHM 3102
[M + nH]
z
et
m / z2 =
[M + nH + 1]
z +1
et
m / z 2 < m / z1
30
Ions multiplement chargés et charge
M: 1000.5 Da
1001.5
1 m/z
Simplement chargé
0.5 m/z
501.3
Doublement chargé
0.33 m/z
Triplement chargé
334.5
m/z
CHM 3102
31
Aspect mécanistique
Production de gouttelettes chargées à partir de l’analyte
dissout en solution
Evaporation du solvant, diminution de la taille des
gouttelettes, desintégration de celles-ci donnant lieu à des
micro-gouttelettes plus chargées.
Production d’ions en phase gazeuse.
Phénomènes secondaires tels oxidation de l’analyte.
CHM 3102
32
Gouttelettes chargées. La solution à l’extrémité du nébuliseur
électrostatique est soumis à une tension électrique elevée.
Lorsque le capillaire de diametre rc est situé à une distance d de
la contre-électrode (MS), le champ électrique est donné par:
Ec = 2 Vc/rc ln(4d/rc)
Reduction
+
+
-
+
+ +
+
+
+++
+
- +
Taylor cone
e-
Oxydation
High-voltage
power supply
+ ++
+
+
+++
+
+
++
+
+ +
++ +
++
+
+
+
++
+
++
+++
+
+
++
++
++
e-
Anal. Chem. 65, 972A (1993)
CHM 3102
33
L’évaporation du solvant et la collision avec les molécules
environnantes a pression atmospherique occasionne une
réduction de la taille des gouttelettes. Une explosion
Coulombique (fission) survient lorsque la micro-gouttelette
atteint la limite de Rayleigh ou l’ampleur du champ
électrostatique est plus grand que la tension de surface
maintenant l’integrité de la gouttelette.
Q2 = 64 π2 ε0 γ R3
ou Q correspond a la charge, ε0 la constante de permittivité, γ
la tension de surface, R le rayon de la gouttelette. Pour une
solution aqueuse ou R=1.5 µm nous obtiendrons une charge Q
de 10-14 C (ou 50,000 ions simplement chargés).
CHM 3102
34
Ionisation de l’analyte. La diminution de la gouttelette suite aux
fissions successives peut donner lieu a un résidu ionique
désolvaté de ~ 1nm (single ion in droplet theory, SIDT, proposé
par Dole et al., J. Phys. Chem.49, 2240 (1968)). Un autre
mécanisme assume une évaporation ionique successive
(émission) a partir de micro-gouttelettes de plus en plus
chargées (Iribarne and Thomson, J. Phys. Chem., 64, 2287
(1976)). Ces gouttelettes compétitionnent avec les phénomènes
de fission lorsque celles-ci atteignent un diametre de 8 nm
comprenant ~ N=70 charges élsmentaires. Dans ces conditions,
les micro-gouttelettes ne donnent pas lieu à une fission mais
émettent des ions directement. Lorsque N décroit, l’émission peut
être maintenue suite à la diminution du diamètre de la
gouttelette. Ce modèle peut survenir même en présence
d’analytes formant des paires d’ions.
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35
Taille de l’émetteur, débit et efficacité d’émission. Les progrès
récents dans la fabrication d’émetteurs de petits diamètres et la
disponibilité de pompes CLHP à faible débit ont permis d’obtenir
des gains importants de sensibilité (Dale, D.C., Smith, R.D., Rapid
Commun. Mass Spectrom., 7, 1017, (1993), Emmett, M.R.,
Caprioli, R.M., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, 605, (1994),
Andren, P.E., Emmett, M.R., Caprioli, R.M., J. Am. Soc. Mass
Spectrom., 5, 867, (1994) and Wilm, M.S., Mann, M., Int. J. Mass
Spectrom. Ion Proc., 136, 167, (1994)]. Dans ces conditions un
cône de Taylor est obtenu pour des debits de 25-100 nL/min avec
une émetteur de <10 µm. Le rayon d’émission est definit par:
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36
ρ
⎛
⎜
re = ⎜
⎜
⎝
2
4π γ
⎞
⎡⎛
tan
U ⎞
⎛π
a
− α ⎞ ⎢⎜
⎝2
⎠ U ⎟
⎢⎣⎝ t ⎠
2
⎤⎟
− 1⎥ ⎟
⎟
⎥⎦ ⎠
1/ 3
x
⎛ dV ⎞
⎝ dt ⎠
2/3
où γ est la tension de surface du liquide, α l’angle de cone liquide, ρ sa
densité, Ut et Ua le seuil du voltage d’émission et le voltage appliqué, et
dV/dt le débit. Pour un capillaire de dimension donné, le diamètre est
proportionnel au débit (DV/dt)2/3 . Pour une solution aqueuse dont le
débit est de 25 nL/min, re est 88 nm. L’efficacité d’ionisation/
transmission à ce débit est d’environ 8 x 10-4. Cette réduction de la taille
de l’émitteur permet des gains significatifs de sensibilité et ce pour des
diamètre de < 5 µm et des gouttelettes de < 200 nm, ce qui permet
également la réduction du voltage appliqué.
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37
Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS
Diamètre (mm)
Débit (µL/min)
Qté inj. (pmol)
Facteur de conc.
Rel.
4.6
500-1000
102-105
1
2.1
100-400
50-104
5
1.0
40-100
5-103
20
0.32
1-10
0.5-500
200
0.075
0.05-0.5
0.001-1
3700
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38
Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS
CHM 3102
39
CHM 3102
40
CHM 3102
41
Résolution accrue pour l’analyse de
protéines en mode ESI.
MALDI permet par contre une mesure de
masse avec une plus grande sensibilité
pour l’analyse de glycoprotéines, ce qui
n’est pas possible avec ESI car la
protonation de l’analyte ne permet pas
d’obtenir des m/z dans la gamme
accessible du MS.
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42
Analyse de peptides
et protéines par ESI
Smith et al. Anal. Chem., 62,
882 (1990)
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43
Analyse LC-MS de digestat trypsique de lectin (PNA)
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Spectre de masse d’oligonucléotide dT10 en présence
d’imidazole et piperidine (échange H/Na)
GreigM., Griffey. R.H., Rapid Commun. Mass Spectrom., 9, 97 (1995)
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