Etude de la présence de Kystes de Giardia - GIP Seine-Aval

Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée
de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I)
Avril 2002
Etude de la présence de kystes de Giardia duodenalis dans
l'estuaire de la Seine.
Responsable : P. Brasseur
Université de Rouen
Introduction
L'infection par Giardia duodenalis est la première cause de gastro-entérite parasitaire dans le monde (le
nombre de nouveaux cas est estimé à 200 millions par an dans le monde avec 2 millions aux Etats Unis) (Furness
BW, 2000).
D'un point de vue clinique, la giardiose s'exprime surtout chez les enfants chez qui elle peut déterminer
un ou plusieurs des symptômes suivants: diarrhée, flatulence, cassure de la courbe de poids, nausée,
malabsorption, fatigue, anorexie. Bien que considérée générallement comme bénigne, cette pathologie peut être
grave. Ainsi, Berkman et coll. viennent de montrer dans une étude effectuée au Pérou que l'existence
d'antécédents de malnutrition due à des infections répétées par Giardia dans la petite enfance étaient associés
chez des enfants péruviens âgés de 9 ans à une diminution de leurs capacités cognitives. Chez les adultes en
revanche, l'infection est plus souvent asymptomatique mais elle peut être aussi responsable de troubles
fonctionnels digestifs.
Cette parasitose présente également un intérêt en médecine vétérinaire. Ainsi, chez certains animaux, en
particulier les veaux, Giardia détermine une diarrhée de malnutrition grave qui peut mettre en jeu le pronostic
vital.
D'un point de vue épidémiologique, la présence de porteurs asymptomatiques méconnus qui élimine des
kystes durant quelques semaines à quelques mois augmente la dissémination du parasite. En outre, l'importance
relative des différents réservoirs de parasite reste méconnue. Si on a longtemps pensé que Giardia duodenalis
était strictement inféodé à l'homme, il est maintenant bien démontré que ce parasite infecte également d'autres
mammifères, que ce soient des rongeurs (rat, castors) ou des animaux domestiques, bovins en particulier (Slifko,
2000). De plus, plusieurs génotypes de ces parasites ont été caractérisés. Certains sont strictement inféodés à
l'homme, d'autres responsables d'anthropozoonoses, d'autres encore spécifiquement animaux.
En France, très peu d'études concernant l'épidémiologie de cette maladie ont été réalisées. Une étude
récente que nous avons effectué en Haute Normandie retrouve une prévalence de 4% de cette protozoose chez
l'homme (Maillot, 2000). Concernant le réservoir animal, nous effectuons actuellement une étude en
collaboration avec le laboratoire Franck Duncombe de Caen pour déterminer la prévalence de la giardiose bovine
en Basse Normandie. Les résultats préliminaires nous montre des taux de prévalence de la giardiose bovine de
l'ordre de 1%, avec une maladie beaucoup plus fréquente chez les veaux âgés de moins de un mois. Le réservoir
animal semble donc pouvoir jouer un rôle dans l'épidémiologie de la giardiose humaine. En effet, nous avons pu
par ailleurs étudier le génotype de 16 isolats humains provenant de différentes régions françaises et montrer que
la majorité des infections étaient dues à des génotypes pouvant infecter à la fois l'animal et l'homme (Lemée V,
2001)
L'homme se contamine par ingestion de kyste à la suite de contacts interhumains (directs par les mains
sales ou indirects via la manipulation d'objet contaminés) ou par ingestion de nourriture ou d'eau souillée.
Giardia est ainsi l'agent étiologique qui a été le plus souvent associé à des épidémies de gastro-entérite liée à
l'eau de boisson aux Etats Unis entre 1976 et 1994.
Le risque pour l'homme est d'autant plus important que la dose infectieuse pour un individu sain est
relativement faible (1 à 100 kystes)(Rendtorff, 1954). En outre, la dose infectante est probablement plus faible
chez les sujets immunodéprimés, chez qui d'ailleurs la maladie est plus symptomatique (Abboud, 2001). Les
formes parasitaires responsables de la contamination, les kystes de G. duodenalis, sont très résistantes dans un
milieu hydrique ce qui explique que la contamination est liée à l'eau (eau de boisson ou récréative) et à la
consommation de coquillages. Ainsi, Deregnier et coll. ont estimé la viabilité des kystes en rivière entre 56 et 84
jours suivant la saison (Deregnier DP, 1989).
Dans ce contexte, le but de ce travail a été de rechercher les kystes de Giardia présents dans l'estuaire de Seine.
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1. Prélèvements et méthodes d'étude
1.1 Prélèvements
Les prélèvement analysés ont été recueillis lors des campagnes suivantes:
- Prélèvement du bouchon vaseux et étude des vasières (Mission DYVA, mai 2001)
- Profil longitudinal (Campagne SNS, Mai 2001)
- Prélèvement au niveau du gradient de salinité en période de crue (Mission Vastedeba,
29/4/2001)
- Etude du gradient de salinité en période d'étiage (Août 2001)
- Etude du panache de sortie de la station émeraude (Campagne STEP du 30/04/2001)
- Etude d'un cycle semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux (Août 2001)
1.2 Méthode d’étude
Les kystes de parasite ont été recherchés et dénombrés selon la technique
recommandée par l'agence américaine de l'environnement pour la recherche et le dénombrement des
kystes de Giardia dans les prélèvements d'eau (Méthode USEPA 1623, Avril 1999). Les prélèvements
d'eaux ont ainsi été filtrés sur des cartouches Envirochek® (Pall Gelmann Laboratory, Ann Arbor, MI
, USA). Après filtration, les parasites ont été élués selon la technique proposée par le fabricant:
brièvement, les cartouches ont été vidées puis agitées deux fois consécutivement pendant 10 minutes
en présence de 100 ml de tampon d'élution (Tampon Tris/EDTA (0.01M/0.001M) contenant 1g/l de
lauryl-sulfate de sodium). L'eau restant dans la cartouche et les 200 ml de tampon d'élution sont
ensuite mélangés et centrifugés (1500g, 10 min) et le culot obtenu est resuspendu dans 10 ml d'eau
distillée. En ce qui concerne les prélèvements des vasières, ceux ci sont directement dilués dans l'eau
distillée pour obtenir un volume total de 10ml.
Les kystes de Giardia présents dans le prélèvement sont ensuite purifiés en utilisant le système
Dynabeads® (Dynal France SA, Compiègne, France). Le principe de cette purification est d'utiliser
des billes magnétiques recouvertes d'anticorps monoclonaux dirigés contre Giardia. Brièvement, les
billes magnétiques recouvertes d'anticorps sont mélangées dans des tubes en verre avec l'échantillon
en milieu tamponné. Après fixation des billes sur la paroi du tube par utilisation de portoirs aimantés,
les parasites fixées sur les billes sont lavés puis séparés des billes par rupture de la liaison antigèneanticorps en milieu acide (HCl 0,1N). L'ensemble de l'échantillon susceptible de contenir des parasites
est ensuite analysé en microscopie à fluorescence après utilisation d'anticorps monoclonaux
fluorescents (Aqua-glo®, New Orleans, LA, USA).
2. Résultats
2.1 Etude de la vasière intertidale Nord:
Aucun parasite n'a été retrouvé au niveau des prélèvements effectués (Tableau 1).
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2.2 Etude de la contamination des eaux de l'estuaire de la Seine:
Lors de l'étude du profil longitudinal effectué en mai 2001 en période de crue, aucun parasite
n'a été retrouvé (Tableau 2). Les résultats de l'analyse de différents prélèvements d'eau de surface
effectués au niveau du gradient de salinité sont exposés dans les figures 1 et 2. Le tableau 3 résume les
résultats de la recherche de kyste de Giardia à la sortie de la station émeraude et l'évolution en
fonction de la distance avec le rejet. Enfin, l'évolution de la présence de parasite au cours d'un cycle
semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux est résumée dans le tableau 4.
3. Discussion
Aucun parasite n'a été retrouvé au niveau de la vasière intertidale Nord. Il n'existe
malheureusement aucune donnée de la littérature à ce sujet. Toutefois, la durée de vie
relativement limitée du parasite dans l'eau (56 à 84 jours) peut partiellement expliquer ces
résultats. En outre, la difficulté de la recherche du parasite dans un milieu solide ou semi
solide comme de la vase limite à la fois la prise d'échantillon possible et le rendement de la
recherche (Nieminski EC, 1995).
Au cours de la campagne SNS de profil longitudinal (Mai 2001), aucun parasite n'a été
retrouvé. Cette campagne a été effectuée en période de grande crue et le phénomène de
dilution liée à la crue peut en partie expliquer ces résultats.
Concernant l'étude du gradient de salinité, il apparaît que l'on retrouve des parasites
surtout dans les eaux de salinité faible (comprise entre 0 et 5g/l). Là aussi, aucune étude
comparable n'a été rapportée dans la littérature. Il est toutefois intéressant de constater que
lorsque les parasites sont présents, les concentrations sont comparables à celles retrouvées
lors d'études effectuées dans d'autres rivières en Asie (Japon, Taiwan) ou au Canada
(généralement de l'ordre de 0.1 à 1 kyste par litre)(Hashimoto A., 2002; Hsu BM, 2001; Ono
K, 2001; Robertson LJ, 2001).
L'étude du panache de sortie de la station d'épuration émeraude montre la présence de
parasite à ce niveau malgré le faible volume de l'échantillon. Lors de cette étude, le seul
prélèvement retrouvé négatif est celui dans lequel les flores indicatrices sont en très faible
quantité. Il nous paraît donc important de recommencer cette étude sur de plus gros volume
d'échantillons afin de pouvoir quantifier le parasite et d'analyser les résultats avec ceux des
flores indicatrices.
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En conclusion, le but de cette étude était de rechercher la présence de kystes de
Giardia au niveau des vasières, le long du gradient de salinité et au niveau du panache de
sortie d'une station d'épuration. Ces résultats, bien que provenant de l'étude de faibles volumes
d'eaux semble très intéressants et méritent d'être confirmer par des études complémentaires
portants sur des échantillons de plus gros volume qui permettront de mieux préciser les
concentrations en parasites présents dans les environnements considérés.
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Bibliographie
Abboud P, Lemee V, Gargala G, Brasseur P, Ballet JJ, Borsa-Lebas F, Caron F,
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Berkman DS, Lescano AG, Gilman RH, Lopez SL, Black MM. Effects of stunting,
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Hsu BM, Huang C, Hsu CL Analysis for Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in
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Maillot C, Favennec L, Lalaude O, Savoye G, Riachi G, Zalar A, Hochain P, Brasseur
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Tableau 1: Recherche de kystes de Giardia duodenalis à différentes profondeur de
vase.
Profondeur (cm)
Quantité analysée
Giardia duodenalis
-1
10g
absence
-3
10g
absence
-15
10g
absence
-29
10g
absence
Les recherches de kyste de Giardia ont été réalisée selon le protocole décrit dans le
chapitre: " prélèvement et méthodes". Elles ont été faites sur les échantillons obtenus
à partir de la carotte de sédiment (campagne DYVA).
Tableau 2: Recherche de kystes de Giardia duodenalis le long de l'estuaire de la
seine.
Giardia
duodenalis
202
absence
247
absence
Point Kilométrique
260
337
absence
absence
356
absence
357
absence
Les recherches de kyste de Giardia ont été réalisée à partir de différents
échantillons d'eau prélevés ( Campagne SNS) et selon le protocole décrit dans le
chapitre: " prélèvement et méthodes". Les points kilométriques sont mesurés le long
de l'estuaire de la Seine en prenant pour point 0 le Pont marie à Paris. Les points
kilométriques 202, 247, 260, 337, 356 et 357 sont respectivement Poses amont, La
Bouille, Le Croisset, Tancarville, Honfleur basse mer et Honfleur haute mer.
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Gradient de
Avril 2002
0
5.5
14.5
22.2
30.2
+*
+**
-
-
-
salinité (g/l)
Giardia
duodenalis
Figure 1: Recherche de kystes de Giardia le long du gradient salinité (mai 2001)
Les recherches de kystes de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau
de surface le long du gradient de salinité (mission Vastedeba) et selon le protocole décrit
dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 250 ml).
* 4 kystes par litre. ** 8 kystes par litre.
Gradient de
0.35
5
15
20.2
32.8
-
+
+
-
-
(0.2/l)
(0.2/l)
salinité (g/l)
Giardia
duodenalis
Figure 2: Recherche de kystes de Giardia le long du gradient salinité (août 2001)
Les recherches de kystes de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau
de surface le long du gradient de salinité (mission août 2001) et selon le protocole décrit
dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 5 l).
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Tableau 3: Recherche de Giardia duodenalis à la sortie de la station d'épuration
émeraude et évolution en fonction de la distance avec le rejet.
0
Matières en 21
suspension
(mg/l)
Giardia
+*
duodenalis
1.5
20
-
Point kilométrique à partir de la STEP
3.5
6.5
9.5
35
32
30
+**
+
13.5
23
+
+
Les recherches de kystes de Giardia ont été effectuées dans les eaux de la Seine après le
rejet de la station d'épuration émeraude selon le protocole décrit dans le chapitre: "
prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 250 ml).
* 4 kystes par litre. ** 8 kystes par litre.
Tableau 4: Recherche des kystes de Giardia au cours d'un cycle semi diurne de marée
au niveau du bouchon vaseux.
Minutes après la basse mer
-100
0
100
200
300
400
surface
+**
+**
-
fond
+*
+*
+*
-
Les recherches de kystes de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau
d'un cycle semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux (mission Thalia, août 2001)
et selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -:
absence dans 5 l).
* 0.2 kystes par litre. ** 0.4 kystes par litre.
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