TD biologie moléculaire et génie génétique

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Université des Sciences et de la Technologie d’Oran
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Génétique Moléculaire Appliquée
3ème année BCG / LMD
Module de Biologie Moléculaire et Génie Génétique
Année Universitaire 2015-2016
TD N° 1
Exercice 01 :
Soit le brin d’ADN monocaténaire :
5’-TACGCCTAGCTTACGCAT-3’
- Combien y a-t-il de liaisons phosphodiester dans le brin bicaténaire ?
- Combien y a-t-il de liaisons hydrogène dans le brin bicaténaire ?
Exercice 02 :
Quel serait l’effet sur la réplication de l’ADN de mutations abolissant les activités
enzymatiques suivantes de l’ADN polymérase I ?
a. l’activité exonucléasique de 3’ vers 5’
b. l’activité exonucléasique de 5’ vers 3’
c. l’activité polymérase de 5’ vers 3’
Exercice 03 :
Un élément transposable génère des répétitions directes de 4pb de part et d’autre de son point
d’insertion.
- Donnez la séquence qui sera trouvée de part et d’autre de l’élément s’il s’insère à la position
indiquée dans la séquence suivante :
Elément transposable
5’-ATTCGAACTGACCGATCA-3’
Exercice 04 :
Le brin matrice d’un ADN bactérien contient la séquence de bases suivante :
5’-AGGTTTAACGTGCAT-3’
1- Quels sont les acides aminés codés par cette séquence en utilisant la grille du code
génétique?
Suite à une mutation qui touche le 4ème nucléotide dans l’ADN matrice et qui n’aura aucun
effet sur la protéine produite.
2- Indiquez le type de mutation dans l’ADN ?
TD N°2
Exercice 01:
Sachant qu’une enzyme de restriction est utilisée en excès de 5 fois pour digérer un génome
eucaryote. Combien d'unités de cette enzyme seront-elles nécessaires pour digérer 25
échantillons de ce génome tout en sachant que 1 unité enzymatique peut digérer 1µg d’ADN
dans des conditions adéquates (temps et température) ?
(Chaque échantillon comprenant de l'ordre de 10 μg d’ADN)
Exercice 02 :
Quelle est la fréquence statistique des sites de restriction suivant :
1) AGCT pour l’enzyme AluI
2) GAATTC pour l’enzyme EcoRI
3) GCGGCCGC pour l’enzyme NotI
Dans un gène de 40 000 paires de bases, combien de sites pour chacune des trois enzymes
mentionnés ci-dessus doit-on s’attendre à trouver ?
Exercice 03:
Le fragment d’ADN double brin d’une cellule de souris a été isolé sur gradient de CsCl puis
sa concentration en C est déterminée à 30%
1. Déterminez les proportions des bases T, A et G
2. Pourrait-on prévoir les résultats de la même manière si l’ADN était plutôt monobrin
3. Déterminer la taille moyenne des fragments qui peuvent être générés par HaeIII à
partir de cet ADN double brin
4. Quelle serait la taille des fragments générés si le pourcentage de chacune des bases
d’ADN était identique ?
5. Indiquez le type de fragments générés par HaeIII.
Site de restriction HaeIII : CC/GG
TD N°3
Exercice 01 :
Un fragment d’ADN linéaire est coupé d’une part par Hind III, d’autre part par Sma I, puis
conjointement par les deux enzymes. Les fragments obtenus sont les suivants :
Hind III :
2.5 kb et 5.0 kb
Sma I :
2.0 kb et 5.5 kb
Hind III + Sma I :
2.5 kb, 2.0 kb et 3.0 kb
a) dessinez la carte de restriction.
b) le mélange des fragments produits par la combinaison des deux enzymes est ensuite digéré
par l’enzyme EcoRI, ce qui fait disparaître le fragment de 3Kb et fait apparaître une bande
colorée correspondant à un fragment de 1.5 kb. Indiquez le site de clivage d’EcoRI sur la carte
de restriction.
Exercice 02 :
Un gène de 10 Kilobases (Kb) a subi une mutation au niveau d’un seul nucléotide :
remplacement d’une cytosine par une guanine. On cherche à identifier la mutation en
soumettant le gène normal et le gène muté à l’action d’une série d’endonucléases de
restriction (étudiées indépendamment). Après électrophorèse en gel d’agarose, on obtient les
résultats suivants exprimés en Kb.
Enzymes utilisées
Spécificité
Gène normal
Gène muté
EcoR I
GAATTC
7.4 + 2.6
7.4 + 2.6
Bgl II
AGATCT
10
10
Pst I
CTGCAG
6+4
10
Sae I
GAGCTC
10
6+4
a) quelles sont vos conclusions en ce qui concerne l’effet de chaque enzyme sur chaque
gène ?
b) à la lumière de ces conclusions, reconstituez une séquence de 9 nucléotides en
précisant le siège de la mutation.
TD N°4
Exercice 01 :
On dispose d’un fragment d’ADN de 40Kb et on connaît les emplacements de deux sites de
restriction X et Y.
X
*
32Kb
8Kb
Y
*
18Kb
Y
7Kb
15Kb
1) Placer sur un schéma représentant une plaque d’électrophorèse les fragments produits respectivement
par :
-
L’enzyme X seule
-
L’enzyme Y seule
-
Les deux enzymes (X + Y).
L’extrémité 5’ d’un des deux brins du fragment d’ADN a été marquée (*)
2) Comparer les fractions issues de l’action enzymatique X et X + Y. En bilan de cette analyse, donner la
liste des fragments produits par l’action de X qui ne sont pas recoupés par Y et ceux qui sont produits
par X et sont recoupés par Y.
3) En comparant cette fois les fractions issues de l’action enzymatique Y et X + Y, donner la liste des
fragments produits par Y qui ne sont pas recoupés par X et ceux qui sont produits par Y et sont
recoupés par X.
Exercice 02 :
Soit un ADN F, hydrolysé séparément par chacune des 2 enzymes A et B. Les produits obtenus
sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose, la taille des fragments de restriction est
déterminée grâce à un marqueur de taille M.x
Chaque fragment obtenu lors de la 1ère digestion incomplète, est isolé et hydrolysé :
- Avec A pour les fragments résultants de la digestion de F par B,
- Avec B pour les fragments résultants de la digestion de F par A,
- Parallèlement, on réalise une digestion double de l’ADN entre F par les 2 enzymes A et B
- Proposer une carte de restriction du fragment F de taille 5000 pb.
TD N°5
Exercice 01 :
Le tableau suivant donne la liste d’un certain nombre de sites de restriction distincts. Lesquels
d’entres eux donneront naissance, après digestion, à un site d’association entre extrémités
cohésives semblables à celui de BamHI ?
Quelle sera la conséquence de ce type de constatation lors du processus d’insertion ?
Sites de reconnaissance de plusieurs enzymes de restriction :
BamHI
G/GATCC
Bgl II
A/GATCT
EcoRI
G/AATTC
HindIII
A/AGCTT
XmaI
C/CCGGG
Exercice 02 :
MspI et HpaII sont deux endonucléases qui clivent le même motif palindromique CC/GG. Il est
par ailleurs démontré que la méthylation des cytosines qui précèdent les guanines protège les
sites CC/GG de l’attaque de HpaII et non celle de MspI.
1/ Comment appelle-t-on les enzymes HpaII et MspI ?
L’étude de deux fragments d’ADN (A) et (B) isolés à partir de deux tissus différents d’un
même individu, est réalisée à l’aide de ces deux enzymes.
L’électrophorégramme ci-après est obtenu après coloration au BET des sous fragments de
digestion des deux ADN, préalablement séparés par électrophorèse.
ADN (A)
ADN (A)
+ Hpa II
ADN (B)
+ Hpa II
ADN (A)
+ Msp I
ADN (B)
+ Msp I
ADN (B)
Marqueur de
taille
10Kb
-
5
4
3
2
1
+
2/ Que peut-on dire des ADN A et B ? Justifiez votre réponse.
3/ Quelle signification physiologique peut revêtir le constat fait à la question 2 ?
En vue de cartographier les fragments d’ADN A et B, ils sont marqués avec le (y32p) ATP, puis digérés par
les enzymes de restriction.
L’autoradiogramme obtenu est présenté ci-dessous :
ADN (A)
ADN (A)
+ Hpa II
ADN (B)
+ Hpa II
ADN (A)
+ Msp I
ADN (B)
+ Msp I
ADN (B)
Marqueur de
taille
10Kb
5
4
3
2
1
+
4/ Donnez la cartographie des ADN (A) et (B).
TD N°6
Exercice 01 :
Proposez par un schéma une stratégie d’insertion d’un ADNc double brin au site PstI situé
sur le gène de la résistance à l’ampicilline de pBR322 en utilisant les polydG-polydC la
méthode des séquences homopolymériques complémentaires.
1/ Pourquoi est-il intéressant d’utiliser les homoplymères dG-dC ?
2/ Comment opère-t-on pour libérer ultérieurement la séquence insérée de PBR322 ?
3/ En quoi l’insertion au site PstI est-elle particulièrement utile ?
(Site PstI : CTGCA/G)
Exercice 02 :
Proposez par un schéma une stratégie d’insertion d’un ADNc double brin au site HindIII
d’un plasmide quelconque par la méthode des adaptateurs.
HindIII : A/AGCTT
Exercice 03
Un fragment de restriction d’ADN de lapin coupé par l’enzyme Kpn mesure 5100pb et
contient le gène de la β-globine. Par hybridation après transfert avec une sonde β-globine on
démontre qu’après digestion par EcoRI de ce fragment, deux sous fragments (de 2500 et de
800pb) s’hybrident avec cette sonde, alors qu’à la suite de sa digestion par BamHI, deux
autres sous fragments radioactifs (de 1900 et de 3000pb) sont produits. Sachant qu’au
niveau de l’ADN complémentaire du messager de la β-globine les deux premiers sites
BamHI et EcoRI sont distants de 76 pb.
-
Montrer que la comparaison des cartes de restriction des deux clones permet d’établir
l’existence d’un intron dans la séquence de ce gène et de mesurer sa longueur.
TD N°7
Exercice 01 :
Un plasmide pBR322 résistant à la kanamycine et à l’ampicilline est coupé avec l’enzyme
PstI, enzyme coupant dans le gène de résistance à l’ampicilline. L’ADN plasmidique est
ligaturé avec les produits de digestion de l’ADN de Drosophile par PstI, puis utilisé pour
transformer E. coli.
a) quel est le phénotype de la souche d’E.coli utilisé dans cette expérience ?
b) quel antibiotique, mettrez-vous dans le milieu pour vous assurer que les colonies ont un
plasmide ?
c) quels phénotypes de résistance aux antibiotiques trouvera-t-on sur la boite ?
d) quels phénotypes auront les colonies contenant de l’ADN de Drosophile ? Comment
appelle-t-on ces colonies et comment les sélectionner ?
Si des colonies individuelles de la boite en (c) sont cultivées et si leur ADN est extrait, quel
profil observez-vous après coupure par PstI et coloration du gel d’électrophorèse au BET ?
Exercice 02 :
Afin de cloner un segment d’ADN linéaire double brin dans le plasmide pUC18, on traite de
l’ADN à cloner avec les deux enzymes de restriction EcoRI et HindIII. Les plasmides
recombinants sont incubés en présence d’une souche E.coli AMPS LacZ-. Les bactéries sont
ensuite cultivées sur une gélose contenant de l’ampicilline et de l’IPTG et du X-gal, substrat
incolore devenant bleu après hydrolyse par la -galactosidase.
Les résultats de ces expériences sont consignés dans le tableau suivant :
Enzyme utilisée
EcoRI
HindIII
Type de colonie
A : bleue
B : blanche
C : blanche
A : bleue
B : blanche
C : blanche
D : blanche
Taille de l’ADN
plasmidique en Kpb
2,69
3,05
3,28
2,69
2,92
2,81
3,29
1. Quel est le rôle de l’ampicilline au cours de ces expériences ?
2. A quoi correspond une colonie bleue ? Une colonie blanche ?
3. Déterminer la taille de l’ADN inséré dans ce plasmide.
4. Etablir la carte de restriction de l’ADN inséré.
Exercice 03 :
On dispose de l’ADNc (ADN complémentaire) de l’insuline humaine, du plasmide pBR322,
de bactéries hôtes sensibles à l’ampicilline (AMP) et à la tétracycline (TET) ainsi que deux
enzymes de restriction : PstI et BamHI.
A la fin de cette expérience, nous obtenons trois types de clones bactériens dont les
caractéristiques sont regroupées dans le tableau suivant :
Clone
I
II
III
Milieu de culture Milieu de culture
+ TET
+ AMP
+
+
-
+
-
Milieu de culture
Sans antibiotique
+
+
+
+ : croissance bactérienne
- : absence de croissance
bactérienne
1/ Donner les principales étapes de cette expérience ?
2/ Interpréter les résultats regroupés dans ce tableau en précisant le clone positif ?
3/ Quels sont les avantages de la synthèse de l’insuline par génie génétique ?
TD N°8
Exercice :
Un plasmide de 4000pb a été digéré par EcoRI (E), BamHI (B) et HindIII (H). Les produits de
la digestion ont ensuite été séparés par électrophorèse en gel d’agarose et la taille (en pb) des
différents fragments obtenus a été estimée comme suit : E : 4000, B : 2500 et 1500, H : 2600
et 1400, EB : 1900, 1500 et 600, EH : 1500, 1400 et 1100, BH : 2100, 1000, 500 et 400.
Etablissez la carte de restriction de ce plasmide.
Ce plasmide porte les gènes de résistance à la tétracycline (TET R) et à l’ampicilline (AMPR).
On désire maintenant cloner le fragment d’ADN X. Dans ce but, l’ADN X est coupé par
EcoRI. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer des bactéries compétentes
d’Eschérichia coli et les produits de transformation sont dilués et étalés sur différents milieux
sélectifs contenant de l’ampicilline (AMP), de la tétracycline (TET) et/ou de la kanamycine
(KAN).
Deux clones sont sélectionnés. Les résultats sont portés dans le tableau suivant :
Milieu
Clone 1
Clone 2
Sans antibiotique
100
100
+ AMP
100
80
+ TET
100
100
+ KAN
0
20
+ TET + AMP
100
80
+ AMP + KAN
0
0
+ TET + KAN
0
20
+ AMP + TET + KAN
0
0
-
Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ces résultats ?

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