adamou-n`diaye bat - Revue de Médecine Vétérinaire

ARTICLE ORIGINAL
Cryopréservation de la semence de taureau
de race Borgou au Bénin
° M. ADAMOU-N’DIAYE, °° A.B. GBANGBOCHE*, ° A. ADJOVI et °°° R. JONDET
° Centre d’Insémination Artificielle et de Contrôle Sanitaire des Reproducteurs (CIA-CSR), Département des Productions Animales (PA),
Faculté des Sciences Agronomiques (FSA), Université d’Abomey-Calavi (UAC), 01 B.P. 526 Cotonou, Bénin
° ° Institut Vétérinaire Tropical, Université de Liège, Boulevard de Colonster 20, Bât 43, B - 4000 Liège, Belgique
Centre d’Insémination Artificielle et de Contrôle Sanitaire des Reproducteurs (CIA-CSR), Département des Productions Animales (PA),
Faculté des Sciences Agronomiques (FSA), Université d’Abomey-Calavi (UAC), 01 B.P. 526 Cotonou, Bénin
°°° Président d’Honneur du Centre d’Elevage et d’Insémination Artificielle de Rennes et de Plounevezel, France
Correspondance : Gbangboche Armand Bienvenu, Centre d’Insémination Artificielle et de Contrôle Sanitaire des Reproducteurs (CIA-CSR),
Département des Productions Animales (PA), Faculté des Sciences Agronomiques (FSA), Université d’Abomey, Calavi (UAC), 01 B. P. 526 Cotonou, Bénin
Tel/fax : 00229 30 30 84. E-mail : [email protected]
RÉSUMÉ
SUMMARY
Deux éjaculats récoltés par taureau sur dix sept taureaux Borgou à l’aide
de vagin artificiel en présence d’une femelle «boute en train» ont été dilués
avec le dilueur à base de citrate-fructose jaune d’œuf et de glycérol. Les
semences mises en paillettes ont été constituées en lots et refroidies au bainmarie (+ 32° C) pendant différents temps : 30, 60 et 120 minutes respectivement pour les lots 1,2 et 3. Elles ont ensuite été soumises à des traitements
identiques : congélation à -196° C, décongélation par immersion dans de
l’eau à + 38° C pendant 7 minutes, incubation à + 38° C pendant 30 minutes,
1 heure, 2 heures, 3 heures, 4 heures ou 5 heures.
La durée de refroidissement de 60 minutes a permis d’obtenir le pourcentage de spermatozoïdes vivants le plus élevé après décongélation et
après incubation (respectivement p < 0,05 et p < 0,01). Les effets de la
décongélation et de l’incubation ont été marqués sur le pourcentage de spermatozoïdes vivants (p < 0,05). A l’issue de la période d’incubation (+ 38°
C) de 30 minutes à 3 heures, toutes les semences présentent moins de 60 %
de spermatozoïdes vivants, et à partir de 4 heures d’incubation tous les spermatozoïdes sont morts.
Il ressort de cette étude que la méthode de traitement de la semence maîtrisée chez les taureaux de race Européenne, ne peut être appliquée à la
semence de race Borgou.
Cryopreservation of Borgou bull semen in Benin. Par M. ADAMOUN’DIAYE, A.B. GBANGBOCHE, A. ADJOVI and R. JONDET.
MOTS-CLÉS : congélation - éjaculat - spermatozoïdes semence - Borgou - taureau.
KEY-WORDS : thawing - freezing - ejaculate - spermatozoa - semen - Borgou - bull.
Introduction
L’un des premiers temps de la préparation de la semence
consiste à abaisser graduellement la température de + 32° C à
+ 5° C pendant une durée variable de 30 à 120 minutes [27].
Lorsque le sperme est dilué à + 32° C et refroidi jusqu’à + 5°
C, la vitalité des spermatozoïdes se maintient plus longtemps
[42]. Un maintien de la semence à + 5° C en présence de glycérol est nécessaire avant d’amorcer la descente vers les températures de congélation (- 79° C ou -196° C) [21, 34].
L’ensemble des opérations d’un programme d’insémination artificielle est comparable à une chaîne dont chaque
maillon constitue un stade technologique important. Qu’un
seul de ces maillons soit défectueux et le résultat final, c’està-dire la fécondation se trouve compromise. Cette chaîne est
chronologiquement découpée comme suit : récolte de sperme ;
dilution de sperme ; refroidissement jusqu’à + 5° C du
sperme dilué ; conditionnement en des doses individuelles ;
congélation et conservation à - 196° C ; décongélation et
insémination artificielle [27].
Revue Méd. Vét., 2003, 154, 1, 3-8
Semen ejaculates were collected from seventeen Borgou bulls via sexual
stimulation by immobilized females and collection into an artificial vagina.
The ejaculates (two per bull) were subsequently diluted with citrate-fructose, egg yolk and glycerol. Semen packaged in straws were divided into three
groups of cooling times : group 1, 30 minutes ; group 2, 60 minutes and
group 3, 120 minutes. They were submitted to a typical processing consisting of freezing at -196° C, thawing by immersion in a + 38° C water bath
for 7 minutes and incubation at + 38° C for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3
hours, 4 hours and 5 hours.
Cooling of semen for 60 minutes resulted in the highest percentage of
live spermatozoa after both thawing and incubation (p < 0.05 and p < 0.01,
respectively). Thawing and incubation effects have been observed on the
percentage of live spermatozoa (p < 0.05). At the end of the incubation period (at + 38° C from 30 minutes to 3 hours), all semen presented less than
60 % live spermatozoa, and at 4 hours of incubation all the spermatozoa
died.
In conclusion, this study suggests that, the method of semen treatment
commonly used for European bulls is not suitable for the semen from Borgu
bulls.
Les modalités de congélation et de décongélation de la
semence revêtent une importance capitale, le but à atteindre
est de réanimer le nombre le plus élevé possible de spermatozoïdes devant conserver leur intégrité afin de préserver leur
4
pouvoir fécondant [27]. Plusieurs méthodes on été préconisées ; la décongélation dans un bain d’eau à +4° C ou entre
+10° C et +18° C, ou à +35° C dans l’air ambiant, dans la
main ou dans la poche de l’inséminateur, dans le pistolet
d’insémination (c’est-à-dire une partie dans l’air ambiant,
une partie dans les voies génitales femelles ou décongélation
«in vivo»).
L’épreuve de la thermorésistance ou l’incubation des
paillettes dans un bain d’eau à +38° C fournit les indications
sur la vitalité des spermatozoïdes [5, 15]. Les méthodes couramment utilisées sont : la méthode lente et classique (incubation à + 38° C pendant 5 heures) et la méthode rapide
(incubation à + 46° C pendant 30 minutes). La méthode lente
se rapproche davantage des conditions auxquelles sont soumis les spermatozoïdes après insémination [27] ; la température de + 38° C est celle du corps de la vache et le transport
des spermatozoïdes depuis le lieu de dépôt jusqu’au lieu de la
fécondation (les trompes utérines) est de l’ordre de 5 heures
[44].
La République du Bénin possède 1,2 millions de bovins en
1994 et la race Borgou représente à elle seule 34 % des
bovins [32]. Cette race provient d’un croisement stabilisé
entre le taurin à courtes cornes d’Afrique Occidentale
(Somba ou lagunaire) et le Zébu White Fulani. Elle constitue
une race rustique dotée d’une assez bonne résistance à la trypanosomose qui sévit à l’état endémique au Bénin. Son aire
de répartition s’étend du Bénin, au Togo, au Burkina - Faso,
au Nigéria où elle est connue sous le nom de Keteku [20]. La
race Borgou est exploitée pour le lait, la viande et le travail
(culture attelée). Plus de la moitié de la viande consommée
au Bénin est fournie par la race Borgou [32].
Sur les races bovines Européennes, de nombreuses études
ont été réalisées tout au long du siècle écoulé pour améliorer
les techniques de cryoconservation de la semence dans le but
de maintenir le pouvoir fécondant des spermatozoïdes,
d’augmenter la quantité de doses de semences préparées à
partir d’un même éjaculat. Les travaux effectués dans ce
domaine sont éminemment rares en Afrique et se rapportent
le plus souvent aux caractéristiques descriptives du sperme
[2, 4, 10, 22, 24, 26, 28, 43].
Dans le cadre de l’étude de la semence de race Borgou, la
durée de refroidissement à + 5° C avant congélation est testée
dans le but d’améliorer la technique de cryopréservation. La
période d’incubation à +38° C après décongélation (de 30
minutes à 5 heures, c’est-à-dire bien au-delà de ce qui est préconisé avant une insémination), permet d’estimer si la durée
de vie des spermatozoïdes après décongélation est susceptible de permettre la fécondation.
Matériel et méthodes
ADAMOU-N’DIAYE (M.) ET COLLABORATEURS
Sciences Agronomiques de l’Université d’Abomey Calavi
ont été utilisés. Les animaux sont âgés de 48 ± 7 mois
(moyenne ± écart type) et pèsent 235 ± 18 kg (moyenne ±
écart type). 6 % et 94 % des animaux ont respectivement
entre [30-45 mois] et [45-60 mois]. 82 % et 18 % des animaux pèsent respectivement entre [200-250 kg] et [250-270
kg]. Les animaux sont alimentés avec les fourrages locaux
essentiellement à base de graminées qu’ils broutent dans les
pâturages naturels. Ils n’ont reçu aucune complémentation
alimentaire, autre que les minéraux apportés par les pierres à
lécher (phosphate bi-calcique, chlorure de sodium et de
potassium, carbonate de zinc, sulfate de cuivre, soufre). En
dehors du temps passé au pâturage, 3 h le matin et 2 h 30
l’après midi, ils sont maintenus aux piquets dans un parc collectif pourvu d’un espace couvert. Les taureaux de l’étude
ont été entraînés préalablement à la récolte de sperme et régulièrement collectés.
B) MÉTHODES
Les animaux ont été récoltés le même jour (le matin entre 7
et 10 h) avant le pâturage, pendant que la température
ambiante était comprise entre 24-30° C. Deux récoltes espacées de 4 jours ont été effectuées par animal, en présence de
femelle «boute en train» à l’aide d’un vagin artificiel. Le
temps de préparation a duré environ 10 min et comprend une
ou deux fausses montes pour la mise en condition physique.
Chaque éjaculat a été aussitôt examiné, pour enregistrer le
volume, la couleur et la consistance. Une goutte de sperme a
été examinée au microscope (grossissement 40 à 100) sur
platine chauffante à +37/38° C, pour apprécier la motilité
notée subjectivement de 0 à 5. La concentration a été déterminée à l’aide d’un hématimètre, par comptage des spermatozoïdes dans une goutte de sperme dilué au 1/100 avec une
solution de chlorure de sodium à 3 p.100. Le pourcentage de
spermatozoïdes vivants a été évalué sous microscope après
coloration à l’éosine-nigrosine.
C) DILUTION ET REFROIDISSEMENT DE SPERME
Après les premiers examens (couleur, volume, concentration…), les éjaculats ont été immédiatement placés dans un
bain-marie (+32° C) pour être rapidement dilués. Les éjaculats conservés (ADAMOU - N’DIAYE et al., [4]) présentent
les caractéristiques suivantes: volume supérieur à 3ml ;
concentration supérieure à 0,6 x 109 spermatozoïdes/ml. Le
taux de dilution a été calculé de sorte que chaque paillette de
0,25 ml renferme avant congélation, au moins 20 millions de
spermatozoïdes mobiles. La dilution des éjaculats a été faite
en deux phases successives avec une quantité égale de deux
types de dilueurs I et II de composition suivante (Jondet,
[27]) :
A) ANIMAUX
Dilueur (I) : Citrate de sodium (2H20) 14,7 g; jaune d’úuf
250 ml ; pénicilline 1 MU ; streptomycine, 2g ; eau bidistillée 750 ml.
Dix-sept taureaux reproducteurs de race Borgou en service
au Centre d’Elevage et d’Insémination Artificielle et de
Contrôle Sanitaire des Reproducteurs de la Faculté des
Dilueur (II) : Citrate de sodium (H20) 25,3 g ; jaune d’úuf
250 ml ; pénicilline 1 MU ; streptomycine, 2g ; eau bidistillée 750 ml ; fructose, 20 g ; glycérol 140ml.
Revue Méd. Vét., 2003, 154, 1, 3-8
CRYOPRÉSERVATION DE LA SEMENCE DE TAUREAU DE RACE BORGOU AU BÉNIN
D) PREMIÈRE PHASE : ADJONCTION DU DILUEUR I
ET REFROIDISSEMENT DE LA SEMENCE
Les éjaculats ont été dilués avec le dilueur I maintenu à la
température de +32° C. Les semences ont été réparties en
trois lots selon le temps de refroidissement de +32° C à
+5° C : 30, 60 et 120 minutes respectivement pour les lots 1,
2 et 3.
E) DEUXIÈME PHASE : ADDITION DES DILUEURS I ET
II, ÉQUILIBRATION ET MISE EN PAILLETTES DE LA
SEMENCE.
Après un temps de 30, 60 ou de 120 minutes de refroidissement, la deuxième moitié du volume de dilueur I a été ajoutée à la semence (maintenu à +5° C). Deux heures après, le
dilueur II a été additionné en cinq fois à intervalle de 10 min
au volume de la semence (maintenu à +5° C). La semence a
été ensuite mise en paillettes de 0,25 ml et conservées à
+5° C pendant 3 heures (période d’équilibration).
F) CONGÉLATION, DÉCONGÉLATION ET INCUBATION.
Trois portoirs de capacité de 250 paillettes de 0,25 ml, sont
placés au centre d’une corbeille métallique à fond multiperforé de 33 cm de diamètre. La corbeille introduite dans le
conteneur d’azote liquide repose sur le socle. Le couvercle
est ensuite posé sur le conteneur. Le fond de la corbeille est
en contact avec l’azote liquide sur une profondeur d’environ
1 cm. Un thermocouple enregistreur a permis d’avoir les températures de l’azote liquide de -89,4° C, -116° C et -163° C
[0-30]
respectivement à la 10e min, 15e et 35e min. Au retrait du
canister au bout de la 35e min, 34 paillettes (17 taureaux, 2
éjaculats, 1 paillette par éjaculat) de chaque lot ont été
immergées dans de l’eau à +35° C pendant 7 min pour être
décongelées ; ensuite 204 paillettes (correspondant à 17 taureaux, 2 éjaculats par taureau, 6 paillettes par éjaculat) ont été
réparties en 6 groupes de 34 pour être incubées à +38° C respectivement pendant 30 minutes, 1 heure, 2 heures, 3 heures,
4 heures et 5 heures.
L’examen des semences sur microscope à platine chauffante a permis de déterminer le pourcentage de spermatozoïdes avant congélation, après décongélation et incubation.
L’effet du refroidissement, de la congélation et de l’incubation sur le pourcentage de spermatozoïdes vivants a été testé
par l’analyse de variance (logiciel Statistica 5.1, Edition
98, StatSoft France - 31, cours des Juilliottes - 94700
Maisons-Alfort). Les résultats sont exprimés sous forme de
moyenne ± écart type.
Résultats
A) SEMENCES CONGELÉES ET APRÈS DÉCONGÉLATION
Le pourcentage de spermatozoïdes vivants immédiatement
après décongélation a diminué fortement, ce qui montre l’effet de la congélation sur la teneur en spermatozoïdes vivants
des semences (64 % ± 7 %, rang 35-75 % de spermatozoïdes
vivants avant congélation vs 39 % ± 17 % après décongélation, rang 0-65 %, p < 0,05 Figure 1). Le pourcentage de
semences contenant plus de 60% de spermatozoïdes vivants
[30-60]
FIGURE 1. — Répartition des 34 paillettes de semences (1 paillette/éjaculat, 2 éjaculats et
17 taureaux) en fonction de spermatozoïdes vivants avant congélation (histogramme
noir) ou avant décongélation (histogramme gris).
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ADAMOU-N’DIAYE (M.) ET COLLABORATEURS
d’incubation de 30 minutes, 1, 2 et 3. heures, p < 0,01 Figure
3). Aucun spermatozoïde n’a survécu pour des durées d’incubation de 4 heures à 5 heures.
Le pourcentage de spermatozoïdes vivants après congélation, décongélation et incubation à + 38° C, est plus élevé
pour le temps de refroidissement de 60 minutes par rapport à
celui observé pour les temps de refroidissement de 30
minutes et 120 minutes : 16% ± 14 % de spermatozoïdes
vivants vs 12 % ± 15 % et 10 % ± 10 % pour des temps de
refroidissement de la semence, respectivement de 60, 30 et
120 minutes, p < 0,05 et p < 0,01 (Figure 2).
Discussion
Classiquement, les facteurs de variation de la viabilité des
spermatozoïdes sont multiples, notamment les caractéristiques individuelles de chaque animal, la concentration des
semences, le dilueur, le temps de refroidissement, le mode de
congélation, de décongélation et d’incubation de la semence.
FIGURE 2. — Pourcentage de spermatozoïdes vivants après incubation de 3
heures à +38° C en fonction de la durée de refroidissement de la semence
dans 204 paillettes correspondant à 17 taureaux (2 éjaculats par taureau et
6 paillettes/éjaculat).
avant congélation est passé de 72 % à 12 % après congélation-décongélation.
Le pourcentage de spermatozoïdes vivants avant congélation n’a pas été différent pour les trois temps de refroidissement avant congélation (63 % ± 8 %, 64 % ± 8 %,
65 % ± 32 %, respectivement pour une durée de refroidissement de 30, 60, et 120 minutes, p > 0,05 Figure 2). Après
décongélation, le refroidissement le plus lent (120 minutes)
correspond au pourcentage de spermatozoïdes vivants le
moins élevé (32 % ± 14% de spermatozoïdes vivants après
120 minutes de refroidissement vs 44% ± 15% après 60
minutes et 41 % ± 19 % après 30 minutes de refroidissement,
p < 0,05 Figure 2)
B) SEMENCES INCUBÉES
La concentration en spermatozoïdes vivants des semences
varie en sens inverse par rapport à la durée de l’incubation à
+38 C après décongélation (Figure 3). Plus la durée de l’incubation est élevée et plus le nombre de semence ne contenant pas spermatozoïdes vivants augmente: 2 %, 10 %, 35 %
et 65 % respectivement pour les incubations de 30 minutes,
1 heure, 2 heures et 3 heures (Figure 3). L’effet de la durée
d’incubation sur la viabilité des spermatozoïdes est significatif (27 % ± 14 % de spermatozoïdes vivants, rang 0-50 %,
16 % ± 10 %, rang 0-45 %, 6 % ± 6 %, rang 0-30 %,
2 % ± 3 %, rang 0-15 %, respectivement pour une durée
La diminution importante de 25 % de la vitalité des spermatozoïdes après congélation-décongélation témoigne de la
fragilité certaine des spermatozoïdes de la race bovine
Borgou [3], observée également chez les zébus au Brésil
[17]. Cette perte de vitalité est supérieure à celle que rapporte
JONDET [27] chez la race Normande : 1 % après décongélation à +35° C pendant quelques secondes.
L’intérêt des températures de décongélation élevées est
controversé. En effet, la quasi-totalité des spermatozoïdes
meurt à partir de 4 heures d’incubation à la température de
+38° C en race Borgou, alors que JONDET [27] a récupéré
22 % à 57 % de spermatozoïdes vivants en race normande
après 5 heures d’incubation à +38° C et 6 % de spermatozoïdes vivants après une incubation rapide de 30 minutes à
+46° C [19]. Les températures élevées de décongélation des
paillettes (+75° C, +95° C, +115° C et +135° C) pendant un
laps de temps ont montré que l’effet bénéfique maximal a été
obtenu dès que l’on atteint +75° C [2, 7, 8, 10, 18, 37, 38 ,
40]. Le pourcentage de spermatozoïdes vivants après décongélation à +35° C ne diffère guère de celui de +75° C [10,
27].
Au nombre des facteurs d’influences susceptibles de modifier la résistance des spermatozoïdes à la congélation,
d’autres auteurs ont montré l’effet de l’acrosome [31, 40], du
système hypothalamo-hypophysaire [6, 33, 41], de l’épididyme [11, 29] et de la teneur en cholestérol des éjaculats sur
la qualité de la semence [45]. Le type de dilueur peut influencer également la capacité des spermatozoïdes à résister au
choc de température [12, 29]. L’effet de la durée de l’incubation sur la viabilité des spermatozoïdes est d’autant plus marqué que la dilution de la semence est élevée [27]. Le contact
des spermatozoïdes avec le liquide séminal, produit des effets
divers qui selon l’espèce en cause, se révèlent favorable, nuls
ou défavorables sur la qualité de la semence : ENNEN et al.,
[23], LENZ et al., [41] chez le taureau ; DARIN-BENNET et
al., [16] QUINN et al., [36] chez le bélier ; ROMENY et al.,
[39] ; PURSEL et al., [35] ; GRAHAM et PAGE [25] chez le
verrat; CORTEEL [13, 14] chez le caprin.
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CRYOPRÉSERVATION DE LA SEMENCE DE TAUREAU DE RACE BORGOU AU BÉNIN
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FIGURE 3. — Influence de la durée d’incubation de la semence à +38°C sur le pourcentage de spermatozoïdes vivants dans 612 paillettes correspondant à 17 taureaux (6 paillettes/par taureau et 3 paillettes
par éjaculat).
Certains laboratoires d’Europe éliminent tout lot de
semence congelée qui à l’issue de cinq heures d’incubation,
contient moins de 20 % de spermatozoïdes vivants. La race
normande a présenté un taux de survie proche de 60 %, après
cinq heures d’incubation [27], alors que plus de la moitié des
semences de la race Borgou dans la présente étude ne
contient que des spermatozoïdes morts après 4 heures d’incubation. Il est évident que les spermatozoïdes sont de moindre
résistance en milieu tropical [17] et ne peuvent être soumis à
cette épreuve, au risque de tuer tous les spermatozoïdes. Ces
différences procèderaient de plusieurs origines : (1) en
France, les taureaux font l’objet d’une sélection poussée (testage sur descendance), (2) la spermatogenèse et la qualité du
sperme sont dépendantes de la température ; la température
dans l’Ouest de la France excède rarement 25° C en été alors
que les conditions climatiques sont beaucoup plus difficiles
en milieu tropical [24, 26, 43].
Conclusion
L’amélioration de la technologie de la semence des taureaux de race Borgou constitue un enjeux technique, génétique et économique majeur au Bénin. Le traitement de la
semence maîtrisée pour les taureaux de race européenne ne
peut être appliqué à la semence de race Borgou, si l’on doit
tenir compte du temps de remontée des spermatozoïdes jusRevue Méd. Vét., 2003, 154, 1, 3-8
qu’au lieu de fécondation, et d’un éventuel décalage entre le
moment de l’ovulation et de l’insémination.
Il est évident qu’un spermatozoïde vivant, même s’il présente une bonne motilité progressive n’est pas obligatoirement un spermatozoïde fécondant. Les résultats de la fertilité
à l’insémination artificielle permettraient de connaître définitivement la qualité des semences ainsi préparées et sélectionnées.
Remerciements
Nous présentons nos vifs remerciements aux spécialistes anonymes qui
ont relu ce travail. Nos remerciements s’adressent également à tout le personnel du Centre d’Elevage et d’Insémination Artificielle de la Faculté des
Sciences Agronomiques de l’Université d’Abomey Calavi et à Mlle SOGBOHOSSOU Etotépé pour la contribution importante apportée à ce travail.
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