Processes for the Production of PEGylated Proteins David E. Pfister

Diss. ETH No. 22800
Processes for the Production of
PEGylated Proteins
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES OF ETH ZURICH
(Dr. Sc. ETH ZURICH)
presented by
David E. Pfister
Dipl. Ing. ENSIC Nancy, France
born on 05.03.1988
citizen of France
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Massimo Morbidelli (ETH Zurich), examiner
Prof. Dr. Andrew deMello (ETH Zurich), co-examiner
Dr. Eric Bourgeaux (Sanofi), co-examiner
2015
Abstract
Thanks to major breakthroughs in genetic engineering, proteinbased drugs progressively became the workhorse of the pharmaceutical
industry. Despite their indisputable specificity and selectivity, the
production and injection of therapeutic proteins is challenging due to
unfavorable protein properties such as low solubility, instability, and
rapid clearance by the organism. To overcome these limitations, the
covalent binding of poly(ethylene glycol) to the protein surface emerges
as a solution of growing interest. This technique, known as
`PEGylation', has already successfully led to several commercially
available PEGylated drugs.
The present work aims at better understanding the two main steps
which are involved in the production of PEGylated proteins, i.e. the
PEGylation reaction per se and the purification of the PEGylated
product by ion-exchange chromatography. The knowledge is then used
to investigate process integration and intensification, i.e. the
combination of reaction and separation steps to take advantage of their
strong synergy and thus develop better processes delivering improved
productivity at high conversion.
To begin with, a kinetic model describing the conjugation of the
functionalized PEG to the reactive sites on the protein surface is
derived. The proposed model offers a detailed description of the
mechanisms involved in the protein PEGylation reaction by accounting
for the diffusion of the reactants, the heterogeneity in the sites
reactivity and the shielding effect caused by the conjugated polymer.
Moreover, it provides an accurate tool to optimize the reaction
conditions with a view to obtaining the best yield at the highest
possible protein conversion.
Secondly, the separation of the products according to their extent
of PEGylation, by ion-exchange chromatography, is investigated.
Chromatographic model parameters are rigorously estimated from
linear gradient elution experiments and the chromatographic behavior
of a mixture of PEGamers is investigated by means of a mechanistic
model. The PEGamers are shown to be complex mixtures of multiple
iii
positional isomers whose separation, even subtle, leads to the
broadening of the apparent `single' peak chromatogram. In order to
account for the presence of these distributed solutes composing the
PEGamers, a continuum approach approximating the multiple
isoforms by a continuous function is proposed. A continuous model for
multicomponent linear chromatography is derived and then applied to
the modeling of the elution of a mixture of mono-PEGylated positional
isomers on a strong cation-exchange resin.
Based on solid knowledge, integrated processes, associating reaction
and separation are investigated. A cyclic process, including the
PEGylation reactor, the separation of the PEGamers by ion-exchange
chromatography, the diafiltration of the fraction containing the
unreacted protein and its recycling is implemented. With such
integrated processes, a high yield for the mono-PEGylated protein
together with high conversion of the protein can be reached. With a
view to pushing the integration even further, a batch on-column
PEGylation process is considered so as to PEGylate the protein once
adsorbed on the ion-exchange resin. In this case, the yield for lower
degrees of PEGylation is increased due to the shielding of the reactive
sites facing the surface of the resin. Moreover, such integrated oncolumn reactive chromatography process reduces the investment cost
since reaction and separation are obtained with a single unit. This
reactive chromatography process is investigated both batch-wise and
using a continuous multi-column chromatographic unit. For the
continuous implementation of the previously developed on-column
process a multicolumn countercurrent solvent gradient purification
(MCSGP) process is used. Thanks to the internal recycling of the nonresolved fractions and of the unreacted protein, the yield for the monoPEGylated protein can be improved together with the conversion of
the protein.
iv
Résumé
Les récentes avancées dans le domaine du génie génétique ont
permis aux protéines thérapeutiques de s’imposer comme le nouveau
cheval de bataille de l’industrie pharmaceutique. Cependant, leur
indéniable supériorité en terme de spécificité et de sélectivité est
contrebalancé par des propriétés physico-chimiques défavorables
comme une solubilité limité, leur instabilité et une élimination
rapide une fois injecté dans l’organisme. Afin de surpasser ces
problèmes, la conjugaison avec du polyéthylène glycol apparaît
comme une solution des plus intéressantes. Cette technique,
dénommée `PEGylation' a déjà fait ses preuves à en juger par le
nombre de médicaments PEGylés aujourd’hui sur le marché.
Cette thèse vise à obtenir une meilleure compréhension des deux
principales étapes impliquées dans la production de protéines
PEGylées : la réaction chimique à proprement parler et la
purification par chromatographie d’échange d’ions. En utilisant les
connaissances acquises, une attention toute particulière est portée à
l’intégration et à l’intensification de procédés combinant
avantageusement ces deux étapes pour développer de meilleures
procédés de PEGylation offrant une meilleure productivité à plus
haute conversion.
Dans un premier temps, un modèle cinétique décrivant
l’attachement du PEG avec un site réactionnel à la surface de la
protéine est développé. Ce modèle cinétique inclus une description
détaillée des différents mécanismes impliqués dans la réaction de
PEGylation en prenant en compte la diffusion des réactifs, les
hétérogénéités de réactivité parmi les différents sites et l’effet écran
causé par le polymère déjà conjugué. De plus, ce modèle fournit un
outil précis pour optimiser les conditions réactionnelles et obtenir le
meilleur rendement à la conversion la plus haute possible.
Dans un second temps, la séparation des produits de la réaction
de PEGylation par chromatographie d’échange d’ions est étudiée.
Les paramètres du modèle chromatographique sont rigoureusement
déterminés à l’aide d’expériences effectuées en conditions diluées en
appliquant un gradient de sel. Le comportement chromatographique
du mélange de protéines PEGylées est ensuite modélisé à l’aide d’un
v
modèle mécanistique. Par ailleurs, il est observé que les protéines
ayant un même degré de PEGylation sont en réalité composées d’un
mélange d’isomères de position dont la séparation, même subtile, se
propage dans la largeur du chromatogramme. Afin de prendre en
compte la distribution des solutés, une approche continue est
proposée. Pour ce faire, les différentes protéines avec un même degré
de PEGylation sont décrites à l’aide d’une distribution continue
d’isomères de position. Ce modèle continu est appliqué à la
description de l’élution de la lysozyme mono-PEGylée sur une résine
cationique forte.
Grâce à ces nouvelles connaissances, des procédés intégrés
couplant la réaction chimique avec l’étape de séparation sont
étudiés. Un procédé cyclique incluant réaction, séparation par
chromatographie d’échange d’ions et diafiltration avant recyclage a
été mis en place. Ainsi, un haut rendement pour la protéine monoPEGylée et une haute conversion de la protéine peuvent être
obtenus simultanément. Afin de pousser l’intégration encore plus
loin, un procédé de réaction ‘sur colonne’ a été mis en place. La
protéine n’est conjuguée au PEG qu’après avoir été adsorbée sur la
résine d’échange d’ions. Le rendement envers les faibles degrés de
PEGylation s’en trouve amélioré car plusieurs sites réactifs faisant
face à la surface de la résine se retrouvent inaccessibles. De plus, de
tels procédés de chromatographie réactive permettent de réduire les
coûts d’investissement en réalisant la réaction ainsi que la
séparation des produits dans une seule unité. Ce procédé a été mis
en place à la fois de manière discontinue et continue dans une unité
de chromatographie multi colonnes. C’est ainsi que le procédé de
PEGylation ‘sur colonne’ développé précédemment a été adapté à
un procédé de chromatographie multicolonnes à contre-courant
(MCSGP). Grâce au recyclage des fractions non résolues ainsi qu’à
celui de la protéine non réagit le rendement pour la protéine monoPEGylée est amélioré tout comme la conversion de la protéine.
vi