ProC® Ac R

OPBC G03 C0542 (526)
ProC® Ac R
Screening test for APC resistance
Russell Viper Venom-based screening test for the determination of resistance to Activated
Protein C that may be caused by the FV (Leiden) gene defect.
Stability of the sample
at +2 to +8 °C 4 hours (fresh plasma)
at -30 °C
6 months (if platelets are removed by double centrifugation prior to freezing).
Intended Use
Procedure
The Dade Behring ProC® Ac R Test is a functional clotting test intended for screening of resistance
to Activated Protein C (APC) in plasma from individuals with the Factor V (Leiden) defect. It can also
be performed on plasma from patients on stabilized oral anticoagulant or heparin therapy.
Manual:
Test with activator:
1. Pre-warm a sufficient amount of PR3V Reagent, allowing 0.1 mL per test, to +37 ± 1 °C in a
reagent reservoir.
2. Dispense 0.1 mL test plasma into a test tube.
3. Add 0.1 mL Activator to the test plasma and incubate for exactly 5 minutes at +37 ± 1 °C.
4. Add 0.1 mL of the PR3V Reagent prewarmed to +37 ± 1 °C, start the stop watch immediately
and determine the clotting time.
5. Repeat the measurement for double determination and report the average of both determinations as the result.
Summary and Explanation
Activated Protein C Resistance (APC Resistance) is associated with a point mutation in the Factor
V gene [e.g. Factor V (Leiden)]. The mutation results in the replacement of the amino acid Arginine
506 (R) with glutamine (Q) in the Factor V protein 1. This mutation slows the inactivation of factor Va
by APC, causing a hypercoagulable state. The presence of Factor V (Leiden) is the most common
cause of inherited thrombophilia, accounting for 20 - 50% of all cases.2
Principle of the Method
The Dade Behring ProC® Ac R Test is based on the activation of endogenous Protein C by incubation of plasma with Agkistrodon contortrix contortrix (Southern Copperhead) venom. A dilute
"Russell’s Viper Venom Time" (DRVVT, snake venom activator for Factor X) is then performed on
the plasma. The DRVVT is sensitive to changes in concentration of Activated Protein C. In normal
individuals, activation of their Protein C prolongs the result two- to three-fold, compared to plasma
without activator. In individuals with Factor V (Leiden), the venom activation of Protein C induces
only marginal prolongation of the result (usually less than 1.5 times the plasma without activator). To
minimize the effect of other clotting variables, a ratio of clotting times obtained with and without
venom activation should be determined.
Activated Protein C resistance may also be caused by other mutations in the factor V gene [e.g. FV
(Cambridge) and FV (Hong Kong)].
Reagents
Materials provided
ProC® Ac R Test
Test Kit, Code No. OPBC with
5 x for 4.0 mL
PR3V Reagent
5 x for 2.0 mL
Activator Reagent
Sufficient to perform 100 manual clotting assays (100 tests with activator and 100 tests without
activator).
Note: The number of tests obtained with specific coagulation analyzers may vary.
Composition:
Activator Reagent: Lyophylisate, contains Agkistrodon contortrix contortrix venom (< 0.1 g/L) in
stabilizing-buffer solution.
Preservative:
sodium azide (< 0.01%)
PR3V Reagent: Lyophilisate, contains diluted phospholipid rich Vipera Russeli venom (< 1 mg/L),
plant derived phospholipids (< 10 g/L), calcium (0.1 M) and a heparin inhibitor (< 0.5 g/L).
Preservative:
sodium azide (< 0.01%)
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use only.
2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution: Do not ingest or allow to
contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explosive azides if it comes into
contact with heavy metals such as copper or lead.
Preparation of the Reagents
• Reconstitute Activator in 2.0 mL distilled or deionized water without preservatives, as indicated
on the vial’s label. The reconstituted product should be a clear, pale green solution with no
apparent particles.
• Reconstitute PR3V Reagent in 4.0 mL distilled or deionized water without preservatives, as
indicated on the vial’s label. The reconstituted product should be a translucent, pale solution with
no apparent particles.
• Gently invert to mix. Do not shake!
• Incubate for 10 minutes at room temperature (+15 to + 25 °C) before use.
• Mix reagents again carefully before use.
Storage and Stability
Freeze dried reagents must be stored at +2 to +8 °C and are stable up to the date indicated on the
label.
Stability after reconstitution (closed vial)
Temperature:
ProC® Ac R
ProC® Ac R
Activator
PR3V Reagent
at +2 to +8 °C
2 weeks
2 weeks
at +20 to +25 °C
12 days
12 days
at +37 °C
6 hours
6 hours
at -20 °C
2 weeks
2 weeks
Indication of expiration: If there is no evidence of a vacuum when the reagent vial is opened and/
or the reagent does not appear dry, it should be returned to Dade Behring. If reconstituted products
show clear signs of particles or contamination or if they do not dissolve completely within 15 minutes of the addition of distilled or deionized water, please contact Dade Behring or your distributor.
Do not freeze and then thaw again more than once after reconstitution!
Materials required but not provided in the kit
Sodium citrate (0.11 M or 3.2%) for blood collection
Control Plasma N, Code No. ORKE
ProC® Control Plasma, Code No. OQKE
Distilled or deionized water without preservatives
Plastic test tubes
Pipettes for the exact measuring of 100 µL, 2.0 mL and 4.0 mL
Water bath, maintained at +37 °C
Timer or stop watch
Physiological saline solution (0.15 M sodium chloride) for use with the BCS® coagulation analyzer
Dade® CA System Buffer for use with Sysmex® CA Systems, Code No. B4265 or
Dade® Owren’s Veronal Buffer, Code No. B4234
Coagulation analyzer (see ”Limitations of the Test Procedure”)
Equipment
The Dade Behring ProC® Ac R Test may be perform manually or with a multitude of coagulation
analyzers. Observe the operating instructions of the instrument’s manufacturer!
Specimen collection and preparation
Important: Treat all plasmas as potentially infectious!
To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution (0.11 M) with 9 parts freshly collected venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately for 10 minutes at 1,500 x g
and pipette off the supernatant plasma. When separating the plasma, take care that no platelets are
pipetted off as well. If the sample is to be frozen, centrifuge the separated plasma again and freeze
immediately.
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
1
Test without activator:
1. Pre-warm a sufficient amount of PR3V Reagent, allowing 0.1 mL per test, to +37 ± 1 °C in a
reagent reservoir.
2. Dispense 0.1 mL test plasma into a test tube.
3. Add 0.1 mL saline solution to the test plasma and incubate for exactly 5 minutes at +37 ± 1 °C.
4. Add 0.1 mL of the PR3V Reagent prewarmed to +37 ± 1 °C, start the stop watch immediately
and determine the clotting time.
5. Repeat the measurement for double determination and report the average of both determinations as the result.
Automatic:
Test protocols for Dade Behring coagulation analyzers may be obtained from Dade Behring on
request.
Dade Behring has checked the use of these reagents in different analyzers for optimal product
performance and adherence to product specifications.
Dade Behring does not support modifications since these may influence the performance of the
system and the test results. It is the responsibility of the user to validate modifications of these
instructions or the use of these reagents in other analyzers besides those named by Dade Behring
in the application directions or these instructions.
Internal Quality Control
Normal range:
Control Plasma N
Pathological range: ProC® Control Plasma
Two controls (one in the normal range and one that is FV Leiden positive) should be measured. A
normal control plasma may be established using a pool of freshly collected normal plasmas, all
tested and found to be negative for the Factor V Leiden mutation. The plasmas should be pooled on
the day of collection and frozen in small aliquots for later use. A positive control may be prepared
from aliquots of a known Factor V Leiden positive individual.
Plasma should be frozen at -70 °C for use.
The controls should be prepared and handled in the same manner as the samples.
Acceptable limits should be set for each control plasma by performing precision studies in accordance with NCCLS guidelines. These guidelines recommend that controls be assayed at the beginning of a measurement series, at least once in an 8-hour shift, and with each change in reagents.
Each laboratory should determine its own quality control range for both controls, either by means of
the target values and ranges provided by the manufacturer of the controls or by means of control
values determined in the laboratory, with each lot of the ProC® Ac R Test. This normally amounts to
± 2.5 standard deviations from the mean control value.
If the measured control values are outside of the predetermined control range, do not report patient
results until the problem has been identified, corrected and documented. Determine which part of
the instrument/reagent/control system did not function properly and correct it. After corrective measures are implemented and documented according to good laboratory practice (GMP), retest the
controls. If they are now within the confidence range, patient samples can be tested and the results
reported.
Results
Results should be expressed as a ratio:
Clotting time PR3V with activator
–––––––––––––––––––––––––––––––––––
Clotting time PR3V with saline solution
or Dade® CA System Buffer
The Dade Behring ProC® Ac R Test results on pooled normal plasma with Activator present should be
2 to 3 times longer than results on pooled normal plasma without Activator (see expected values).
Dade Behring ProC® Ac R ratio =
Limitations of the Procedure
There are appropriate coagulation analyzers for which Dade Behring provides operating instructions.
The utilization of the Dade Behring ProC® Ac R Test in other coagulation analyzers must be validated by the testing laboratory. In doing so, performance data other than that provided may be obtained. Tests with the Dade Behring ProC® Ac R Reagent were carried out with samples from patients
on stabilized oral anticoagulant therapy, patients on heparin and low-molecular heparin therapy,
and patients with lupus anticoagulant.
Samples from such patients may exhibit significantly longer clotting times than samples from normal individuals. However, since the clotting times with saline solution or Dade® CA System Buffer
are also prolonged, the quotient derived from the clotting time with/without activator remains reliable and the diagnostic significance is maintained.
Therapeutic doses of hirudin or other direct thrombin inhibitors lead to prolonged clotting times.
Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history,
clinical presentation and other findings.
Interferences
Icteric, lipemic and hemolytic samples and samples with a low hematocrit should not be used with
this test, since they may lead to incorrect results (see NCCLS H21-A3 for further clarification3). Low
activities of Factors VII, VIII, IX and XII do not interfere with the Dade Behring ProC® Ac R Test.
Activities of Factors II and V of over 10% and of Factor X of over 20% also have no effect on the test.
At the beginning of treatment with oral anticoagulants, i.e. before stabilization, the Dade Behring
ProC® Ac R Test may provide ratios that are too low. The same applies for Protein C concentrations
under 50%.
Expected Values
Values (ratios) for healthy individuals vary from laboratory to laboratory, depending on the procedure used. Therefore, each laboratory should determine its own reference ranges on the basis of the
methods and coagulation analyzers used.
In general, ratios smaller than or equal to 1.5 indicate the Factor V (Leiden) variant. A study with the
Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 and CA-1500 systems yielded a decision limit of 1.8 for
these assay applications.
Ratios between 1.5 and 2.1 may indicate low concentrations of Protein C and should be further
investigated. These investigations could include specific tests for Protein C and DNA tests.
Samples with positive or equivocal results should be confirmed by genetic analysis.
Specific Performance Characteristics
Reagenzien
Diagnostic Sensitivity and Diagnostic Specificity
The Dade Behring ProC® Ac R Test was validated on a Stago STA• instrument against the DNA
analysis method and a cut-off of 1.57 was established by ROC analysis.
A clinical evaluation study was then performed at three independent test centers to evaluate the
ability of the Dade Behring ProC® Ac R Test to detect the Factor V (Q506) mutation. The Dade
Behring ProC® Ac R Test was compared with the Coatest•• APC•• Resistance V Test and DNA
analysis, using a total of 164 samples (82 normal and 82 Factor V Leiden positive) from patients
ranging in age from 2 to 87 years. The population included patients with the following clinical conditions: untreated (49), DVT/PE or other prothrombotic conditions (58), oral anticoagulants (36), heparin/LMW heparin (21), lupus anticoagulant (12) or familial studies (39). 163 of 164 patients were
correctly identified using a cut-off of 1.57 at all sites, giving a sensitivity of 100% (confidence limits:
95.6 to 100%) and a specificity of 98.8% (confidence limits 93.4 to 99.8%) relative to the DNA
method. Validation was performed on a Stago STA•, an Organon Teknika MDA••• 180 and using
the manual tilt tube technique.
An additional clinical evaluation of the ProC® Ac R Test with the Dade Behring BCS®, Sysmex®
CA-7000 and CA-1500 systems defined the decision limit by ROC analysis as 1.8. The diagnostic
sensitivity and diagnostic specificity for these assay applications were evaluated. A minimum of 198
fresh and/or frozen samples from unselected volunteer healthy blood donors confirmed negative for
Factor V Leiden by PCR, and from patients with different disease states confirmed positive for
Factor V Leiden by PCR were tested. Please refer to Table 1 for the results.
Inhalt der Handelspackung
ProC® Ac R Test
Testkit, Bestell-Nr. OPBC mit
5 x für 4,0 ml
PR3V Reagenz
5 x für 2,0 ml
Aktivator Reagenz
Ausreichend um 100 manuelle Gerinnungstests durchzuführen (100 Tests mit Aktivator und 100
Tests ohne Aktivator).
Hinweis: Die Anzahl an Tests, die mit einem spezifischen Gerinnungsmessgerät erhalten wird,
kann variieren.
Results of the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity study for ProC® Ac R
Table 1:
CA-1500
CA-7000
BCS®
N
198
214
231
Cutoff
1.8
1.8
1.8
Specificity [%]
97.2
98.0
98.1
Sensitivity [%]
98.9
99.1
99.2
®
®
NPV [%]
99
99
99
PPV [%]
96.8
98.2
98.4
®
The ProC Ac R Test applications with the Dade Behring BCS , Sysmex CA-7000 and CA-1500
systems were compared to Coatest•• APC•• Resistance V on ACL 9000. A total of 139 fresh and/
or frozen samples from unselected volunteer healthy blood donors confirmed negative for Factor V
Leiden by PCR, and from patients with different disease states confirmed positive for Factor V
Leiden by PCR were tested. 138 out of the 139 samples were correctly identified by the ProC® Ac R
Test with Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 systems and Coatest•• APC•• Resistance V on
ACL 9000. 137 out of 139 were correctly identified by the ProC® Ac R Assay with the Sysmex® CA1500 system.
Note: Sensitivity and specificity of the Dade Behring ProC® Ac R Test for non-FV Leiden APC
resistance screening has not been established. Due to differences in sample populations, collection
techniques and instrument technology, each testing laboratory should determine its own cut-off.
Precision
The within run precision maximum (intraassay coefficient of variation) was 1.9% The total precision
maximum was 8.9% using two sites, instruments and operators with three plasmas, tested in double determination for 20 days.
Bibliography
1. Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with
resistance to activated protein C. Nature 1994; 369:64-7.
2. Dahlback B. Physiological anticoagulation. Resistance to activated protein C and venous thromboembolism. J Clin Invest 1994; 94:923-927.
3. NCCLS: Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and
General Performance of Coagulation Assays, Approved Guideline H21-A3. Wayne, PA 1998.
Guarantee
This product is guaranteed to perform as described in the labeling and the product literature. Dade
Behring disclaims any implied warranty of merchantability or fitness for any other purpose,
and in no event shall Dade Behring be liable for any consequential damages arising out of
the aforesaid express warranty.
Dade is a registered trademark of Dade Behring Inc. in the USA, in Germany and other countries.
ProC and BCS are registered trademarks of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany
and other countries.
Sysmex is a registered trademark of SYSMEX CORPORATION in the USA, in Germany and other
countries.
• STA is a trademark of Diagnostica Stago
•• Coatest and APC are trademarks of Chromogenix AB
•••MDA is a trademark of Organon Teknika B.V.
Edition February 2005
®
ProC Ac R
Test zum Screening auf APC Resistenz
Auf Russell Viper Schlangengift basierender Screening-Test zur Bestimmung der Resistenz
gegenüber aktiviertem Protein C, die durch den FV (Leiden) Gendefekt hervorgerufen wird.
Anwendungsbereich
®
Der Dade Behring ProC Ac R Test ist ein funktionaler Gerinnungstest, der für das Screening auf
Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C (APC) in Plasma von Personen mit dem Faktor V (Leiden) Defekt geeignet ist. Der Test kann auch mit Plasma von Patienten unter stabiler oraler Antikoagulationstherapie oder unter Heparin-Therapie durchgeführt werden.
Diagnostische Bedeutung
Die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C (APC Resistenz) wird durch eine Punktmutation im
Faktor V Gen [z.B. Faktor V (Leiden)] hervorgerufen. Die Mutation führt zu einem Austausch der
Aminosäure Arginin 506 (R) gegen Glutamin (Q) im Faktor V Protein1. Diese Mutation verzögert die
Inaktivierung des Faktors Va durch APC und führt dadurch zu einer erhöhten Gerinnungsneigung.
Das Vorliegen des Faktor V (Leiden) ist in 20-50% aller Fälle die hauptsächliche Ursache für eine
hereditäre Thrombophilie2.
Prinzip der Methode
Der Dade Behring ProC® Ac R Test beruht auf der Aktivierung von endogenem Protein C durch
Inkubation von Plasma mit dem Schlangengift von Agkistrodon contortrix contortrix (Südlicher Kupferkopf). Anschließend wird mit der Plasmaprobe eine verdünnte „Russell’s Viper Venom Time“
(DRVVT, Schlangengiftaktivator für Faktor X) Bestimmung durchgeführt. Die DRVVT reagiert empfindlich auf Konzentrationsänderungen des aktivierten Protein C. Im Falle von normalen Individuen
wird durch die Aktivierung von Protein C das Ergebnis des Tests mit Aktivator gegenüber dem mit
Puffer zwei- bis dreifach verlängert. Bei Personen mit Faktor V (Leiden) verursacht die Schlangengiftaktivierung von Protein C nur eine geringfügige Verlängerung gegenüber dem Ergebnis für den Test
mit Puffer (gewöhnlich kleiner als 1,5-fach). Um den Effekt anderer Gerinnungsparameter zu minimieren, sollte das Verhältnis der Gerinnungszeit mit Schlangengiftaktivator zu der ohne Schlangengiftaktivator bestimmt werden.
Die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C kann auch durch andere Mutationen im Faktor V
Gen hervorgerufen werden [z.B. durch FV (Cambridge) und FV (Hong Kong)].
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
2
Zusammensetzung
Aktivator Reagenz: Lyophilisat, enthält Schlangengift von Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/
l) in stabilisierender Pufferlösung.
Konservierungsmittel:
Natriumazid (< 0,01%)
PR3V Reagenz: Lyophilisat, enthält verdünntes phospholipidreiches Schlangengift der Vipera Russeli (< 1 mg/l), pflanzliche Phospholipide (< 10 g/l), Calcium (0,1 M) und einen Heparinneutralisator
(< 0,5 g/l).
Konservierungsmittel:
Natriumazid (< 0,01%)
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in-vitro diagnostischen Anwendung.
2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen in-vitro-Diagnostika ist zu beachten: Verschlucken und
Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden! Natriumazid kann mit Schwermetallen wie
Kupfer oder Blei explosive Azide bilden.
Vorbereitung der Reagenzien
• Rekonstituieren Sie den Aktivator in 2,0 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser ohne Konservierungsstoffe, wie auf dem Fläschchenetikett angegeben. Das aufgelöste Produkt sollte
eine klare blassgrüne Lösung ohne erkennbare Partikelrückstände ergeben.
• Rekonstituieren Sie das PR3V Reagenz in 4,0 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser ohne
Konservierungsstoffe, wie auf dem Fläschchenetikett angegeben. Das aufgelöste Produkt sollte
eine leicht trübe Lösung ohne erkennbare Partikelrückstände ergeben.
• Zur Durchmischung vorsichtig umschwenken - nicht schütteln!
• Vor Gebrauch 10 Minuten bei Raumtemperatur (+15 bis + 25 °C) inkubieren.
• Reagenzien vor Gebrauch noch einmal vorsichtig mischen.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Die gefriergetrockneten Reagenzien sind bei +2 bis +8 °C zu lagern und bis zu dem auf dem Etikett
angegebenen Datum haltbar.
Stabilität nach Rekonstitution (geschlossenes Fläschchen)
Temperatur:
ProC® Ac R
ProC® Ac R
Aktivator
PR3V Reagenz
bei +2 bis +8 °C
2 Wochen
2 Wochen
bei +20 bis +25 °C
12 Tage
12 Tage
bei +37 °C
6 Stunden
6 Stunden
bei -20 °C
2 Wochen
2 Wochen
Hinweis auf Verfall: Im Falle von fehlendem Vakuum beim Öffnen des Fläschchens und/oder falls
das Reagenz feucht erscheint, sollte es zu Dade Behring zurückgesendet werden. Wenn das rekonstituierte Produkt deutliche Anzeichen von Schwebstoffen oder Kontaminationen aufweist oder
wenn es sich nicht innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe von destilliertem oder entionisiertem
Wassers vollständig löst, kontaktieren Sie bitte Dade Behring oder Ihren lokalen Distributor.
Nach Rekonstitution nicht häufiger als einmal einfrieren und wieder auftauen!
Zusätzlich benötigte nicht im Kit enthaltene Materialien
Natriumcitrat (0,11 M bzw. 3,2%ig) für die Blutabnahme
Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE
ProC® Kontrollplasma, Bestell-Nr. OQKE
Destilliertes oder entionisiertes Wasser ohne Konservierungsstoffe
Kunststoffröhrchen
Pipetten für das genaue Abmessen von 100 µl, 2,0 ml und 4,0 ml
Wasserbad, temperiert auf +37 °C
Zeitmesser oder Stoppuhr
Physiologische Kochsalzlösung (0,15 M Natriumchlorid) zur Verwendung mit dem BCS® Gerinnungsmessgerät
Dade® CA System-Puffer zur Verwendung mit Sysmex® CA-Systemen, Bestell-Nr. B4265 oder
Dade® Owren’s Veronal-Puffer, Bestell-Nr. B4234
Gerinnungsmessgerät (siehe "Einschränkung der Testdurchführung")
Geräte
Der Dade Behring ProC® Ac R Test kann manuell oder an einer Vielzahl von Gerinnungsmessgeräten verwendet werden. Beachten Sie die Bedienungsanleitung des Geräteherstellers!
Probenabnahme und -vorbereitung
Achtung: Alle Plasmen sind als potentiell infektiös zu behandeln!
Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung (0,11 M) mit 9 Teilen frisch abgenommenem Venenblut sorgfältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort für 10 Minuten bei 1500 x g
zentrifugieren und das überstehende Plasma abpipettieren. Beim Separieren des Plasmas darauf
achten, dass keine Blutplättchen abpipettiert werden. Falls die Probe eingefroren werden soll, separiertes Plasma erneut zentrifugieren und unverzüglich einfrieren.
Stabilität der Probe
bei +2 bis +8 °C 4 Stunden (Frischplasma)
bei -30 °C
6 Monate (wenn Plättchen vor dem Einfrieren durch doppelte Zentrifugation
entfernt wurden).
Testdurchführung
Manuell
Test mit Aktivator:
1. Eine ausreichende Menge an PR3V Reagenz, unter Berücksichtigung von 0,1 ml pro Test, bei
+37 ± 1 °C in einem Reagenzgefäß vorinkubieren.
2. 0,1 ml des Testplasmas in ein Reaktionsgefäß geben.
3. 0,1 ml des Aktivators zu dem Testplasma geben und für genau 5 Minuten bei +37 ± 1 °C
inkubieren.
4. Mit Zugabe von 0,1 ml des auf +37 ± 1 °C vorinkubierten PR3V Reagenzes Stoppuhr starten
und die Gerinnungszeit bestimmen.
5. Messung für Doppelbestimmung wiederholen und den Mittelwert beider Bestimmungen als Ergebnis angeben.
Test ohne Aktivator:
1. Eine ausreichende Menge an PR3V Reagenz, unter Berücksichtigung von 0,1 ml pro Test, bei
+37 ± 1 °C in einem Reagenzgefäß vorinkubieren.
2. 0,1 ml des Testplasmas in ein Reaktionsgefäß geben.
3. 0,1 ml der Kochsalzlösung zu dem Testplasma geben und für genau 5 Minuten bei +37 ± 1 °C
inkubieren.
4. Mit Zugabe von 0,1 ml des auf +37 ± 1 °C vorinkubierten PR3V Reagenzes Stoppuhr starten
und die Gerinnungszeit bestimmen.
5. Messung für Doppelbestimmung wiederholen und den Mittelwert beider Bestimmungen als Ergebnis angeben.
Automatisch:
Testprotokolle für Dade Behring Gerinnungsmessgeräte werden auf Anfrage von Dade Behring zur
Verfügung gestellt.
Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale
Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft.
Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die
Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung
des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf
anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
Interne Qualitätskontrolle
Normalbereich:
Kontroll-Plasma N
Pathologischer Bereich:
ProC® Kontrollplasma
Zwei Kontrollen (eine im Normalbereich und eine FV Leiden positive) sollten gemessen werden. Ein
normales Kontrollplasma kann aus frisch abgenommenen Plasmen erstellt werden, die auf die FV
Leiden-Mutation getestet wurden und dabei einen negativen Befund aufwiesen. Die Plasmen sollten am Tag der Abnahme vereinigt und für die spätere Verwendung in kleinen Aliquoten eingefroren
werden. Zur Positivkontrolle kann ein Plasma-Aliquot eines FV Leiden Trägers verwendet werden.
Die Plasmen sollten bis zur Verwendung bei -70 °C eingefroren werden.
Das Kontrollmaterial sollte in derselben Weise vorbereitet und behandelt werden wie die Proben.
Für jedes Kontrollplasma sollten geeignete Grenzen gesetzt werden, indem Präzisionsuntersuchungen nach den Richtlinien der NCCLS durchgeführt werden. Diese Richtlinien empfehlen die
Bestimmung von Kontrollen zu Beginn einer Mess-Serie, zumindest einmal in einer 8-StundenSchicht, und bei jedem Wechsel des Reagenzes. Jedes Labor sollte für beide Kontrollen entweder
anhand der vom Hersteller der Kontrollen angegebenen Sollwerte und- bereiche oder anhand im
Labor bestimmter Kontrollwerte seinen eigenen Qualitätskontrollbereich mit jeder Charge des
ProC® Ac R Tests ermitteln. Dieser beträgt in der Regel ± 2,5 Standardabweichungen vom mittleren
Kontrollwert.
Liegen die gemessenen Kontrollwerte außerhalb des vorher festgelegten Kontrollbereiches, dürfen
die Patientenergebnisse nicht eher berichtet werden, bis das Problem identifiziert, korrigiert und
dokumentiert ist. Überprüfen Sie, welcher Teil des Geräte/Reagenz/Kontroll-Systems nicht einwandfrei funktioniert hat und korrigieren Sie ihn. Nachdem korrigierende Maßnahmen implementiert und unter Einhaltung der Guten Laborpraxis (GMP) dokumentiert wurden, sind die Kontrollen
erneut zu testen. Wenn sie nun innerhalb des Vertrauensbereiches liegen, können Patientenproben
getestet und die erhaltenen Ergebnisse berichtet werden.
Ergebnisse
Die Messergebnisse sollten als Verhältnis (Ratio) ausgedrückt werden:
Die ProC® Ac R-Applikationen mit den Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 und CA-1500 Systemen wurden mit dem Coatest•• APC•• Resistance V auf dem ACL 9000 System verglichen. Insgesamt wurden 139 frische und/oder gefrorene Proben von nicht ausgewählten, freiwilligen, gesunden Blutspendern, welche PCR-negativ für Faktor V Leiden waren, sowie von PCR-positiven Patienten für Faktor V Leiden mit verschiedenen Krankheitsstadien getestet. 138 dieser 139 Proben
wurden sowohl vom ProC® Ac R-Test mit den Dade Behring BCS® und Sysmex® CA-7000 Systemen korrekt bestimmt, als auch vom Coatest•• APC•• Resistance V auf dem ACL 9000 System.
137 der genannten 139 Proben wurden mit dem ProC® Ac R-Test auf dem Sysmex® CA-1500
System korrekt erkannt.
Hinweis: Die Sensitivität und Spezifität des Dade Behring ProC® Ac R Tests für das Screening von
APC Resistenzen, die nicht auf den FV Leiden Gendefekt beruhen, wurde nicht ermittelt. Aufgrund
von Unterschieden in der Probenpopulation, in der Abnahmetechnik und in der Gerätetechnik sollte
jedes Untersuchungslabor seinen eigenen Cut-off bestimmen.
Präzision
Präzision in der Serie (Intra-Assay-Variationskoeffizient): maximal 1,9%. Die Gesamtpräzision wurde mit drei Plasmen an zwei Prüfstellen über 20 Tage in Doppelbestimmung ermittelt und lieferte
einen Variationskoeffizienten von maximal 8,9%.
Literatur
Siehe englische Packungsbeilage.
Garantie
Es wird garantiert, dass die Wirkungsweise dieses Produktes den Angaben auf der Packung und in
der Produktliteratur entspricht. Dade Behring haftet nicht für die handelsübliche Qualität oder
die Eignung des Produktes, falls diese für irgendwelche anderen als die angegebenen
Zwecke verwendet wird, noch für irgendwelche Folgeschäden, die sich aus den vorstehenden vertraglichen Gewährleistungen ergeben.
Dade ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Inc. in den USA, Deutschland und anderen
Ländern.
ProC und BCS sind eingetragene Marken der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, in
Deutschland und in anderen Ländern.
Sysmex ist eine eingetragene Marke der SYSMEX CORPORATION in den USA, Deutschland und
anderen Ländern.
• STA ist eine Marke von Diagnostica Stago
•• Coatest and APC sind Marken von Chromogenix AB
••• MDA ist eine Marke von Organon Teknika B.V.
Gerinnungszeit PR3V mit Aktivator
–––––––––––––––––––––––––––––––––––
Gerinnungszeit PR3V mit Kochsalzlösung
oder Dade® CA System-Puffer
Dade Behring ProC® Ac R Ratio =
Die für ein Poolplasma im normalen Bereich unter Verwendung von Aktivator erhaltenen Ergebnisse für den Dade Behring ProC® Ac R Test sollten zwei- bis dreimal größer sein als die Ergebnisse
für ein Poolplasma im normalen Bereich ohne Aktivator (siehe Erwartete Werte).
Einschränkungen der Testdurchführung
Es sind Gerinnungsmessgeräte geeignet, für die Dade Behring Anwendungsvorschriften bereitstellt. Die Verwendung des Dade Behring ProC® Ac R Tests an anderen Gerinnungsmessgeräten
muss von dem Untersuchungslabor selbst validiert werden. Dabei können andere als die angegebenen Leistungsdaten erhalten werden. Tests mit dem Dade Behring ProC® Ac R Reagenz wurden
mit Proben von Patienten unter stabiler oraler Antikoagulanzientherapie, Patienten unter Heparinund niedrigmolekularer Heparintherapie sowie Patienten mit Lupus Anticoagulans durchgeführt.
Proben solcher Patienten können wesentlich längere Gerinnungszeiten zeigen als Proben von normalen Individuen. Da die Gerinnungszeiten mit Kochsalzlösung bzw. Dade® CA System-Puffer jedoch ebenfalls verlängert sind, bleibt der Quotient aus der Gerinnungszeit mit/ohne Aktivator verlässlich und die diagnostische Aussagekraft bleibt erhalten.
Therapeutische Dosen von Hirudin oder anderen direkten Thrombin-Inhibitoren führen zu verlängerten Gerinnungszeiten.
Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Störfaktoren
Ikterische, lipämische und hämolytische Proben sowie Proben mit niedrigem Hämatokrit sollten mit
dem vorliegenden Test nicht verwendet werden, da sie zu fehlerhaften Ergebnissen führen können
(vergleiche NCCLS H21-A3 für weitere Erklärungen3). Niedrige Aktivitäten der Faktoren VII, VIII, IX
und XII beeinflussen den Dade Behring ProC® Ac R Test nicht. Aktivitäten der Faktoren II und V von
über 10% und des Faktors X von über 20% haben ebenfalls keine Auswirkung auf den Test. Zu
Beginn der Behandlung mit oralen Antikoagulanzien, d.h. vor dem Zustand der Stabilisierung, kann
der Dade Behring ProC® Ac R Test zu niedrigen Ratios führen. Gleiches gilt für Protein C Konzentrationen unter 50%.
Ausgabe Februar 2005
ProC® Ac R
Test pour le dépistage de la résistance APC
Test de dépistage basé sur du venin de vipère de Russell, qui permet de mesurer la
résistance à la protéine C activée due à une mutation du gène du facteur V (facteur V
Leiden).
Domaine d’utilisation
Le test Dade Behring ProC® Ac R est un test de coagulation fonctionnel qui permet de dépister une
résistance à la protéine C activée (APC) dans le plasma de sujets ayant un facteur V Leiden. Le test
peut également être effectué sur des plasmas de patients sous anticoagulants oraux ou sous héparinothérapie.
Intérêt diagnostique
La résistance à la protéine C activée (APC) est due à une mutation ponctuelle du gène du facteur
V (par ex. le facteur V Leiden). La mutation entraîne le remplacement de la glutamine (Q) par l’acide
aminé arginine 506 (R) dans la protéine facteur V1. Cette mutation ralentit l’inactivation du facteur Va
par l’APC, provoquant ainsi une plus grande tendance au saignement. La présence de facteur V
Leiden est, dans 20 à 50% des cas, la cause principale d’une thrombophilie héréditaire2.
Principe de la méthode
Die Werte (Ratio) gesunder Personen variieren von Labor zu Labor in Abhängigkeit vom angewendeten Verfahren. Daher sollte jedes Labor auf der Grundlage der verwendeten Methode und des
Gerinnungsmessgerätes eigene Referenzbereiche ermitteln.
Im Allgemeinen deuten Verhältnisse kleiner oder gleich 1,5 auf die Faktor V (Leiden) Variante hin.
In einer Studie mit den Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 und CA-1500 Systemen wurde eine
Entscheidungsgrenze von 1,8 für diese Applikation ermittelt.
Ratios zwischen 1,5 und 2,1 lassen niedrige Konzentrationen an Protein C vermuten und sollten
weiter untersucht werden. Diese Untersuchungen könnten spezifische Tests für Protein C und
DNA-Tests beinhalten.
Proben mit positiven oder grenzwertigen Ergebnissen sollten durch Genanalyse bestätigt werden.
Le test Dade Behring ProC® Ac R est basé sur l’activation de la protéine C endogène par incubation
du plasma à tester avec du venin de serpent Agkistrodon contortrix contortrix (mocassin à tête
cuivrée du sud). On mesure ensuite sur ce plasma un temps de venin de vipère de Russell dilué
(DRVVT, « Diluted Russell’s Viper Venom Time », venin de serpent qui active le facteur X). Le
DRVVT réagit de façon sensible aux modifications de concentration de la protéine C activée. Dans
le cas de sujets normaux, le résultat du test avec activateur qui active la protéine C, par rapport à
celui obtenu avec le test réalisé avec du tampon, est allongé de 2 à 3 fois. Chez les sujets ayant un
facteur V Leiden, l’activation de la protéine C par le venin de serpent ne provoque qu’un allongement négligeable par rapport au test réalisé avec du tampon (en général, l’allongement est inférieur
à 1,5 fois). Afin de minimiser les effets des autres paramètres de la coagulation, il est recommandé
de calculer le rapport entre le temps de coagulation obtenu avec l’activateur venin de serpent et
celui obtenu sans activateur.
La résistance à la protéine C activée peut également être due à d’autres mutations du gène du
facteur V, comme par ex. le facteur V Cambridge ou le facteur V Hong Kong.
Leistungsmerkmale des Tests
Réactifs
Diagnostische Sensitivität und diagnostische Spezifität
Der Dade Behring ProC® Ac R Test wurde auf einem Stago STA•-Gerät im Vergleich zur DNAAnalysenmethode validiert und ein Cut-off von 1,57 wurde durch ROC-Analyse ermittelt.
An drei unabhängigen Testzentren wurden klinische Validierungsstudien durchgeführt, um die
Wirksamkeit des Dade Behring ProC® Ac R Testes zum Nachweis der Faktor V (Q506)-Mutation zu
evaluieren. Der Dade Behring ProC® Ac R Test wurde mit dem Coatest•• APC•• Resistance V Test
und der DNA-Analyse verglichen. Dabei wurde eine Gesamtzahl von 164 Proben (82 normale und
82 Faktor V Leiden positive) von Patienten im Alter zwischen 2 und 87 Jahren verwendet. Die
Population umfasste Patienten mit folgenden klinischen Bedingungen: unbehandelt (49), DVT/PE
oder andere prothrombotische Bedingungen (58), oral antikoaguliert (36), Heparin/LMW Heparin
(21), Lupus Antikoagulans (12) oder Familienverwandtschaftsstudien (39). 163 von 164 Patienten
wurden mit Hilfe eines Cut-offs von 1,57 an allen Prüfstellen korrekt identifiziert. Das ergab eine
Sensitivität von 100% (Vertrauensbereich: 95,6 bis 100%) und eine Spezifität von 98,8% (Vertrauensbereich 93,4 bis 99,8%) relativ zur DNA-Methode. Die Validierung wurde auf einem Stago STA•,
und einem Organon Teknika MDA••• 180 und mit einer manuellen Technik ("tilt tube") durchgeführt.
Eine weitere klinische Bewertung des ProC® Ac R Testes mit den Dade Behring BCS®, Sysmex®
CA-7000 und CA-1500 Systemen ergab mittels ROC-Analyse 1,8 als Entscheidungsgrenze. Für
diese Applikationen wurden diagnostische Sensitivität und diagnostische Spezifität evaluiert. Mindestens 198 frische und/oder gefrorene Proben von nicht ausgewählten, freiwilligen, gesunden
Faktor-V-Leiden negativen Blutspendern (Status bestätigt durch PCR), sowie von PCR-positiven
Faktor V Leiden-Trägern mit verschiedenen Krankheitsstadien wurden getestet. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 dargestellt.
Conditionnement
Test ProC® Ac R
Coffret, code OPBC, contenant
5 x pour 4,0 ml
Réactif PR3V
5 x pour 2,0 ml
Réactif Activateur
permet de réaliser 100 tests de coagulation manuels (100 tests avec activateur et 100 sans activateur).
Remarque : le nombre de tests peut varier selon l’appareil de coagulation spécifique utilisé.
Composition
Réactif Activateur : lyophilisat contenant du venin de serpent Agkistrodon contortrix contortrix
(< 0,1 g/l) en solution tampon stabilisante.
Conservateur :
azide de sodium (< 0,01%)
Réactif PR3V : lyophilisat contenant du venin de serpent Vipera Russell dilué riche en phospholipides (< 1 mg/l), des phospholipides végétaux (< 10 g/l), du calcium (0,1 M) et un neutralisateur de
l’héparine (< 0,5 g/l).
Conservateur :
azide de sodium (< 0,01%)
Zu erwartende Werte
Tabelle 1: Ergebnisse der diagnostischen Sensitivitäts- und Spezifitätsstudie für ProC® Ac R
CA-1500
CA-7000
BCS®
N
198
214
231
Cutoff
1,8
1,8
1,8
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
Spezifität [%]
97,2
98,0
98,1
3
Sensitivität [%]
98,9
99,1
99,2
NPV [%]
99
99
99
PPV [%]
96,8
98,2
98,4
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Réservé à un usage de diagnostic in vitro.
2. Les réactifs in vitro contenant de l’azide de sodium doivent être utilisés avec précaution : ne pas
avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir
explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
Préparation des réactifs
• Reconstituer le Réactif Activateur avec 2,0 ml d’eau distillée ou désionisée exempte de conservateur, comme indiqué sur l’étiquette du flacon. Une fois reconstituée, la solution doit être limpide, vert pâle, sans aucune particule visible.
• Reconstituer le Réactif PR3V avec 4, 0 ml d’eau distillée ou désionisée exempte de conservateur, comme indiqué sur l’étiquette du flacon. Une fois reconstituée, la solution doit être légèrement trouble et ne contenir aucune particule visible.
• Bien homogénéiser les solutions en retournant les flacons - ne pas les agiter !
• Avant emploi, les laisser incuber 10 minutes à la température ambiante (+15/+25 °C).
• Homogénéiser à nouveau les réactifs avec précaution avant emploi.
Stabilités et conditions de conservation
Conservés lyophilisés à +2/+8 °C, les réactifs du coffret peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur l’étiquette.
Stabilités après reconstitution (dans flacon fermé) :
Température :
ProC® Ac R
ProC® Ac R
Activateur
Réactif PR3V
+2/+8 °C
2 semaines
2 semaines
+20/+25 °C
12 jours
12 jours
+37 °C
6 heures
6 heures
-20 °C
2 semaines
2 semaines
Signes de détérioration des réactifs : en l’absence de vide à l’ouverture d’un flacon ou si le
lyophilisat apparaît humide, renvoyer le flacon à Dade Behring. Si le produit reconstitué présente
des particules, est contaminé ou n’est pas totalement reconstitué dans les 15 minutes qui suivent
l’addition de l’eau distillée ou désionisée, contacter Dade Behring.
Une fois reconstituées, les solutions ne peuvent être congelées qu’une seule fois !
Autres réactifs et matériel nécessaires non contenus dans le coffret
Citrate de sodium (0,11 M ou 3,2%) pour les prélèvements sanguins
Plasma de contrôle N, code ORKE
ProC® Plasma de contrôle, code OQKE
Eau distillée ou désionisée exempte de conservateur
Tubes à essai en plastique
Pipettes exactes de 100 µl, 2,0 ml et 4,0 ml
Bain-marie thermostaté à +37 °C
Timer ou chronomètre
Sérum physiologique (chlorure de sodium 0,15 M) pour une utilisation sur l’appareil de coagulation
BCS®
Dade® Tampon pour systèmes CA pour une utilisation sur les systèmes CA Sysmex®, code B4265 ou
Dade® Tampon véronal d’Owren, code B4234
Appareil de coagulation (cf. « Limites de réalisation du test »)
Appareils de coagulation
Le test ProC® Ac R de Dade Behring peut être utilisé aussi bien manuellement que sur un grand
nombre d’automates de coagulation. Respecter le manuel d’utilisation de l’automate utilisé !
Prélèvement et préparation des échantillons
Attention : considérer tous les plasmas comme potentiellement infectieux lors de leur manipulation !
Pour obtenir les plasmas, mélanger 1 volume de solution de citrate de sodium (0,11 M) avec 9
volumes de sang veineux fraîchement prélevé, et homogénéiser avec précaution en évitant la formation de mousse. Centrifuger aussitôt 10 min à 1500 x g et prélever le plasma surnageant à l’aide
d’une pipette en veillant à ne pas aspirer de plaquettes. Si l’échantillon doit être congelé, centrifuger
de nouveau le plasma prélevé, et le congeler immédiatement.
Stabilité de l’échantillon
+2/+8 °C 4 heures (plasma frais)
-30 °C
6 mois (à condition que les plaquettes aient totalement été éliminées par double centrifugation avant la congélation)
Réalisation du test
Méthode manuelle :
Test avec activateur :
1. Préincuber la quantité nécessaire de Réactif PR3V (compter 0,1 ml par test) à +37 ± 1 °C dans
un récipient pour réactif.
2. Verser 0,1 ml de plasma à tester dans un tube à essai.
3. Ajouter 0,1 ml de Réactif Activateur au plasma à tester et laisser incuber exactement 5 minutes à +37 ± 1 °C.
4. Ajouter 0,1 ml de Réactif PR3V préincubé à +37 ± 1 °C, déclencher simultanément le chronomètre et mesurer le temps de coagulation.
5. Retester le plasma pour un dosage en double et rendre la moyenne des deux dosages comme
résultat.
Test sans activateur :
1. Préincuber la quantité nécessaire de Réactif PR3V (compter 0,1 ml par test) à +37 ± 1 °C dans
un récipient pour réactif.
2. Verser 0,1 ml de plasma à tester dans un tube à essai.
3. Ajouter 0,1 ml de sérum physiologique au plasma à tester et laisser incuber exactement 5
minutes à +37 ± 1 °C.
4. Ajouter 0,1 ml de Réactif PR3V préincubé à +37 ± 1 °C, déclencher simultanément le chronomètre et mesurer le temps de coagulation.
5. Retester le plasma pour un dosage en double et rendre la moyenne des deux dosages comme
résultat.
Méthode automatique :
Les protocoles spécifiques aux appareils de coagulation Dade Behring sont envoyés sur demande
par Dade Behring.
Dade Behring a contrôlé l’efficacité optimale des réactifs ainsi que le respect de leurs spécifications
dans le cadre de leur utilisation sur différents appareils de coagulation.
Dade Behring n’encourage pas les utilisateurs à modifier les protocoles, dans la mesure où les
modifications peuvent influencer la performance du système et les résultats du test. Il est de la
responsabilité de l’utilisateur de valider toute modification par rapport au protocole indiqué , ou
l’utilisation de ces réactifs sur d’autres appareils de coagulation que ceux indiqués par Dade
Behring dans les protocoles d’application ou les fiches techniques.
Contrôle de qualité interne
Domaine normal :
Plasma de contrôle N
Domaine thérapeutique : ProC® Plasma de contrôle
Tester deux contrôles (un dans le domaine normal et un positif en facteur V Leiden). Comme plasma de contrôle normal, on peut utiliser des plasmas fraîchement prélevés sur lesquels on fait une
recherche de mutation du facteur V Leiden et qui donnent un résultat négatif. Purifier les plasmas le
jour de leur prélèvement et les congeler en petites parties aliquotes pour une utilisation ultérieure.
Comme contrôle positif, on peut utiliser un plasma aliquoté porteur du facteur V Leiden. Congeler
les plasmas à -70 °C jusqu’à leur utilisation.
Préparer et tester les contrôles comme des échantillons de patients. Déterminer des valeurs-limites
pour chaque plasma de contrôle en réalisant une étude de précision selon les lignes directrices du
NCCLS. Ces lignes directrices recommandent de tester les contrôles au début de chaque série de
mesures, au moins une fois toutes les 8 heures de travail, et à chaque changement de réactif.
Chaque laboratoire doit déterminer, pour chacun des deux contrôles et pour chaque lot du test
ProC® Ac R, son propre domaine de contrôle de qualité soit à partir des valeurs théoriques et
domaines de confiance indiqués par le fabricant des contrôles, soit à partir de valeurs de contrôle
déterminées dans son laboratoire. Le domaine de contrôle de qualité correspond en général à ± 2,5
déviations standard par rapport à la valeur moyenne des contrôles.
Si les valeurs obtenues pour les contrôles sortent des domaines préalablement établis, ne pas
rendre les résultats de patients tant que le problème n’aura pas été identifié, corrigé et documenté.
Déterminer quel élément du système appareil/réactifs/contrôles a présenté un dysfonctionnement
et corriger celui-ci. Une fois les mesures correctives mises en place et documentées selon les
bonnes pratiques de laboratoire (GMP), tester à nouveau les contrôles. S’ils sont trouvés à
l’intérieur de leur domaine de confiance respectif, les échantillons de patients peuvent être testés et
les résultats rendus.
Résultats
Rendre les résultats sous forme de ratio :
Temps de coagulation PR3V avec activateur
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Temps de coagulation PR3V avec sérum physiologique
ou avec Dade® Tampon pour systèmes CA
Ratio Dade Behring ProC® Ac R =
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
4
Les résultats obtenus dans le test Dade Behring ProC® Ac R pour un pool de plasmas dans le
domaine normal en utilisant l’activateur doivent être deux à trois fois supérieurs à ceux obtenus
pour le même pool de plasmas sans activateur (cf. « Valeurs attendues »).
Limites de réalisation du test
Dade Behring propose des protocoles d’adaptation pour les automates de coagulation adaptés à la
réalisation du test. L’utilisation du test Dade Behring ProC® Ac R sur d’autres automates de coagulation doit être validée par le laboratoire utilisateur. Celui-ci peut alors obtenir des données de
performance différentes de celles indiquées comme caractéristiques du test. Le test Dade Behring
ProC® Ac R a été effectué sur des échantillons de patients sous traitement aux anticoagulants
oraux stabilisé, sous traitement à l’héparine et sous traitement à l’héparine de faible poids moléculaire, ainsi que chez des patients avec un Lupus anticoagulant : les temps de coagulation de ces
patients peuvent être largement supérieurs à ceux obtenus chez des sujets normaux. Dans la
mesure cependant où les temps de coagulation obtenus avec du sérum physiologique ou le Dade®
Tampon pour systèmes CA sont également allongés, le ratio entre temps de coagulation avec
activateur et temps de coagulation sans activateur reste fiable, et l’interprétation diagnostique est
maintenue possible.
Les doses thérapeutiques d’Hirudin ou d’autres inhibiteurs directs de la thrombine entraînent un
allongement du temps de coagulation.
Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux
du patient, les signes cliniques et autres constatations.
Facteurs d’interférences
Ne pas utiliser d’échantillons ictériques, lipémiques, hémolytiques, ni ayant un faible hématocrite
pour ce test, au risque d’obtenir de faux résultats (cf. NCCLS H21-A3 pour plus de précisions3). Des
activités faibles de facteur VII, VIII, IX ou XII n’ont pas d’influence sur le test Dade Behring ProC® Ac
R. Des activités de facteur II ou V augmentées de 10% ou de facteur X augmentées de 20% n’ont
pas non plus d’influence sur le test. Au début d’un traitement aux anticoagulants oraux, c’est-à-dire
avant la phase de stabilisation, le test Dade Behring ProC® Ac R peut donner des ratios diminués.
Le même phénomène est observé avec des concentrations de protéine C diminuées de 50%.
Valeurs attendues
Les valeurs (ratios) des sujets sains varient d’un laboratoire à l’autre selon la technique utilisée.
Aussi chaque laboratoire doit-il déterminer ses propres domaines de référence par rapport à la
méthode et à l’appareil de coagulation utilisés.
En règle générale, un ratio égal ou inférieur à 1,5 indique la présence de la mutation du facteur V
(Leiden). Une étude effectuée avec les systèmes Dade Behring BCS®, Syxmex® CA-7000 et
CA-1500 a donné un seuil de décision à 1,8 pour ces applications.
Un ratio compris entre 1,5 et 2,1 fait penser à une concentration diminuée de protéine C et nécessite la poursuite de l’exploration. Effectuer alors des tests spécifiques de protéine C et des tests
d’ADN.
Les résultats positifs et douteux doivent être confirmés par une analyse génétique.
Caractéristiques du test
Sensibilité diagnostique et spécificité diagnostique
Le test Dade Behring ProC® Ac R a été validé par comparaison avec une méthode d’analyse d’ADN
sur un appareil Stago STA•. Le cut-off a été déterminé à 1,57 selon une analyse ROC.
Des études de validation cliniques ont été menées dans trois centres indépendants afin d’évaluer
l’efficacité du test Dade Behring ProC® Ac R à révéler la mutation du facteur V (Q506). Le test Dade
Behring ProC® Ac R a été comparé avec le test Coatest•• APC Resistance V et l’analyse d’ADN. Au
total, 164 échantillons (82 normaux et 82 positifs en facteur V Leiden) provenant de patients âgés de
2 à 87 ans ont été utilisés. La population comprenait des patients aux caractéristiques suivantes : non
traités (49), DVT/PE ou autres conditions prothrombotiques (58), sous anticoagulants oraux (36),
sous héparine ou héparine de bas poids moléculaire (21), avec Lupus anticoagulant (12) ou faisant
partie d’études familiales (39). 163 des 164 patients ont été correctement identifiés par les trois
centres à partir d’un cut-off à 1,57. Cela donne une sensibilité de 100% (domaine de confiance : 95,6
à 100%) et une spécificité de 98,8% (domaine de confiance : 93,4 à 99,8%) par rapport à la méthode
d’ADN. La validation a été effectuée sur un Stago STA•, un Organon Teknika MDA••• 180 et une
technique manuelle (retournement du tube).
Une autre évaluation clinique du test ProC® Ac R effectuée sur les systèmes Dade Behring BCS®,
Syxmex® CA-7000 et CA-1500 a donné par une analyse ROC 1,8 comme seuil de décision. La
sensibilité diagnostique et la spécificité diagnostique ont été évaluées pour ces applications. Au
moins 198 échantillons frais et/ou congelés provenant de donneurs de sang non sélectionnés,
volontaires, sains et trouvés négatifs en facteur V Leiden (statut confirmé par PCR) ainsi que de
patients trouvés positifs en facteur V Leiden par PCR, à différents stades de la maladie. Les résultats sont représentés dans le tableau 1.
Tableau 1 : Résultats d’une étude de sensibilité et de spécificité diagnostiques pour le test ProC® Ac R
CA-1500
CA-7000
BCS®
N
198
214
231
Cut-off
1,8
1,8
1,8
Spécificité [%]
97,2
98,0
98,1
Sensibilité [%]
98,9
99,1
99,2
VPN [%]
99
99
99
VPP [%]
96,8
98,2
98,4
Les applications du test ProC® Ac R sur les systèmes Dade Behring BCS®, Syxmex® CA-7000 et
CA-1500 ont été comparées avec le Coatest•• APC•• Resistance V sur le système ACL 9000. Au
total, 139 échantillons frais et/ou congelés ont été testés, provenant de donneurs de sang non
sélectionnés, volontaires, sains et trouvés négatifs en facteur V Leiden par PCR, ainsi que de
patients trouvés positifs en facteur V Leiden par PCR, à différents stades de la maladie. 138 de ces
139 échantillons ont été correctement trouvés, aussi bien avec le test ProC® Ac R sur les systèmes
Dade Behring BCS® et Syxmex® CA-7000, qu’avec le Coatest•• APC•• Resistance V sur le système
ACL 9000. 137 des 139 échantillons ont été correctement trouvés avec ProC® Ac R sur le système
Syxmex® CA-1500.
Remarque : la sensibilité et la spécificité du test Dade Behring ProC® Ac R pour le dépistage des
résistances APC qui ne sont pas dues à une mutation du gène du facteur V Leiden n’ont pas été
déterminées. Du fait de différences de populations, de techniques de prélèvement et de techniques
des appareils utilisés, chaque laboratoire doit déterminer son propre cut-off.
Précision
Répétabilité (coefficient de variation dans la série) : maximum 1,9%. La précision globale a été
déterminée avec trois plasmas testés dans deux centres. Les tests ont été effectués en double sur
20 jours. Les coefficients de variation obtenus ont été de 8,9% maximum.
Littérature
Cf. texte anglais.
Garantie
La performance de ce produit n’est garantie que si celui-ci est utilisé selon les indications du coffret
et la littérature spécifique au produit. Dade Behring n’est pas responsable de la qualité ni de
l’adéquation du produit, si celui-ci est utilisé à d’autres fins que celles indiquées, et ne
pourra en aucun cas être poursuivi pour des dommages survenus en dehors des garanties
contractuelles.
Dade est une marque déposée de Dade Behring Inc. aux USA, en Allemagne et dans d’autres
pays.
ProC et BCS sont des marques déposées de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans d’autres pays.
Sysmex est une marque déposée de SYSMEX CORPORATION aux USA, en Allemagne et dans
d’autres pays.
• STA est une marque de Diagnostica Stago
•• Coatest et APC sont des marques de Chromogenix AB
•••MDA est de marque de Organon Teknika B.V.
Edition Février 2005
ProC® Ac R
Test di screening per la resistenza all’APC
Test di screening basato sul Veleno di Vipera Russell per la determinazione della resistenza
alla Proteina C Attivata che può essere causata da difetto genetico del FV (Leiden).
Settore d'impiego
Il test Dade Behring ProC® Ac R è un test coagulativo funzionale destinato allo screening della
resistenza alla Proteina C Attivata (APC) sul plasma di soggetti con difetto del Fattore V (Leiden). Il
test può anche essere eseguito sul plasma di pazienti in terapia anticoagulante orale stabilizzata o
in terapia eparinica.
Significato diagnostico
La Resistenza alla Proteina C Attivata (APC Resistance) è associata ad una mutazione del gene
del Fattore V [Fattore V Leiden]. La mutazione consiste nella sostituzione dell’Aminoacido Arginina
506 (R) con glutamina nella molecola proteica del Fattore V1. Tale mutazione rallenta l’inattivazione
del fattore Va da parte dell’APC, provocando uno stato di ipercoagulabilità. La presenza di Fattore V
(Leiden) è la più comune causa di trombofilia ereditaria, ricorrente nel 20 - 50% dei casi.2
Principio del metodo
Il test Dade Behring ProC® Ac R si basa sull’attivazione della Proteina C endogena mediante
incubazione del plasma con veleno di Agkistrodon contortrix contortrix (Southern Copperhead). Il
”Tempo di Veleno di Vipera Russell” diluito (DRVVT, veleno di serpente come attivatore del Fattore
X) viene poi eseguito sul plasma. Il DRVVT è sensibile alla variazioni di concentrazione della Proteina C Attivata. Nei soggetti normali, l’attivazione della Proteina C endogena prolunga da due a tre
volte il risultato, in confronto al plasma senza attivazione. In soggetti con Fattore V (Leiden),
l’attivazione mediante veleno della Proteina C induce solo un incremento marginale del risultato
(solitamente, meno di 1,5 volte il valore su plasma senza attivazione). Per minimizzare l’effetto di
altre variabili coagulative, occorre determinare il rapporto dei tempi di coagulazione ottenuti con e
senza attivazione mediante veleno.
La resistenza alla Proteina C Attivata può essere provocata anche da altre mutazioni del gene del
fattore V [FV (Cambridge) e FV (Hong Kong)].
Reagenti
Materiali forniti
Test ProC® Ac R
Kit analitico, Codice OPBC contenente
5 x 4,0 mL Reagente PR3V
5 x 2,0 mL Reagente Attivatore
Sufficiente per eseguire 100 dosaggi coagulativi manuali (100 test con attivatore e 100 test senza
attivatore).
Nota: Il numero di test ottenibili con specifici analizzatori per coagulazione può variare.
Composizione
Reagente Attivatore: Liofilizzato, contiene veleno di Agkistrodon contortrix contortrix (< 0,1 g/L) in
soluzione con tampone stabilizzante.
Conservante:
sodio azide (<0,01%)
Reagente PR3V: Liofilizzato, contiene veleno di Vipera Russell diluito (< 1 mg/L) arricchito con fosfolipidi, fosfolipidi di origine vegetale (< 10 g/L), calcio (0.1 M) e un inibitore dell’eparina (< 0,5 g/L).
Conservante:
sodio azide (<0,01%)
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in vitro.
2. I reagenti contenenti sodio azide devono essere manipolati con la dovuta cautela: Non ingerire
né lasciare a contatto con la pelle o le membrane mucose ! La sodio azide può formare azidi
esplosive a contatto con metalli pesanti come rame o piombo.
Preparazione del reagente
• Ricostituire l’Attivatore con 2,0 mL di acqua distillata o deionizzata priva di conservanti, come
indicato sull’etichetta del flacone. Il prodotto ricostituito dovrebbe apparire come una soluzione
limpida, di colore verde pallido senza evidenza di particelle.
• Ricostituire il Reagente PR3V con 4,0 mL di acqua distillata o deionizzata priva di conservanti,
come indicato sull’etichetta del flacone. Il prodotto ricostituito dovrebbe apparire come una soluzione translucida, pallida senza evidenza di particelle.
• Capovolgere delicatamente per miscelare. Non agitare !
• Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (+15 - +25 °C) prima dell’uso.
• Mescolare ancora accuratamente i reagenti prima dell’uso.
Conservazione e stabilità
I reagenti liofilizzati devono essere conservati a +2 - +8 °C e sono stabili fino alla data indicata
sull’etichetta.
Stabilità dopo ricostituzione (flacone chiuso)
Temperatura:
Attivatore
Reagente PR3V
ProC® Ac R
ProC® Ac R
a +2 - +8 °C
2 settimane
2 settimane
a +20 - +25 °C
12 giorni
12 giorni
a +37 °C
6 ore
6 ore
a -20 °C
2 settimane
2 settimane
Indice di deterioramento:
In caso di assenza di vuoto all’apertura del flacone e/o di aspetto non secco del reagente, il prodotto deve essere restituito a Dade Behring. Se i prodotti ricostituiti mostrano chiaramente presenza di
particelle o di contaminazione ovvero non si sciolgono completamente entro 15 minuti dall’aggiunta
dell’acqua distillata o deionizzata, contattare Dade Behring o il Distributore di zona.
Non congelare e scongelare più di una volta dopo ricostituzione !
Materiale necessario ma non fornito nel kit
Sodio citrato (0,11M o 3,2%) per la raccolta del sangue
Plasma di Controllo N, Codice ORKE
ProC® Plasma di Controllo, Codice OQKE
Acqua distillata o deionizzata priva di conservanti
Provette di reazione in plastica
Pipette per misurare con precisione 100 µL, 2,0 mL e 4,0 mL
Bagno termostatato, tenuto a +37 °C
Orologio o cronometro
Soluzione salina fisiologica (sodio cloruro 0,15 M) da utilizzare sull’analizzatore BCS®
Soluzione Diluente CA Dade® da utilizzare con i Sistemi CA Sysmex®, Codice B4265 oppure
Tampone di Owren Dade®, Codice B4234
Analizzatore per coagulazione (vedere ”Limiti della Procedura”)
Strumentazione
Il Test Dade Behring ProC® Ac R può essere eseguito manualmente oppure con numerosi analizzatori per coagulazione. Attenersi alle istruzioni operative del produttore dello strumento !
Raccolta e preparazione dei campioni
Importante: Trattare tutti i plasmi come potenzialmente infettivi !
Per ottenere il plasma, miscelare con cura 1 parte di sodio citrato (0,11 M) con 9 parti di sangue
venoso appena prelevato, evitando la formazione di schiuma. Centrifugare immediatamente per 10
minuti a 1,500 x g e trasferire il plasma sovranatante. Durante la separazione del plasma, fare
attenzione a non trasferire piastrine. Se il campione deve essere congelato, centrifugare il plasma
separato in precedenza e congelare immediatamente.
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
5
Stabilità dei campioni
a +2 - +8 °C
4 ore (plasmi freschi)
a -30 °C
6 mesi (dopo rimozione delle piastrine con doppia centrifugazione prima del congelamento)
Esecuzione del test
Manuale:
Test con attivatore:
1. Preriscaldare una quantità sufficiente di Reagente PR3V, tenendo 0,1 mL per test a +37 ± 1 °C
in un adeguato contenitore.
2. Dispensare 0,1 mL di plasma in esame in una provetta di reazione.
3. Aggiungere 0,1 mL di Attivatore al plasma in esame e incubare esattamente per 5 minuti a + 37
± 1 °C.
4. Aggiungere 0,1 mL di Reagente PR3V preriscaldato a +37 ± 1 °C, avviare immediatamente il
cronometro e determinare il tempo di coagulazione.
5. Ripetere la misurazione per la determinazione in doppio e riportare come risultato la media di
entrambe le determinazioni.
Test senza attivatore:
1. Preriscaldare una quantità sufficiente di Reagente PR3V, tenendo 0,1 mL per test a +37 ± 1 °C
in un adeguato contenitore.
2. Dispensare 0,1 mL di plasma in esame in una provetta di reazione.
3. Aggiungere 0,1 mL di soluzione salina al plasma in esame e incubare esattamente per 5 minuti
a + 37 ± 1 °C.
4. Aggiungere 0,1 mL di Reagente PR3V preriscaldato a +37 ± 1 °C, avviare immediatamente il
cronometro e determinare il tempo di coagulazione.
5. Ripetere la misurazione per la determinazione in doppio e riportare come risultato la media di
entrambe le determinazioni.
Automatica:
I protocolli analitici per gli analizzatori Dade Behring possono essere ottenuti a richiesta da Dade
Behring.
Dade Behring ha verificato che l’utilizzo di questi reagenti su differenti analizzatori dia prestazioni
ottimali e sia conforme alle specifiche di prodotto.
Dade Behring non supporta modifiche poiché queste potrebbero influenzare le prestazioni del sistema ed i risultati analitici. È responsabilità dell’Utilizzatore validare le modifiche a queste istruzioni
o l’utilizzo di questi reagenti su analizzatori che non siano quelli indicati da Dade Behring nelle
istruzioni applicative o nelle presenti istruzioni.
Controllo di qualità interno
Intervallo normale: Plasma di Controllo N
Intervallo patologico: ProC® Plasma di Controllo
Occorre analizzare due controlli (uno nell’intervallo normale e uno positivo per il FV Leiden). Un
plasma di controllo normale può essere definito utilizzando un pool di plasmi normali prelevati di
fresco, tutti analizzati e trovati negativi per la mutazione del Fattore V Leiden. Il pool di plasmi deve
essere preparato nello stesso giorno del prelievo e congelato in piccole aliquote per il successivo
utilizzo. Un controllo positivo può essere preparato da aliquote di un soggetto sicuramente positivo
per il Fattore V Leiden.
I plasmi devono essere congelati a -70 °C per l’utilizzo.
I controlli devono essere preparati e gestiti esattamente come i campioni.
I limiti di accettabilità devono essere definiti per ciascun plasma di controllo eseguendo studi di
precisione secondo le indicazioni NCCLS. Tali indicazioni raccomandano di analizzare i controlli
all’inizio di ogni serie di analisi, almeno una volta ogni otto ore di lavoro,, e ad ogni cambiamento dei
reagenti. Ogni laboratorio deve determinare il proprio intervallo di controllo di qualità per entrambi i
controlli, tramite i valori dichiarati e gli intervalli forniti dal produttore dei controlli oppure mediante i
valori di controllo definiti nel laboratorio, per ogni lotto di Test ProC® Ac R. Tali intervalli di norma
sono pari a ± 2,5 deviazioni standard dal valore medio del controllo.
Se i valori ottenuti per il controllo sono al di fuori dell’intervallo di controllo predefinito, non refertare
i risultati dei pazienti finché il problema non sia stato identificato, corretto e documentato. Individuare quale parte del sistema strumento/reagente/controllo non ha funzionato adeguatamente e correggerla. Dopo aver messo in atto le misure correttive documentandole secondo la buona pratica di
laboratorio (GMP), rianalizzare i controlli. Se rientrano nell’intervallo di accettabilità, è possibile
analizzare i campioni dei pazienti e refertarne i risultati.
Risultati
I risultati dovrebbero essere espressi come ratio:
Ratio Dade Behring ProC® Ac R =
tempo di coagulazione PR3V con attivatore
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
tempo di coagulazione PR3V con soluzione salina
oppure con Soluzione Diluente CA Dade®
I risultati del Test Dade Behring ProC® Ac R su pool di plasmi normali con Attivatore dovrebbero
risultare da 2 a 3 volte più lunghi dei risultati ottenuti su pool di plasmi normali senza Attivatore
(vedere valori attesi).
Limitazioni della esecuzione del test
Per taluni analizzatori da coagulazione Dade Behring può fornire le istruzioni operative.
L’utilizzo del Test Dade Behring ProC® Ac R su altri analizzatori per coagulazione deve essere
validato dal laboratorio. È possibile che i dati così ottenuti differiscano da quelli forniti. Il Reagente
Dade Behring ProC® Ac R è stato utilizzato per analizzare campioni di pazienti in terapia anticoagulante orale stabilizzata, di pazienti in terapia eparinica e con eparina a basso peso molecolare, e di
pazienti con anticoagulanti lupus.
I campioni di tali pazienti possono presentare tempi di coagulazione significativamente più lunghi
rispetto ai campioni di soggetti normali. Tuttavia, poiché risultano prolungati anche i tempi di coagulazione con soluzione salina o con Soluzione Diluente CA Dade®, il rapporto ottenuto per il tempo di
coagulazione con/senza attivatore rimane affidabile e mantiene il significato diagnostico.
Dosi terapeutiche di irudina o di altri inibitori diretti della trombina mostrano tempi di coagulazione
allungati. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del
paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.
Interferenze
Campioni itterici, lipemici ed emolizzati e campioni con basso ematocrito non dovrebbero essere
utilizzati per questo test, perché possono generare risultati non corretti (vedere NCCLS H21-A3 per
ulteriori chiarimenti3). Attività bassa per i Fattori VII, VIII, IX e XII non interferiscono con il Test Dade
Behring ProC® Ac R. Anche attività dei Fattori II e V superiori al 10% e di Fattore X superiori al 20%
non hanno effetto sul test. All’inizio della terapia con anticoagulanti orali, es. prima della stabilizzazione, il Test Dade Behring ProC® Ac R può generare valori di ratio troppo bassi. Lo stesso fatto si
verifica per concentrazioni di Proteina C inferiori al 50%.
Valori attesi
I valori (ratio) per i soggetti sani variano da laboratorio a laboratorio, in base alla procedura utilizzata. Pertanto, ogni laboratorio deve definire i propri intervalli di accettabilità in rapporto ai metodi e
agli analizzatori utilizzati.
In generale, valori di ratio inferiori o uguali a 1,5 indicano la variante Fattore V Leiden. Uno studio
con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 ha evidenziato un limite decisionale pari a 1,8 per queste applicazioni analitiche.
Valori di ratio tra 1,5 e 2,1 possono indicare basse concentrazioni di Proteina C e richiedono ulteriori indagini. Tali indagini potrebbero comprendere analisi specifiche per la Proteina C e per il DNA.
Campioni con risultati positivi o dubbi dovrebbero essere confermati con analisi genetiche.
Caratteristiche analitiche
Sensibilità Diagnostica e Specificità Diagnostica
Il Test Dade Behring ProC® Ac R è stato validato su strumentazione Stago STA• rispetto al metodo
di analisi del DNA ed è stato definito un cut-off di 1,57 mediante analisi ROC.
È stato poi eseguito uno studio di valutazione clinica presso tre centri indipendenti per valutare la
capacità del Test Dade Behring ProC® Ac R di rilevare la mutazione del Fattore V (Q506). Il Test
Dade Behring ProC® Ac R è stato confrontato con il Test Coatest•• APC•• Resistance V e con
l’analisi del DNA, utilizzando un totale di 164 campioni (82 normali e 82 positivi per il Fattore V
Leiden) di pazienti di età compresa tra 2 e 87 anni. La popolazione comprendeva pazienti con le
seguenti condizioni cliniche: non trattati (49), DVT/PE o altre condizioni protrombotiche (58), terapia
anticoagulante orale (36), eparina/eparina LMW (21), anticoagulanti lupus (12) e studi familiari
(39). 163 su 164 pazienti sono stati correttamente identificati applicando il cut-off di 1,57 in tutti i siti,
mostrando una sensibilità pari al 100% (limiti fiduciari: da 95,6 a 100%) e una specificità pari al
98.8% (limiti fiduciari 93,4 a 99,8%) rispetto al metodo su DNA. La validazione è stata eseguita su
Stago STA•, Organon Teknika MDA••• 180 e utilizzando il metodo manuale ("tilt tube").
Un’ulteriore valutazione clinica del Test ProC® Ac R con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA7000 e CA-1500 ha definito il limite decisionale a 1,8 mediante analisi ROC. Sono state valutate la
sensibilità diagnostica e la specificità diagnostica di queste applicazioni. Sono stati analizzati almeno 198 campioni freschi o congelati di donatori volontari sani non selezionati confermati negativi
per il Fattore V Leiden, e di pazienti con stati patologici diversi confermati positivi per il Fattore V
Leiden mediante PCR. I risultati sono riportati in Tabella 1:
Tabella 1: Risultati dello studio di sensibilità diagnostica e specificità diagnostica per ProC® Ac R
CA-1500
CA-7000
BCS®
N
198
214
231
Cutoff
1,8
1,8
1,8
Specificità (%)
97,2
98,0
98,1
Sensibilità (%)
98,9
99,1
99,2
NPV (%)
99
99
99
PPV (%)
96,8
98,2
98,4
Le applicazioni del Test ProC® Ac R con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e
CA-1500 sono stati confrontati con Coatest•• APC•• Resistance V su ACL 9000. Sono stati analizzati in totale 139 campioni di plasma fresco o congelato da donatori volontari sani non selezionati
confermati negativi per il Fattore V Leiden mediante PCR e da pazienti con stati patologici diversi
confermati positivi per il Fattore V Leiden mediante PCR. 138 campioni su 139 sono stati correttamente identificati dal Test ProC® Ac R con i sistemi Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e con
Coatest•• APC•• Resistance V su ACL 9000. 137 su 139 sono stati correttamente identificati dal Test
ProC® Ac R sul sistema Sysmex® CA-1500.
Nota: Sensibilità e specificità del Test Dade Behring ProC® Ac R per lo screening dell’APC Resistance non FV Leiden dipendente non sono state definite. A causa delle differenze di popolazione,
di tecniche di prelievo e di tecnologia strumentale, ogni laboratorio dovrebbe determinare il proprio
cut-off.
Precisione
La massima precisione intra-serie (coefficiente di variazione intra-serie) è risultata pari a 1,9%. La
massima precisione totale è risultata pari a 8,9% basandosi su due siti, strumenti e operatori con
tre plasmi ripetuti in doppio per 20 giorni.
Bibliografia
Vedi testo Inglese.
Garanzia
Dade Behring garantisce che questo prodotto è conforme alle caratteristiche riportate sulla etichetta e nel materiale bibliografico relativo al prodotto stesso. Dade Behring declina ogni responsabilità per la commercializzazione o utilizzo del prodotto per scopi diversi da quelli dichiarati
e in nessun caso Dade Behring potrà essere ritenuta responsabile di alcun danno che possa
eventualmente verificarsi al di fuori di questa forma di garanzia.
Dade è un marchio registrato di Dade Behring Inc. negli USA, in Germania ed in altri Paesi.
ProC e BCS sono marchi registrati di Dade Behring Marburg in USA, Germania e altri Paesi.
Sysmex è un marchio registrato della SYSMEX CORPORATION in USA, in Germania e in altri
Paesi.
• STA è un marchio registrato di Diagnostica Stago.
•• Coatest e APC sono marchi registrati di Chromogenix AB
•••MDA è un marchio registrato di Organon Teknika B. V.
Reactivo PR3V: Liofilizado, contiene veneno de la serpiente Vipera Ruseli, diluido, rico en fosfolípidos (< 1 mg/l), fosfolípidos derivados de plantas (< 10 g/l), calcio (0,1 M) y un neutralizador de
heparina (< 0,5 g/l).
Agente de conservación:
azida de sodio (< 0,01%)
Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para usar en diagnósticos in vitro
2. En el manejo de diagnósticos in vitro que contengan azida de sodio se debe observar: No ingerir
y evitar el contacto con la piel y mucosas. La azida de sodio puede formar azidas explosivas con
metales pesados como cobre y plomo.
Preparación de los reactivos
• Reconstituir el activador en 2,0 ml de agua destilada o desionizada sin agentes de conservación, como está descrito en la etiqueta. El producto diluido debe dar una solución azul verdosa,
clara, sin partículas reconocibles.
• Reconstituir el reactivo PR3V en 4,0 ml de agua destilada o desionizada, sin agentes de conservación, como está descrito en la etiqueta. El producto diluido debe dar una solución ligeramente
turbia sin partículas reconocibles.
• Para mezclar invierta cuidadosamente - no agite!
• Incubar a temperatura ambiente (entre +15 y +25 °C) durante 10 minutos, antes de usar.
• Mezclar los reactivos cuidadosamente una vez más antes de usarlos.
Estabilidad y almacenaje
Los reactivos liofilizados almacenados entre +2 y +8 °C, son estables hasta la fecha de vencimiento
dada en la etiqueta.
Estabilidad después de la reconstitución (frascos cerrados)
Temperatura:
ProC® Ac R
ProC® Ac R
Activador
Reactivo PR3V
entre +2 y +8 °C
2 semanas
2 semanas
entre +20 y +25 °C
12 días
12 días
a +37 °C
6 horas
6 horas
a -20 °C
2 semanas
2 semanas
Indicaciones de expiración: Si no existe vacío al abrir el frasco y/o el reactivo parece húmedo,
devolver el reactivo a Dade Behring. Si el producto reconstituido muestra, claramente, señales de
partículas o de contaminación o si no se disuelve completamente después de 15 minutos de agregarle el agua destilada o desionizada, póngase en contacto con Dade Behring o con su representante local.
No congele y descongele más de una vez después de la reconstitución!
Materiales adicionales necesarios pero no contenidos en el kit
Citrato de sodio (0,11M o al 3,2%) para la toma se sangre
Plasma control N, N° de pedido ORKE
ProC® Plasma control, N° de pedido OQKE
Agua destilada o desionizada sin agentes de conservación
Tubos de plástico
Pipetas para la medida exacta de 100 µl, 2,0 ml y 4,0 ml
Baño de agua, mantenido a +37 °C
Medidor de tiempo o cronómetro
Solución salina fisiológica (0,15 M cloruro de sodio) para usar con los aparatos de medida de la
coagulación BCS®
Dade® Sistema tampón CA para usar con el sistema Sysmex® CA, N° de pedido B4265 o
Dade® Tampón Veronal de Owren, N° de pedido B4234
Aparatos de medida de la coagulación (ver „Limitaciones del procedimiento“)
Aparatos
El test Dade Behring ProC® Ac R se puede usar manualmente o en una gran variedad de aparatos de
medida de la coagulación. Observe el manual de operaciones dado por el fabricante del aparato!
Toma y preparación de la muestra
Edizione Febbraio 2005
ProC® Ac R
Atención: Tratar todos los plasmas como potencialmente infecciosos!
Para obtener el plasma, mezclar cuidadosamente 1 parte de solución de citrato de sodio (0,11 M)
con 9 partes de sangre venosa recién tomada, evitando la formación de espuma. Centrifugar a
continuación aprox. 1 500 x g durante 10 min. y pipetear el plasma sobrenadante. Al separar el
plasma tener cuidado de no pipetear también las plaquetas. En caso de congelar la muestra,
centrifugar de nuevo el plasma separado y congelarlo inmediatamente.
Test para el screening de la resistencia a PCA
Estabilidad de la muestra
entre +2 y +8 °C
4 horas (plasma fresco)
a -30 °C
6 meses (cuando antes de congelar, las plaquetas se retiran por doble centrifugación).
Test de screening basado en el veneno de serpiente de Russell, para determinar la resistencia
a la proteína C activada que puede ser causada por el defecto genético FV (Leiden).
Procedimiento
Campos de aplicación
El test de Dade Behring ProC® Ac R es un test de coagulación funcional apropiado para el screening de la resistencia a la proteína C activada (PCA) en plasmas de personas con el defecto
genético factor V (Leiden). El test se puede también realizar con plasmas de pacientes bajo una
terapéutica con anticoagulantes orales estabilizada o bajo una terapéutica con heparina.
Significado diagnóstico
La resistencia a la proteína C activada (Resistencia PCA) está asociada con una mutación genética
puntual del factor V [por ej., factor V (Leiden)]. La mutación conduce a un cambio del aminoácido
arginina 506 (R) por glutamina (Q) en la proteína factor V1. Esta mutación retarda la inactivación del
factor Va por medio de la PCA, aumentando de está forma la tendencia a la coagulación. La existencia del factor V (Leiden), en un 20-50% de todos los casos, es la causa más común de una
trombofilia hereditaria2.
Principio del método
El test Dade Behring ProC® Ac R se basa en la activación de la proteína C endógena, por incubación del plasma con el veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix contortrix (Cabeza del cobre
del sur) y en la realización posterior, con la muestra de plasma, de la determinación del „Russell’s
Viper Venon Time“ (Tiempo de veneno de serpiente de Rusell) diluido (DRVVT, activador de veneno de serpiente para el factor X). El DRVVT reacciona de manera sensible a los cambios de concentración de la proteína C activada. En el caso de individuos normales, por medio de la activación
de la proteína C, se van a prolongar los resultados del test de dos a tres veces en comparación con
los del plasma sin activador. En personas con el factor V (Leiden) la activación de la proteína C con
el veneno de serpiente causa solamente una prolongación marginal de los resultados, en comparación con los resultados del test sin activador (normalmente menos de 1,5 veces). Para minimizar
el efecto sobre otros parámetros de la coagulación, se debe determinar la relación del tiempo de
activación con y sin el activador del veneno de serpiente.
La resistencia a la proteína C activada puede, también, ser ocasionada por otras mutaciones del
gen del factor V [por ej., por FV (Cambrige) y FV (Hong Kong)].
Reactivos
Contenido del envase comercial
Test ProC® Ac R
Test kit, N° de pedido OPBC con
5 x para 4,0 ml
Reactivo PR3V
5 x para 2,0 ml
Reactivo activador
Suficiente para realizar 100 ensayos manuales de coagulación (100 ensayos con activador y 100
ensayos sin activador).
Nota: El número de ensayos obtenidos con un aparato de medida de la coagulación específico
puede variar.
Composición:
Reactivo activador: Liofilizado, contiene veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix contortrix
(< 0,1 g/l) en solución tampón estabilizante.
Agente de conservación:
azida de sodio (< 0,01%)
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
6
Manual:
Test con activador:
1. Precalentar a +37 ± 1 °C una cantidad suficiente del reactivo PR3V en un tubo de ensayo,
calculando 0,1 ml por test.
2. Colocar 0,1 ml del plasma test en un tubo de ensayo.
3. Agregar 0,1 ml del activador al plasma test e incubar a +37 ± 1 °C por exactamente 5 minutos.
4. Añadir 0,1 ml del reactivo PR3V precalentado a +37 ±1 °C y accionar inmediatamente el cronómetro para determinar el tiempo de coagulación.
5. Repetir la medida para una doble determinación y dar el valor promedio de ambas determinaciones como resultado del test.
Test sin activador:
1. Precalentar a +37 ± 1 °C una cantidad suficiente del reactivo PR3V en un tubo de ensayo,
calculando 0,1 ml por test.
2. Colocar 0,1 ml del plasma test en un tubo de ensayo.
3. Agregar 0,1 ml del solución salina al plasma test e incubar a +37 ± 1 °C por exactamente 5
minutos.
4. Añadir 0,1 ml del reactivo PR3V precalentado a +37 ±1 °C y accionar inmediatamente el cronómetro para determinar el tiempo de coagulación.
5. Repetir la medida para una doble determinación y dar el valor promedio de ambas determinaciones como resultado del test.
Automático:
Protocolos del test para los aparatos de medida de la coagulación de Dade Behring pueden ser
solicitados a Dade Behring.
Dade Behring ha comprobado el uso de este reactivo en diferentes aparatos de análisis con relación al rendimiento optimo del producto y al cumplimiento de las especificaciones del producto.
Dade Behring no apoya modificaciones propuestas por el usuario, ya que esto puede influenciar las
características del sistema y los resultados del test. Es la responsabilidad del usuario validar las
variaciones de estas instrucciones o el uso del reactivo en otros aparatos de análisis diferentes a
los dados por Dade Behring en las direcciones de aplicación o los nombrados en este boletín.
Control de calidad interno
Rango normal:
Plasma control N
Rango patológico: ProC® Plasma control
Se deben medir dos controles (uno en el rango normal y uno con FV Leiden positivo). Un plasma de
control normal se puede preparar a partir de plasma frescos, recién tomados, que hayan sido
chequeados para la mutación FV-Leiden y que hayan dado un resultado negativo. Los plasmas
deben purificarse el día de la toma y congelarse en alícuotas pequeñas, para usar más tarde.
Como control positivo se puede usar una alícuota del plasma de un portador del FV Leiden. Los
plasmas se deben mantener a -70 °C hasta el momento de usarse.
El material de control debe prepararse y tratarse de la misma forma que las muestras. Para cada
plasma control se deben establecer límites apropiados, realizando para esto estudios de precisión
según las normas del NCCLS. Estas normas recomiendan la determinación de los controles al
comienzo de una serie de medidas, por lo menos una vez en un turno de 8 horas y para cada
cambio de reactivo. Cada laboratorio debe, con cada lote del test ProC® Ac R, determinar para los
dos controles sus propios rangos de control de calidad, ya sea en base a los valores y rangos
teóricos dados o a los valores de control determinados por el mismo laboratorio. Este es normalmente ± 2,5 desviaciones estándar del valor control promedio.
Si los valores de control medidos se encuentran por fuera del rango de control antes establecido,
los resultados del paciente no se deben entregar hasta que el problema no haya sido identificado,
corregido y documentado. Comprobar que parte del sistema aparato/reactivo/control no ha funcionado correctamente y corregirla. Después de implementar las medidas correctivas y de documentar de acuerdo a good laboratory practice (GMP), medir de nuevo los controles. Si después de esto,
los controles se encuentran dentro del rango de confianza, se pueden chequear las muestras de
los pacientes y reportar sus resultados.
Resultados
Los resultados de las medidas se deben expresar como relación (radio):
Tiempo de coagulación PR3V con activador
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Tiempo de coagulación PR3V con sol. salina
o Dade® Sistema tampón CA
Dade Behring ProC® Ac R Radio=
Bibliografía
Ver boletín informativo en inglés.
Garantía
Se garantiza, que el modo de acción de este producto corresponde con los datos dados en el
envase y en este boletín informativo. Dade Behring no responde por la calidad usual en el
comercio o la idoneidad del producto, en caso de que el producto sea utilizado con otros
fines diferentes a los indicados, como tampoco por daños consecutivos que resulten de la
garantía arriba estipulada.
Dade es una marca de fabrica registrada de Dade Behring Inc. en USA, Alemania y otros países.
ProC y BCS son marcas de fábrica registradas de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania
y en otros países.
Sysmex es una marca de fábrica registrada de SYSMEX CORPORATION en USA, Alemania y
otros países.
• STA es una marca de fábrica de Diagnostica Stago
•• Coatest y APC son marcas de fábrica de Chromogenix AB
••• MDA es una marca de fábrica de Organon Teknika B.V.
Los resultados obtenidos en el test Dade Behring ProC® Ac R para un pool de plasmas en el rango
normal, usando activador deben ser dos a tres veces más grandes que los resultados para el pool
de plasmas en el rango normal sin activador (ver Valores esperados).
Limitaciones del procedimiento
Hay aparatos de medida de la coagulación, apropiados, para los cuales Dade Behring facilita las
instrucciones de operación. El uso del test Dade Behring ProC® Ac R en otros aparatos de medida
de la coagulación debe ser validado por el laboratorio investigador. En este caso, se pueden presentar valores diferentes a los dados para las características del test. Ensayos con los reactivo
Dade Behring ProC® Ac R fueron hechos con muestras de pacientes bajo una terapéutica con
anticoagulantes orales, estabilizada, pacientes bajo una terapéutica con heparina y con heparina
de bajo peso molecular, así como, con pacientes con anticoagulante lúpico. Las muestras de estos
pacientes pueden mostrar tiempos de coagulación significantemente más largos que las muestras
de individuos normales. Sin embargo, dado que los tiempos de coagulación con la solución salina
o con el Dade® Sistema tampón CA, están igualmente prolongados, el cociente derivado de los
tiempos de coagulación con/sin activador permanece confiable y el significado diagnóstico se mantiene.
Dosis terapéuticas de hirudina o de otros inhibidores directos de trombina conducen a prolongación de los tiempos de coagulación.
Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del
paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.
Interferencias
Muestras ictéricas, lipémicas y hemolíticas, así como, muestras con un hematócrito bajo no deben
ser usadas en este test, ya que estas pueden conducir a resultados incorrectos (comparar con
NCCLS H21-A3 para mayor aclaración3). Las bajas actividades de los factores VII, VIII, IX y XII no
influyen sobre el test Dade Behring ProC® Ac R Las actividades de los factores II y V superiores al
10% y del factor X por encima del 20% no tienen, igualmente, ninguna influencia sobre el test. Al
comienzo del tratamiento con anticoagulantes orales, por ej., antes de la estabilización, el test
Dade Behring ProC® Ac R puede dar radios que son demasiado bajos. Lo mismo es válido para
concentraciones de proteína C por debajo del 50%.
Valores esperados
Los valores (radio) de personas sanas varían de laboratorio a laboratorio dependiendo del procedimiento usado. Por esto, cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de referencia basados en el método y en el aparato de medida de la coagulación usados.
En general, radios más pequeños o iguales a 1,5 indican la variante del factor V (Leiden). En un
estudio con los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 y CA- 1500 se calculó un limite de
decisión de 1,8 para esta aplicación. Radios entre 1,5 y 2,1 permiten suponer concentraciones
bajas de proteína C y deben seguirse investigando. Estas investigaciones pueden incluir test específicos para proteína C y test para DNA.
Las muestras con resultados positivos o de valor limítrofe deben ser comprobadas por análisis
genético.
Características del test
Sensibilidad diagnóstica y especificidad diagnóstica
El test Dade Behring ProC® Ac R fue validado en un aparato Stago STA• en comparación con un
método de análisis del DNA y se estableció un cut-off de 1,57 mediante un análisis ROC.
En tres centros de investigación independientes, se efectuaron estudios de validación clínica para
evaluar la habilidad del test Dade Behring ProC® Ac R para detectar la mutación del factor V (Q506).
El test Dade Behring ProC® Ac R se comparó con el test Coatest•• APC•• Resistance V y el análisis
del DNA. Para esto, se usaron un total de 164 muestras (82 normales y 82 con factor V Leiden
positivo) de pacientes con edades entre 2 y 87 años. La población cubría pacientes con las siguientes condiciones clínicas: sin tratar (49), DVT/PE u otras condiciones protrombóticas (58), anticoagulantes orales (36), Heparina/ Heparina LMW (21), anticoagulante lúpico (12) o estudios familiares (39). 163 de los 164 pacientes fueron identificados correctamente en todos los sitios con
ayuda de un cut-off de 1,57, dando una sensibilidad del 100% (rango de confianza: 95,6 hasta
100%) y una especificidad del 98,8% (rango de confianza de 93,4 hasta 99,8%) relativo al método
del DNA. A validação foi executada no Stago STA•, no Organon Teknika MDA••• 180 e com uma
técnica manual ("tilt tube").
Una evaluación clínica adicional del test ProC® AC R con los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex®
CA-7000 y CA-1500 dio, mediante un análisis - ROC, un límite de desición de 1,8. Para estas aplicaciones se evaluaron la sensibilidad diagnóstica y la especifidad diagnóstica. Se estudiaron por lo menos
198 muestras frescas y/o congeladas de donantes de sangre, no seleccionados, voluntarios, sanos,
con factor V de Leiden negativo (estado confirmado por PCR), así como de portadores del factor V de
Leiden, PCR positivo, con diferentes estadios de la enfermedad. Los resultados están dados en la
Tabla 1.
Tabla 1: Resultados de la sensibilidad y especificidad diagnóstica para ProC® AC R
CA-1500
CA- 7000
BCS®
N
198
214
231
Cutoff
1,8
1,8
1,8
Especificidad (%)
97,2
98,0
98,1
Sensibilidad (%)
98,9
99,1
99,2
NPV (%)
99
99
99
PPV (%)
96,8
98,2
98,4
Las aplicaciones con el ProC® AC R en los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 y
CA-1500 se compararon con el test Coatest•• APC•• Resistance V en el sistema ACL 9000. En
general, se estudiaron 139 muestras frescas y/o congeladas de donantes de sangre, no seleccionados, voluntarios, sanos, los cuales eran PCR negativos para factor V de Leiden, así como de
pacientes PCR positivos para factor V de Leiden, en diferentes estadios de la enfermedad. 138 de
las 139 muestras fueron determinadas correctamente tanto por el test ProC® AC R, con los sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000, como por el test Coatest•• APC•• Resistance V en el
sistema ACL 9000. 137 de las 139 muestras antes nombradas fueron reconocidas correctamente
por el test ProC® AC R en el sistema Syxmex® CA-1500.
Nota: La sensibilidad y la especificidad del test Dade Behring ProC® Ac R para el screening de la
resistencia a APC, que no se atribuya al defecto genético Factor V (Leiden), no fueron estudiadas.
Debido a las diferencias en la población de las muestras, en la técnica de la toma y en la técnica de
los aparatos, cada laboratorio investigador deberá determinar su propio cut-off.
Precisión
Precisión en la serie (Coeficiente de variación intra assay): máximo 1,9%. La precisión total se
determinó en tres plasmas, en dos sitios, con determinaciones dobles, durante más de 20 días
obteniéndose un coeficiente de variación de máximo 8,9%.
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
7
Edición Febrero 2005
ProC® Ac R
Teste de rastreio da resistência APC
Teste de rastreio baseado no veneno da víbora Russel, para determinação da resistência
à proteína C activada, causada pelo defeito genético FV (Leiden).
Campo de aplicação
O teste ProC® Ac R da Dade Behring é um teste de coagulação funcional, adequado para o rastreio
da resistência à proteína C activada (APC) no plasma de indivíduos com o factor V (Leiden). O
teste também pode ser executado com plasma de pacientes sujeitos a uma terapia oral estável de
anticoagulantes ou terapia de heparina.
Significado diagnóstico
A resistência à proteína C activada (resistência APC), é causada pela mutação de um ponto no
gene do factor V [p. ex., factor V (Leiden]. A mutação provoca uma substituição do aminoácido
arginina 506 (R) pela glutamina (Q) na proteína do factor V1. Esta mutação retarda a inactivação do
factor Va pela APC, provocando, assim, um aumento da tendência de coagulação. Em 20 a 50% de
todos os cacos, a existência do factor V (Leiden) é a causa principal da trombofilia hereditária2.
Princípio metodológico
O teste ProC® Ac R da Dade Behring baseia-se na activação da proteína C endógena através da
incubação do plasma com o veneno da serpente Agkistrodon contortrix contortrix (cabeça de
cobre meridional). Seguidamente, com a amostra de plasma é executada uma determinação com
diluição do “Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, activador de veneno de serpente para o factor
X). O DRVVT reage de forma sensível às alterações da concentração da proteína C activada. Nos
indivíduos normais, devido à activação da proteína C, o resultado do teste com o activador é
prolongado duas a três vezes, quando comparado com o resultado do teste com tampão. Nos
indivíduos com o factor V (Leiden), a activação da proteína C pelo veneno de serpente provoca
apenas um prolongamento insignificante em relação ao resultado do teste com o tampão (normalmente inferior a 1,5 vezes). Para minimizar o efeito dos outros parâmetros de coagulação,
deverá ser determinada a relação entre o tempo de coagulação com activador do veneno de serpente e a coagulação sem o activador do veneno de serpente.
A resistência à proteína C activada também pode ser causada por outras mutações no gene do
factor V [p. ex., pelo FV (Cambridge) e o FV (Hong Kong)].
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Teste ProC ® Ac R
Kit de teste, ref. OPBC com
5 x para 4,0 ml
de reagente PR3V
5 x para 2,0 ml
de reagente activador
Suficiente para executar 100 testes de coagulação manuais (100 testes com activador e 100 testes
sem activador).
Nota: O número de testes que se pode obter com um coagulómetro específico pode variar.
Composição:
Reagente activador: Liofilizado, contém veneno de serpente Agkistrodon contortrix contortrix
(< 0,1 g/l) numa solução tampão estabilizada.
Conservante:
Azida de sódio (< 0,01%)
Reagente PR3V: Liofilizado, contém veneno de serpente diluído, rico em fosfolípidos, da Vipera
Russeli, (< 1 mg/l), fosfolípidos vegetais (< 10 g/l), cálcio (0,1 M) e um neutralizador de heparina
(< 0,5 g/l).
Conservante:
Azida de sódio (< 0,01%)
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Precauções a observar ao lidar com reagentes para diagnóstico in vitro com teor de azida de
sódio:
Evitar ingerir e todo o contacto com a pele ou mucosas! Com metais pesados, como o cobre ou
o chumbo, a azida de sódio pode formar azidas explosivas!
Preparação dos reagentes
• Reconstituir o activador em 2,0 ml de água destilada ou desionizada sem substâncias conservantes, como indicado no rótulo do frasco. O produto diluído deverá resultar numa solução
verde pálida clara sem resíduos de partículas perceptíveis.
• Reconstituir o reagente PR3V em 4,0 ml de água destilada ou desionizada sem substâncias
conservantes, como indicado no rótulo do frasco. O produto diluído deverá resultar numa solução ligeiramente turva sem resíduos de partículas perceptíveis..
• Para misturar, inverter cuidadosamente - não agitar!
• Antes de usar, incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (+15 a + 25 °C).
• Antes de usar, misturar os reagentes cuidadosamente uma vez mais.
Estabilidade e condições de conservação
Os reagentes liofilizados deverão ser conservados entre +2 e +8 °C e são estáveis até à data
indicada no rótulo.
Estabilidade após reconstituição (frasco fechado)
Temperatura:
ProC® Ac R
ProC® Ac R
Activador
Reagente PR3V
entre +2 e +8 °C
2 semanas
2 semanas
entre +20 e +25 °C
12 dias
12 dias
a +37 °C
6 horas
6 horas
a -20 °C
2 semanas
2 semanas
Indício de deterioração: No caso de não existir vácuo ao abrir o frasco e/ou o reagente ter o
aspecto molhado, deverá ser devolvido à Dade Behring. Se o produto reconstituído apresentar
sinais claros de substâncias suspensas ou contaminação ou não se dissolver integralmente 15
minutos após a adição de água destilada ou desionizada, por favor contacte a Dade Behring ou o
seu distribuidor local.
Depois da reconstituição, não congelar ou descongelar mais do que uma vez!
Outros materiais necessários não constantes do kit
Citrato de sódio (0,11 M ou 3,2%) para a colheita do sangue
Plasma de controlo N, ref. ORKE
Plasma de controlo ProC®, ref. OQKE
Água destilada ou desionizada sem substâncias conservantes
Tubinhos de plástico
Pipetas de 100 µl, 2,0 ml e 4,0 ml para uma medição precisa
Banho-maria temperado a +37 °C
Cronómetro ou cronógrafo
Solução fisiológica de cloreto de sódio (0,15 M de cloreto de sódio) para utilizar com o coagulómetro BCS®
Tampão sistema CA da Dade® para utilizar com os sistemas CA Sysmex®, ref. B4265 ou
Tampão veronal de Owren da Dade®, ref. B4234
Coagulómetro (veja “Limite de execução do teste”)
Instrumentos
O teste ProC® Ac R da Dade Behring pode ser utilizado manualmente ou numa multiplicidade de
coagulómetros. Por favor observe o manual de utilização do fabricante do aparelho!
Colheita e preparação de amostras
Atenção: Todos os plasmas deverão ser tratados como potencialmente infecciosos!
Para obtenção do plasma, misturar cuidadosamente 1 parte de solução de citrato de sódio (0,11
M) com 9 partes de sangue venoso colhido de fresco, evitando a formação de espuma. Centrifugar,
imediatamente, durante 10 min., no mínimo, a 1500 x g e retirar com a pipeta o plasma sobrenadante. Ao separar o plasma, prestar atenção a que não sejam retiradas com a pipeta plaquetas
sanguíneas. Se for necessário congelar a amostra, centrifugar, novamente, o plasma separado e
congelá-lo imediatamente.
Estabilidade da amostra
Entre +2 e +8 °C 4 horas (plasma fresco)
a -30 °C
6 meses (se, antes da congelação, as plaquetas forem eliminadas através de
centrifugação dupla).
Execução do teste
Manual:
Teste com activador:
1. Incubar, previamente, a +37 ± 1 °C uma quantidade suficiente de reagente PR3V num recipiente de reacção, tomando em consideração que a quantidade por teste deve ser de 0,1 ml.
2. Adicionar 0,1 ml do plasma de teste ao recipiente de reacção.
3. Adicionar 0,1 ml de activador ao plasma de teste e incubar, exactamente, durante 5 minutos a
+37 ± 1 °C.
4. Ao adicionar 0,1 ml do reagente PR3V pré-incubado a +37 ± 1 °C, por em marcha o cronógrafo
e determinar o tempo de coagulação.
5. Repetir a medição para a determinação dupla e indicar o valor médio das duas determinações
como resultado.
Teste sem activador:
1. Incubar, previamente, a +37 ± 1 °C uma quantidade suficiente de reagente PR3V num recipiente de reacção, tomando em consideração que a quantidade por teste deve ser de 0,1 ml.
2. Adicionar 0,1 ml do plasma de teste ao recipiente de reacção.
3. Adicionar 0,1 ml de solução de cloreto de sódio ao plasma de teste e incubar, exactamente,
durante 5 minutos a +37 ± 1 °C.
4. Ao adicionar 0,1 ml do reagente PR3V pré-incubado a +37 ± 1 °C, por em marcha o cronógrafo
e determinar o tempo de coagulação.
5. Repetir a medição para a determinação dupla e indicar o valor médio das duas determinações
como resultado.
Automática:
A pedido, a Dade Behring disponibiliza protocolos de teste para os coagulómetros.
A Dade Behring controlou a utilização destes reagentes em vários analisadores, em termos de
performance e manutenção das especificações do produto.
As alterações efectuadas pelo utilizador não são promovidas pela Dade Behring, uma vez que
podem afectar a performance do sistema e os resultados do teste. As alterações destas instruções
ou a utilização destes reagentes noutros analisadores que não os validados nas instruções de
aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização são da responsabilidade do utilizador.
Controlo de qualidade interno
Intervalo normal:
Plasma de controlo N
Intervalo patológico: Plasma de controlo ProC®
Deverão ser medidos dois controlos (um no intervalo normal e um FV Leiden positivo). O plasma de
controlo normal pode ser preparado a partir de plasmas colhidos de fresco, que foram testados em
termos de mutação do FV Leiden e apresentaram um resultado negativo. Os plasmas deverão ser
juntos no dia da colheita e congelados em pequenas alíquotas para utilização posterior. Para o
controlo positivo, pode ser utilizada uma alíquota de plasma de um portador de FV Leiden.
Até serem utilizados, os plasmas deverão ser congelados a -70 °C.
O material de controlo deverá ser preparado e tratado da mesma forma que as amostras. Para
cada plasma de controlo deverão ser estabelecidos limites adequados, executando-se análises
precisas de acordo com as directivas do NCCLS. Estas directivas recomendam que se faça a
determinação de controlos no início de uma série de medições, uma vez num turno de 8 horas, no
mínimo, e sempre que o reagente seja substituído. Para cada lote do teste ProC® Ac R, cada
laboratório deverá determinar para os dois controlos o seu intervalo de controlo de qualidade
próprio, com base nos valores e intervalos teóricos do fabricante dos controlos, ou com base em
valores de controlo determinados no laboratório. Geralmente, este perfaz ± 2,5 desvios standard
do valor de controlo médio.
Se os valores de controlo medidos se situarem fora do intervalo de controlo definido previamente,
os resultados dos pacientes não devem ser reportados até o problema ser identificado, corrigido e
documentado. Verifique qual a parte do aparelho/reagente/sistema de controlo que não funciona
irrepreensivelmente e corrija-a. Depois de terem sido implementadas medidas correctivas e documentadas com respeito pelas boas práticas laboratoriais (GMP), os controlos deverão ser testados
de novo. Se se situarem agora dentro do intervalo de confiança, as amostras dos pacientes podem
ser testadas e os resultados obtidos podem ser reportados.
Resultados
Os resultados de medição deverão ser expressos numa relação (ratio):
Tempo de coagulação PR3V com activador
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Tempo de coagulação PR3V com solução de cloreto
de sódio ou tampão sistema CA Dade®
Ratio ProC® Ac R Dade Behring =
Os resultados obtidos com o teste ProC® Ac R da Dade Behring no intervalo normal para um pool
de plasma utilizando o activador, deverão ser duas a três vezes superiores aos resultados para um
pool de plasma no intervalo normal sem activador (veja Resultados expectáveis).
Limites de execução do teste
São adequados os coagulómetros para os quais a Dade Behring disponibiliza instruções de utilização. A utilização do teste ProC® Ac R da Dade Behring noutros coagulómetros tem de ser validada pelo laboratório da análise. Neste caso, podem obter-se outras características de performance
que não as indicadas. Com o reagente ProC® Ac R da Dade Behring foram executados testes com
amostras de pacientes sujeitos a uma terapia oral estável de anticoagulantes, terapia de heparina
ou terapia de heparina com baixo teor de moléculas e amostras de pacientes com anticoagulante
Lúpus. As amostras destes pacientes podem apresentar tempos de coagulação substancialmente
mais prolongados do que as amostras dos indivíduos normais. Contudo, como os tempos de
coagulação também são prolongados com solução de cloreto de sódio ou o tampão sistema CA da
Dade®, o quociente resultante do tempo de coagulação com/sem activador permanece fiável e a
validade do diagnóstico mantém-se.
OPBC G03 C0542 (526) H/CS
8
Doses terapêuticas de hirudina ou outros inibidores directos da trombina provocam tempos de
coagulação prolongados.
Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico do
doente, estado clínico e outros dados de interesse.
Interferências
As amostras ictéricas, lipémicas e hemolíticas, assim como as amostras com hematócrito baixo
não deverão ser utilizadas com o presente teste, uma vez que podem causar resultados erróneos
(compare com NCCLS H21-23, para mais explicações3). Baixas actividades dos factores VII, VIII,
IX e XII não afectam o teste ProC® Ac R da Dade Behring. Actividades dos factores II e V superiores
a 10% e do factor X superiores a 20% também não têm qualquer influência sobre o teste. No início
do tratamento com anticoagulantes orais, ou seja, antes do estado de estabilização, o teste ProC®
Ac R da Dade Behring pode conduzir a ratios baixos. O mesmo é válido para as concentrações de
proteína C inferiores a 50%.
Valores expectáveis
Os valores (ratio) de indivíduos saudáveis variam de laboratório para laboratório em função do
processo utilizado. Por isso, cada laboratório deverá determinar intervalos de referência próprios,
com base no método e coagulómetro utilizados.
Geralmente, as relações inferiores ou iguais a 1,5 indiciam a variante do factor V (Leiden). Num
estudo com os sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 foi determinado um
limite de decisão de 1,8 para esta aplicação.
Os ratios entre 1,5 e 2,1 fazem supor a existência de concentrações baixas de proteína C e deverão continuar a ser investigados. Essas investigações podem conter testes específicos para a proteína C e testes de DNA.
As amostras com resultados positivos ou duvidosos deverão ser confirmadas por uma análise
genética.
Características de performance do teste
Sensibilidade e especificidade diagnósticas
O teste ProC® Ac R da Dade Behring foi validado num aparelho Stago STA•, em comparação com
o método analítico DNA e foi determinado um Cut-off de 1,57 através da análise ROC.
Foram executados estudos clínicos de validação em três centros de teste independentes, para
avaliar a eficácia do teste ProC® Ac R da Dade Behring na detecção da mutação do factor V (Q506).
O teste ProC® Ac R da Dade Behring foi comparado com o teste Coatest•• APC•• Resistance V e
a análise de DNA. Neste caso, foi utilizado um total de 164 amostras de pacientes (82 normais e 82
positivas com factor V Leiden) com idade compreendida entre os 2 e os 87 anos. A população
abrangeu pacientes com as seguintes condições clínicas: não tratados (49) DVT/PE e outras condições pró –trombóticas (58), anticoagulados oralmente (36), heparina/heparina LMW (21), anticoagulante Lúpus (12) ou estudos com afinidade familiar (39). Com a ajuda de um Cut-off de 1,57
foram identificados por todas as entidades examinadoras 163 pacientes de um total de 164. Resultou, daí, uma sensibilidade de 100% (intervalo de confiança: 95,6 a 100%) e especificidade de
98,8% (intervalo de confiança de 93,4 a 99,8%), relativamente ao método DNA. A validação foi
executada no Stago STA•, no Organon Teknika MDA••• 180 e com uma técnica manual ("tilt tube").
Uma outra avaliação clínica do teste ProC® Ac R com os sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex®
CA-7000 e CA-1500 através da análise ROC, produziu um resultado de limite de decisão de 1,8.
Foram avaliadas a sensibilidade e a especificidade diagnósticas para estas aplicações. Foram
testadas, no mínimo, 198 amostras de sangue frescas e/ou congeladas de dadores voluntários
saudáveis, não seleccionados, com factor V Leiden negativo (estado confirmado por PCR), assim
como amostras de portadores do factor V Leiden positivo com vários estádios da doença. Os
resultados estão apresentados na tabela 1.
Tabela 1: Resultados do estudo de sensibilidade e especificidade diagnósticas para ProC® Ac R
CA-1500
CA-7000
BCS
N
198
214
231
Cutoff
1,8
1,8
1,8
Especificidade %
97,2
98,0
98,1
Sensibilidade %
98,9
99,1
99,2
NPV %
99
99
98
PPV %
96,8
98,2
98,4
As aplicações ProC® Ac R nos sistemas Dade Behring BCS®, Sysmex® CA-7000 e CA-1500 foram
comparadas com o Coatest•• APC•• Resistance V no sistema ACL 9000. Foi testado um total de
139 amostras frescas e/ou congeladas de dadores voluntários saudáveis, não seleccionados, que
eram PCR -negativos para o factor V Leiden, assim como amostras de pacientes PCR -positivos
para o factor V Leiden com vários estádios da doença. Destas 139 amostras, 138 foram determinadas, correctamente, pelo teste ProC® Ac R, com os sistemas Dade Behring BCS® e Sysmex®
CA-7000, assim como pelo Coatest•• APC•• Resistance V no sistema ACL 9000. Das 139 amostras, 137 foram detectadas, correctamente, com o teste ProC® Ac R no sistema Sysmex® CA-1500.
Nota: Não foram determinadas a sensibilidade e a especificidade do teste ProC® Ac R da Dade
Behring para rastreio das resistências APC que não se baseiam no defeito genético FV Leiden.
Devido às diferenças na população de amostras, técnica de colheita e técnica instrumental, cada
laboratório deverá determinar o seu cut-off próprio.
Precisão
Precisão na série (coeficiente de variação intra-ensaio): máximo 1,9%. A precisão total foi determinada por duas entidades examinadoras com determinações duplas durante um período de tempo
superior a 20 dias e forneceu um coeficiente de variação máximo de 8,9%.
Bibliografia
Veja o folheto da embalagem em inglês.
Garantia
Garante-se que a eficácia deste produto corresponde aos dados indicados na embalagem e na
bibliografia do produto. Dade Behring declina a garantia habitual na actividade comercial e de
adequação do produto, caso este seja utilizado para outros fins que não os indicados e em
caso algum será responsabilizada pelos prejuízos decorrentes das garantias contratuais
acima referidas.
Dade é uma marca registada da Dade Behring Inc. nos EUA, Alemanha e noutros países.
ProC e BCS são marcas registadas da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, Alemanha e
noutros países.
Sysmex é uma marca registada da SYSMEX CORPORATION nos EUA, Alemanha e noutros países.
• STA é uma marca da Diagnostica Stago
•• Coatest e APC são marcas da Chromogenix AB
•••MDA é uma marca da Organon Teknika B.V.
Edição Fevereiro 2005