telomeres dynamic in human cells

DYNAMIQUE DE LA LONGUEUR DES
TELOMERES AU COURS DE LA SENESCENCE ET
DE L’IMMORTALISATION DE CELLULES
HUMAINES
Jean-Patrick Pommier
CEA / DSV / DRR
LABO RATOIRE DE RADIOBIOLOG IE ET ONCOLOGIE
13 décembre 1999
Dynamique de la longueur des télomères et
instabilité chromosomique spécifique
Sénescence in-vivo
Les télomères :
des sabliers mitotiques?
Cellules primaires
Télomérase OFF
Sénescence in-vitro
Cellules Immortelles
Télomérase ON
La sénescence réplicative des fibroblastes humains invitro
Explants de tissu
Nombre de passages :
•Fini : 40 à 60 DPMs
•Variabilité interindividuelle
Trypsination
Ensemencement
Passage P1
Confluence
Passage Pn
Hayflick et Moorhead (1961)
Localisation des signaux télomériques
HIS sur chromosomes métaphasi ques hum ains, avec une sonde PNA (CCCTAA)3-Cy3
Yq?
2q13-q14
2q13-q14
Organisation génomique des télomères
•
•
Séquences répétées en tandems directs jointifs.
Localisation terminale, brin G orienté en 3’
•Localisation intrachromosomique : Blocs de tandems inverses (ex HS 2q13-q14) ?
Réplication incomplète des télomères
synthèse discontinue
(1)-Dégradation amorce ARN
(2)-Synthèse ADN
(3)-Ligation
fragment d’Okasaki
5’
(1)
Progression de la fourche de réplication
TTAGGG
amorce ARN
(2)
AATCCC
5’
3’
3’
5’
100 à 275 bases
simples brins
(3)
synthèse continue
Fin du passage de la
fourche de réplication
Dégradation de la dernière
amorce ARN synthétisée
+
Post-traitement du brin C
-Dégradation ou
-Structure secondaire ?
+
±10 bases
simples brins
Fonctions des télomères
• Stabilisation du génome
– Supportent la réplication incomplète de l’ADN.
– Blocage des fusions chromosomiques dans les cellules
mitotiques.
• Absence de motifs TTAGGG
– Blocage irreversible en G1/S (sénescence)
– Signal apoptotique
• Topographie des chromosomes interphasiques
– Appariement des homologues dans la méiose
La télomérase est un complexe
ribonucléoprotéique
3’
5’
AAUCCCAAUCCCAAUCCC
TTAGGG TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
TTAGGG 3’
AATCCC 5’
site catalytique
motif télomérique néosynthétisépar la télomérase
sous unité catalytique: hTERT (Homme); Est2p (Levure); p123, p133 (Ciliés)
cofacteurs protéiques: p80, p95 (Ciliés)
protéine d’amarrage: Est4 Cdc13 p (Levure)
matrice ARN: hTER (Homme); TLC1 (Levure)
Chromatine télomérique des vertébrés
TRF1
TRF2
Boucle T
5’
AATCCC
3’
TTAGGG
Boucle D
de Lange et al. (1999)
Limitation de la prolifération des fibroblastes par
la quantité de motifs TTAGGG présente à chaque
télomère ?
• Les fibroblastes primaires n’expriment pas la télomérase.
• Les divisions cellulaires générent des télomères avec peu ou
pas de motifs TTAGGG (réplication incomplète, autre(s)
mécanisme(s) ?).
• Les télomères privés de TTAGGG sont équivalents à des
cassures d’ADN double brin:
– Blocage constitutif en G1
– Réparation par end-joining: Dicentrique ter-ter (fréquence ?).
• Expression ectopique de hTERT dans les fibroblastes :
– Immortelles
– Normales : éternellement “jeunes” (Bodnar et al. 1998)
Fusions télomériques dans les fibroblastes sénescents
(Benn 1976)
Fibroblastes MRC5 sénescents
occurence
25
pter
qter
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
chromosomes
Fibroblastes WI38 sénescents
25
pter
qter
occurence
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
Chromosomes
Y
Hypothèses
• Les dicentriques sont le produit d’une réparation
inappropriée des télomères érodés.
• Etat des télomères érodés dans une cellule sénescente?
• Implications de chromosomes spécifiques
• Différence entre donneurs
• Rôle du polymorphisme de longueur des séquences
télomériques?
QUANTIFICATION DES SEQUENCES TELOMERIQUES
Support
Méthode
Sonde
+
Marquage
32
-
ADN
Southern
géno mique Blot
Telomérique Chaud
•Sensibilité : P
•Calibration interne
•Mesure en Kb
•Quantité ADN
•Effet longueur de la cible
• Smearing non linéair e
•Non télomère spécifique
•Subtelo inconnu
•Durée
•Sensible à la fragmentationde l’ADN
•Echantillonage
Métaphase
FISH
Télomérique Froid
(+autres)
•Hybr idation simultanée
•Télomère spécifique
•Homologue spécifique
•Calibration interne.
•Représentativité métaphases/noyaux
(Culture cellulaire)
•Traitement informatique lourd
• Calibration externe pour la longueur ?
Noyaux
FISH
Télomérique Froid
(+autres)
•Hybr idation simultanée
•Quantité de cellules
•Calibration externe pour la longueur
•Focalisation (100x)
Flow
FISH
Télomérique Froid
(+alphoïde)
•Rapidité
•Cytométr ie en flux
Analyse de la longueur des FRTs
Principes
RsaI, HinfI
FRT
Digestion enzymatique
Sonde subtélomérique (minisatellite)
S(x)=k•N(x)
Sonde pantélomérique (CCC TAA)n
Migration électrophorétique
(échantillons + calibration)
+
Autoradiographie
S(x)=k•N(x)•L(x)
Dynamique de la longueur des télomères et
instabilité chromosomique spécifique
Sénescence in-vivo
Les télomères :
des sabliers mitotiques?
Cellules primaires
Télomérase OFF
Sénescence in-vitro
Cellules Immortelles
Télomérase ON
Evolution de la longueur des télomères /
immunosénescence
• Modèle in-vivo
– Patients HIV+ vs HIV-
• Hypothèse
– Augmentation du renouvellement cellulaire
– =>Erosion des télomères dans les lymphocytes?
Southern-Blot Patients VIH+ vs VIHCalcul de la longueur moyenne des FRTs
BET
Individus HIV+
Kb
λ ladder
23
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1.6
Autoradiogramme
Individus HIV-
BET
Plac PY
ladder
Longueur moyenne des FRTs (kb)
13
Comparaison de la taille des télomères des CMSP
au cours de l'infection à VIH
12
11
10
9
8
7
6
Témoins
n=11
Patients
> 200 T CD4+ /µl
Patients
< 200 T CD4+ /µl
n=5
n=16
n=10
p=0.6917
p=0.0002
p=0.0005
Groupe A
(T8)
Groupe B
(B)
n=6
p=0.0104
(Pommier JP ,Gauthier L et al., Virology, 1997)
Immunosénescence in-vivo
• -40 bp/an dans les CMSP (Vaziri et al. 1993)
• Patients avec moins de 200 T4/mm 3 :
– ∆FRT=-2,78 Kb : vieillissement de 70 ans des CSMP.
– Réduction de la longueur des télomères dans les:
• Lymphocytes T8
• Lymphocytes B
• 2 patients avec réduction dans les lymphocytes T4
• Immunosénescence des progéniteurs hématopoétiques par
sénescence réplicative ?
• La télomérase est incapable de maintenir la longueur des
télomères.
Dynamique de la longueur des télomères et
instabilité chromosomique spécifique
Sénescence in-vivo
Les télomères :
des sabliers mitotiques?
Cellules primaires
Télomérase OFF
Sénescence in-vitro
Cellules Immortelles
Télomérase ON
SENESCENCE - CELLULES TP
Analysed mitosis
Abnormal mitosis
Dicentrics+rings
Rea Chr13
Passage P20
50
0
0
0
P35
50
15
14
13
P44 (senescence)
20
19
21
15
Chromosomes dicentriques dans les fibroblastes
TP
Effets à long terme d’une irradiation aux ions lourds.
150
100
souscultures précoces
P ≤ 10
souscultures tardives
P> 10
50
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Réactivation de l’activité télomérase dans les
fibroblastes transformés par SV40.
Sénescence (M1)
Crise (M2)
Immortalisation
clone(s) immortalisé(s)
Divisions cellulaires supplémentaires
+
ATM
p53
-
+
+
TSV40
augmentation de
l'instabilité
chromosomique
+
+
réactivation de la
télomerase
-
OFF
+
+
p21 WAF1
p16 INK4a
G1
Addition de motifs TTAGGG
érosion des télomeres
érosion des télomeres
hTERT
G1
S
activité télomérase
S
ON
Crise
CRISE
Peteb
TP15.5
Placenta
Hétérogénéité de la taille des télomères
Peteb PB1.2
6 8 15 25 33 50 64 78
Passages
Pl TP 5
8
10 14 19 29 34 40 45 50 56 65
Kb
12
10
8
12
11
10
9
8
7
6
6
5
4
5
4
3
3
2
Avant crise : corrélation inverse entre la taille moyenne des
télomères et le nombre de dicentriques
MRC5
HYPO THESE :
Les télomères courts sont
instables
CRISE
DICENTRIQUES
700
600
500
Peteb PB1.2
400
CRISE
300
TP15.5, Peteb
-> hétérogènes
TP15.5
CRISE
MRC5
200
-> homogènes
100
0
0
2,5
5
7,5
10
TRF (Kb)
La longueur télomérique critique est-elle identique pour toutes les lignées ?
Localisation des points de cassure dans les
dicentriques
télomère-télomère
centromère-centromère
télomère-centromère
télomère-euchromatine
INSTABILITE CHROMOSOMIQUE
% de mitoses avec des remaniements chromosomiques
100
dic + r
13
75
16
1
6
50
8
14
25
0
0
5
10
passages après transfection par SV40
15
L’INSTABILITÉ CHROMOSOMIQUE EST SPÉ CIFIQUE
QUEL QUE SO IENT LES É VÈNEMEN TS INDUISANT LA PROLIFÉRATION
HYP : CARACTÉRISTIQUE INTRINSÈQUE DE S TÉLOMÈR ES
Buts
• Relation entre la longueur des télomères et la
stabilité des chromosomes.
• Mesure de la longueur des télomères
– cellule par cellule et chromosome par chromosome
– Comparaison de la longueur des télomères à l’intérieur d’une même
cellule.
– Comparaison d’un télomère d’une cellule à l’autre.
Détection des motifs TTAGGG sur chromosomes
métaphasiques
Sondes
PNA (CC CTAA )3-FITC
PNA (CC CTAA )3-Cy3
Directement fluorescentes
Spécificité très grande
Stabilité des complexes PNA-DNA
Chromosom es
DAPI (Bandes Q)
Acquisition des images
CCD monochromes
caméra 8bits (256 niveaux de gris)
caméra 12bits (4096 niveaux de gris)
Codage des mesures
• Association à chaque mesure d’un code numérique
arbitraire précisant:
– Le type du signal (paire, non résolu, “orphelin”)
– La localisation (télomère pter ou qter).
– Le chromosome auquelle elle appartient :
• “objet chromosome” (1-46)
• caryotype (1-24 avec X=23 et Y=24)
• Etiquetage des particules binaires
– spots
– Chromosomes
Mesure des signaux télomériques par
segmentation binaire
0
255
255
0
Surface (pixels)
Soustraction locale du fond
255
0
Seuillage
Niveau de gris
moyen
Etiquetage des spots binaires
255
0
0
255
255
0
Double Paire
pter
qter
Orphelin
Type de spot
(Etiquettes en type de spot)
Localisation
(coordonnées cytogénétique)
Etiquetage des chromosomes
B
A
★
★
★
★
★
F
★
★
D
E
★
★
C
★
★
★
Construction du tableau Ligne-particule
Volume des
spots
Objet
46 couleurs
Type
4 couleurs
Caryotype
24 couleurs
Localisation
2 couleurs
Homologue
2 couleurs
Standardisation des mesures
• Variabilité des mesures d’intensité des signaux
– D’un champ à l’autre.
– D’une lame à l’autre.
– Selon les expériences
– Biais dans l’analyse des mesures absolues
– Calibration externe, mesures en Kb (Lansdorp)
• Nécessité d’une indépendance des mesures / conditions
– Calibration interne
– Standardisation interne : mesures centrées-réduites
S i ,k =
*
Si − S
σ
k
k
Construction d’un tableau métaphase-ligne
Variables utilisées
Tableau T1
58
2410
Interface de l’outil Tableau Croisé Dynamique
TableauT3 : valeurs brutes
287+94=381
1430
TableauT3 : valeursCentrées-Réduites
qter
3000
Les mesures sont ensuite
centrées-réduites
1500
0
0
1500
pter
3000
HETEROGENEITE DES INTENSITES
STANDARDISEES DE 10 MÉTAPHASES
4.0
Sample size=920
90
3.5
80
2.5
70
Cumulated counts
Normalized intensity (q arm)
3.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
60
50
40
30
-0.5
20
-1.0
10
-1.5
-2.0
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Normalized intensity (p arm)
3.5
4.0
4.5
5.0
0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Normalized intensity (10 metaphases)
? LES TÉLOMÈRES LES PLUS COU RTS SONT-ILS IDENTIQUES
POUR CHAQUE MÉTAPHASE?
5.0
Diagramme pter-qter
Recherche d’une différence de longueur des télomères entre
les chromosomes homologues:
Cas des chromosomes 1 dans les fibroblastes TP (P14).
Chromosome 1 (Passage P14)
1.0
Métaphase
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1qter *
0.5
0.0
A
-0.5
B
-1.0
-1.5
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1pter*
Construction d’un tableau métaphase-ligne :
Tri des télomères des groupes A et B
2 groupes : -> distribution aléatoire?
-> paternel / maternel
Distinction des chromosomes 1 homologues
Association du marquage télomérique fort au marquage
hétérochromatique foncé (P=0.08)
Recherche d’hétéromorphismes
télomériques
-2 -1 0
1
2
3
4
5
-2 -1 0
1 2
3
4 5
-2 -1 0 1
2
3
4 5
4
3
1
2
3
4
5
2
1
0
-1
-2
4
6
7
8
9
10
3
2
1
0
-1
4
3
-2
11
12
13
14
15
2
1
0
-1
-2
4
16
17
18
19
20
3
2
1
0
-1
4
3
-2
21
22
X
Y
2
1
0
-1
-2
-2 -1 0
1
2 3
4
5
-2 -1 0
1
2
3 4 5
Recherche du nombre de sous classes de
longueur des télomères
5 sous classes de télomères
4
Yq
Yp
3
2
1
25.1
Classe I.1
3.35
0
7 qB
11 pA
-0.428
P=0.0069
Classe I
7 pA
6 pA
Classe I.2
6 qA
1 pb
Xp
11 qA
P<0.0001
7 qA
Xq
Classe II.1.1
11 qB
19 qA
19 qB
P<0.0001
Classe II.1
6 pB
19 pA
6 qB
1 qb
Classe II.1.2
Seul 1pa instable
11 pB
1 qa
1pa = 1qa
P<0.0001
19 pB
7 pB
Classe II
Classe II.2
1 pa
confirmation de l’hétérogénéité de longueur des télomères (southern)
Instabilité chromosomique et longueur des
télomères
•
•
•
•
Differenciation de chromosomes homologues 1, 6, 7, 11, 19, X, Y
Les chromosomes instables aux passages proches de la sénescence avaient
des petits télomères en P14 (chromosome 1A, 7B ?, 19B ?).
Les chromosomes avec des petits télomères (11B, 6B) en P14 ne sont pas
forcement instables.
La faible longueur des télomères est nécessaire mais pas suffisante.
Hypothèses
•
•
•
Le taux d’érosion est différent pour chaque télomère ?
Sélection cellulaire ?
Effet des séquences flanquantes : recombinaison preférentielle ? (associations
préférentielles : Dic 13-13; Dic 1-13)
Erosion des télomères du chromosome Y au
cours de la prolifération cellulaire.
3
Erosion Yq >> Yp
P14
P39-1
Yqter (intensité télomérique standardisée)
2
P39-2
P44
1
Hypothèse:
dégradation plus élevé
ou
recombinaison intratélomérique
->expulsion mini cercle
0
-1
-2
-2
0
2
4
Ypter (intensité télomérique standardisée)
6
Dynamique de la longueur des télomères et
instabilité chromosomique spécifique
Sénescence in-vivo
Les télomères :
des sabliers mitotiques?
Cellules primaires
Télomérase OFF
Sénescence in-vitro
Cellules Immortelles
Télomérase ON
Taille moyenne de télomères (Kb)
12,5
TP15.5
Avant la crise
110 pb / division
10
Juste après la crise
7,5
69 pb / division
Après la crise
5
2,5
0
100
200
300
400
Divisions cellulaires
25
Télomères longs (Kb)
Erosion des télomères
pré et post crise
TP15.5
Corrélation entre l’activation de
la télomérase et
un ralentissement de la perte
des séquences télomériques
Avant la crise
20
400 pb / division
Juste après la crise
15
58 pb / division
10
5
25
50
75
100
Divisions cellulaires
125
- allongement et dégradation en
faveur d’un raccourcissement
télomérique
- pas d’élongation : la
télomérase perturbe le
fonctionnement de l’exonucléase
Le taux d’érosion :
équilibre entre élongation et dégradation
la diminution des télomères n’est pas constante
Le taux d’érosion varie en fonction de la longueur des télomères dans le clone
TP15.5
100
50
0
Pic à 21Kb (fibroblastes Primaires TP)
Pic Haut Poids moleculaires (Tp15.5)
FRTs moyens ( FRTs homogènes; MPD>200)
Fonction
Hyperbolique
18
16
14
’Taux dérosion
Longueur (Kb)
24
22
20
12
10
8
6
4
0
100
200
DPM
300
400
-50
-100
-150
-200
-250
-300
-350
-400
5Kb
0
5
10
15
20
Longueur des pics télomériques
autres facteurs influençant la dynamique d’érosion?
25
TP
TP15.5 p11
homogénéisation
Hétérogène
TP15.5 p55
TP15.5 p5
Variation de l’hétérogénéité télomérique au cours des passages
Relation entre l’instabilité chromosomique, la longueur
des télomères et l’activation de la télomérase
T P15.5
+
120
12
FRT moyens (kb)
8
80
6
60
4
40
2
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Nb Dic pour 100 mitoses
100
10
0
90
1) érosion des télomères
précrise télomérase OFF -> instabilité chromosomique
postcrise télomérase ON -> chromosomes relativement stables
2) homogénéisation de la taille des télomères
-> évolution autour d’une taille “optimale
CONCLUSIONS
•
Dans les fibroblastes, les télomères sont hétérogènes en longueur. Certains
chromosomes homologues sont hétéromorphes. Origine de cette hétérogénéité et
de cette différence ?
– Recombinaison (méiose) ? Différence entre lignée masculine et féminine ?
•
En absence de télomérase, la variation de longueur peut être différente d’un
télomère à l’autre:
– Erosion constante et élevée ou recombinaison mitotique?
•
Le taux de variation de la longueur des grands télomères est d’autant plus fort
que les télomères sont longs :
– Mécanisme coopératif du blocage de l’amarrage de la télomérase aux télomères ?
érosion différentielle ?
•
Il y a stabilisation de la longueur des télomères autour d’une valeurs ± constante
(homogénéisation)
– Facteurs déterminant cette longueur : Contrôle de l’accessibilité des télomères? de
l’efficacité de la télomérase ?
•
Stabilité différentielle des chromosomes homologues selon leur télomère?
PERSPECTIVES (1)
•
Augmenter le nombre de chromosomes homologues différentiables (autres
sondes polymorphes).
– Sondes alphoïdes, minisatellites ... en multiFISH.
•
Suivi de la longueur des télomères dans des contextes à réarrangement
chromosomiques complexes, au cours de la prolifération cellulaire.
– Sondes subtélomériques.
•
Analyser la distribution de la longueur des télomères des cellules sénescentes
(bloquées en G1/S).
– PCC ?
•
•
•
Mécanismes de réactivation de la télomérase ?
Rôle de la structure des télomères (protéines spécifiques), absence de la
télomérase/ dynamique des télomères (Taux d’érosion ?)
Automatiser la segmentation des images de cytogénétiques.
– Smart Snakes ?
PERSPECTIVES (2)
A recessive mutation is
present in the zygote or is
acquired in somatic cells
Mutated
Unstable telomere
Normal
Cell proliferation leading to
telomere length reduction
in somatic cells
Mutated
}
Normal
Specific pattern of tissular expression
Repressed gene
Mutated
No phenotypic effect of LOH
Biochi mi e (1995) 77, 817-825
Whole or partial
chromosome loss
oriented by telomere
loss
Expressed gene
Mutated
Phenotypic effect of LOH
Commitment towards
immortalization of a
specific cell type