telomeres dynamic in human cells

Comparaison du potentiel de division
cellulaire par quantification des signaux
télomériques
• Sénescence cellulaire
– Modèles fibroblastiques
– Cellules hématopoïétiques
• Déterminisme de la sénescence
– Correlation entre FRTmoyen et DPmax (fibroblastes)
– Cellules immortelles mais normales
• Méthodes d’estimation de la longueur des télomères
– Southern et slots blots
– FISH
• Cytométrie en flux
• Microscopie
Sénescence réplicative:modèle fibroblastique
Les fibroblastes primaires ont un potentiel de division
limité in-vitro
• Indépendant de l’âge du donneur.
• Dépendant du donneur: 30-60 DPmax
Cristofalo et al. 1998
Sénescence réplicative:cas des lymphocytes
• Les cellules hématopoïétiques ont un potentiel de
division limité in-vitro (1)
• DPmax: Naïves > mémoires
• supérieur à celui des fibroblastes
• Les cellules hématopoïéitiques auraient un potentiel de
division limité in-vivo
• SIDA (2)
(1) Weng, Levine et al. 1995
(2) Ho 1995, Wei 1995
Sénescence réplicative:cellules épithéliales
• Les cellules épithéliales sénescent en culture:
– ex: Kératinocytes oraux
Kang et al. 1995
Déterminisme de la sénescence cellulaire
Rôle des séquences télomériques
• Corrélation positive et significative entre la longueur des
télomères en début de culture et le nombre maximum de
doublement de population cellulaire
DPmax
FRT (Kb)
Allsopp et al. (1992)
Déterminisme de la sénescence cellulaire
Rôle des séquences télomériques
• L’expression ectopique de hTERT rend les fibroblastes
primaires immortels en concervant un phénotype normal.
Bodnar, Ouellette et al. (1998)
Morales et al. (1999)
Réactivation de l’activité télomérase dans les
fibroblastes transformés par SV40.
Sénescence (M1)
Crise (M2)
Immortalisation
clone(s) immortalisé(s)
Divisions cellulaires supplémentaires
+
ATM
p53
-
+
+
TSV40
augmentation de
l'instabilité
chromosomique
+
+
réactivation de la
télomerase
-
OFF
+
+
p21 WAF1
p16 INK4a
G1
Addition de motifs TTAGGG
érosion des télomeres
érosion des télomeres
hTERT
G1
S
activité télomérase
S
ON
Méthodes d’estimation de la longueur des
télomères
Support
ADN
génomique
Méthode
Southern
Blot
Sonde
Telomérique
5
Marquage
Chaud
6
32
•Sensibilité : P
•Calibration interne
•Mesure en Kb
•Quantité ADN
•Effet longueur de la
cible
• Smearing non
linéaire
•Non télomère
Ref
1,
2,
3
spécifique
•Subtelo inconnu
•Durée
•Sensible à la
fragmentationde
l’ADN
•Echantillonage
Froid
32
•Pas de P
•Calibration
•idem sonde chaude
•Sensibilité?
4
Interne
ADN
génomique
/Cellules
Slot Blot
Subtelomériq
ue
Chaud
Froid ?
•Telomère
spécifique
•Disponibilité
sonde?
•Homologue
spécifique?
5, 6,
7, 8,
9
Télomérique
+alphoïde (ou
autre)
Chaud
•Quantité ADN
•Calibration externe
pour la longueur
•Hybridation
séquentielle
Quantité totale
10
•min=9ng
•1250 cellules
•Insensible à la
fragmentation de
l’ADN
Métaphase
Noyaux
FISH
FISH
Télomérique
(+autres)
Télomérique
Froid
Froid
(+autres)
Flow
FISH
Télomérique
(+alphoïde)
Froid
•Hybridation
simmultannée
•Télomère
spécifique
•Homologue
spécifique
•Représentativité
métaphases/noyaux
(Culture cellulaire)
•Traitement
informatique lourd
• Calibration
12, 13,
14,
15,
16,
•Calibration
interne.
•Hybridation
externe pour la
longueur ?
•Calibration externe 17
simmultannée
•Quantité de
cellules
pour la longueur
•Focalisation (100x)
•Rapidité
•Cytométrie en flux
18,
19
Méthodes d’estimation de la longueur des
télomères par Southern blot
Analyse de la longueur des FRTs
Principes
RsaI, HinfI
FRT
Digestion enzymatique
Sonde subtélomérique (minisatellite)
S(x)=k•N(x)
Sonde pantélomérique (CCC TAA)n
Migration électrophorétique
(échantillons + calibration)
+
Autoradiographie
S(x)=k•N(x)•L(x)
La distribution de la longueur des télomères
en Southern, est hétérogène.
•
Superposition de la distribution de la longueur de chaque télomère à
l’intérieur de chaque cellule (Hétérogénéïté intracellulaire)
• Superposition de la longueur d’un même télomère d’une cellule à
l’autre (Hétérogénéïté intercellulaire)
Southern-Blot Patients VIH+ vs VIHBET
Individus HIV+
Kb
λ ladder
23
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1.6
Autoradiogramme
Individus HIV-
BET
Plac PY
ladder
Histogramme de la longueur des télomères dans les
lymphocytes au cours de l’infection au VIH
25
Quantité de FRTs (NG/Kb)
VIHVIH+
20
15
10
5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Longueur des FRTs (Kb)
20
22
24
Crise
CRISE
Peteb
TP15.5
Placenta
Hétérogénéité de la taille des télomères
Peteb PB1.2
6 8 15 25 33 50 64 78
Passages
Pl TP 5
8
10 14 19 29 34 40 45 50 56 65
Kb
12
10
8
12
11
10
9
8
7
6
6
4
5
5
4
3
3
2
Méthodes d’estimation de la longueur des
télomères par FISH
Chromosomes métaphasiques:
Estimation de l’hétérogénéïté intracellulaire
Détection des motifs TTAGGG en FISH
Sondes
Sondes
PNA
PNA(CC
(CCCTAA
CTAA)3)3-FITC
-FITC
PNA
PNA(CC
(CCCTAA
CTAA)3)3-Cy3
-Cy3
Directement
Directementfluorescentes
fluorescentes
Spécificité
Spécificitétrès
trèsgrande
grande
Stabilité
Stabilitédes
descomplexes
complexesPNA-DNA
PNA-DNA
Chromosom
Chromosomes
es
DAPI
DAPI (Bandes
(BandesQ)
Q)
Acquisition
Acquisitiondes
desimages
images
CCD
CCD monochromes
monochromes
caméra
caméra8bits
8bits(256
(256niveaux
niveauxde
degris)
gris)
caméra
caméra12bits
12bits(4096
(4096niveaux
niveauxde
degris)
gris)
Localisation des signaux télomériques
HIS sur chromosomes métaphasi ques hum ains, avec une sonde PNA (CCCTAA)3-Cy3
Yq?
2q13-q14
2q13-q14
Hétérogénéïté intracellulaire de la longueur des
télomères dans des fibroblastes primaires (TP P14)
4.0
3.0
80
2.5
70
Cumulated counts
Normalized intensity (q arm)
Sample size=920
90
3.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
60
50
40
30
-0.5
20
-1.0
10
-1.5
-2.0
-2.0
0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Normalized intensity (p arm)
3.5
4.0
4.5
5.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Normalized intensity (10 metaphases)
4.0
4.5
5.0
5 sous classes de télomères
4
Yq
Yp
3
2
1
25.1
Classe I.1
3.35
0
7 qB
11 pA
-0.428
P=0.0069
Classe I
7 pA
6 pA
Classe I.2
6 qA
1 pb
Xp
11 qA
P<0.0001
7 qA
Xq
Classe II.1.1
11 qB
19 qA
19 qB
P<0.0001
Classe II.1
6 pB
19 pA
6 qB
1 qb
Classe II.1.2
Classe II
P<0.0001
19 pB
11 pB
7 pB
1 qa
Classe II.2
1 pa
confirmation de l’hétérogénéité de longueur des télomères (southern)
Analyse de la distribution sur chromosomes
métaphasiques
• Requiert
– une culture cellulaire
– un caryotypage (identification de chaque télomère)
• Permet
– de distinguer les chromosomes homologues
– de suivre le devenir d’un seul télomère
Méthodes d’estimation de la longueur des
télomères par FISH
• Sur noyaux : à un fort grandissement (100X)
– Hétérogénéïté intracellulaire
– Hétérogénéïté intercellulaire
• Sur noyaux : à un faible grandissement (20X)
– Hétérogénéïté intercellulaire
Fibroblastes primaires TP P14 (X100)
Fort
Faible
DAPI
Sonde Cy3-(CCCTAA)3
Fibroblastes Transformés par LTSV40
TP15.5 P9-avant crise (X100)
DAPI
Sonde Cy3-(CCCTAA)3
Fibroblastes Transformés par LTSV40
TP15.5 P55 P >> crise (X100)
DAPI
Sonde Cy3-(CCCTAA)3
Noyaux de fibroblastes à un faible grandissement (20X)
TP P14
DAPI
Sonde Cy3-(CCCTA A)3
TP15.5 P11
DAPI
Sonde Cy3-(CCCTA A)3
Noyaux de fibroblastes à un faible grandissement (20X)
TP15.5 P55
Spots homogènes
DAPI
Sonde Cy3-(CCCTA A)3
Le FISH sur noyaux permet de
quantifier les spots télomériques
• comparaison des télomères de cellules
– d’un même donneur
– de donneurs différents
• centaines de noyaux suffisants
– minicultures cellulaires directement sur une lame de
microscope.
– étalonnage avec des cellules de FRT moyen connu.
Diagramme pter-qter
Recherche d’une différence de longueur des télomères entre
les chromosomes homologues:
Cas des chromosomes 1 dans les fibroblastes TP (P14).
Chromosome 1 (Passage P14)
1.0
Métaphase
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1qter *
0.5
0.0
A
-0.5
B
-1.0
-1.5
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1pter*
Construction d’un tableau métaphase-ligne :
Tri des télomères des groupes A et B
2 groupes : -> distribution aléatoire?
-> paternel / maternel
Distinction des chromosomes 1 homologues
Association du marquage télomérique faible au marquage
hétérochromatique foncé (P=0.08)
Recherche d’hétéromorphismes
télomériques
-2 -1 0
1
2
3
4
5
-2 -1 0
1 2
3
4 5
-2 -1 0 1
2
3
4 5
4
3
1
2
3
4
5
2
1
0
-1
-2
4
6
7
8
9
10
3
2
1
0
-1
4
3
-2
11
12
13
14
15
2
1
0
-1
-2
4
16
17
18
19
20
3
2
1
0
-1
4
3
-2
21
22
X
Y
2
1
0
-1
-2
-2 -1 0
1
2 3
4
5
-2 -1 0
1
2
3 4 5