obtention de pieds néoformés suite à l`induction de cals

195
Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2005, 144, 195-210
OBTENTION DE PIEDS NÉOFORMÉS
SUITE À L’INDUCTION DE CALS EMBRYOGÈNES
D’EMBRYONS ZYGOTIQUES DE BLÉS
PAR LE BORATE DE SODIUM
ET UN EXTRAIT DE FUSARIUM GRAMINEARUM(*)
Rachid KARIM
(1)
, H assan CHLYAH ( 1 ) , Alain BADOC
All al DOUIRA ( 3 )
(2)
,
Quatre milieux de culture ont été testés sur la variation
somaclonale chez le Blé tendre ‘Nesma 149’ et le Blé dur ‘Karim’
à partir de cals embryogènes issus de la culture d'embryons
zygotiques immatures.
Le milieu MS conduit à la régénération de pieds semblables
à ceux issus de semis. Les milieux renfermant le borate de sodium
à concentration toxique ou bien l’extrait de F u s a r i u m
graminearum donnent des pieds plus petits. La combinaison du
borate de sodium et de l’extrait fongique conduit à une importante
variation somaclonale et fournit des pieds viables, mais peu
développés. Par rapport au témoin semis, aucune amélioration de
la vigueur n’est observée.
(*)
(1)
(2)
(3)
Manuscrit reçu le 26 mai 2005.
Laboratoire de Physiologie végétale, Département de Biologie, Faculté des
Sciences, Université Mohamed V, av. Ibn Battouta, BP 1014, 10000 Rabat, Maroc.
[email protected]
Laboratoire de Mycologie et Biotechnologie végétale, GESVAB – EA 3675,
Faculté des Sciences pharmaceutiques, Université Victor-Segalen Bordeaux 2,
146, rue Léo-Saignat, 33076 Bordeaux Cedex. [email protected]
Laboratoire de Botanique et de Protection des Plantes, Département de Biologie,
Faculté des Sciences, Université Ibn Tofaïl, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc.
[email protected]
196
INTRODUCTION
La culture in vitro de tissus de Blés peut s’accompagner de la
formation de cals. Ces derniers peuvent devenir embryogènes et conduire à
la formation de pousses.
Le rendement en cals et en embryons somatiques dépend de la nature
des explants [28 ]. Des explants généralement jeunes sont utilisés. Ce
peuvent être des inflorescences jeunes [2,4,22,25,34,45,etc.], des embryons
immatures [3-4,24,26,30,34,38-40,etc.] des bases de tige [40].
Le rendement dépend aussi du choix du génotype [12,38,42]. Dahiya
et al. [10] ont retenu le Blé tendre ‘HD 2009’, alors que d'autres variétés ont
été utilisées par d’autres auteurs [14,17]. Plusieurs variétés de Blé dur sont
souvent testées dans un même travail pour choisir celles qui répondent le
mieux aux facteurs étudiés [2,4,22,45].
On emploie habituellement des auxines. Dahiya et al. [10] ont utilisé
le 2,4,5-T (acide 2,4,5-trichlorophénoxyacétique) et l’AIA à 0,2 mg/l. Pour
Immonen [23], l'auxine dicamba (Banvel®, auxine synthétique herbicide) a
donné les meilleurs résultats. Des repiquages successifs avec du 2,4-D
(acide 2,4-dichlorophénoxyacétique) à 2,5 mg/l permettent la croissance et
le développement de cals pendant de longues périodes allant jusqu'à trois
ans [41]. Le nombre de cycles de culture in vitro peut induire une variation.
Une cytokinine permet d’augmenter la quantité de cals et
d’embryons somatiques [8]. On utilise souvent la BA (benzylaminopurine)
[9] ou la kinétine. Le cal scutellaire se développe bien en présence de
6-furfurylaminopurine [5].
L’ajout, au milieu de culture de substances pouvant influencer la
callogenèse et l’embryogenèse somatique est rapporté par quelques auteurs.
Mathias et Simpson [27] ont augmenté la quantité de cal en utilisant du lait
de coco. Hashim et al. [18 ] ont doublé la teneur du milieu MS [29 ] pour
augmenter le rendement en pousses néoformées. Des extraits de pomme de
terre [15,44], de malt [15], de graines immatures de Blé [44] ont été testés
pour améliorer le rendement en embryons somatiques.
Le polyéthylèneglycol, qui réduit le potentiel hydrique externe, a
permis d’obtenir des plantules de Blé dur tolérantes à la sécheresse [22].
Différentes concentrations de chlorure de sodium ont été utilisées pour
197
obtenir des variétés de Blé tolérantes [32-33,45,etc.]. Le sorbitol a été ajouté
au milieu de culture pour induire une embryogenèse somatique [37].
L'addition d’azide de sodium (toxique) et d’ESM (éthyl-éthanesulfonate, mutagène) se sont avérés efficaces pour produire une grande
quantité de variants. Les radiations gamma ont donné le même résultat, mais
ont conduit à des variants sans intérêt agricole [6].
Certains facteurs physiques, comme la température [28 ], jouent
encore un rôle important dans la régénération des embryons somatiques en
plantules.
L'addition d'extraits fongiques au milieu n’a jamais été réalisée à
notre connaissance chez le Blé dur. Elle a été faite chez le Blé tendre en vue
d'obtenir des Blés résistants aux agents pathogènes [1,13,31,46 ]. Elle ne
semble jamais avoir été réalisée pour l’obtention de variations
somaclonales.
Le borate de sodium (Na2B4O7, 10 H2 O = borax) est utilisé
couramment comme sel de conserve, agent fongistatique. On l’emploie
fréquemment comme engrais à faibles concentrations.
L'objectif de ce travail est d'étudier l'effet de l'extrait fongique de
Fusarium graminearum et du borate de sodium à concentration toxique,
combinés ou non, sur l’induction de variations somaclonales chez le Blé
tendre et le Blé dur.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Les grains de Blé tendre (Triticum aestivum L.) var. Nesma 149 ont
été fournis par la station de Merchouch à Rommani au Maroc. Ceux de Blé
dur (Triticum durum Desf. = T. turgidum subsp. durum (Desf.) Husnot) l’ont
été par le Service de contrôle des semences de Guich de Rabat.
Une série de plantes témoins est obtenue par semis des grains de ces
deux espèces dans des pots en plastique (25 cm de diamètre) contenant un
mélange de sable et de terreau (1:4). Les plantes développées sont
maintenues sous serre et arrosées avec la solution nutritive d’Hogland [21]
jusqu’au stade 11-Z71 de l’échelle de Fecks et Zadock [43], qui illustre les
stades de croissance des céréales. À ce stade, on est à trois mois du semis, il
y a formation des épis et les feuilles commencent à tomber.
198
Les embryons immatures sont obtenus à partir d’une vingtaine de
plantes issues d’un semis de grains réalisé à l’INRA de Guich. Les épis
formés par ces plantes sont récoltés 14 jours après anthèse [3,35], ce qui
correspond au stade 10-Z59 de l’échelle de Fecks et Zadok [43 ]. Les
embryons immatures ont alors atteint une taille comprise entre 1 et 1,5 mm.
Les grains sont désinfectés par passage 30 secondes dans l'éthanol 70° et 20
minutes dans l'hypochlorite de calcium 7 %, puis rincés à l’eau distillée
stérile. L’extraction des embryons zygotiques est réalisée dans des boîtes de
Petri sous hotte à flux laminaire et sous UV.
Quatre milieux de culture ont été testés pour la production
d’embryons zygotiques, à raison de 50 tubes à essais de 15 mm de diamètre,
remplis de 20 ml de milieu. Ils font tous intervenir le milieu MS [29],
additionné de 2,5 mg/l de 2,4-D et 2,5 mg/l de BA et ajusté à pH 5,8 avant
autoclavage et deux d’entre-eux sont à double couche [1] :
A : milieu MS.
B : milieu MS additionné de borate de sodium à 1 g/l, concentration
toxique pour la plante.
C : constitué d’une couche de milieu PDA portant l’extrait fongique,
surmontée d’une couche de milieu MS.
D : constitué d’une couche de milieu PDA portant l’extrait fongique,
surmontée d’une couche de milieu MS additionné de 1 g/l de
borate de sodium.
La souche de Fusarium graminearum Schwabe, champignon causant
la pourriture des racines de Blé, a été aimablement fournie par l’INRA de
Settat au Maroc. Les cultures de F. graminearum sont réalisées en tubes à
essais sur PDA [Potato Dextrose Agar] à partir de pastilles de 2 mm de
diamètre et incubées une semaine à 25°C à l’obscurité. Après autoclavage
20 minutes à 120°C sans filtration, on obtient le milieu PDA portant l’extrait
fongique.
Les embryons zygotiques peuvent être cultivés scutellum face au
milieu [19], mais nous avons préféré les placer face embryonnaire en contact
avec le milieu de culture, ce qui ne gêne pas la formation des cals par le
scutellum [4,20] et le pôle apical de l’embryon [37]. Ils sont cultivés avec
une photopériode de 16 heures à 25 ± 2°C le jour et 22 ± 2°C la nuit, à une
humidité relative de 65 %. On observe une callogenèse et une
embryogenèse à partir de la quatrième semaine [3,35].
199
Le pourcentage de callogenèse a été établi à partir du nombre
d’embryons présentant un grand nombre de cals et / ou un volume de cal
important.
Le pourcentage d’embryogenèse a été calculé par le rapport du
nombre de tubes présentant un ou plusieurs cals embryogènes au nombre de
tubes présentant un ou plusieurs cals.
Les cals embryogènes ont été repiqués au bout de deux semaines.
Une ou deux autres cultures de 2 semaines peuvent être nécessaires pour
supprimer des cals qui se nécrosent. Les pousses vertes enracinées sont
transférées sous serre et cultivées dans les mêmes conditions que les pieds
issus de grains. Elles sont arrosées jusqu’au stade 11-Z71 de l’échelle de
Fecks et Zadok [43].
Le pourcentage de maturité est calculé par le nombre de plants
atteignant le stade d’épiaison par rapport aux cals embryogènes ayant
régénéré des pousses.
Plusieurs caractères ont été suivis sur les pieds régénérés ou issus de
semis au stade épiaison : longueur moyenne des racines, tiges, feuilles et
épis, nombre moyen de racines, feuilles (y-compris celles qui commencent à
se dessécher), épis et grains.
La détermination de la densité stomatique foliaire a été effectuée sur
trois feuilles prélevées au sommet, au milieu et à la base des pieds au début
du stade 11-Z71 de l’échelle de Fecks et Zadok [43]. Pour chaque feuille,
trois échantillons d’épiderme de la face inférieure près de la nervure centrale
sont observés. Le décompte du nombre de stomates est réalisé au
microscope sur un champ de 0,16 mm2.
Le poids de 50 grains est calculé à partir des grains de l’ensemble
des épis d'une même condition de culture.
Une estimation du rendement en poids de grains par pied est obtenue
à partir du nombre d’épis par pied, du nombre de grains par épi et du poids
de 50 grains.
Le pouvoir germinatif est estimé à partir de 50 grains stérilisés 30
secondes à l’éthanol 70°, 20 minutes à l’hypochlorite de calcium 7 %, lavés
à l’eau distillée stérile, ensemencés dans des boîtes de Petri contenant des
rondelles de papier filtre et mis à germer 72 heures à 25°C le jour et 22°C la
nuit avec une photopériode de 16 heures.
200
RÉSULTATS
Callogenèse et embryogenèse
La culture des embryons immatures face embryonnaire en contact
avec le milieu a favorisé la prolifération de cals compacts blancs
embryogènes à partir du scutellum et du pôle apical des embryons. Le cal
scutellaire se développe bien en présence de 2,5 mg/l de BA. Le 2,4-D à
2,5 mg/l favorise la formation de cals compacts blancs et embryogènes.
Chez le Blé tendre, avec le milieu MS, 98 % des explants ont donné
des cals (Tableau I) dont 92 % sont embryogènes, compacts et blancs. Les
autres sont mous, friables ou nécrosés. Les embryons somatiques sont de
grande taille, globuleux et en forme de cœur. 98 % d’entre eux ont donné
des plantules normales et vigoureuses dont 95 % ont atteint la maturité.
Tableau I :
Caractéristiques de la culture d’embryons somatiques de deux Blés.
A
Plante issue du milieu
B
C
D
Blé tendre ‘Nesma 149’
Pourcentages de :
callogenèse
98
88
72
90
embryogenèse
92
65
42
75
régénération
98
48
54
78
maturité
95
25
82
53
callogenèse
95
74
90
96
embryogenèse
89
74
45
72
régénération
83
48
42
57
maturité
76
33
45
19
pouvoir germinatif
67
25
43
19
Blé dur ‘Karim’
Pourcentages de :
A : Murashige et Skoog [29]
B : MS + 1 g/l borate de Na
C : bicouche PDA + extrait fongique / MS
D : bicouche PDA + extrait fongique / MS + borate de Na
201
L’addition de borate de sodium conduit à une diminution du nombre
de cals. Seulement 65 % d’entre eux sont compacts, blancs, et forment des
embryons somatiques de petite taille en forme de cœur aplati. Un repiquage
a été réalisé pour éliminer 10 % de cals nécrosés. Le taux de régénération
est faible et peu de plantules atteignent la maturité.
Pour le milieu couche C, on a 88 % de cals, dont 42 % sont compacts
blancs et embryogènes, les autres étant friables, transparents, avec beaucoup
de racines enchevêtrées. Les cals compacts ont été repiqués trois fois à
cause d’un fort taux de nécrose (25 %) et donnent des embryons somatiques
de petite taille, globuleux, qui ne régénèrent des plantules que dans 54 %
des cas dont 82 % atteignent la maturité.
Le milieu D donne 90 % de cals dont 75 % sont compacts blancs et
embryogènes, les autres étant transparents, mous et mélangés avec des
racines poilues. Un seul repiquage a été nécessaire pour éliminer 2 % de
cals nécrosés. Les embryons somatiques sont nombreux, gros et globuleux.
78 % d’entre eux régénèrent en plantules dont 53 % atteignent la maturité.
Pour le Blé dur (Tableau I), sur le milieu A, 95 % des cultures ont
donné des cals dont 89 % sont compacts, blancs et embryogènes et
présentent des embryons somatiques plus ou moins sphériques. 83 % d’entre
eux ont régénéré rapidement des plantules normales et vigoureuses, mais qui
n’atteignent la maturité que dans 75,6 % des cas.
Sur le milieu B, seulement 74 % des cultures sont callogènes, avec
des cals blancs embryogènes comportant des embryons somatiques aplatis et
non transparents. 47 % des embryons ont régénéré des plantules enracinées,
dont 33,4 % ont atteint la maturité.
Sur le milieu C, 90 % des cultures ont donné des cals soit friables,
mous, transparents, soit, dans 45 % des cas, compacts, blancs et fortement
embryogènes. Ces derniers doivent être repiqués une fois car ils tendent à se
nécroser et devenir bruns. Les embryons somatiques sont de petite taille et
de deux types. Ceux qui sont sphériques régénèrent précocement, et ceux
qui sont cordiformes et allongés régénèrent tardivement. 41 % des embryons
des deux types ont donné des plantules avec des feuilles portant des petites
taches blanches et peu de racines. Après repiquage en pots, elles reprennent
de la vigueur, et 45 % atteignent la maturité.
Pour le milieu D, le rendement en cals est élevé et 71 % des cals sont
blancs et embryogènes, les autres étant mous, transparents et mélangés avec
des racines parfois poilues. Les embryons somatiques sont globuleux et de
202
taille moyenne. 56 % d’entre eux donnent, parfois précocement, des
plantules viables, qui atteignent la maturité dans seulement 19 % des cas.
Caractéristiques des pieds régénérés
Les pieds de Blé tendre obtenus à partir du milieu A diffèrent peu de
ceux issus de semis (Tableau II). On observe une réduction significative de
la longueur de la tige et du nombre de grains par épi, mais au final, le
rendement en grains est identique.
Tableau II :
Caractéristiques des pieds de Blé tendre ‘Nesma 149’ régénérés.
Plante issue de :
semis
Milieu
A
milieu B milieu C milieu D
Nombre de racines
6,7
4,4
4,2
10,8
4,0
Longueur des racines (cm)
5,0
6,2
4,3
8,8
5,5
62,0
52,4
45,0
47,0
40,7
6,0
5,3
4,0
6,0
3,0
Longueur des feuilles (cm)
31,7
19,2
15,0
17,5
10,8
Nombre de stomates
foliaires / mm2
225
156
141
89
Nombre d’épis / pied
3,9
Longueur des tiges (cm)
Nombre de feuilles
196
3,75
1,1
1,8
0,9
Longueur d’un épi (cm)
12,5
13,1
8,3
14,7
6,8
Nombre de grains / épi
50,9
45,1
38,2
40,3
24,3
Poids de 50 grains (g)
2,0
2,3
1,1
2,8
0,3
Estimation du rendement en
grains / pied (g)
7,8
7,8
0,9
3,9
0,1
A : Murashige et Skoog [29]
C : bicouche PDA + extrait fongique / MS
B : MS + 1 g/l borate de Na
D : bicouche PDA + extrait fongique / MS + borate de Na
203
Les plantes issues du milieu B ont développé moins de racines et
sont chétives. La longueur des feuilles et des tiges et le nombre et la
grosseur des épis ont diminué.
Avec le milieu C, les racines sont bien développées, mais la
croissance est lente. Certaines feuilles présentent des taches blanches très
petites. La longueur des tiges, le nombre d’épis par pied et de grains par épi
sont réduits alors que la longueur des épis et le poids de 50 grains sont
augmentés.
Les plantes issues de D apparaissent vigoureuses avec des racines
développées, mais forment peu de grains.
Les pieds de Blé dur sont plus petits et présentent moins d’épis
(Tableau III).
Tableau III :
Caractéristiques des pieds de Blé dur ‘Karim’ régénérés.
Plante issue de :
semis
milieu A milieu B milieu C milieu D
Nombre de racines
7,8
6,8
5,3
3,8
5,1
Longueur des racines (cm)
4,8
5,8
4,0
3,5
5,3
35,3
37,8
28,3
32,7
23,5
5,8
5,4
3,0
4,7
2,8
19,7
22,3
9,2
14,7
8,1
Nombre d’épis / pied
1,5
0,3
0,3
1,6
0,3
Longueur d’un épi (cm)
8,2
8,9
5,2
7,9
5,7
Nombre de grains / épi
35,2
42,8
29,7
31,8
23,9
Poids de 50 grains (g)
1,3
1,0
1,2
1,1
0,5
Estimation du rendement en
grains / pied (g)
1,4
0,2
0,2
1,1
0,1
Longueur des tiges (cm)
Nombre de feuilles
Longueur des feuilles (cm)
A : Murashige et Skoog [29]
B : MS + 1 g/l borate de Na
C : bicouche PDA + extrait fongique / MS
D : bicouche PDA + extrait fongique / MS + borate de Na
204
Les plantes régénérées à partir du milieu A forment beaucoup moins
d’épis avec des grains moins lourds que les plantes issues de semis.
Les plantes issues du milieu B présentent une diminution de la
longueur des tiges, des feuilles, des épis ainsi que du nombre de grains par
épi.
Pour le milieu bicouche C, le nombre d’épis par pied est
relativement élevé et les pieds sont relativement bien développés.
Sur le milieu D, les pieds sont de petite taille et forment des grains
peu nombreux et légers, d’où un rendement en poids de grains extrêmement
faible.
DISCUSSION ET CONCLUSION
L’utilisation de 2,5 mg/l de 2,4-D et de BA semble favorable à la
production de cals compacts blancs embryogènes en accord avec la
littérature [35,41].
Le Blé tendre ‘Nesma 149’ a fourni un bon rendement en cals
compacts blancs embryogènes en accord avec des travaux précédents [9].
Alors que les inflorescences immatures de Blé dur ‘Karim’ ont donné peu
de cals (20 %) et pas de régénération [2], les embryons immatures ont fourni
une callogenèse et une embryogenèse satisfaisantes. On voit ici
l’importance du choix des explants.
Le comportement des deux types d’embryons somatiques observés
chez le Blé dur, sphériques régénérant rapidement et allongés et cordiformes
régénérant tardivement a aussi été observé par Ozias-Akins et Vasil [34].
Dahleen et McCormick [11] ont mis en évidence un faible effet sur la
callogenèse de l’Orge du désoxynivalénol (= vomitoxine), un des
trichothécènes toxiques inhibant la synthèse protéique formé par le genre
Fusarium. Ceci ne contredit pas nos résultats : les milieux C et D, qui
présentent l’extrait fongique de Fusarium graminearum, n’ont pas un
pourcentage de callogenèse très différent du milieu MS.
La culture in vitro donne des pieds régénérés de Blé tendre similaires
aux pieds issus de semis. La réduction de la longueur de la tige et du
nombre de grains / épi obtenue pour le Blé tendre a été rapportée également
par Guenzi et al. [16 ]. Par contre, Dahiya et al. [10 ] ont obtenu une
augmentation du nombre de grains en utilisant le 2,4,5-T pour le Blé tendre
‘HD 2009’.
205
Pour le Blé dur, on a nettement moins d’épis d’où un rendement en
grains beaucoup plus faible. La régénération issue de cals embryogènes est
souvent affectée de vitro-variations [12,24,26,36,38-39] rarement suivies d’un
avantage économique. Cheng et al. [7] ont obtenu par culture in vitro de 35
génotypes de Blé dur une diminution de la grosseur des épis transmissible
génétiquement. L’utilisation du 2,4-D comme auxine de synthèse favorise
peut-être un trop grand nombre de mutations.
La toxicité du borate de sodium dans le milieu B et la présence de
toxines fongiques thermostables dans le milieu C peuvent expliquer les
variations significatives observées par rapport au milieu A. La combinaison
du borate de sodium et des toxines fongiques dans le milieu D conduit à des
pieds très peu productifs pour les deux Blés.
Dahleen et McCormick [11 ] ont mis en évidence une moindre
croissance des racines des plantules d’Orge en présence du désoxynivalénol
du genre Fusarium. Si le nombre et la longueur des racines de Blé dur sont
plus faibles en présence du milieu PDA avec l’extrait fongique, les racines
du Blé tendre sont particulièrement nombreuses et bien développées pour le
milieu C. Le Blé tendre réagit donc positivement à l’extrait, ce qui pourrait
signer l’acquisition d’une résistance.
Les deux éléments étudiés, biologique (extrait fongique) et chimique
(borate de sodium), ont donné, seuls ou combinés, des vitro-variations
viables puisqu’on obtient des pieds qui fleurissent et fructifient et pourraient
fournir des lignées somaclonales. Cependant, ces pieds sont moins
vigoureux que les témoins et ne permettent pas d’envisager d’éventuelles
améliorations agronomiques.
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ABSTRACT
Obtaining neoformed shoots following induction of embryogenic
calluses of wheat zygotic embryos by sodium borate and by a Fusarium
graminearum extract
Four culture media were tested on a somaclonal variation of ‘Nesma
149’ soft wheat and ‘Karim’ hard wheat from embryogenic callus derived
from zygotic immature embryos.
The MS medium led to regeneration of shoots similar to those of
seedlings. Media including sodium borate at a toxic concentration or
Fusarium graminearum extract gave smaller shoots. The combination of
sodium borate and fungal extract gave an important somaclonal variation
and provided viable but sparse developed shoots. Compared to the
seedlings, no improvement in vigour was observed.
Key-words: sodium borate, somaclonal variation, somatic embryogenesis,
Fusarium graminearum, Triticum aestivum, Triticum durum
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