carbonate buffer

—
102
—
UTILISATION D'UN SYSTÈME
TRIS-GLYCOCOLLE
POUR TAMPONNER LE DILUEUR
D'INSÉMINATION POUR TRUITE
p a r R.
Laboratoire
I.N.R.A.,
de
BILLARD
Physiologie
78350
des
Poissons
JOUY-EN-JOSAS,
France
INTRODUCTION
L'avantage
des solutions
nidés est c o n n u depuis
ramment
salines
longtemps,
en salmoniculture.
m e n t é l e v é s ( p H 9 à 9,5) ( P E T I T e f al.,
pour
à
dilueur
fabrication
d'un
l'insémination
elles
n'avaient
La d é m o n s t r a t i o n
carbonate-bicarbonate
la
pour
mais
stabiliser
de
artificielle
jamais
l'effet f a v o r a b l e
1973) e t l ' u t i l i s a t i o n
ce
utilisable
pH
en
été
(BILLARD
et
pisciculture.
des
Salmo-
utilisées
de
pH
de t a m p o n à base
al.,
Le
1974)
dilueur
de
l'emploi
la
nature
d'eaux
du
tampon
minéralisées.
d i s t i l l é e e t le f a i t q u e
pérature
ambiante
et
La
des
risques
difficulté
de
de
précipitation
disposer
dans
que
la
conduit
est
préparé
ont
conduit
à rechercher
un
tampon
compte
présenterait
pratique
le b i c a r b o n a t e e s t s u s c e p t i b l e d e s e d é c o m p o s e r
nous
de
ont
e x t e m p o r a n é m e n t par addition d'eau qui doit n é c e s s a i r e m e n t être distillée,
tenu
cou-
relative-
d'eau
à la
tem-
susceptible
d'être
m é l a n g é d i r e c t e m e n t à l'eau de s o u r c e o u de r i v i è r e dans laquelle l ' i n c u b a t i o n
sera
pratiquée. Les investigations
base
de
glycocolle
sperme
dont
l'effet
de Truite avait
M A T E R I E L ET
ont été décrites
1974b).
cultures
Les
géniteurs
privées
sur
précédemment
et d o u b l e
générales
dans
mâles
les
et
et e n t r e n t a u
effets des dilueurs
simple
favorable
sur un s y s t è m e t a m p o n
la
été
conservation
montré
de
(BILLARD
organique
la
à
fécondance
e t al.,
du
1974b).
METHODES
Les conditions
taux
ont porté
d'insémination
publications
femelles
laboratoire
(Salmo
avant
s u r la s u r v i e d u s p e r m e
dilution
(BILLARD
et d ' i n c u b a t i o n
précédentes
gairdneri)
la p é r i o d e
ont été testés
et JALABERT,
en
lots
(BILLARD
proviennent
de
par
expérimen-
e t al.,
de
1974a,
pisci-
reproduction.
les t e c h n i q u e s
1974).
Article available at http://www.kmae-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/kmae:1977013
Les
de
—
Brièvement
le
sperme
est
—
103
mélangé
aux
différents
dilueurs
et
l'ensemble
s p e r m e - d i l u e u r e s t ajouté aux o v u l e s secs (technique de simple dilution) ou préalablement
dilués
dans
le
dilueur
Les dilueurs d'insémination
pression
osmotique
finale
carbonate-bicarbonate
(posm)
0,02
d'insémination
utilisés
M
(technique
de
final
250
mosmol
(BILLARD
et
et
al.,
un
pH
1974b)
t a m p o n de référence et comparé au système Tris-glycocolle
tives
variables
(cf.
de
double
F i g . 1). D ' a u t r e s
dilueurs
décrits
d e 9,0.
a été
1974),
ainsi
que
fères
du
liquide
coelomique
balancé (Milieu
(MENEZO,
naturel,
B 2) u t i l i s é p o u r
du
une
système
utilisé
comma
de molarités
respec-
précédemment
plasma
par
Le
ont
l i s é s ( r e c o n s t i t u t i o n m i n é r a l e du l i q u i d e s é m i n a l : M M L S ) ( B I L L A R D et
synthétique
dilution).
sont à base de N a C I et c a r a c t é r i s é s
sanguin
été
uti-
JALABERT,
et
un
les c u l u t r e s d e f o l l i c u l e s d e
milieu
Mammi-
1976).
L e s e f f e t s d e s d i f f é r e n t s d i l u e u r s s o n t m e s u r é s p a r le p o u r c e n t a g e d e f é c o n dation.
œufs
Ce
à
dernier
10° C
embryonnés,
établi
pendant
mais
à
100
10 j o u r s ,
représente
degrés-jour,
correspond
assez
c'est-à-dire
en
fidèlement
réalité
le
après
au
incubation
pourcentage
pourcentage
de
des
d'œufs
fécondation.
L ' a n a l y s e s t a t i s t i q u e e s t f a i t e p a r a n a l y s e d e v a r i a n c e o u t e s t t, a p r è s t r a n s angulaire
Fécond.(p. 100)
formation
des
pourcentages.
Dil. IA Tompons
;
A Glyc. 0,05 M Tris 0,05 M
•
0,02
0,02
o
0,05
0,02
*
0,02
0,05
• Carb . bicarb . 0,02 M
Taux de dilution
Figure
1 - Evolution
d'ovules
différents
du
dans
pourcentage
un
dilueur
Tris-glycocolle
de
fécondation
dont
et
le
pH
est
obtenu
stabilisé
carbonate-bicarbonate.
après
par
insémination
des
tampons
—
104
—
RESULTATS
A.
- Utilisation
du
système
d a n s le d i l u e u r d ' i n s é m i n a t i o n
Les comparaisons
nate
sont
présentées
avec
le s y s t è m e
mais
l'analyse
Tris-glycocolle
e n t r e les s y s t è m e s
dans
la f i g u r e
Tris-glycocolle
de
tampon
variance
à différentes
e t e f f e t sur le p o u r c e n t a g e
1. Les
utilisé
ne
montre
aux
de
Tris-glycocolle
et
résultats
légèrement
molarités
pas
d'effet
sont
molarités
fécondation
Carbonate-bicarbosupérieurs
intermédiaires
0,05-0,02
significatif
au
dû
M,
système
tampon.
Une comparaison
0,05
aussi
e t T r i s 0,02
( F i g . 2) u n e
que
M
entre deux dilueurs différents tamponnés
e t le s y s t è m e
légère
l'analyse
de
supériorité
variance
ne
Carbonate-bicarbonate
du
dilueur
permette
tamponné
de dégager
de
par
un
avec
glycocolle
référence
le
montre
Tris-glycocolle,
effet
dû
au
dilueur.
Fécond
(p.100)
sans
M
O
Dil
•
I A T G
I A
•
C B
M M L C T G
Toux
Figure 2 - Pourcentage
dilueurs pour
DIATG
de
fécondation
de
dilution
observé
du
après
utilisation
de
différents
l'insémination.
et o s : d i l u e u r d ' i n s é m i n a t i o n
à base de N a C I
s y s t è m e t a m p o n T r i s C.C2 M - g l y c o c o l l e 0.C5 M
bonate ( e n ) .
sperme
(TG) e;
posm 250, pH
9,
carbonate-bicar-
—
B
a
le s y s t è m e
servi
de
dilution
de
du pouvoir fécondant
Tris-glycocolle
tampon.
10
: f
et
10
L'effet
1
10
:i
10
1
est meilleure
dans
est
le d i l u e u r
hautement
où
dans
le
le d i l u e u r
3)
tamponné
carbonate-bicarbonate
significatif
pour
les
taux
de
1).
dl
Somme des
carrés
dilueur
temps
résiduelle
4
3
12
415.40
1 076.40
1 042.60
103.85
358.80
86.88
dilueur
temps
résiduelle
4
3
12
3 929.80
648.55
870.20
982.45
216.18
75.52
13.01***
2.86
dilueur
temps
résiduelle
4
3
12
4 029.95
1 338.00
1 030.25
1 007.24
446.00
85.85
11.73***
5.19*
P < 0.05
Tableau
que
dilueur
(tableau
dilution
10 -
—
- Effet du s y s t è m e t a m p o n sur la s u r v i e d e s s p e r m a t o z o ï d e s ( F i g
La c o n s e r v a t i o n
avec
105
* * : P < 0.01
Carré
***: P <
F
moyen
1.20
4.13*
0.001
1 : A n a l y s e d e v a r i a n c e d e s effets d e la n a t u r e du d i l u e u r e t d e la d u r é e
d e la d i l u t i o n du s p e r m e dans le d i l u e u r a v a n t i n s é m i n a t i o n .
de
la f i g u r e
1.
Données
—
106
Dil. IA. T a m p o n s
GlycO,05M
TrisO,05M
0,02
0,05
0,02
0,02
0,02
0,05
0,02
M
Fécond
(p.
100)
Carb. bicarb
1
I n t e r v a l l e d i l u t i o n d u s p e r m e - lnsemination( mn)
Figure 3 - Evolution
du pouvoir
fécondant
du sperme
après
dilution
dans
diffé-
r e n t s milieux ; t e c h n i q u e d e s i m p l e d i l u t i o n ; m ê m e s d i l u e u r s q u e dans
la f i g u r e 1 .
—
Le dilueur
comparé
le p l u s f a v o r a b l e
avec d'autres
milieux:
107
—
( g l y c o c o l l e 0,05 M , T r i s 0,02
plasma sanguin et milieu
B2
M : DIATG)
( F i g . 4 ) . Il
q u e ces deux derniers milieux, beaucoup plus complets, n'assurent
pas une
l e u r e c o n s e r v a t i o n q u e D I A T G . La c o m p a r a i s o n d e D I A T G a v e c le l i q u i d e
naturel
est
présentée
dans
la
tozoïdes est aussi élevé dans
pour
des
durées
d'exposition
figure
5. L e
maintien
de
la s u r v i e
dépassant
pas
8
minutes.
Pour
été
meil-
coelomique
des
sperma-
le D I A T G que d a n s le l i q u i d e c o e l o m i q u e , a u
ne
a
apparaît
les
moins
taux
de
d i l u t i o n p l u s é l e v é s ( 1 0 ' ) , le D I A T G e s t m ê m e p l u s f a v o r a b l e a u - d e l à d e 8 m i n u t e s .
L a c o n s e r v a t i o n e s t m e i l l e u r e d a n s le l i q u i d e c o e l o m i q u e a u m o i n s p o u r les f a i b l e s
dilutions
(10"-').
dil.
IA
T G
Fécond, (p.
100)
Plasma sang.
I n t e r v a l l e d i l u t i o n du s p e r m e - insémination (mn)
Figure 4 - Evolution
du
pouvoir
dilueur d'insémination
fécondant
tamponné
du
sperme
après
dilution
p a r g l y c o c o l l e 0.05 M
dans
le
e t T r i s 0.02
M
( D I A T G ) * d u p l a s m a s a n g u i n o e t milieu b a l a n c é B2 A ( M E N E Z O , 1 9 7 6 ) .
—
Dans
une expérience
108
—
complémentaire,
la c o m p a r a i s o n
entre
liquide
coelo-
m i q u e et D I A T O a été faite par les t e c h n i q u e s de s i m p l e et d o u b l e dilutions.
la t e c h n i q u e
partie
pour
des
de
simple
spermatozoïdes
les faibles
dilueur
dilution,
dilutions
aux oeufs
peut
et
puisque
ne
utilisée
dans
ne
avoir
pas
l'est pas
l'insémination
les
été
lors de
est
plémentaire. Les résultats
de
dilution
liquide
la
périodes
supériorité
d'exposition
dilutions est moins
du
bonne
que dans
mouvement,
du
mélange
à sec. Dans
E
aux
la t e c h n i q u e
faibles
le D I A ™ la s u r v i e
même
E
de
dilutions
de
et
du sperme
la
lors
sup-
simple
pour
des
aux
fortes
le c a s p r é c é d e n t (Fig. 5 ) . L'utilisation
d e la
ne m o d i f i e pas s e n s i b l e m e n t
à une
e t la 1 2 0 m i n u t e d ' e x p o s i t i o n
sperme-
le c a s
les résultats en c e
reprise
de
ce
pouvoir
qui
prolongation
fécondant
entre
(Fig. 6 ) .
Fécond.( p. 100)
la 6 0
une
surtout
d u f a i t d e la d i l u t i o n
avec
c o n c e r n e le D I A T G , m a i s o n a s s i s t e a v e c le l i q u i d e c o e l o m i q u e à u n e
du pouvoir fécondant, voire
Dans
précédentes,
pas été mis en m o u v e m e n t
1 confirment
coelomique
en
l'addition
lors de l'insémination
la f i g u r e
prolongées. Avec
technique de d o u b l e dilution
mise
pratiquée
d o u b l e dilution, les s p e r m a t o z o ï d e s qui n'auraient
d e la p r e m i è r e d i l u t i o n le s e r o n t
expériences
Intervalle
Figure 5 - Evolution
du
pouvoir
du liquide c o e l o m i q u e
dilution du s p e r m e - i n s é m i n a t i o n ( m n )
fécondant
du
sperme
naturel ; technique
de
dilué
simple
dans
le
dilution.
DIATO
et
—
109
Simple dilution
Double dilution
—
(OOTdypuooej
Figure 6 - Evolution
du
(OOI - d j - p u o o e j
pouvoir
fécondant
du
sperme
dilué
dans
le
DIATU
et
du liquide coelomique naturel ; techniques de simple e t double dilutions.
Lorsque
ponner
restent
immobiles
conservée
dilution
le s y s t è m e
g l y c o c o l l e 0,05
M
et T r i s 0,02
u n m i l i e u p l u s c o m p l e x e c o m m e le M M L S
à son
après
niveau
ne d é p a s s e
pas
dilution,
initial
3
10~ .
on
constate
pendant deux
M est utilisé pour
d a n s lequel les
(Fig
heures
7)
que
la
à condition
tam-
spermatozoïdes
fécondance
que
le t a u x
est
de
110
n
Figure 7 - Conservation
du
)
pouvoir
fécondant
du
sperme
dilué,
mais
maintenu
i m m o b i l e d a n s le M M L S t a m p o n n é a v e c g l y c o c o l l e 0 . 0 5 M - T r i s 0 . 0 2
C . - Effet d u D I A n ; s u r le p o u r c e n t a g e d e f é c o n d a t i o n d ' o v u l e s
du
Le
mélange
où
les
DIAT,-, a
telle
ovules
par
vitellus
d'ovules
2 % ) . Une
M.
pollués
été
dans
comparé
lequel
situation
peuvent
peut
se
avec
un
de
certain
se
l'eau
rencontrer
trouver
dans
nombre
écrasés
dans
lors
le
ont
les
de
cas
d'insémination
été écrasés
la
conditions
collecte,
d'un
( 0 - 0,5 - 1
de
et
pisciculture
particulièrement,
d a n s le c a s d e j e u n e s f e m e l l e s o u d e f e m e l l e s d o n t l e s o v u l e s s o n t f r a g i l e s . L o r s que ces ovules
précipitation
pollués
et
une
p a r le v i t e l l u s s o n t m i s e n p r é s e n c e
agglutination
des
spermatozoïdes,
p r o d u i s e n t p a s a p r è s d i l u t i o n d a n s le DIAT,;. L ' e x a m e n
dation obtenus
(tableau 2), m o n t r e , dans
une diminution
du pourcentage
raître hautement
%
2
10
10
0,5
a
10"
10
2
: j
1,0
1010"
3
2,0
10"
10
2
:!
: P <
0.001
de l'eau
statistique
fait
une
se
douce,
appa-
du
dilueur
sur
le
succès
de
1
par test X ' corrigé.
*
: P <
005
d'insémination
eau
DIATG
67.6
55.7
86.1***
76.8***
44.1
42.0
84.2***
83.5***
0
0
76.7
68.6
0
0
***
75.3
78.7
*
l'insémination
s o n t p o l l u é s p a r du v i t e l l u s p r o v e n a n t d ' o v u l e s
***
avec
que l'analyse
Milieu
Taux de dilution
du sperme
0
des pourcentages
ne
des p o u r c e n t a g e s de f é c o n -
le c a s d e d i l u t i o n
de f é c o n d a t i o n
qui
significative.
d'ovules
écrasés
T a b l e a u 2 : Effet
d ' e a u , il s ' e n s u i t
phénomènes
lorsque
écrasés.
les
ovules
Comparaison
—
DISCUSSION
Le
tion,
ET
les
demment
Tris-glycocolle
paramètres
( P E T I T e t al.,
utilisé
essentiels
comme
(posm
e t al.,
pH
de
9)
dilueur
ont
été
d'insémina-
définis
en c e qui
précé-
concerne
au système carbonate-bicarbonate
(BIL-
1974).
Le glycocolle semble
sperme
tampon
250 e t
1973), s e révèle a u m o i n s c o m p a r a b l e
les pourcentages de fécondation obtenus
LARD
—
CONCLUSION
système
dont
111
de truite
que ce dernier
dilué
même
un effet
a v o i r s u r le m a i n t i e n d u p o u v o i r f é c o n d a n t
supérieur
à celui
du c a r b o n a t e - b i c a r b o n a t e ,
p u i s s e f o u r n i r d u C O 2 qui p e u t ê t r e f i x é p a r le s p e r m e d e
du
bien
Saumon
( M O U N I B e t E I S A N , 1 9 6 6 , 1 9 6 8 a ) e t de M o r u e ( M O U N I B e t E I S A N , 1 9 6 8 b ) e t d o n t
un
effet
favorable
sur
le
(HUMPHREY et M A N N ,
noté chez
dû
à
un
les M a m m i f è r e s
effet
rable
du
la
milieu
sur
les
B 2 ( F i g . 4) q u i
précipitation
des
utilisé
du
contient
ou
Mammifères
8 mM
a été
du glycocolle
pourrait
été
de glycocolle
et
être
(prévention
expliquer
l'effet
et, d ' a u t r e
le t a u x d e f é c o n d a t i o n
lipoprotéines
signalé
a aussi
1 9 7 5 , 1976) e t p o u r r a i t
spermatozoïde
effet a n a l o g u e
peut favoriser
protéines
de
MENEZO,
membranes
par exemple). U n
d'insémination
sperme
un e f f e t f a v o r a b l e
(FLIPSE, 1956;
protecteur
l'effet de dilution
dilueur
métabolisme du
1949). M a i s
en
l'agglutination
de
favo-
part,
le
prévenant
des
sperma-
tozoïdes qui s e produisent lorsque de l'eau est mis e n présence d e vitellus.
Une
p o l l u t i o n d e la p o n t e p a r d u v i t e l l u s p r o v e n a n t d ' o v u l e s
pos-
sible
dans
la p r a t i q u e , f a i s a n t
appel
à un
écrasés est toujours
prélèvement
des
ovules
par
massage
a b d o m i n a l , de s o r t e q u e l ' i n s é m i n a t i o n p r a t i q u é e a v e c de l'eau d o u c e e s t
tible
de
déjà
signalé
mènes
lioré
réduire
notablement
que
des
le
solutions
de précipitation. Dans
par
la
grande
d u T r i s e t du
variété
salines
de
fécondation.
simples
pouvaient
réduire
le c a s du D I A ™ c e t e f f e t f a v o r a b l e
des
groupements
hydrophiles
suscep-
LEITRITZ
et
(1962)
ces
peut être
même
a
phénoamé-
lipophiles
glycocolle.
En c o n c l u s i o n ,
posée
pourcentage
comme
l'association
système tampon
Tris-glycocolle
susceptible
semble
de stabiliser
donc
pouvoir
être
le p H d u d i l u e u r
pro-
d'insé-
mination.
REMERCIEMENTS
La p r é s e n t a t i o n d a c t y l o g r a p h i q u e
CEL.
lire
M. Yves
ce
bien
document.
voulu
d'une
MENEZO
nous
Nous
assurer
la
collaboration
du manuscrit est due
a aimablement fourni
remercions
fabrication
contractuelle
aussi
les
du dilueur.
avec
le
à Jacqueline
MAR-
B 2 et a bien
voulu
laboratoires
Ce
Conseil
le m i l i e u
travail
LATHEVET
s'inscrit
Supérieur
de
dans
la
qui
le
ont
cadre
Pêche.
RESUME
Le
ment
pH d u
stabilisé
favorables
tion
4
dans
dilueur
avec
s o n t d e 0,05
ce
milieu
min. (dilution
4
10 )
un
milieu
de
la f é c o n d a n c e
Lorsque
vitellus
le
tamponné
le
M
pour
(DIA™)
pour
tampon
par
le s p e r m e
le
système
une
est
d'ovules
Salmonidés
Tris-glycocolle.
le g l y c o c o l l e e t 0,02 M
conserve
son
1 0 ' ' et
10 - )
ou 8 min. (dilution
après
DIATG
provenant
d'insémination
système
carbonate
peut
Les
pour
pouvoir
alors
bicarbonate
être
avantageuse-
molarités
les
plus
le T r i s . A p r è s
dilu-
fécondant
que
pendant
la d i l u t i o n
entraine
une
dans
chute
minute.
employé
écrasés,
p l u s é l e v é q u e si l ' i n s é m i n a t i o n
pour
l'insémination
le t a u x
d'ovules
de f é c o n d a t i o n
est pratiquée avec de
l'eau.
est
pollués
par
du
significativement
112
SUMMARY
Use
diluent
of
the
imDroves
and 0 02 M Tris.
tilize
for
only one
4
buffer
the
system
Tris-glycine
effectiveness.
The
to
ideal
stabilize
S p e r m diluted with this milieu ( D I A ™ )
min.
(dilution
min. using
10')
a buffer
or
8
min.
system
of
the
concentration
(dilution
is
pH
0.05
of
sperm
M
glycine
retain their ability to
10~
:i
2
and
10 )
fer-
compared
to
carbonate/bicarbonate.
W h e n D I A T O is u s e d f o r f e r t i l i z a t i o n of e g g s c o n t a m i n a t e d b y y o l k f r o m
d a m a g e d e g g s , t h e f e r t i l i z a t i o n s u c c e s s is s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n t h a t f o u n d
using water.
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