Validation d`un nouveau système rapporteur amplifié PROJET DE

Validation d’un nouveau système rapporteur amplifié
Directeur de Thèse : C. Couturier
PROJET DE RECHERCHE
RESUME
De nombreux systèmes rapporteurs ont été développés pour répondre à différentes
applications, allant de l’étude des régions promotrices gouvernant l’expression de gènes, le
suivit de voies de signalisation ou encore l’interaction de partenaires protéiques. Dans le but
de développer un test d’activité protéase ayant une sensibilité accrue, nous avons développé
un système rapporteur permettant l’amplification du signal. Cette amplification met en jeu
plusieurs mécanismes : l’utilisation de la TEV protéase, une enzyme hyperactive et un
système d’auto-amplification aboutissant à un signal de type on/off. La détection du signal
peut se faire par deux modes de lecture compatibles avec le haut débit: le transfert d’énergie
de bioluminescence par résonance (BRET) et la microscopie confocale automatisée (High
Content Screening). La grande sensibilité de notre système nous amène aujourd’hui à
valider son utilisation de façon générique. C’est pourquoi, le sujet de thèse que nous
proposons consiste à adapter puis démontrer son application dans divers domaines:
A] le suivi d’infection virale à haut débit, en prenant comme modèle l’infection par le virus
HCV ; B] la détection d’interactions protéine/protéines ; C] la détection d’interaction
protéine/molécule chimique où une sensibilité très importante est nécessaire. Les résultats
accumulés lors du développement de ce projet de thèse devraient conduire au
développement d’un nouveau système rapporteur auto-amplifié utilisable dans de
nombreuses applications où une très grande sensibilité est nécessaire.
I
CONTEXTE SCIENTIFIQUE
La plupart des découvertes scientifiques fondamentales ont suivit de près le développement
de techniques de détection de plus en plus sensibles. De nombreux systèmes rapporteurs
ont ainsi été développés pour répondre à différentes applications, allant de l’étude des
régions promotrices gouvernant l’expression de gènes, le suivi de voies de signalisation ou
encore l’interaction de partenaires protéiques. L’évolution des ces approches est basée sur
l’augmentation de leur sensibilité et une augmentation du champ possible de leur
applications.
Afin de valider l’effet de molécules potentiellement inhibitrices de l’infection par le HCV, nous
avons précédemment mis au point un test à haut débit basé simultanément sur deux
méthodes le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et le HCS (microscopie
confocale automatisée haut débit). Ce test est basé sur la coupure d’une sonde protéique
exprimée dans des hépatocytes et clivée spécifiquement par la protéase du HCV (NS3/4)
exprimée par le virus natif. Dans cette construction, le meilleur site de coupure par la
protéase NS3/4 décrit à ce jour (1) a été
introduit entre un donneur d’énergie
(bioluminescent) et un accepteur (fluorescent). La coupure par la protéase provoque une
baisse du transfert d’énergie par séparation du donneur et de l’accepteur. En HCS, cette
même coupure provoque une relocalisation de la fluorescence (de l’accepteur) du Réticulum
endoplasmique (RE) vers le noyau des cellules. Un peptide de localisation co-traductionelle
vers le RE (IPS1) l’emporte sur la localisation au noyau (post-traductionnelle) provoqué par
un triple site NLS (NLS3). La coupure par NS3/4 sépare les deux parties de la construction
contenant ces signaux de localisation et permet au NLS3 de relocaliser la fluorescence vers
le noyau après coupure. Cette double approche BRET/HCS simultanée sur la même
construction montre la supériorité de l’approche BRET au niveau débit et sensibilité mais ce
1 Koutsoudakis
G, Pérez-Del-Pulgar S, González P, Crespo G, Navasa M, Forns X. (2012) PLoS One.7:e53254. doi: 10.1371
mode de lecture étant sensible aux molécules colorées ou fluorescentes, la lecture en HCS
apporte son intérêt pour la vérification des effets observés apportant de plus d’autre
paramètres comme l’état et la viabilité des cellules. Bien que très sensible pour suivre
l’infection par le HCV, cette sonde montre ses limites pour le suivi de l’activité protéase
NS3/4 codée par un plasmide ou bien des pseudo-particules virales. Contrairement aux virus
HCV qui se répliquent et permettent l’expression
d’une quantité suffisante de protéase pour
provoquer un changement drastique dans ce test,
une expression plus faible (plasmide ou pseudoparticules) n’est pas suffisante (figure 1). En effet,
un certain niveau d’expression de la protéase est
Figure 1 : Effet de l'expression de NS3/4 sur la
nécessaire pour atteindre un seuil de détection de la sonde (1ère version) observée en HCS.
coupure et ne permet pas son utilisation en criblage
à haut débit sauf pour le virus natif réplicatif. Pour palier à ce problème, nous avons donc fait
évoluer cette première sonde pour obtenir une meilleure sensibilité en augmentant le rapport
signal avant/après coupure simultanément sur les deux modes de lecture et en introduisant
un mécanisme d’auto-amplification. Ces résultats étant prometteurs, nous souhaitons faire
la preuve de concept de l’utilisation avantageuse de ce système en BRET et HCS en
l’adaptant à différentes applications où une haute sensibilité est nécessaire : A] le suivi
d’infection virale, en prenant comme modèle le virus HCV pour lequel la sonde a été
développée à l’origine; B] la détection d’interactions protéine/protéine difficiles à détecter
de par leur rareté ou un laps de temps d’interaction trop court ; et enfin, C] la détection
d’interaction protéine/molécule chimique où une très grande sensibilité est encore
recherchée. Ce projet de thèse devrait conduire au développement d’un nouveau système
rapporteur auto-amplifié utilisable dans de nombreuses applications où une très grande
sensibilité est nécessaire.
II ETAT DU SUJET DANS LE LABORATOIRE
Pour améliorer notre sonde de départ pour l’approche en BRET, nous avons sélectionné une
construction où le donneur et l’accepteur sont plus proches et dans une orientation
conduisant à un transfert d’énergie optimal. Pour l’approche HCS, nous avons tenté
d’augmenter le contraste entre l’état de base et l’état après coupure, en couplant deux
principes d’amplification de ce signal : i) une localisation plus discriminante de la
fluorescence et ii) l’utilisation d’une enzyme relai hyperactive. Pour obtenir une meilleure
discrimination de la localisation entre les deux états, nous avons changé la localisation de la
sonde en modifiant l’emplacement des peptides de localisation. A l’état basal la fluorescence
est maintenant localisée dans le noyau, ce qui présente l’avantage de concentrer le signal de
fluorescence exclusivement dans ce compartiment, puis se retrouve dans le cytoplasme
après coupure par la protéase. Pour amplifier la faible activité de la protéase NS3/4 et
augmenter encore le contraste, nous avons utilisé la protéase du Tobacco Etch Virus (TEV).
Qui présente une très forte activité: La coupure par la protéase NS3/4 initie la libération de
cette protéase hyperactive qui peut aller agir sur la sonde avec une activité plus importante
d’où une première amplification du signal. Cependant, nous avons constaté une coupure
quais-totale de la sonde dès expression de la protéase TEV même très faible, indiquant la
très, et même trop grande sensibilité de notre approche amplifiée. La TEV pouvant être
exprimée en deux moitiés N et C terminales qui se réassocient pour conduire à l’activité
protéolytique (splitTEV), nous avons donc construit des vecteurs d’expression pour les deux
parties de la splitTEV afin de permettre l’association de la protéase et l’apparition de son
activité après coupure par la protéase NS3/4. Enfin, pour augmenter le contraste avant/après
coupure par la protéase NS3/4 à la fois en BRET et en HCS, nous avons imaginé un
système d’auto-amplification pour conduire après l’activation initiale à une néo-activation du
système par la TEV. Pour cela, les constructions TEV ont été faites pour qu’une fois la TEV
réassociée et active, elle puisse venir à son tour provoquer la première étape du système
comme le fait la protéase initiatrice NS3/4. L’ensemble de notre design conduit donc à un
système qui s’initie avec une activité protéase même faible et conduit à un signal très
discriminant entre deux états (figure 2): un signal de BRET
basal maximal qui descend très fortement après coupure;
un signal HCS où l’expression exclusivement nucléaire se
retrouve aussi dans le cytoplasme de façon très contrastée
comparée à la première approche réalisée en parallèle.
Les compétences que nous avons en clonage au sein du
laboratoire nous ont permit d’obtenir rapidement l’ensemble
des parties codantes nécessaires aux différentes
approches testées. Les vecteurs codant pour la sonde et la TEV entière ou dissociée sont
donc déjà disponibles au sein du laboratoire. Notre
savoir faire en criblage cellulaire et les appareillages Figure 2 : Comparaison des résultats obtenus
ère
ème
du laboratoire nous ont déjà permis de cribler à haut pour la sonde 1 version et 2 version en
absence ou en présence de NS3/4 ; A] en BRET,
débit en BRET (15.000 molécules/semaine). Ce haut B] en HCS
débit est aussi atteint en HCS par l’utilisation de la
plateforme de criblage Imaginex (à laquelle notre laboratoire est associé) située sur le
campus Pasteur où est localisé le laboratoire d’accueil. Enfin, les compétences nécessaires
au traitement et l’analyse des images obtenues en HCS sont présentes au sein du
laboratoire et plus précisément, les scripts nécessaires pour ce projet sont déjà utilisés en
routine (analyse de la fluorescence présente autour du noyau). Ce projet devrait être mené
avec succès dans cet environnement propice, par la disponibilité du matériel biologique, des
appareils et des procédures automatisées, ainsi que les différentes compétences
scientifiques et techniques regroupées au sein de notre laboratoire.
III PROGRAMME DU TRAVAIL
Le sujet de thèse proposé met en jeu des techniques utilisées en routine au sein du
laboratoire (clonage/ transfection / BRET/ HCS/immunofluorescence), qui une fois maitrisées
donnent des résultats très rapidement du fait du format haut débit dans lequel nous
travaillons, c’est pourquoi notre ambition est d’adapter la sonde hypersensible développée
dernièrement dans trois différents domaines où le haut débit et la sensibilité accrue sont des
atouts majeurs.
III-A] LE SUIVI D’INFECTION VIRALE A HAUT DEBIT
La majorité des tests de suivi d’infection virale mettent en jeu des virus modifiés pour
coder un gène rapporteur (Luciférase ou protéines fluorescentes). Cependant, la sensibilité
de tels systèmes reste limitée et l’amplification du signal met seulement en jeu
l’accumulation du rapporteur jusqu'à sa détection. De plus les modifications génétiques
engendrées sur le virus provoquent en général une baisse des titres infectieux pouvant être
obtenus, diminuant ainsi l’étape d’infection. Pour améliorer ce genre d’approche en utilisant
un virus natif, un autre rapporteur a été ensuite développé mettant en jeu la coupure d’une
sonde fluorescente localisée de façon constitutive au niveau du RE et relocalisée au niveau
du noyau après coupure par une protéase endogène du virus étudié. Cependant ces
approches ne bénéficient pas d’amplification du signal autre que l’accumulation progressive
de la fluorescence dans le noyau au fur et à mesure de la coupure par la protéase. La
validation de la spécificité des expériences d’infection nécessite en général l’utilisation de
pseudo-particules qui sont des virus artificiels ne codant pas les gènes du virus et sont donc
dépourvus de la protéase permettant le fonctionnement du test. Un système non homogène,
faisant appel à un gène rapporteur est donc nécessairement comparés aux résultats obtenus
avec le virus natif. Notre système rapporteur peut d’une part apporter un système unique
pour le virus natif et les pseudo-virus et de surcroit apporter une meilleure sensibilité par
l’amplification qu’il apporte. Nous proposons donc de montrer l’application possible de notre
rapporteur pour le suivi d’infection à haut débit à la fois sur le HCV natif mais aussi la
protéase exprimée depuis un vecteur d’expression plasmidique ou bien depuis des pseudoparticules. Pour cela, nous allons générer des cellules Huh-7 (lignée hépatocytaire pouvant
être infectées par le HCV) exprimant de façon stables les vecteurs codant pour les
différentes protéines impliquées dans notre système rapporteur. Ces dernières étant
exprimées depuis des vecteurs lentiviraux, nous allons produire des particules virales pour
générer des lignées cellulaires stables. Pour montrer la faisabilité, nous proposons de mettre
au point un test haut débit au format 384 puits à partir d’une lignée sélectionnée pour son
meilleur signal avant/après coupure par la protéase. Nous l’avons déjà réalisé avec la
première sonde et avons donc l’expérience nécessaire ainsi que le protocole d’infection déjà
optimisé au format 384puits.
La mise au point sera faite à partir de la méthode de BRET car plus simple et plus
rapide mais la mesure en HCS sera aussi optimisée à partir de la même lignée pour montrer
sa faisabilité et sa robustesse à haut débit.
III-B] LA DETECTION D’INTERACTIONS PROTEINE/PROTEINE
De nombreuses méthodes ont été développées pour mettre en évidence des
interactions protéine/protéine depuis le double hybride en levure puis dans les cellules de
mammifères, en passant par les méthodes de transfert d’énergie comme le FRET, l’HTRF et
le BRET. Le suivi ou même la détection d’interactions protéiques en cellules de mammifères
intactes reste cependant plus complexe à réaliser et met en évidence les limites inhérentes à
chaque méthode. Des interactions très brèves, comme par exemple la phosphatase PTP1b
qui interagit avec le récepteur à l’insuline un laps de temps très courts, ne peuvent être
détectées même en BRET qui est une des méthodes les plus sensibles. Des mutations
ponctuelles empêchant la dissociation du complexe ont ainsi permit de démontrer cette
interaction (2). Notre approche de par sa sensibilité et l’auto-amplification du signal devrait
être à même de détecter des interactions protéine/protéine et même ce genre d’interaction
« furtives ». De plus, en HCS, aucun exemple de détection d’interactions n’est décrit dans la
littérature. Le seul exemple est la mise en évidence de l’interaction bien connue entre p53 et
hdm2 qui disparait en présence de molécules inhibitrices de cette interaction (3). Dans le
système que nous avons développé, un premier événement de clivage permet la
reconstitution de la TEV, qui va ensuite pouvoir couper la sonde et permettre une autoamplification du signal. L’approche splitTEV a déjà été utilisée pour montrer des intéractions
protéine/protéine et est donc très bien adaptée à cette approche. Avec notre système, que
l’interaction étudiée soit rare ou représente un grand nombre d’événements moléculaires
dans la cellule, nous devrions pouvoir la détecter par un changement drastique d’état après
activation dans les deux cas. Nous proposons donc d’adapter notre système à la détection
d’interaction protéine/protéine en utilisant la même sonde rapporteur mais en incorporant le
système splitTEV cette fois sur des protéines dont on veut détecter l’interaction. Nous
prendrons tout d’abord comme modèle d’étude un couple de partenaires décrits, mais aussi
une interaction reconnue plus difficile à démontrer pour mettre en évidence la sensibilité de
notre système dans ce champ d’application. Ce système pourrait être le premier exemple de
détection d’interaction protéine/protéine en HCS. Si le succès de notre approche sur ce point
est confirmé, dans un second temps, nous envisageons de mettre au point un système de
criblage de partenaires d’une protéine à haut débit. Pour cela, nous souhaitons adapter nos
constructions au système gateway afin de cloner une banque de cDNA codant pour les
protéines humaines dans notre système.
2 Issad
3 D.
T, Boute N, Boubekeur S, Lacasa D. (2005) Biochimie. 87(1):111-116.
Dudgeon, S. Shinde, T Shun, J. Lazo, C. Strock, K. Giuliano, D. Taylor, P. Johnston, and P. Johnston. (2010) ASSAY and Drug
Development Technologies. 8(4): 437-458.
III-C] LA DETECTION D’INTERACTIONS PROTEINE/MOLECULE CHIMIQUE
Ces dernières années, une méthode dérivée du double hybride en cellules de mammifères a
montré la faisabilité d’une approche de détection d’interaction drogue/ protéine à haut débit
dans le but d’identifier d’autres cibles de molécules actives ou des « off targets » (4). Cette
méthode « mammalian small molecule protein interaction trap » (MASPIT) est basée sur la
fixation du composé chimique sur une protéine qui va permettre l’activation d’un gène
rapporteur si le composé interagit avec un second partenaire protéique. Bien que la preuve
de concept soit faite, un manque évident de sensibilité et une mise en œuvre difficile gène
son application dans d’autres laboratoires (5). Notre système rapporteur devrait pouvoir
mettre en évidence un événement moléculaire rare, et donc conduire à une amélioration
dans ce genre d’application. De plus les deux méthodes utilisées pour la lecture des signaux
sont relativement répandues de nos jours : le BRET n’est plus restreint aux laboratoires
initiés et devient même une méthode de routine, et le HCS se démocratise partout dans le
monde avec des appareils de plus en plus accessibles financièrement. Convaincu que la
sensibilité de notre système saura au moins égaler si ce n’est surpasser la sensibilité du
MASPIT, nous proposons d’adapter notre rapporteur en réalisant les constructions
nécessaires à son activation, en nous basant sur les dernières avancées décrites pour le
MASPIT. La banque de cDNA produite avec le système gateway en B] sera réutilisée.
IV-D] ECHEANCIER
V] PROFIL DU CANDIDAT ET CONTACT
Le candidat recherché sera amené à travailler au sein du campus de l’institut pasteur de Lille
sous la direction du Dr C. Couturier, spécialiste du BRET et de la mise au point de tests
cellulaires pour le criblage de molécules.
Le candidat recruté devra maitriser la culture cellulaire, la biologie cellulaire et moléculaire, le
clonage de protéines de fusion, l’étude des interactions protéine/protéines (si possible par
BRET), le High Content Screening (HCS), le travail en laboratoire de sécurité P2 (et P3 si
possible).
Si vous désirez postuler, ou pour obtenir de plus amples informations sur le sujet de thèse
proposé et pour constituer le dossier de candidature, envoyez un mail à l’adresse suivante :
[email protected], en indiquant « CANDIDATURE THESE RAPPORTEUR AUTOAMPLIFIE » comme sujet.
4 Caligiuri M, Molz L, Liu Q, Kaplan F, Xu JP, Majeti JZ, Ramos-Kelsey R, Murthi K, Lievens S, Tavernier J, Kley N. (2006) Chem
Biol.;13(7):711-722.
5 De Clercq DJ1, Risseeuw MD, Karalic I, De Smet AS, Defever D, Tavernier J, Lievens S, Van Calenbergh S. (2015) Chembiochem.
16(5):834-843.
VI] LISTE DES PUBLICATIONS PORTANT SUR LE SUJET
1- Corbel C, Zhang B, Le Parc A, Baratte B, Colas P, Couturier C, Kosik KS, Landrieu I, Le Tilly V, Bach S.
Tamoxifen Inhibits CDK5 Kinase Activity by Interacting with p35/p25 and Modulates the Pattern of Tau
Phosphorylation. Chem Biol. 2015, 22:472-482. doi: 10.1016
2- Couturier C, Deprez B. Setting Up a Bioluminescence Resonance Energy Transfer High throughput
Screening Assay to Search for Protein/Protein Interaction Inhibitors in Mammalian Cells. Front Endocrinol
(Lausanne). 2012;3:100. doi: 10.3389.
3- Zhang B, Corbel C, Guéritte F, Couturier C, Bach S, Tan VB; An in silico approach for the discovery of
CDK5/p25 interaction inhibitors. Biotechnol J 2011, 6, 871-881.
4- Corbel C, Wang Q, Bousserouel H, Hamdi A, Zhang B, Lozach O, Ferandin Y, Tan VB, Guéritte F, Colas P,
Couturier C, Bach S; First BRET-based screening assay performed in budding yeast leads to the discovery of
CDK5/p25 interaction inhibitors. Biotechnol J 2011, 6, 860-870.
5- Bacart J, Leloire A, Levoye A, Froguel P, Jockers R, Couturier C, Evidence for leptin receptor isoforms
heteromerization at the cell surface FEBS Lett 2010 ,584, 2213-2217.
6- Kamal M, Marquez M, Vauthier V, Leloire A, Froguel P, Jockers R, Couturier C ; Improved donor/acceptor
BRET couples for monitoring beta-arrestin recruitment to G protein-coupled receptors. Biotechnol J 2009,
9,1337-1344.
7- Bacart, J, Corbel, C, Jockers, R, Bach, S, Couturier, C; The BRET technology and its application to
screening assays. Biotechnol J 2008, 3, 311-324.
8- Peelman F, Couturier C, Dam J, Zabeau L, Tavernier J, Jockers R, Techniques: new pharmacological
perspectives for the leptin receptor. Trends Pharmacol Sci 2006, 27, 218-225.
9- Couturier C, Jockers R, Activation of the leptin receptor by a ligand-induced conformational change of
constitutive receptor dimers. J Biol Chem 2003, 278, 26604-26611.
10- Ayoub MA, Couturier C, et al; Monitoring of ligand-independent dimerization and ligand-induced
conformational changes of melatonin receptors in living cells by bioluminescence resonance energy transfer.
J Biol Chem 2002, 277, 21522-21528.
Validation of a high sensitivity reporter system
phD Director : C. Couturier
Research project summary
Several reporter systems have been developed in order to support fundamental scientific
project, form gene promoter regulation study, signaling pathway activation, or protein/protein
interaction monitoring. In order to enhance the sensitivity of a protease test we developed a
new reporter system allowing signal amplification. This latest is gained using several
mechanisms: the use of TEV protease having a high activity, and an auto-amplification step
leading to an on/off signal. A dual mode reading compatible with high throughput is available:
the Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) and the High content screening
(HCS). The high sensitivity of our approach now leads us to validate its use in a more
generic way. This is why the proposed thesis project will aim at adapting the system to
several fields of application: A] viral infection test, using HCV as a model ; B] the
detection of protein/protein interaction; C] the detection of protein/chemical
coumpound interaction in which a high sensitivity is requested. Expected results from this
project would lead to the development of a new reporter system, auto-amplified and usable in
a generic way.
Candidate Profile
The candidate will be working within the Pasteur institute of Lille under the direction of Dr. C.
Couturier, a specialist in the BRET methodology and the development of live cell compounds
screening tests.
Recruited for the biological work of this project, the candidate would have experience in the
following areas: cell culture, cell and molecular biology, cloning of fusion proteins, protein /
protein interaction study using BRET or FRET, High content Screening (HCS), and work in
level 2 or 3 safety laboratory.
Contact: [email protected]
If you wish to postulate, or for more information, please contact Dr C. Couturier, indicating
HCV THESIS CANDIDATURE as subject.