Dtection de gardnerella vaginalis et trichomonas

Détection par PCR en temps réel multiplexe de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis Sibylle Richoz
ESsanté, 48ème volée
Novembre 2008 – Avril 2009
Laboratoire MCL, Niederwangen
Responsable : Dr P-A. Menoud
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Remerciements
Je tiens à remercier le laboratoire MCL et plus particulièrement le Dr. P-A. Menoud qui m’a
accueillie durant les 3 premiers mois de mon stage afin d’effectuer mon travail de diplôme et
de me familiariser avec la routine. Durant ces premiers mois, il m’a apporté son aide pour
faire la partie pratique de mon travail et par la suite, ses corrections m’ont été d’une aide
précieuse. Il m’a aussi permis d’avoir de l’autonomie et de gérer mon temps pour effectuer la
routine et le travail de diplôme en même temps. Un grand merci également à la Dresse M.
Affolter ainsi qu’à toute l’équipe de la biologie moléculaire, pour leur aide et leur soutient tout
au long de mon stage.
Un grand merci à tous!
1
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Sommaire
La Gardnerella vaginalis ainsi que le Trichomonas vaginalis, respectivement une bactérie et
un parasite, sont responsables d’infections de la sphère uro-génitale. Ils sont à l’origine de
maladies sexuellement transmissibles.
Les maladies sexuellement transmissibles sont en recrudescence. Elles peuvent passer
complètement inaperçues pendant longtemps et se déclarer après quelques mois. Les
conséquences de cette apparition tardive ou quasi absente des symptômes peuvent être
graves. Cela peut aller de la simple stérilité jusqu’à l’apparition de lésions cancéreuses. Pour
diminuer les risques d’infection, il faudrait faire connaître l’existence de ces agents
pathogènes et communiquer les précautions d’usage à prendre afin d’éviter les
contaminations.
Le but de mon travail est de mettre au point une méthode de détection par PCR multiplexe
avec détection en temps réel. Ceci permet de détecter les Gardnerella et les Trichomonas en
même temps dans une seule réaction d’amplification, de diminuer ainsi le risque de
contamination par les produits de PCR et de raccourcir le temps de manipulation. Ces
analyses sont habituellement faites par culture ou observation au microscope. Cependant, la
sensibilité et la spécificité de ces analyses par ces méthodes traditionnelles sont inférieures
à celles des analyses faites avec des méthodes moléculaires.
D’autres analyses du profil uro-génital (puro), Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium,
Ureaplasma urealyticum et Candida albicans, sont déjà effectuées par PCR en temps réel.
Afin de pouvoir peut-être par la suite faire toutes ces analyses en même temps, nous avons
choisi la méthode de détection avec des sondes TaqMan pour être dans les mêmes
conditions que la méthode commerciale utilisée pour la détection de C. trachomatis et N.
gonorrhoeae.
Mots clés : Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, PCR en temps réel, sondes
TaqMan, sensibilité, spécificité.
2
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Abstract
Gardnerella vaginalis and Trichomonas vaginalis are bacteria and parasites, respectively.
They are responsible for infections of the urogenital area leading to sexually transmitted
diseases (STD).
Sexually transmitted diseases are increasing within the european population. They can
remain undetected in individuals for a long period of time. Consequently, female and male
sterilty or even cancerous lesions may originate from this lack of early detection of the
infection. Therefore, it is essential to promote the prevention by providing the population with
information about STD.
My diploma work intends to develop a realtime multiplex PCR for G. vaginalis and T.
vaginalis. Such a method decreases the risk of contamination by PCR products and shortens
the hand-on-time dramatically. The gold standard is presently the culture for G. vaginalis and
the observation of fresh urinary sediments under the microscope for T. vaginalis. However,
such methods are relatively unspecific and not sensitive enough in addition to be time
consuming.
Other analysis of the urogenital analysis profile such as detection of C. trachomatis, N.
gonorrhoeae, M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum and C. albicans were previously set
up by realtime multiplex PCR. Therefore, we considered the PCR conditions used for
detection of these organisms as prerequisites for developing the multiplex analysis of G.
vaginalis and T. vaginalis.
Keywords : Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, realtime PCR, TaqMan probe,
sensitivity, specificity.
3
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Table des matières
1
Introduction .....................................................................................................................6
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6
1.2.7
1.2.8
1.3
1.3.1
1.3.2
Gardnerella vaginalis........................................................................................................... 6
Caractères bactériologiques .............................................................................................. 6
Habitat et pouvoir pathogène............................................................................................. 6
Diagnostic .......................................................................................................................... 7
Traitement.......................................................................................................................... 7
Trichomonas vaginalis ........................................................................................................ 7
Morphologie ....................................................................................................................... 7
Epidémiologie .................................................................................................................... 8
Transmission...................................................................................................................... 8
Symptômes ........................................................................................................................ 8
Diagnostic .......................................................................................................................... 8
Aspects cliniques ............................................................................................................... 9
Trichomonas et grossesse................................................................................................. 9
Traitement.......................................................................................................................... 9
PCR en temps réel ............................................................................................................... 9
Sonde TaqMan ................................................................................................................ 10
Cycle seuil........................................................................................................................ 11
2
But ..................................................................................................................................12
3
Matériel et méthodes ....................................................................................................13
4
3.1
Prélèvements...................................................................................................................... 13
3.2
Extraction............................................................................................................................ 13
3.3
Séquence : primers et sondes.......................................................................................... 15
3.4
Protocole : mastermix ....................................................................................................... 15
3.5
Lightcycler 480 II ................................................................................................................ 16
3.6
Programme PCR................................................................................................................. 17
Résultats ........................................................................................................................18
4.1
4.1.1
4.1.2
Détection des bactéries..................................................................................................... 18
Exemple de résultats pour une analyse de Gardnerella vaginalis .................................. 18
Exemple de résultats pour une analyse de Trichomonas vaginalis ................................ 19
4
Sibylle Richoz
4.2
4.2.1
4.2.2
4.3
4.3.1
4.3.2
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Sensibilité ........................................................................................................................... 20
Gardnerella vaginalis ....................................................................................................... 20
Trichomonas vaginalis ..................................................................................................... 23
Spécificité ........................................................................................................................... 23
Gadnerella vaginalis ........................................................................................................ 23
Trichomonas vaginalis ..................................................................................................... 24
5
Discussion .....................................................................................................................25
6
Conclusion.....................................................................................................................27
7
Références bibliographiques.......................................................................................28
8
Annexes .........................................................................................................................29
8.1
Mode opératoire pour l’amplification de Gardnerella vaginalis et Trichomonas
vaginalis ........................................................................................................................................... 29
5
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
1 Introduction
1.1
Gardnerella vaginalis
1.1.1 Caractères bactériologiques
Gardnerella vaginalis est un bacille d’apparence granuleuse. La paroi de cette bactérie
présente des similitudes avec celle des bactéries gram positif mais la coloration nous donne
un gram variable ou négatif. Elle est immobile, aéro-anaérobe facultatif, dépourvue de
catalase et d’oxydase et à métabolisme fermentatif. (Euzéby, J.P., 1998)
Figure 1. Microphotographie de Gardnerella vaginalis. Les bactéries sont mises en évidences par une
coloration bleue au milieu de cellules épithéliales.
Cette bactérie pousse mal en milieu liquide et est difficile à cultiver après repiquage. En
général, elle apparaît après 48 heures sur gélose Columbia au sang de mouton, incubée
dans une atmosphère humide et enrichie en CO2. Les bactéries se présentent comme de
très petites colonies rondes, opaques, lisses et sans hémolyse. Par contre, on peut voir une
hémolyse de type bêta sur les géloses à Gardnerella, faites avec du sang de lapin ou
humain. G. vaginalis ne pousse pas sur gélose MacConkey. (Euzéby, J.P., 1998)
1.1.2 Habitat et pouvoir pathogène
G. vaginalis a pour habitat le vagin de la femme. Vingt à 40% des femmes sont des
porteuses saines. Alors que l’infection se transmet principalement par voie sexuelle, dans de
rares cas, elle peut se trouver chez des femmes vierges.
Elle est souvent la cause de vaginoses, soit comme seul germe pathogène soit en
association avec des bactéries anaérobes. On la retrouve aussi lors de troubles génitourinaires, telles qu’urétrites, cystites, balano-posthites, prostatites et épididymites. Ces
infections sont beaucoup plus présentes chez la femme que chez l’homme. On peut aussi
6
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
observer quelques fois des endométrites et des bactériémies chez la femme lors de la
délivrance. Dans de rare cas, il y a une atteinte néonatale. (Euzéby, J.P., 1998)
1.1.3 Diagnostic
L’isolement est réalisé sur géloses au sang, ou enrichies au sang. Des milieux plus sélectifs
peuvent être utilisés telle que la gélose Gardnerella, qui est une gélose Columbia
additionnée de 5% de sang humain. Cela permet de limiter ou d’inhiber la croissance des
micro-organismes associés. L’incubation se fait à 37°C, en milieu humide et contenant entre
5 et 10% de CO2. La confirmation du diagnostic repose sur l’aspect des colonies, le gram,
ainsi que sur différents tests biochimiques effectués. (Euzéby, J.P., 1998)
1.1.4 Traitement
G. vaginalis est sensible aux bêta-lactamines, à l’érythromycine, à la pristinamycine, à la
clindamycine, à la vancomycine, à la novobiocine et au métromidazole. Elle est résistante à
la colistine, l’acide nalidixique et à la néomycine. Les tétracyclines et les sulfamides sont
variables selon la souche. (Euzéby, J.P., 1998)
1.2
Trichomonas vaginalis
1.2.1 Morphologie
Trichomonas vaginalis (T.V.) est un parasite mobile, équivalent à la taille d’un gros
lymphocyte. Il possède 3 à 4 flagelles à sa grosse extrémité, et est entouré d’une membrane
ondulante. Son cytoplasme est granuleux. Le noyau est petit et se trouve près du début des
flagelles. Les kystes ressemblent fortement à des lymphocytes. Pour les distinguer, on fait
une coloration au bleu de crésyl, qui n’imprègne pas les kystes, tandis que les lymphocytes
sont colorés. (Bernard P., Sharaf M., 2001)
Figure 2. Microphotographie de Trichomonas vaginalis
7
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
1.2.2 Epidémiologie
Les infections avec ce parasite touchent les personnes sexuellement actives, femmes et
hommes, entre 15 et 35 ans environ. En moyenne, 40% des femmes et 15% des hommes
sont infectés une fois dans leur vie. Entre 25 à 85% des hommes sont infectés par T.V. si
leur partenaire l’est aussi. Par contre, 100% des femmes le sont lorsque le partenaire a un
Trichomonas. L’incidence de cette maladie augmente avec l’âge. (Bernard P., Sharaf M.,
2001)
1.2.3 Transmission
La transmission est majoritairement sexuelle. Une transmission non-sexuelle peut être
évoquée du fait que le parasite peut rester vivant 24 heures sur la literie, le siège de toilette
ainsi que dans l’eau du bain par exemple. Il est possible avec cela d’expliquer certains cas
d’infection au T.V. chez la femme vierge ou chez le jeune enfant. (Bernard P., Sharaf M.,
2001)
1.2.4 Symptômes
Les 3 principaux symptômes chez la femme sont : la leucorrhée, les brûlures et les prurits
vulvaires. La leucorrhée se manifeste par un écoulement vaginal abondant de coloration
verte tirant sur le jaune, de consistance mousseuse et généralement avec une odeur
désagréable. Ces symptômes peuvent s’accompagner de dyspareunie (douleur au moment
du rapport sexuel), de douleurs du périnée, de dysurie.
A l’examen, on voit une vulve et un périnée irrités avec parfois un œdème des lèvres. A
l’intérieur du vagin, on distingue quelques fois la présence de petites taches sur la muqueuse
écarlate qui va favoriser une sécrétion accrue.
Chez l’homme, les infections sont souvent très discrètes mais peuvent néanmoins faire
apparaître quelques symptômes tels qu’un écoulement urétral de nature mousseuse, des
rougeurs et un gonflement au niveau de l’orifice urétral et de la base du gland ainsi que des
difficultés à uriner. (Bernard P., Sharaf M., 2001)
1.2.5 Diagnostic
La confirmation du diagnostic s’effectue par l’examen de sécrétions vaginales ou urétrales à
l’état frais entre lame et lamelle sous le microscope. Le parasite peut rester vivant plusieurs
heures sur un écouvillon et 24h dans un milieu de transport. Il est possible de rechercher le
germe dans le culot de centrifugation des urines. (Bernard P., Sharaf M., 2001)
8
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
1.2.6 Aspects cliniques
La période d’incubation se trouve entre 2 et 60 jours. 50% des infections chez les femmes et
20% chez les hommes sont asymptomatiques.
Chez les femmes, le T.V. peut entraîner plusieurs infections telles que la vulvo-vaginite
subaiguëe, pseudo-salpingite, la cystite ou encore des formes rares d’endométrite ou de
salpingite. (Bernard P., Sharaf M., 2001)
1.2.7 Trichomonas et grossesse
La prolifération du T.V. est favorisée chez la femme enceinte par son état hormonal
spécifique. Il pourrait même être la cause de certains avortements. Le parasite a été observé
dans le liquide amniotique, le cordon ombilical ainsi que dans le placenta. (Bernard P.,
Sharaf M., 2001)
1.2.8 Traitement
Le traitement se fait sur la base d’un antibiotique de la famille des nitromidazoles. Il s’impose
lors de toute infection même asymptomatique que le partenaire soit aussi être traité.
(Bernard P., Sharaf M., 2001)
1.3
PCR en temps réel
La PCR classique s’effectue en 2 étapes, l’amplification puis l’analyse à l’aide de différentes
méthodes : gel d’agarose, hybridation. La PCR en temps réel permet un gain de temps
puisque la PCR et la détection se déroule en une seule étape. Beaucoup d’échantillons
peuvent être analysés en même temps ce qui constitue un avantage lors d’une analyse de
routine mais l’avantage principal de la PCR en temps réel est certainement la diminution du
risque de contamination par des produits d’amplification qui peut conduire à la détection de
faux positifs.
« La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR classique (amplification
cyclique d’un fragment d’ADN en 3 étapes : dénaturation, hybridation et élongation) avec
pour différence une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction,
donc en temps réel. » (Ameziane N., Bogard M., Lamoril J., 2005). Elle permet l’analyse du
produit amplifié, grâce à la mesure en continu de la fluorescence au cours du processus
d’hybridation. Il existe plusieurs méthodes de détection en temps réel de produit PCR dont
les principales sont : le SYBR Green™, les sondes FRET (fluorescence resonnance energy
transfert), les sondes TaqMan™, et les molecular beacons (balises moléculaires). Dans ce
9
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
travail nous avons choisi d’utiliser des sondes de types Taqman pour être en accord avec les
conditions imposées au départ.
1.3.1 Sonde TaqMan
Le principe de cette technique est basé sur l’activité 5’-nucléase de l’ADN polymérase :
l’enzyme hydrolyse une sonde hybridée à la cible. Cette sonde, d’environ 15-20 pb est
marquée avec 2 fluorophores : un à l’extrémité 5’ de la sonde (fluorophore donneur,
émetteur ou reporter) et l’autre à l’extrémité 3’ de la sonde (fluorophore « extincteur »,
suppresseur ou quencher). Le quencher, à proximité du donneur, absorbe la fluorescence.
Pendant la phase d’extension de la PCR, la Taq polymérase rencontre la sonde hybridée qui
se situe à proximité d’une des deux amorces hydrolyse la sonde, grâce à son activité 5’-3’
exonucléase. Le fluorophore donneur est libéré de l’action du quencher et émet un signal
fluorescent mesurable par l’appareil. Le nombre de cibles formées est ensuite suivi, cycle
après cycle, en temps réel. Comme l’ADN qui sert de matrice augmente à chaque cycle, le
nombre de sondes TaqMan qui peuvent s’hybrider augmente aussi, de même que la
fluorescence (Jaunin, P., 2004, p.79), (Ameziane N., Bogard M., Lamoril J., 2005, p.258),
(Poitras E., Houde A., 2002)
Figure 3. Shéma du principe de la technique avec les sondes TaqMan
10
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
1.3.2 Cycle seuil
« Pour déterminer la positivité d’une PCR, on détermine le nombre de cycles à partir
duquel le produit PCR est détectable. Le moment d’apparition de ce signal seuil
dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle threshold) est dépendant de la quantité de
matrice initialement présente dans l’échantillon amplifié. Le Ct calculé est
inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de copies initiales. Il
apparaît toujours au cours de la phase exponentielle de la PCR.
Le résultat d’une PCR en temps réel est représenté graphiquement sous forme de
courbes sigmoïdes. » (Poitras E., Houde A., Ameziane N., Bogard M., Lamoril J.,
2002-2006)
Figure 4. Chaque courbe correspond à un échantillon. Elle représente la mesure de la
fluorescence de cet échantillon pour chaque cycle. Le signal seuil calculé automatiquement
est matérialisé sur le graphe par une ligne horizontale.
11
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
2 But
Le but de ce travail est de mettre au point, pour Gardnerella vaginalis et Trichomonas
vaginalis, une méthode de détection simple et qui s’inscrit dans le flux des autres analyses
de microbiologie moléculaire courante dans un laboratoire qui possède un département de
diagnostic moléculaire. La PCR standard est fonctionnelle actuellement mais pour une raison
pratique mais aussi pour des raisons de sécurité et de rapidité, il serait préférable de passer
ces 2 analyses sur PCR en temps réel. Nous avons choisi une méthode de PCR en temps
réel avec une détection par sondes « Taqman ». Une contrainte était imposée, une
température d’hybridation à 58°C, ceci afin de se trouver dans les mêmes conditions que les
autres analyses de même type (profil uro-génital qui comprend l’analyse de Mycoplasma
hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum et Candida albicans). Le
programme de PCR devait également être le même. La sensibilité et la spécificité de la
méthode doit être déterminée et la méthode validée par comparaison avec la méthode
« Gold standard » qu’est la culture pour G. Vaginalis.
12
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
3 Matériel et méthodes
3.1
Prélèvements
L’ADN de Gardnerella vaginalis a été extrait à partir de bactéries provenant de cultures
fournies par le département de bactériologie du laboratoire MCL. Ce matériel a été utilisé
pour définir la sensibilité. Pour la spécificité, on a utilisé de l’ADN de patients, qui ont été
testés préalablement pour G. Vaginalis par une méthode de détection validée sur gel
d’agarose.
L’ADN de Trichomonas vaginalis a été extrait à partir de 50 sédiments urinaires fournis par
l’hôpital cantonal de Fribourg. La recherche de T. vaginalis a été faite sur ces sédiments par
microscopie optique dans la routine du laboratoire hospitalier.
3.2
Extraction
Les acides nucléiques ont été extraits à l’aide d’un automate, Le NucliSens® easyMAG™ de
bioMérieux. La méthode d’extraction des acides nucléiques, basée sur la technologie de
Boom, utilise des particules de silice magnétique. Dans un milieu salin élevé, l’ADN se lie
aux particules de silice magnétique. Cela constitue la phase solide. Plusieurs lavages
successifs permettent d’éliminer les composés non nucléiques. L’ADN est ensuite élué et
l’appareil sépare l’éluât des particules de silices à l’aide d’un aimant.
- Quelques colonies de bactéries sont prélevées d’une plaque de culture et diluées dans
1000µl de NaCl 0.9% stérile.
- 500µl de ce mélange sont utilisés pour l’extraction sur easyMAG. On y ajoute 500 µl de
tampon de lyse et on incube 10 minutes à 70°C.
- Les 1000µl sont mis ensuite dans un des puits du rack fourni par le fabricant.
- On démarre l’appareil. La première étape constitue la lyse cellulaire. L’appareil ajuste à
2ml tous les puits avec du tampon de lyse et procède à une incubation de 10min.
- Une fois l’incubation terminée, on ajoute manuellement les particules de silice magnétique
à l’aide d’une pipette automatique. Les particules sont diluées préalablement 1/2 avec de
l’eau distillée. Une fois les particules mélangées, on poursuit la purification des acides
nucléiques.
- Une première incubation permet aux acides nucléiques de se fixer sur les particules de
silice.
13
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
- Le système d’aimants permet par la suite un lavage dynamique et une purification en
fixant la silice à la paroi du puits.
- Ensuite 110 µl de solution d’élution sont ajoutée. Une étape de chauffage à 60°C permet
aux acides nucléiques d’être libérés de la silice.
- L’étape finale consiste à séparer les particules magnétiques de l’éluât. Cette étape
s’effectue grâce à un système d’aimants. Il faut si possible décanter les puits dans les 30
minutes qui suivent l’élution car la silice à tendance à se détacher de la paroi.
(NucliSens easyMAG User Manual)
Figure 5. EasyMAG, extrateur automatique de
bioMérieux basé sur la méthode de Boom.
14
Sibylle Richoz
3.3
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Séquence : primers et sondes
Les séquences des amorces (primers) et des sondes ont été décrites dans la littérature et
sont reproduites dans le tableau ci-dessous. Seules les concentrations utilisées ont été
modifiées pour la mise au point de la réaction multiplexe.
Primers et sondes
TV_for2
AAGATGGGTGTTTTAAGCTAGATAAGGT
TV_rev2
CGTCTTCAAGTATGCCCCAGTAC
83 pb
TV_probe1
CCGAAGTTCATGTCCTCTCCAAGCGT
GAR_for2
CGCATCTGCTAAGGATGTTG
GAR_rev2
CAGCAATCTTTTCGCCAACT
GAR_probe1
3.4
Tailles du fragment
amplifié
Séquences
91 pb
TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC
RNP309F
AGATTTGGACCTGCGAGCG
RNP353R
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
RNP_CY5
TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
65 pb
Protocole : mastermix
L’analyse de G. V. et T. V. se fait dans un seul tube (PCR multiplexe). Le mastermix
contient : de l’eau distillée, du FastStart Taq DNA polymerase mastermix (Roche) ainsi que
les primers et les sondes. Comme contrôle interne d’amplification nous utilisons le gène
humain RNP (Ribonuclease P humaine).
.
Primers
Concentration stock
Concentration finale
50 µM
0.50 µM
50 µM
0.40 µM
20 µM
0.03 µM
Sondes
Concentration stock
Concentration finale
Trichomonas
20 µM
0.20 µM
Gardnerella
20 µM
0.20 µM
RNP
20 µM
0.10 µM
Trichomonas
(forward et reverse)
Gardnerella
(forward et reverse)
RNP
(forward et reverse)
15
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Les volumes pour un aliquot sont les suivants :
Matériel
H2O
Roche mastermix
Primers T.V.
Sonde T.V.
Primers G.V.
Sonde G.V.
Primers ctrl interne
Sonde ctrl interne
Conc. Stock
2x
50 µM
20 µM
50 µM
20 µM
20 µM
20 µM
Volume à aliquoter
4.12 µl
10.00 µl
0.20 µl
0.20 µl
0.16 µl
0.20 µl
0.03 µl
0.10 µl
15.00 µl
Volume ADN
3.5
Volume
un aliquot
5.00 µl
Lightcycler 480 II
Ce travail a été effectué sur le LightCycler 480 II. Cet appareil est conçu pour faire des PCR
en temps réel « haut-débit », c'est-à-dire que l’on travaille avec une plaque de 96 puits. Il
nous permet une analyse rapide de 96 d’échantillons simultanément.
Dans ce travail, nous avons utilisé 3 sondes différentes pour Trichomonas, Gardnerella et le
contrôle interne, marquées avec trois fluorochromes: Fluorescein (FAM), Yakima yellow et
Cy5.
Fluorochrome
Filtre
Filtre
Fluorochrome
Couleur
(reporter)
excitation émission
(quencher)
Fluorescein
Trichomonas
465
510
Vert
BHQ-1
(FAM)
Yakima
yellow
Gardnerella
533
580
Jaune
BHQ-1
(YYE)
Contrôle
Cy5
618
660
Rouge
BHQ-2
interne
16
Sibylle Richoz
3.6
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Programme PCR
Deux conditions ont été imposées pour ce travail: une température d’hybridation de 58°C et
le programme PCR identique à celui des autres analyses du profil uro-génital..
1. 95°C, pendant 10 min : Cela permet d’activer la Taq polymérase, enzyme qui permet
l’élongation de la chaîne d’ADN.
2. 95°C, pendant 10 sec : Dénaturation des doubles brins d’ADN pour obtenir un simple
brin.
3. 58°C, pendant 30 sec : Hybridation des primers et des sondes sur leur séquences
complémentaires, élongation du brin et libération du fluorophore due à l’activité 5’-3’
exonucléase de la Taq polymérase.
4. 72°C, pendant 1 sec : complément d’élongation du brin d’ADN à partir des amorces
et grâce à l’ajout successif de désoxyribonucléotide (dNTP) en excès dans le
mélange. Les étapes 2 à 4 sont répétées 44 fois (45 cycles).
17
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
4 Résultats
Toutes les analyses ont été effectuées dans les mêmes conditions d’amplification afin
d’arriver au but final d’une PCR multiplexe pour le profil uro-génital.
Une première série d’analyses nous a permis de tester la sensibilité de la méthode. Ensuite
la spécificité a été testée.
4.1
Détection des bactéries
4.1.1 Exemple de résultats pour une analyse de Gardnerella vaginalis
Pour Gardnerella vaginalis le fluorochrome utilisé est yakima yellow, avec un filtre
d’excitation à 533 nm et un filtre d’émission à 580 nm. On peut observer une augmentation
de la fluorescence au cours des cycles pour l’échantillon avec Gardnerella positive. En
dessous, on voit un trait droit qui ne nous montre aucune fluorescence, c’est un échantillon
négatif pour Gardnerella.
Figure 6. Exemple de résultats obtenus par PCR en temps réel pour l’analyse de
Gardnerella vaginalis.
18
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
4.1.2 Exemple de résultats pour une analyse de Trichomonas vaginalis
Pour Trichomonas vaginalis le fluorochrome utilisé est FAM, avec un filtre d’excitation à 465
nm et un filtre d’émission à 510 nm. On peut observer une augmentation de la fluorescence
au cours des cycles pour les 2 contrôles positifs. On voit que le contrôle négatif n’émet
aucune fluorescence.
Figure 7. Figure d’amplification typique pour l’analyse de Trichomonas vaginalis
19
Sibylle Richoz
4.2
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Sensibilité
4.2.1 Gardnerella vaginalis
La sensibilité a été évaluée en comparant la culture et la détection par PCR en temps réel.
Des colonies pures de Gardnerella ont été ensemencées dans 1ml de NaCl à 0.9%. A partir
de ce tube que l’on va considérer comme pur, des dilutions géométriques de 1/10 ont été
effectuées. La dernière dilution était de 107. De ces dilutions, 50μl sont mis en culture sur
plaque COS et 500μl sont extrait sur EasyMag avec un volume d’élution de 100μl.
4.2.1.1 Résultat de la sensibilité sur LC480 :
Pur
Cp
(crossing point =
point de croisement
= Ct)
20.73
101
24.41
2
28.17
3
31.60
4
34.81
5
38.04
6
-
7
-
Dilution
10
10
10
10
10
10
Nous pouvons observer une bonne régularité entre chaque courbe. Les Ct ont un intervalle
d’environ 3-4 cycles entre chaque dilution. Cela nous indique que la dilution a été faite
correctement.
4.2.1.2 Résultat de la sensibilité sur plaque
Le tableau ci-dessous indique la comparaison entre le nombre colonies qui a poussé sur les
plaques et le nombre de copies génomiques calculé par réaction.
20
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
Dilution
Nombre de colonies qui a
poussé sur plaque
Pur
101
102
103
104
105
106
107
incomptable
500
86
13
1
Aucune
Aucune
Aucune
ESsanté 48
ème
volée
Nombre de copies par
tube PCR
250
43
6.5
0.5
Calcul du nombre de copies/tube PCR avec pour exemple la dilution 1/100 :
Sur la plaque 1/100, 50μl de dilutions ont été ensemencés et 86 colonies ont poussé. Dans
les 100 μl élués par EasyMag, nous avons 172 colonies (86x2) et dans les 500μl utilisé pour
l’extraction, nous avons 860 colonies (172x5). Cela fait 8.6 colonies/μl. Pour chaque réaction
PCR, on utilise 5μl d’ADN, donc nous avons 43 copies/tube PCR.
Nous observons ici aussi une très bonne sensibilité car au moins une colonie visible sur
plaque est détectée par PCR.
4.2.1.3 Quantification absolue
Dans une analyse de la quantification absolue, la courbe standard est utilisée pour
déterminer la concentration inconnue des échantillons. Dans ce cas, la courbe standard est
représentée par une droite de régression. Voici ci-dessous comment la droite de régression
a été réalisée.
A partir des trois valeurs cible de CP ci-dessous, nous avons calculé la pente, l’ordonnée à
l’origine ainsi que l’efficacité de cette méthode à l’aide du programme Excel.
Cp 24.41
28.17
31.6
copie log copie 43 1.633468
6.5 0.812913
0.5 ‐0.30103
Pente : -3.67989
Ordonnée à l’origine : 30.69155
Efficacité : 1.869594
21
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
L’efficacité est calculée à l’aide de la formule suivante : E = 10-1/pente. Une efficacité parfaite
d’amplification devrait être de 2. Ici nous sommes en présence d’une efficacité de 1.9 ce qui
est très bien.
Pour la quantification absolue, il faut calculer les CP à l’aide de la pente, de l’ordonnée à
l’origine et du log des copies. Ensuite, nous pouvons tracer le graphique.
0.5
log
copies
-0.30103
Cp
calcule
31.79931
1
0
30.69155
10
1
27.01166
copies
100
2
23.33178
1000
3
19.65189
10000
4
15.972
100000
5
12.29211
1000000
6
8.612223
22
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Avec ce diagramme, nous pouvons déterminer, grâce au CP, le nombre de copies
génomiques par tube PCR.
4.2.2 Trichomonas vaginalis
La sensibilité de Trichomonas vaginalis n’a pas pu être testée, par défaut de prélèvements
positifs. L’origine des prélèvements reçus au laboratoire MCL ne vient pas d’une population
de patients « à risque ». Pour pallier à ce manque de prélèvements positifs, il eût fallu cloner
la région amplifiée de l’ADN de T. vaginalis dans un vecteur et utiliser le plasmide résultant à
différentes dilutions dans un milieu à grande complexité génomique (milieux contenant
plusieurs ADN de différentes origines bactériennes / humaines) pour tester la sensibilité de
la méthode.
4.3
Spécificité
4.3.1 Gadnerella vaginalis
Pour la spécificité, 16 anciens patients testés pour Gardnerella vaginalis ont été testés à
nouveau, mais cette fois-ci avec la PCR en temps réel mise au point dans ce travail. Voici
les résultats :
Patients
Résultats sur gel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
23
Résultats avec PCR en
temps réel
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Les échantillons n°4 et 5 sont trouvés positifs sur gel et sortent négatifs sur PCR en temps
réel. Les tests ont été refaits sur gel et sur LC480. Après vérification, les deux sortent
toujours positif sur gel et négatif sur LC480.
L’échantillon n°14 est trouvé négatif sur gel alors qu’il sort positif sur PCR en temps réel. La
photo du gel a été retrouvée et en inversant les couleurs, une faible bande a été aperçue.
Donc c’est un échantillon positif.
Sur 12 vrais positifs, 10 ont été détectés positifs par PCR en temps réel. Ceci nous donne
une spécificité de 83,3% pour la PCR en temps réel en prenant la méthode de détection sur
gel comme « gold standard ».
4.3.2 Trichomonas vaginalis
Pour la spécificité, 60 sédiments urinaires, testé au microscope négatif pour le Trichomonas,
ont été testés sur PCR en temps réel. Le résultat des 60 sédiments était négatif au
Trichomonas. Seul le contrôle positif était détectable. Nous sommes en présence d’une
bonne spécificité mais pour faire correctement il aurait fallut trouver plus de patients positifs
à ce parasite, mais cela est rare et fonction de la population des patients.
24
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
5 Discussion
Avec ce travail, nous avons pu mettre au point une méthode de PCR en temps réel
multiplexe pour réunir dans la même série l’analyse de Gardnerella vaginalis et Trichomonas
vaginalis.
Au début nous avons testé séparément les 2 analyses avec 2 mélanges réactionnels
différents (mélange pour amplification simplex). Cela fonctionnait très bien donc nous avons
très vite réuni le tout pour ne faire qu’un seul mélange avec les amorces et les sondes
(mélange pour amplification multiplexe).
La sensibilité de Gardnerella vaginalis a été testée en premier. La difficulté première était
d’arriver à avoir des souches pures et de faire des dilutions correctes pour avoir au final de
courbes d’amplification à intervalles réguliers représentatives de la qualité des dilutions.
Nous avons pu déterminer une très bonne sensibilité car moins de une colonie qui a poussé
sur plaque est détectable par PCR en temps réel. Avec ce résultat, il est difficile qu’un
prélèvement positif pour Gardnerella ne soit pas détecté.
La sensibilité pour Trichomonas vaginalis n’a pas pu être effectuée par manque de
prélèvements positifs. Une façon de résoudre ce problème aurait été d’obtenir un plasmide
contenant la région de l’ADN de T. vaginalis amplifiée par nos amorces. Cependant, le
laboratoire MCL n’étant pas équipé pour ce genre d’approche nous avons dû y renoncer.
La spécificité de Gardnerella vaginalis a été évaluée par la suite. On a pris 11 patients
positifs sur gel et 5 patients négatifs sur gel qu’on a analysé avec la PCR en temps réel. La
spécificité trouvée ici est de 83,3 %. Cependant, le nombre de patients testé est
certainement trop petit. D’autre part les amorces et les sondes utilisées dans ce travail sont
différentes de celles utilisées dans la méthode de détection sur gel. Théoriquement, nous
attendons que la spécificité de la méthode que nous avons développée dans ce travail soit
supérieure à celle de détection sur gel. Par conséquent, cette spécificité de 83% est à
considérer avec circonspection et une validation sur un nombre de prélèvements plus
important (~100) doit être considérée.
Pour Trichomonas vaginalis, il est plus difficile de trouver des patients positifs. Dans la
DNAthèque du laboratoire MCL, aucun Trichomonas positif n’a été trouvé. Pour la spécificité
nous avons alors pris 60 sédiments urinaires qui ont été préalablement observés au
microscope. Tous étaient négatifs soit au microscope soit par PCR en temps réel. Ceci nous
indique une bonne spécificité. Pour l’améliorer, il eût fallut aussi avoir des patients positifs au
microscope.
25
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
Dans l’ensemble, nous pouvons valider cette méthode sur le LightCycler 480 puisque
sensibilité et spécificité sont correctes. Malheureusement la routine ne s’effectue pas encore
sur cet appareil et je n’ai pas eu le temps de faire les tests sur le RotorGene
(CorbettResearch).
26
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
6 Conclusion
Le but de ce travail est atteint. La méthode de détection par PCR multiplexe de Gardnerella
vaginalis et Trichomonas vaginalis a été validée sur le Lightcycler 480 II et cette méthode
pourra entrer dans la routine du laboratoire MCL.
La sensibilité et la spécificité ont été testées pour les 2 organismes sur le LightCycler 480.
Les tests démontrent de très bons résultats. La méthode est validée sur cet appareil.
Cette méthode est plus rapide et plus pratique que la méthode utilisée actuellement. Il y a
moins d’étapes et elle peut se faire parallèlement à d’autres analyses avec un kit commercial
tel celui de Roche/TIBmolbiol pour C. trachomatis et N. gonorrhoeae.
27
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
7 Références bibliographiques
Ameziane N., Bogard M., Lamoril J. (2005) Principe de la biologie moléculaire en biologie
clinique, Paris : Elsevier Masson, p.251-265
Bernard P., Sharaf M. (2001). Les MST parasitaires [Page Web]. Accès :
http://www.syngof.fr/~syngof/pages/fmc/MSTmicrobiennes2.html#01 (page consultee le 10
janvier 2009)
Euzéby, J.P. (18 juin 1998). Gardnerella vaginalis, Gardnerella vaginalis like organisms
[Page web]. Accès : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/gg/Gardnerella.html (page consultée
le 10 janvier 2009)
Hardick, J. & al. (2006). Performance of the Gen-Probe Transmission-Mediated Amplification
Research Assay Compared to That of a multitarget Real-Time PCR for Mycoplasma
Genitalium Detection, Molecular Diagnosis of BV, 33-43
Jaunin, P. (2004). Cours de biologie moléculaire [Polycopié]. Lausanne : Ecole Supérieure
de la Santé.
LightCycler 480 Instrument Operator’s Manuel, Software Version 1.5
NucliSens easyMAG User Manual, Biomérieux, version 1.0, article number : 280139, chap 1
p.10-11, chap 2 p. 1 à 18
Poitras E., Houde A. (2002). La PCR en temps réel: principes et applications. Reviews in
Biology and Biotechnology. 2(2):2-11.
Poitras E., Houde A., Ameziane N., Bogard M., Lamoril J. (2002-2006). PCR en temps réel
[Page Web]. Accès : http://www.ilm.pf/PCRtempsreel (page consulté le 15 janvier 2009).
Schirm J. & al. (2006). Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR,
Journal of Microbiological Methods 68, 243-247
Images :
Figure 1 : http://www.cytopathnet.org/show_image.php?id=495&scalesize=0&nocount=y
Figure 2 : http://www.k-state.edu/parasitology/625tutorials/FIGvaginalis02.jpg
Figure 3 : http://www.ilm.pf/PCRtempsreel
Figure 4 : (http://www.ilm.pf/PCRtempsreel)
Figure 5 : http://www.bbcorp.co.kr/technote7/data/board/kkkgoods/file_in_body/1/easymag_tiles.jpg
28
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
ESsanté 48
ème
volée
8 Annexes
8.1
Mode opératoire pour
Trichomonas vaginalis
l’amplification
29
de
Gardnerella
vaginalis
et
Sibylle Richoz
Travail de diplôme
Détection par PCR en temps réel multiplexe
de Gardnerella vaginalis et Trichomonas vaginalis
30
ESsanté 48
ème
volée