151 15-24 Cals Citrus - Société de Pharmacie de Bordeaux

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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2012, 151(1-4), 15-24
OBTENTION DE CALS TOLERANTS AU
CHLORURE DE SODIUM À PARTIR
D'EMBRYONS DE DEUX PORTE-GREFFES
D’AGRUMES (*)
Houda EL YACOUBI (1,2), Driss HMOUNI (2), Lahcen ZIDANE (2),
Alain BADOC (3), Allal DOUIRA (2), Atmane ROCHDI (2)
La callogenèse à partir d'embryons matures excisés de deux
porte-greffes d’agrumes, Citrus trifoliata et C. aurantium, a donné
de bons résultats sur le milieu de Murashige et Tucker additionné
de 2 mg/l de 2,4-D et 1 mg/l de BAP.
Le chlorure de sodium à 9 g/l réduit de plus de 50 % le taux
de germination des graines et des embryons excisés. Cette
concentration a été utilisée comme pression saline sélective sur la
culture des cals. Quatre semaines de culture sont insuffisantes
pour distinguer la réaction des amas callogènes envers la salinité.
À plus de huit semaines, des cals tolérants sont sélectionnés et ils
sont plus nombreux pour Citrus trifoliata.
(*)
(1)
(2)
(3)
Manuscrit reçu le 3 septembre 2011.
Équipe de Biotechnologies végétales, Faculté des Sciences M’hannech II,
Université
Abdelmalek
Essaâdi,
93002
Tétouan,
Maroc.
[email protected]
Laboratoire ‘Botanique, Biotechnologie & PhytoProtection’, Faculté des Sciences,
Université Ibn Tofaïl, BP 133, 14000 Kénitra, Maroc. [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
GESVAB - EA 3675, Faculté des Sciences pharmaceutiques, Université de
Bordeaux, ISVV, 210 Chemin de Leysotte, CS 50008, 33882 Villenave-d’Ornon.
[email protected]
16
INTRODUCTION
La salinité limite l’extension des végétaux et constitue une contrainte
pour la production agricole. C’est tout particulièrement le cas du secteur
agrumicole marocain socioéconomiquement important, déjà soumis à la
sécheresse et à l’intensification de l’agriculture.
La recherche de porte-greffes d'agrumes tolérants au stress salin est
une voie alternative [15]. Une voie de sélection envisageable est la culture
de cals suivie d’une régénération. La sélection de vitrocals résistants à NaCl
pourrait conduire à des variants tolérants [2,10]. Ainsi, la tolérance vis-à-vis
de la salinité a été améliorée pour les cals du Citronnier [16].
L’objectif du présent travail est l’obtention de cals tolérants au
chlorure de sodium à partir d’embryons matures chez deux porte-greffes
d’agrumes, Citrus trifoliata et C. aurantium.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Matériel végétal
Deux porte-greffes polyembryonnés d’agrumes, l'Oranger trifolié ou
Poncirier, Citrus trifoliata L. et l'Oranger bigarade ou Bigaradier,
C. aurantium L. ont été utilisés. Les semences ont été fournies par la
SODEA (Société de Développement Agricole, Rabat, Maroc).
Désinfection et mise en culture
Les graines ont été lavées à l’eau courante puis imbibées d’eau
distillée toute une nuit au réfrigérateur. Elles ont ensuite été débarrassées de
leur tégument sous une hotte à flux laminaire horizontal, désinfectées par
trempage et agitation deux minutes dans l’éthanol à 70° puis quinze minutes
dans une solution d’hypochlorite de sodium à 30 %. Après trois rinçages à
l’eau distillée stérile, un seul embryon a été prélevé et excisé de chaque
graine afin de favoriser la diversité de la réponse callogène ; il s’agit
probablement d’un embryon nucellaire puisque la graine en comporte
plusieurs à côté d’un embryon zygotique unique.
Détermination de la concentration saline sélective
été
La réponse germinative des graines et/ou des embryons à la salinité a
considérée comme un indicateur possible du degré de
17
sensibilité/tolérance des cals et/ou des étapes suivantes de développement.
Le seuil de 50 %, souvent utilisé pour la classification du degré de tolérance
[7], a été retenu.
Quatre concentrations de chlorure de sodium (0, 6, 8 et 9 g/l NaCl)
ont été testées sur la germination à l’obscurité de pépins et d’embryons
excisés de chacun des deux Orangers afin d’obtenir une pression saline
sélective entrainant la réduction de la germination d’au moins 50 % par
rapport au témoin. La germination est considérée comme terminée quand le
taux de germination des témoins a dépassé 90 %.
Pour chaque condition, les graines ont été placées par dix dans trois
boites de Petri contenant du papier filtre imbibé de la solution saline. Elles
sont considérées comme ayant germé si les téguments sont percés par la
radicelle.
Trente embryons ont été cultivés dans autant de tubes à essai
renfermant 20 ml de milieu de base MT (Murashige et Tucker) [14]
additionné de 3 % de saccharose, 0,8 % d’agar et de la dose de NaCl testée
avant autoclavage 20 min à 120°C. Les embryons sont considérés comme
germés s’ils dépassent 2 mm.
Initiation de la callogenèse
Trois milieux, MS (Murashige et Skoog) [13], MS1/2 (MS dont les
macroéléments sont dilués de moitié) et MT ont été utilisés pour la culture
de nouveaux embryons excisés. Ces milieux sont enrichis de 2 mg/l de
l'auxine 2,4-D (acide 2,4-dichlorophénoxy acétique) combinée à 1 mg/l de
la cytokinine BAP (benzylaminopurine) afin d’induire une callogenèse [9].
Les embryons ont été cultivés par quatre en boites de Petri
renfermant 20 ml de milieu nutritif à raison de plus de dix boites par
condition. Les boites ont été scellées par deux tours de parafilm et incubées
quatre semaines à l’obscurité dans une étuve ventilée réglée à 30°C.
Les explants callogènes obtenus ont été ensuite subcultivés avec la
totalité de leur cal trois fois pendant quatre semaines sur le même milieu
frais. Les boites de Petri ont été étalées côte à côte en salle de culture à
25°C, sous une photopériode de 16 h et un éclairement de 2000 lux.
Application du stress salin sur les cals
De nouveaux embryons excisés ont été cultivés par quatre en boites
de Petri renfermant 20 ml de milieu MT additionné de 2 mg/l de 2,4-D et
1 mg/l de BAP pendant quatre semaines à l’obscurité à 30°C à raison de 25
boites par condition. Puis les explants callogènes ont été subcultivés avec la
totalité de leur cal trois fois pendant quatre semaines sur le même milieu en
18
présence de chlorure de sodium (0 et 9 g/l NaCl) à 25°C, sous une
photopériode de 16 h et un éclairement de 2000 lux.
Dispositif expérimental et analyse statistique
Le dispositif expérimental est totalement aléatoire : les tubes ont été
disposés au hasard dans les portoirs, les concentrations testées
correspondant à des capuchons de différentes couleurs et les deux espèces
traitées par une croix ou non. Les boites de Petri numérotées sur le dessous
ont été mélangées.
Le taux d’induction, la couleur, la texture ont été observés. Les petits
embryons de départ deviennent entièrement callogènes. Après chaque
subculture et pour chaque condition, les cals issus d’au moins quatre
embryons d’une boite de Petri ont servi à établir le poids de matière fraiche
et sèche après un séjour de 24 heures à l’étuve à 80°C, d’où la teneur en eau.
Les données ont été soumises à l’analyse de la variance et les
moyennes comparées par le test de Duncan.
RÉSULTATS
Germination
La germination des embryons est plus rapide que celle des graines :
elle a lieu pendant les deux premières semaines de culture et est
relativement plus courte pour les embryons du Bigaradier, alors qu’elle
s'étale sur quatre semaines pour les semences.
La salinité augmente le temps moyen de germination et diminue la
capacité germinative des graines et des embryons des deux porte-greffes. La
variation de germination corrigée montre que le Bigaradier est
statistiquement plus tolérant à la salinité en phase germinative que le
Poncirier. La réduction par rapport aux témoins du taux de germination des
graines et des embryons excisés n’est supérieure à 50 % que pour 9 g/l
(Tableau I). Cette concentration a été retenue comme pression sélective de
la tolérance à la salinité.
19
Tableau I : Influence de la concentration en NaCl sur la réduction du
pourcentage de germination des graines et des embryons excisés de
deux espèces de porte-greffe d’agrumes.
NaCl
(g/l)
6
8
9
Citrus
aurantium
40
48
54
Graines
Citrus
trifoliata
44
49
59
Moyenne
42
49
57
Embryons excisés
Citrus
Citrus
Moyenne
aurantium
trifoliata
38
40
39
44
46
45
52
56
54
Callogenèse
Après quatre semaines d'induction, le taux d’embryons ayant initié
un cal dépasse 91 %, indépendamment de la formulation du milieu de
culture et de l'espèce de porte-greffe. Deux principaux types de cals se sont
différenciés : des cals compacts blanc-jaunâtre et des cals friables beigejaunâtre.
Le milieu MT s'avère significativement plus favorable à la
callogenèse : il a un net effet stimulateur sur la masse de matière fraiche et
sèche des cals des deux Orangers (Tableau II). À douze semaines de culture,
le poids moyen des cals (porte-greffes confondus) a été de 578, 584 et
877 mg de matière fraiche, correspondant à 58, 60 et 88 mg de matière
sèche, respectivement pour MS1/2, MS et MT.
La callogenèse est plus importante pour l’Oranger trifolié
(Tableau II). Les poids de matière fraiche et sèche sont supérieurs à 8 et 12
semaines de manière significative au seuil de 1 %. À douze semaines, la
croissance, estimée par la masse des cals (milieux de culture confondus), est
relativement faible pour le Bigaradier (626 et 61 mg) et plus élevée pour
l'Oranger trifolié (733 et 76 mg pour les poids de matière fraiche et sèche).
Tableau II : Effets de trois milieux de culture sur les poids de matière
fraiche et sèche de cals issus d’embryons matures de deux porte-greffes
d'agrumes après 8 et 12 semaines de culture à 25°C, sous une
photopériode de 16 h.
Espèce
Citrus
aurantium
Citrus
trifoliata
Matière
fraiche
sèche
fraiche
sèche
MS1/2
8 sem.
12 sem.
456
561
41
55
514
595
51
61
8 sem.
433
36
583
59
MS
12 sem.
526
51
642
69
8 sem.
569
56
737
75
MT
12 sem.
791
78
962
97
20
Impact de NaCl et de la durée de culture sur les cals
En présence de chlorure de sodium, la croissance des cals est
amoindrie et ralentie (Tableaux III et IV). Les écarts sont d’autant plus
importants que le temps de culture est long. Quatre semaines de culture sont
insuffisantes pour discriminer la réaction des cals vis-à-vis de l'effet du sel.
Les écarts deviennent significatifs à 8 et 12 semaines.
Tableau III :
Effets de l’apport de NaCl et du temps de culture sur les poids de
matière fraiche et sèche (g) de cals issus d’embryons matures de deux
porte-greffes d’agrumes.
0 g/l NaCl
Culture
(semaines)
9 g/l NaCl
Matière
fraiche
Matière
sèche
Humidité
(%)
Matière
fraiche
Matière
sèche
Humidité
(%)
4
114
19
83,3
81
15
81,5
8
156
23
85,3
100
16
84,0
12
210
30
85,7
111
18
83,8
4
113
22
80,5
106
18
83,0
8
143
26
81,8
137
22
83,9
12
163
30
81,5
148
23
84,5
Citrus aurantium
Citrus trifoliata
La diminution de la croissance est plus accusée pour le Bigaradier
que pour l’Oranger trifolié. Ainsi, à douze semaines de culture, l’apport de
9 g/l de NaCl entraine une réduction des poids de matière fraiche et sèche de
47 et 40 % pour Citrus aurantium et 9 et 23 % pour C. trifoliata.
Tableau IV :
Pourcentages d’augmentation des poids de matière sèche et fraiche des
cals entre 4 et 12 semaines chez deux porte-greffes d’agrumes en
présence ou non de 9 g/l de NaCl.
Augmentation du poids
0 g/l NaCl
Citrus
Citrus
aurantium
trifoliata
9 g/l NaCl
Citrus
Citrus
aurantium
trifoliata
de matière fraiche
84
44
37
40
de matière sèche
58
36
20
28
La teneur en eau des cals, de 80,5 à 85,7 %, ne varie pas de manière
significative avec les milieux de culture, la teneur en NaCl et entre les deux
porte-greffes.
21
Entre la 4e et la 12e semaine de culture, la réduction des poids de
matière fraiche et sèche est plus marquée pour le Bigaradier (56 et 66 %)
que pour l'Oranger trifolié (9 et 22 %). Par ailleurs, à la fin de la 12e
semaine de culture, à 9 g/l de NaCl, les cals du Bigaradier sont plus
nécrosés que ceux de l'Oranger trifolié.
DISCUSSION ET CONCLUSION
La germination plus rapide des embryons par rapport aux graines
témoigne d’un rôle inhibiteur des téguments.
Dans l’hypothèse où 50 % de germination serait un seuil au-dessous
duquel les plantes seraient sensibles au traitement salin, la concentration de
9 g/l de NaCl a été retenue pour les deux porte-greffes d’agrumes.
Le succès des techniques de vitroculture résulte d’une meilleure
connaissance des besoins nutritionnels. Chez les Citrus, la composition des
milieux a une influence morphogène [6]. Chez les deux porte-greffes
d’agrumes étudiés, le milieu MT, favorable à la réactivité des embryons
excisés, diffère de MS par sa teneur élevée en vitamines (acide nicotinique,
pyridoxine et thiamine), apportées dans le milieu au même titre que les
microéléments afin d’éviter toute éventuelle carence [11]. Dans une
précédente étude [9], nous avions noté que la callogenèse de ces mêmes
porte-greffes était conditionnée par les phytorégulateurs du milieu de
culture et leur interaction. Il apparait maintenant aussi que la composition en
vitamines joue un rôle dans l’optimisation de la culture des cals d’agrumes.
La composition en macroéléments deux fois plus faible du milieu
MS1/2 n’a pas d’effet sur la prolifération des amas cellulaires. L’absence de
différence entre les milieux MS et MS1/2 laisse penser que les deux portegreffes d'agrumes sont plus exigeants en vitamines qu’en macroéléments.
Une vitrovariation au niveau des tissus callogènes a été recherchée
avec 9 g/l de NaCl comme pression de sélection, dose réduisant de plus de
la moitié le taux de germination des graines et des embryons excisés des
deux porte-greffes. Cette concentration correspond au niveau salin sélectif
des cals d’agrumes, allant de 5 à 10 g/l NaCl [3-4,9,16].
La survie de quelques cals correspondrait à la sélection de lignées
cellulaires tolérantes à la salinité. Des lignées variantes ont été ainsi
sélectionnées chez les porte-greffes Citrus sinensis [12] et C. limon [17].
22
Nous avons confirmé la stabilité du caractère de tolérance au stress salin et
observé que les lignées sélectionnées accumulent plus d’ions Na+ et Cl- [9].
Les cals de Citrus trifoliata sont plus tolérants que ceux de C. aurantium, en
accord avec des résultats précédents [1]. Ces vitrovariants supportant la
salinité pourraient être dans un deuxième temps régénérés.
Citrus trifoliata est plus sensible à la salinité que Citrus aurantium
en phase de germination, mais c’est l’inverse en phase de callogenèse. Dans
un précédent travail, nous avions montré que les cals de Poncirus trifoliata
sont modérément tolérants et ceux de Citrus aurantium modérément
sensibles [18]. Les vitrogerminations et les cals issus d’embryons n'auraient
pas le même degré de tolérance à NaCl, en accord avec le comportement des
plantules observé dans un précédent travail [1]. Toutefois, chez certaines
espèces, il semble exister une corrélation positive entre la sensibilité à la
salinité des plants ou des plantules et celle des cals issus d’embryons. Ainsi,
chez la tomate, des cals issus d’embryons ont présenté le même degré de
sensibilité au NaCl que des plantules en culture in vitro [19]. De même, chez
le Soja, une relation positive a été observée pour la réponse au sel entre les
cals de la première subculture et la plante entière [5].
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ABSTRACT
Obtaining tolerant calluses to sodium chloride from embryos of two
Citrus rootstocks
Callogenesis induction from excised mature embryos of two Citrus
rootstocks, C. trifoliata and C. aurantium, gave good results on Murashige
and Tucker medium supplemented with 2 mg/l 2.4-D and 1 mg/l BA.
Sodium chloride (9 g/l-1) reduced the seeding rate of seeds and
excised embryos by more than a half. This concentration was used as
selective salt pressure on the callus culture. Four-week culture was
insufficient to distinguish salt-tolerant calluses. In more than 8 weeks,
tolerant calluses were selected and were more numerous for Citrus
trifoliata.
Key-words: callogenesis, Citrus aurantium, Citrus trifoliata, in vitro
culture, salt tolerance, sodium chloride.
__________