CLHP chirale

INSA de ROUEN
Laboratoire de Chimie Analytique
UV - ANA4
Utilisation d’un logiciel d’optimisation pour l’étdue d’une
séparation par HPLC sur colonne chirale
I - But du travail proposé:
Il s'agit de déterminer les conditions optimales de séparation sur une colonne chirale
d’un mélange comportant les produits suivants :
- Methylparaben (4-hydroxybenzoate de méthyle)
- Ethylparaben (4-hydroxybenzoate d’éthyle)
- propylparaben (4-hydroxybenzoate de propyle)
- (R)-méthyl mandelate
- (S)-méthyl mandelate
OH
OH
COOMe
COOMe
(R) et (S) méthyl mandelate
On évaluera ensuite les conditions de séparation sur une colonne préparative.
Caractéristique de la colonne chirale :
CHIRALCEL OJ-H 0.46 cm (I.D) L=25 cm. Particules 10 µm
Particules de silice recouvertes de cellulose modifiée :
CH3
OR
O
OR
R=
O
OR
*
n
O
gel de Silice
Sélecteur chiral : Cellulose tris (4-methylbenzoate)
INSA Rouen – ANA4 TP
1
C’est une chromatographie en phase normale.
Phase mobile compatible avec le support : Heptane / isopropanol.
Débit maximum 1 mL/min, pression maximale 50 bars, Tmax=40°C
Coût de la colonne 1500 euros.
II - Matériel à disposition.
- CHROMATOGRAPHE VARIAN VISTA 5000 permettant l'utilisation d'un gradient
ternaire.
- Vanne d'injection RHEODYNE (boucle 20 µl)
- Détecteur UV Pye Unicam ( λ variable ; on choisira 254 nm )
- Logiciel d’acquisition AZUR (Datalys) notice jointe
- Colonne CHIRALCEL® OJ-H
- Logiciel d’optimisation OSIRIS (Datalys) notice jointe
III - Partie expérimentale.
III - 1 : Conditions expérimentales:
La colonne est conditionnée avec un éluant 90% heptane 10% isopropanol.
Régler sur l’HPLC la pression maximum à 50 bar (Set Cond, voir notice).
NB : si vous changez les proportions, il faut d’abord conditionner avec 10x le volume
mort au moins !!!!. Bien contrôler la pression !! Demander à l’enseignant si problème.
III - 2 : Programmation du logiciel AZUR.
Voir Notice
III - 3: Optimisation de la séparation.
Optimiser la séparation des deux énantiomères en injectant la solution 1 (6 mg de
chaque paraben et 50 mg du mélange racémique du mandelate) dans 10mL d’un
mélange iPrOH/Hept (20/80).
Faire une injection du mélange à 10/90 Hept/iPrOH. Puis une autre à 30/70.
Passez ensuite à l’optimisation sur le logiciel Osiris (voir notice). Enfin, tester les
conditions obtenus sur la chaine HPLC.
III - 4: Identification des composés et calcul de l’excès énantiomérique
Dans les conditions obtenues après optimisation, injecter:
1° l’énantiomère pur le (R)-methyl mandelate (solution 2, 50mg dans 10mL de
mélange iPrOH/Hept 20/80)
2° un mélange énantiomériquement enrichi. Déterminer l’excès énantiomérique
et la nature de l’énantiomère majoritaire. (Solution 3)
INSA Rouen – ANA4 TP
2
III - 5 : Détermination des conditions de séparation sur HPLC
préparative.
L’objectif de cette partie est de déterminer les conditions de séparation du mélange racémique
sur une colonne préparative. La manipulation trop coûteuse ne sera pas effectuée ici, nous
effectuerons simplement le calcul prévisionnel.
Nous allons d’abord étudier l’influence de la quantité de matière injectée sur la résolution. On
parle d’étude de capacité.
Dans les conditions obtenues précédemment injecter :
-
la solution 1 (déjà fait) 50 mg du racémique10mL d’iPrOH/Hept
la solution 4, 500 mg du (R),(S) methyl mandelate dans 10mL d’iPrOH/Hept
Estimer la concentration de la solution la plus concentrée ayant une résolution supérieure à
1.5. On choisira cette solution pour passer en mode préparatif.
La chromatographie préparative a pour objectif d’obtenir des quantités importantes des
énatiomères purs.
L’étape qui consiste à passer de la colonne analytique à la colonne prépararive s’appelle le
scale-up. L’objectif est d’obtenir exactement le même chromatogramme sur la colonne
préparative. On modifie alors les débits et les quantités d’échantillons introduits de la manière
suivante :
Calcul du facteur de Scale-up F :
2
d 
F = 2 
 d1 
où d2 est le diamètre de la colonne préparative et d1 celui de la colonne analytique.
Calcul du nouveau débit : D2=D1xF où D2 est le débit de la colonne préparative et D1 celui de
la colonne analytique.
Calcul du volume à injecter : V2=FxV1
On effectuera le scale up vers une colonne de 5cm de diamètre, de 25 cm de long et
comportant exactement la même phase fixe. Avec ces nouvelles conditions : calculer la
quantité de matière que l’on peut obtenir de chacun des énantiomères sur la colonne
préparative. Calculer la quantité de solvant précédent l’apparition du premier produit et la fin
du premier produit.
INSA Rouen – ANA4 TP
3