Implication de l`apolipoprotéine AV dans le déterminisme des

Transcription

N° d’ordre 09ISAL
Année 2009
Thèse
Implication de l’apolipoprotéine AV
dans le déterminisme
des hyperchylomicronémies
présentée devant
L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon
pour obtenir
le grade de docteur
Ecole doctorale : Ecole doctorale Interdisciplinaire Science Santé (EDISS)
Spécialité : Biochimie
par
Sybil CHARRIERE
Soutenue le 05 Février 2009 devant la Commission d’examen
Jury
LAGARDE Michel
MOULIN Philippe
BENLIAN Pascale
COLLET Xavier
FREDENRICH Alexandre
Professeur (INSA de Lyon)
Professeur (UCBL)
Maître de Conférence
Directeur de recherche (INSERM)
Professeur (Faculté de Nice)
Président
Directeur de thèse
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
N° d’ordre 09ISAL
Année 2009
Thèse
Implication de l’apolipoprotéine AV
dans le déterminisme
des hyperchylomicronémies
présentée devant
L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon
pour obtenir
le grade de docteur
Ecole doctorale : Ecole doctorale Interdisciplinaire Science Santé (EDISS)
par
Sybil CHARRIERE
Soutenue le 05 Février 2009 devant la Commission d’examen
Jury
LAGARDE Michel
MOULIN Philippe
BENLIAN Pascale
COLLET Xavier
FREDENRICH Alexandre
Professeur (INSA de Lyon)
Professeur (UCBL)
Maître de Conférence
Directeur de recherche (INSERM)
Professeur (Faculté de Nice)
Président
Directeur de thèse
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
1
INSA Direction de la Recherche- Ecoles Doctorales – Quadriennal 2007-2010
SIGLE
ECOLE DOCTORALE
NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE
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M. Jean Marc LANCELIN
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POUR LA SOCIETE
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http://ediis.univ-lyon1.fr
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INTERDISCIPLINAIRE SCIENCESHôpital Cardiologique de Lyon
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PM : 71.70 –Fax : 87.12
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ScSo
Université Lyon 2
M. BRAVARD Jean Paul
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*ScSo : Histoire, Geographie, Aménagement, Urbanisme, Archéologie, Science politique, Sociologie, Anthropologie
CHIMIE
CHIMIE DE LYON
http://sakura.cpe.fr/ED206
2
REMERCIEMENTS
A notre directeur de thèse, Monsieur le Professeur Philippe MOULIN,
Je vous remercie très sincèrement de la confiance dont vous m’avez témoigné depuis les
débuts de mon internat et de m’avoir donné l’opportunité de réaliser ce travail de recherche.
Vous avez su me communiquer votre enthousiasme pour la recherche clinique dans le
domaine de la lipidologie. Votre rigueur scientifique et votre sens clinique sont pour moi un
exemple.
Je vous suis reconnaissante de me permettre de poursuivre notre collaboration clinique et
scientifique.
Aux rapporteurs, Madame le Dr Pascale BENLIAN et Mr Xavier COLLET
Je vous remercie d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail. Vos expertises dans le
domaine de la génétique des dyslipidémies et du métabolisme des lipoprotéines me seront
précieuses pour juger ce travail.
Soyez assurés de ma reconnaissance et de mon respect.
Aux membres du jury,
Monsieur le Professeur Michel LAGARDE
Je vous remercie d’avoir accepté de juger ce travail et pour votre accueil toujours chaleureux.
Je suis heureuse de pouvoir continuer mes travaux de recherche au sein de l’unité.
Soyez assuré de mon profond respect.
Monsieur le Pr Alexandre FREDENRICH
Vous faites autorité dans le domaine des dyslipidémies. Je vous remercie d’avoir accepté de
juger ce travail.
Soyez assuré de ma reconnaissance.
3
A Christophe MARCAIS,
Je te remercie très sincèrement d’avoir encadré ce travail depuis les tous débuts au sein de
l’unité de biologie moléculaire jusqu’à la finalisation des dernières discussions, et de ton
accueil toujours sympathique.
Sois assuré de ma reconnaissance et de mon amitié.
A toutes les personnes qui ont été indispensables à la réalisation de ce travail, fruit d’une
large collaboration entrez cliniciens, biologistes, chercheurs et personnels hospitaliers :
- Aux Professeurs Bruno Vergès et Vincent Durlach,
- Aux Docteurs Sophie Bernard, Laure Groisne, Laurence Perrot,
- A Agnès Sassolas et Mathilde Charcosset,
- Aux infirmières de l’unité 11,
- A Micheline, qui a encadré mes premiers pas en biologie moléculaire et qui m’a accueilli
avec beaucoup de gentillesse. Je t’adresse toute mon amitié.
- A Mireille et Stéphane, pour leur collaboration et leur sympathie.
4
A Benoît,
Merci pour ton soutien indéfectible et ta patience, qui m’ont permis de mener à bien ce
travail.
Avec tout mon amour.
A Martin,
Tu es mon rayon de soleil et ma plus grande fierté.
A Maman,
Merci de ton soutien et de ta confiance,
Avec toute ma reconnaissance et mon affection.
A Monique et Jean Pierre, pour leur gentillesse et leur aide précieuse avec Martin.
A ma famille et mes amis.
5
TABLE DES MATIERES
Pages
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
12
13
14
INTRODUCTION
15
IERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
GENETIQUE DES HYPERCHYLOMICRONEMIES
L’APOA5 : un nouvel acteur du métabolisme des triglycérides
17
CHAPITRE 1. Rappels sur le métabolisme des lipoprotéines riches
en triglycérides
18
I. Synthèse des chylomicrons et des VLDL
18
II. Catabolisme des lipoprotéines riches en triglycérides
20
A. Les enzymes du catabolisme
1. La lipoprotéine lipase
2. La lipase hépatique
3. La CETP
B. Les récepteurs hépatiques : capture des remnants
20
20
21
22
23
III. Métabolisme des chylomicrons
23
IV. Métabolisme des VLDL
24
CHAPITRE 2. Les hyperchylomicronémies : diagnostic positif, étiologies
26
I. Diagnostic positif des hyperchylomicronémies
26
A. Circonstances de découverte
B. Diagnostic biologique
26
27
II. Hyperchylomicronémies primitives
27
A. Mutations de la LPL
B. Mutations de l’APOC2
C. Variants de l’apoE
27
28
29
III. Hyperchylomicronémies secondaires
A. Circonstances physiopathologiques
29
29
6
B. Co-facteurs génétiques
IV. Nouveaux gènes candidats pour l’étude des hyperchylomicronémies
A. GPIHBP1
B. LMF1
C. ANGPTL3 et 4
30
31
31
32
32
CHAPITRE 3. L’apolipoprotéine AV, un nouvel acteur du métabolisme des
triglycérides : revue de la littérature
34
I. Découverte du gène APOA5
34
A. RAP3 – régénération hépatique précoce chez le rat
B. Comparaison génomique ente l’homme et la souris
II. Le gène humain APOA5 : caractéristiques structurales et expression
A. Structure du gène et des transcrits
B. L’apolipoprotéine AV
1. Structure et propriétés physico-chimiques
2. Expression tissulaire et distribution sur les lipoprotéines circulantes
3. Concentrations plasmatiques d’apoAV
III. Régulation de l’expression du gène APOA5
A. Régulation par les récepteurs nucléaires
1. Rappels
2. Régulation par PPARα
3. Régulation par FXR
4. Régulation par LXR et SREPB-1c
5. Régulation par RORα
6. Régulation par HNF-4α
34
35
35
35
37
37
39
40
42
42
42
42
44
45
46
47
B. Régulation par l’insuline et le glucose
49
1. Régulation par l’insuline
2. Régulation par le glucose
49
51
C. Régulation par les hormones thyroïdiennes
D. Pas de régulation par l’APOC3 enhancer
E. Régulation au cours de l’inflammation
IV. ApoAV et paramètres lipidiques
A. Etude des modèles animaux
1. Souris transgéniques APOA5et souris KO apoa5
2. Surexpression adénovirale de l’apoa5 chez la souris
51
52
54
55
55
55
56
B. Etude des polymorphismes dans la population générale chez l’homme
56
1. Polymorphismes nucléotidiques
2. Haplotypes
3. Fréquence des polymorphismes dans la population générale
56
58
59
7
a. Polymorphisme -1131T>C
b. Polymorphisme S19W
c. autres polymorphismes
4. Association des polymorphismes aux paramètres lipidiques
60
a. Triglycérides
b. HDL cholestérol
c. Autres paramètres lipidiques
5. Association des polymorphismes aux variations physiologiques des TG
a. Durant la grossesse
62
b. En période post-prandiale
C. Relation entre les concentrations plasmatiques d’apoAV et les paramètres
lipidiques chez l’homme sain
V. Mécanismes d’action de l’apoAV : connaissances actuelles et hypothèses
A. Effet de l’apoAV sur la synthèse des LRTG
B. Effet de l’apoAV sur le catabolisme des LRTG
1. Apo AV et lipolyse
2. Mécanismes d’action de l’apoAV sur la LPL
62
64
64
66
66
67
a. Rôle de l’apoCII et de l’apoCIII
b. Rôle des HSPG
c. Hypothèses actuelles
3. ApoAV et capture hépatique des lipoprotéines
C. ApoAV et métabolisme du cholestérol
VI. Détermination de la fonctionnalité des polymorphismes de l’APOA5
A. Relation entre les polymorphismes du cluster APOA1/C3/A4/A5
B. Etudes fonctionnelles des polymorphismes de l’APOA5
1. Haplotype APOA5*1 – étude du polymorphisme S19W
2. Etude indépendante des polymorphismes de l’haplotype APOA5*2
70
71
72
72
73
73
75
a. polymorphisme -1131T>C
b. polymorphisme -3A>G ou Kozak
c. polymorphisme 751 A>G (SNP2)
d. polymorphisme 1891T>C (SNP1)
3. Etude combinée des polymorphismes de l’haplotype APOA5*2 :
recherche d’interactions fonctionnelles entre les polymorphismes
VII. Polymorphismes de l’APOA5 et dyslipidémies
A. Hypertriglycéridémie
1. HTG modérée
2. HTG sévère
B. Hyperlipémie combinée familiale
C. Interaction avec les génotypes de l’APOE
83
D. Modulation de la triglycéridémie dans l’hypercholestérolémie familiale
E. Autres dyslipidémies
1. Hypoalphalipoprotéinémie et hyperalphalipoprotéinemie
2. Dyslipidémies chez les patients HIV+ traités par antirétroviraux
3. Dyslipidémie sous antipsychotiques chez les patients schizophrènes
F. Polymorphismes de l’APOA5 et réponse aux fibrates
76
78
78
78
79
82
84
84
84
84
85
85
8
VIII. APOA5 et syndrome métabolique
A. Définitions du syndrome métabolique
B. APOA5 et insulinorésistance
C. Etude des polymorphismes de l’APOA5 dans le syndrome métabolique
1. Association aux paramètres lipidiques
2. Association au risque de syndrome métabolique
IX. APOA5 et interaction gène-nutrition
A. Interaction gène-nutrition : effet sur l’IMC et l’obésité
B. Interaction gène-nutrition : effet sur les paramètres lipidiques
X. APOA5 et diabète de type 2
A. Polymorphismes de l’APOA5 et risque de diabète de type 2
B. Polymorphismes de l’APOA5 et paramètres lipidiques dans le diabète
de type 2
1. Polymorphismes -1131T>C et S19W
2. Polymorphisme G185C
3. Polymorphismes et hypertriglycéridémie modérée dans le diabète
de type 2
C. Concentrations plasmatiques d’apoAV chez les diabétiques de type 2
1. Concentrations d’apoAV et relation avec les triglycérides
2. Concentrations d’apoAV et polymorphismes de l’APOA5
3. Concentrations d’apoAV en phase post-prandiale
XI. ApoAV et risque cardiovasculaire
A. Arguments expérimentaux en faveur d’un rôle athéroprotecteur
de l’apoAV
B. Polymorphismes de l’APOA5 et marqueurs intermédiaires
du risque cardiovasculaire
1. Etudes d’association à l’épaisseur intima-média carotidienne (EIMc)
2. Etudes d’association à la CRP
C. Etudes d’association des polymorphismes de l’APOA5 au risque
Cardiovasculaire
1. Etudes cas-témoins
a. Etudes d’association au risque coronarien
b. Etudes d’association au risque d’AVC ischémiques
2. Etudes de cohorte
XII. Mutations de l’APOA5 identifiées chez des patients avec HTG sévères
A. Mutations avec troncature prématurée de l’apoAV
1. Mutation Q148X
2. Mutation Q97X
3. Mutation c.161 + 3g>c (IVS3 + 3g>c)
B. Mutations faux –sens de l’APOA5
1. Description des cas index
87
87
88
88
88
89
91
91
92
93
93
94
94
94
95
95
95
96
96
97
97
97
97
98
98
98
101
104
104
104
106
107
108
111
111
9
.
a. Mutation E255GMutation G271C
b. Mutation H321L
2. Etudes fonctionnelles des mutations E255G, G271C, H321L.
a. Effet sur la lipolyse in vitro
b. Effet sur la liaison aux récepteurs
c. Western blot
3. Implication des 3 mutations non-sens en pathologie
112
113
XIII. Conclusion de la revue de la littérature
115
2ème PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
116
Article 1: “APOA5 Q139X truncation predisposes to late-onset
hyperchylomicronemia due to lipoprotein lipase impairment”
Résultats complémentaires
117
126
Article 2: “Modulation of phenotypic expression of APOA5 Q97X and
L242P mutations by genetic and metabolic factors”
128
Article 3: “Association of APOA5 -1131T>C and S19W gene polymorphisms
with both mild hypertriglyceridemia and hyperchylomicronemia in type 2
diabetic patients”
155
3ème partie : DISCUSSION
161
I. Place des mutations de l’APOA5 dans les étiologies génétiques des
hyperchylomicronémies
162
II. Implication des mutations de l’APOA5 en pathologie
164
A. Mutations Q139X et Q97X
1. Anomalies fonctionnelles induites par les mutations Q139X et Q97X
164
164
a. chez tous les hétérozygotes
b. chez tous les porteurs des mutations Q139X et Q97X
exprimant une dyslipidémie de type V
2. Mécanismes de la dyslipidémie chez les porteurs des mutations
Q97X et Q139X
167
a. défaut d’activation de la LPL
b. déficit en LPL à la surface endothéliale
3. Comment expliquer la révélation tardive et fluctuante du syndrome ?
B. Mutation L242P
III. Variabilité de l’expression phénotypique des mutations de l’APOA5
A. Mutations non-sens
B. Mutations faux-sens
C. Facteurs influençant l’expression des mutations de l’APOA5
172
174
175
175
177
177
10
1. Facteurs génétiques
177
a. rôle des haplotypes de l’APOA5
b. rôle fonctionnel des 2 haplotypes APOA5*2 et APOA5*3
c. rôle des autres variants génétiques modulant la triglycéridémie
2. Facteurs métaboliques et nutritionnels
D. Mutations non-sens de l’APOA5 : expression dominante ou récessive ?
IV. Complications cliniques des mutations de l’APOA5
A. Pancréatites aiguës
B. Complications cardiovasculaires
V. Conséquences en terme de diagnostic, de pronostic
A. Quelle stratégie proposer pour le diagnostic étiologique des
hyperchylomicronémies ?
B. Quel pronostic clinique pour les sujets porteurs de mutations de l’APOA5 ?
182
183
184
184
184
186
186
197
VI. Apports des mutations Q139X et Q97X dans la connaissance du rôle
physiologique de l’apoAV
188
VII. Perspectives
189
VIII. Conclusions
191
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
193
ANNEXE : Soumission article 2
209
FOLIO ADMINISTRATIF
210
11
LISTE DES ABREVIATIONS
AA :
ADN :
ADNc :
AEJ :
AG :
APO :
ARN :
ARNm :
AVC :
CETP :
CT :
DT2 :
EIMc :
ELISA :
FXR :
FRCV :
HCF :
HDL :
HDLc :
HSPG :
HTA :
HTG :
IDL :
IL :
IMC :
KO :
LDL :
LDLc :
LDL-R :
LH :
LPL :
LRTG :
LRP :
LXR :
MTP :
PCR :
PPAR :
RE :
RFLP :
ROR :
RXR :
SNP :
SREBP :
TG :
TNF:
USF :
VLDL :
acide aminé
acide désoxyribonucléique
ADN complémentaire
apports énergétiques journaliers
acide gras
apolipoprotéine
acide ribonucléique
ARN messager
accident vasculaire cérébral
cholesteryl ester transfer protein
cholestérol total
diabète de type 2
épaisseur intima-média carotidienne
enzyme-linked immunoabsorbent assay
farnesoid X-activated receptor
facteur de risque cardiovasculaire
hyperlipémie combinée familiale
lipoprotéine de haute densité
cholestérol des HDL
héparane sulfate protéoglycanes
hypertension artérielle
hypertriglycéridémie
lipoprotéine de densité intermédiaire
interleukine
indice de masse corporelle
knock out
lipoprotéine de basse densité
cholestérol des LDL
récepteur des LDL
lipase hépatique
lipoprotéine lipase
lipoprotéine riche en triglycéride
LDL receptor related protein
liver X-acrivated receptor
microsomal transfer protein
polymerase chain reaction
peroxisome promoter activated receptor
réticulum endoplasmique
restriction fragment length polymorphism
retinoic acid receptor-related orphan receptor
retinoic acid receptor
single nucleotide polymorphism
sterol regulatory element binding protein
triglycéride
tumoral necrosis factor
upstream stimulatory factor
lipoproteine de très basse densité
12
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Concentrations plasmatiques d’apoAV chez les sujets sains
Tableau 2 : Eléments de régulation de l’expression du gène APO5
Tableau 3 : Principaux polymorphismes du gène APO5
Tableau 4 : Principaux haplotypes du gène APO5
Tableau 5 : Effets de la surexpression ou du KO des gènes APOA5 et APOC3
sur les TG chez la souris
Tableau 6 : Définitions du syndrome métabolique
Tableau 7 : Etude des polymorphismes de l’APOA5 dans le syndrome métabolique
Tableau 8 : Association entre les polymorphismes de l’APOA5 et la survenue d’évènements
Coronariens - Etudes cas-témoins
Tableau 9 : Association entre les polymorphismes -1131T>C et S19W de l’APOA5
et la survenue d’évènements cardiovasculaires - Etudes de cohorte
Tableau 10 : Caractéristiques des patients présentant une HTG sévère et porteurs de
mutations de l’APO5, identifiés dans la littérature
Tableau 11 : Explorations lipidiques et génotypes de la famille Q139X-C
13
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma de l’assemblage des lipoprotéines riches en TG
Figure 2 : Synthèse de l’apoB-100 et de l’apoB-48
Figure 3 : Mécanisme d’action de la lipoprotéine lipase
Figure 4 : Echanges de lipides et d’apolipoprotéines entre HDL et LRTG
Figure 5 : Schéma du métabolisme de chylomicrons et des VLDL
Figure 6 : Représentation simplifiée du cluster APOA1/C3/A4/A5
Figure 7 : Comparaison de la structure des gènes APOA1/C3/A4 et A5
Figure 8 : Structure du gène APOA5 et transcription
Figure 9 : Schéma des différents domaines de l’apolipoprotéine AV mature
Figure 10 : Schéma du promoteur de l’APOA5
Figure 11 : Régulation de l’expression de l’APOA5 par LXR et SREBP-1c
Figure 12 : Régulation de l’expression du promoteur de l’APOA5 par les acides biliaires
Figure 13 : Régulation de l’expression du gène APOA5 par l’insuline et par le glucose
Figure 14 : Compétition des USF et de SREBP-1c sur les E-box du promoteur de l’APOA5
Figure 15 : Cluster APOA1/C3/A4/A5 et position de l’APOC3 enhancer
Figure 16 : Localisation des principaux polymorphismes du gène APO5
Figure 17 : Modélisation de l’insertion des peptides signaux 19S et 19W dans une membrane
lipidique
Figure 18 : Risque de dyslipidémies chez les patients porteurs des polymorphismes APOA5
S19W (A), -1131T>C (B) ou les deux (C).
Figure 19 : Fréquence des polymorphismes de l’APOA5 en fonction des quartiles de TG
Figure 20 : Arbre généalogique de la famille Q148X
Figure 21 : Arbre généalogique de la famille Q139X-C
Figure 22 : Anomalies génétiques identifiées dans une cohorte de patients
hyperchylomicronémiques (n=316).
Figure 23 : Schéma de la protéine tronquée générée par les mutations Q139X et Q97X
Figure 24 : Schéma du mécanisme d’action de l’apoAV en phyiologie (A) et en présence de
la mutation Q139X ou Q97X (B) d’après les données de la littérature
Figure 25 : Hypothèse de dégradation de la LPL en présence d’une mutation non-sens de l’APOA5
Figure 26 : Hypothèse d’action de l’apoAV en physiologie (A) et en présence de la mutation
Q139X (B) : contrôle de l’expression ou de l’adressage de l’apoAV
14
INTRODUCTION
L’hypertriglycéridémie (HTG) est une maladie métabolique recouvrant un ensemble
hétérogène de pathologies déterminées à la fois par des facteurs génétiques et
environnementaux. Elle constitue un facteur de risque cardio-vasculaire indépendant contesté
[Hok’96, Gar’07]. Les HTG modérées sont fréquentes, souvent secondaires à des facteurs
diététiques, médicamenteux ou à des pathologies comme le diabète, le syndrome néphrotique,
ou l’alcoolisme [Mah’03]. Certains patients développent dans ce contexte secondaire ou de
manière primitive des formes rares d’HTG majeure, caractérisées par des triglycérides (TG)
supérieurs à 15 mmol/l, évoluant par poussées ou plus rarement permanente, et dont le risque
majeur est la survenue d’une pancréatite aiguë avec ses complications propres [Mah’03]. Les
HTG majeures, appelées aussi hyperchylomicronémies, sont classiquement divisées en deux
classes selon la classification de Fredrickson : les dyslipidémies de type I caractérisées par
une accumulation de chylomicrons et les dyslipidémies de type V caractérisées par une
accumulation de chylomicrons et de VLDL [Fre’71]. Ces dyslipidémies surviennent parfois
dans des contextes familiaux d’HTG modérée ou sévère, ou d’hyperlipémie combinée
familiale. Les causes monogéniques identifiées sont les déficits homozygotes, généralement
pédiatriques, ou hétérozygotes en lipoprotéine lipase ou en apolipoprotéine CII [Ben’96a,
Jon’99, Mer’02, Mah’03]. Cependant, dans les dyslipidémies de type V de l’adulte, les
interactions entre gènes et environnement apparaissent beaucoup plus complexes. Ainsi, dans
une étude collaborative entre la Fédération d’endocrinologie du Pôle Est de Lyon (Pr P.
Moulin) et la Fédération de Biochimie du Centre Hospitalier Lyon Sud (Dr C. Marçais) dans
le cadre des activités de l’unité INSERM 870, ces anomalies génétiques représentaient moins
de 20 % des cas. Dans la majorité des cas, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont
donc actuellement inconnus.
Le gène de l’apolipoprotéine AV (apoAV), identifié en 2001 comme déterminant
important de la triglycéridémie chez la souris et chez l’homme [Pen’01, Van’01], apparaît
comme un nouveau gène candidat pour étudier la susceptibilité aux HTG majeures chez
l’homme, les données de transgénèse suggérant son implication causale [Pen’01, Van’02].
Chez l’homme, des études ont montré que les haplotypes variants de l’APOA5 expliquaient
15
une part importante de la variabilité de la triglycéridémie dans des populations d’origines
ethniques variées [Pen’01, Pen’02, Tal’02, Oli’04]. Afin de déterminer l’implication de
l’apoAV dans la survenue d’une HTG majeure, et plus généralement dans le métabolisme des
TG chez l’homme, une étude de séquençage systématique du gène APOA5 a été réalisée dans
une population de patients présentant une dyslipidémie de type V et a conduit à la découverte
de plusieurs mutations de ce gène, dont l’une des deux premières décrites dans la littérature.
Ce travail présentera dans une première partie une revue de la littérature sur la
génétique des hyperchylomicronémies et l’apoAV, avec les connaissances actuelles sur son
mécanisme d’action. Les données bibliographiques sur l’apoAV étaient pour l’essentiel
inconnues lorsque cette étude a débuté. La deuxième partie comportera les travaux
expérimentaux avec deux études consacrées d’une part à la description phénotypique et
génotype des patients présentant les mutations de l’APOA5 identifiées avec les enquêtes
familiales, et d’autre part à la caractérisation fonctionnelle des anomalies induites par ces
mutations. Une 3ème étude consacrée à l’étude des variants polymorphiques de l’APOA5 dans
la survenue d’une HTG modérée ou sévère dans une cohorte de patients diabétiques de type 2
sera également présentée. L’ensemble de ces données nous conduira à discuter l’implication
des mutations de l’APOA5 identifiées dans les hyperchylomicronémies, les facteurs modulant
leur expression, et enfin le rôle physiopathologique de l’APOA5.
16
1ERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
GENETIQUE DES HYPERCHYLOMICRONEMIES
L’APOA5 : un nouvel acteur du métabolisme
des triglycérides
17
CHAPITRE 1.
Rappels sur le métabolisme des lipoprotéines riches en triglycérides
Les triglycérides (TG) constituent l’une des principales réserves d’énergie de
l’organisme. Comme le cholestérol, les TG ne sont pas solubles dans le plasma et doivent
donc être associés à des phospholipides et des protéines amphipathiques, les apolipoprotéines,
pour former des complexes solubles, les lipoprotéines. Ces lipoprotéines assurent le transport
des lipides des cellules productrices vers les tissus périphériques. Les lipoprotéines riches en
triglycérides (LRTG) sont constituées principalement des chylomicrons et des VLDL
(lipoprotéines de très basse densité). Les chylomicrons sont synthétisés dans l’intestin et
transportent les TG d’origine exogène ou alimentaire, et les VLDL sont synthétisées dans le
foie et transportent des TG d’origine endogène [Mah’03]. Les concentrations circulantes de
LRTG et de TG résultent de la balance entre leur synthèse et leur dégradation ou catabolisme.
I. Synthèse des chylomicrons et VLDL
L’assemblage et la sécrétion des LRTG résultent d’un procédé complexe qui
s’effectue en 2 phases :
- La 1ère phase permet la formation simultanée et indépendante de 2 précurseurs : un
précurseur contenant une molécule d’apoB partiellement lipidée et une gouttelette lipidique
dépourvue d’apoB.
- La 2ème phase consiste en la fusion de ces 2 précurseurs qui forment la particule
mature.
La maturation des 2 précurseurs s’effectue dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE)
et est dépendante de l’activité d’une enzyme : la MTP (Microsomal transfer protein). Cette
protéine est responsable du transfert des lipides dans les lipoprotéines naissantes (Figure 1)
[Coh’00, She’01].
18
Apo B
MTP
Chylomicron / VLDL
mature
Figure 1 : Schéma de l’assemblage des lipoprotéines riches en TG
D’après [She’01]
L’apoB est synthétisée sous forme d’apoB-100 dans le foie et d’apoB-48 dans
l’intestin. Chaque particule de chylomicron ou de VLDL contient respectivement une seule
molécule d’apoB-48 ou d’apoB-100. Le gène APOB code en fait pour un ARNm (ARN
messager) identique dans le foie et l’intestin. Dans les entérocytes, cet ARNm subit un
processus original d’édition : une cytosine (C) sur le codon CAA (Glutamine) de l’ARNm est
transformé par désamination en uracile (U) grâce à un complexe enzymatique contenant
l’apobec-1 (ApoB editing complex catalytic subunit 1). Ce changement induit la formation
d’un codon STOP UAA et la synthèse d’une protéine apoB-48 ne contenant que les 2152
premiers AA de l’apoB-100 (4536 AA) soit 48 % (Figure 2) [Ana’01, Mah’03].
19
Gène APOB
5’
3’
foie
intestin
CAA
UAA (STOP)
ARNm
NH2
COOH
1
4536
Apo B-100
NH2
1
COOH
2152
Apo B- 48
Figure 2 : Synthèse de l’apo B-100 et de l’apoB-48
D’après [Mah’03]
II. Catabolisme des LRTG
A. Les enzymes du catabolisme
Le catabolisme intravasculaire des LRTG fait intervenir différentes enzymes,
principalement des lipases.
1. La lipoprotéine lipase
La lipoprotéine lipase (LPL), composée de 448 AA, est synthétisée par les cellules
parenchymateuses des tissus extra-hépatiques, en particulier les cellules adipeuses et
musculaires. La LPL est ensuite transloquée à la face luminale de l’endothélium capillaire.
Son expression est ainsi soumise à une importante et complexe régulation posttranscriptionelle. Le gène codant pour la LPL est situé en position 8p22. A la surface
endothéliale, la LPL se lie aux HSPG (Héparane sulfate protéoglycanes) et est active sous
forme d’homodimères. Les LRTG circulantes se fixent sur les complexes LPL/HSPG à la
surface endothéliale, et la LPL hydrolyse alors les TG en acides gras (AG) libres et glycérol
(Figure 3). Les AG libérés sont soit stockés par le tissu adipeux, soit utilisés par les tissus
20
périphériques comme source d’énergie, soit réutilisés pour la synthèse hépatique des VLDL
[Mea’02, Mah’03].
L’apolipoprotéine CII (apoCII) est un co-facteur nécessaire à l’activité de la LPL. Elle
agit comme activateur allostérique. Le site catalytique de la LPL est fermé par un couvercle
ou lid. L’interaction de la LPL avec l’apoCII présente sur les VLDL ou chylomicrons permet
l’ouverture du lid [Jon’99, Mea’02].
L’apolipoprotéine CIII (apoCIII) est un inhibiteur de l’activité de la LPL. Elle
empêche également la capture des remnants par le récepteur aux LDL (LDL-R) [Jon’99,
Sha’01].
VLDL / Chylomicron
TG
VLDL / Chylomicron
ApoCII
TG
LPL
LPL
ApoCII
AG
HSPG
HSPG
Cellule endothéliale
Tissus
Figure 3 : Mécanisme d’action de la lipoprotéine lipase
2. La lipase hépatique
La lipase hépatique (LH) présente des analogies structurales et fonctionnelles avec la
LPL mais est synthétisée uniquement par les hépatocytes. Elle est également liée aux HSPG à
la surface des cellules endothéliales capillaires du foie et dans l’espace de Disse. Elle agit
essentiellement comme phospholipase, mais hydrolyse également les TG. Elle transforme les
21
IDL (lipoprotéines de densité intermédiaire), issues de l’hydrolyse des VLDL, en LDL
(lipoprotéines de basse densité) [Per’02, Mah’03]. Après injection d’héparine, les deux
enzymes LPL et LH sont détachées de la surface endothéliale du foie et des tissus
périphériques. La mesure de l’activité LPL post-héparinique totale reflète donc l’activité de
ces 2 enzymes.
Il existe également une lipase endothéliale synthétisée par les cellules endothéliales
elles-mêmes. Son rôle physiologique est encore mal connu. Elle interviendrait dans le
métabolisme des HDL (lipoprotéines de haute densité), en hydrolysant leurs phospholipides
[Cho’02]. Elle pourrait également intervenir dans le catabolisme intravasculaire des LRTG
[Bro’04].
3. la CETP (cholesteryl ester transfer protein)
La CETP est une glycoprotéine plasmatique synthétisée dans divers tissus tels que le
foie, le tissu adipeux et la rate. Elle joue un rôle très important dans le transport inverse du
cholestérol. La CETP favorise l’échange équimolaire d’esters de cholestérol et de TG entre
les HDL et les LRTG, IDL, LDL, remnants (Figure 4). Le cholestérol des HDL peut ainsi être
recapté par le foie [Mah’03].
TG
HDL
CETP
VLDL /
Chylomicron
Cholestérol estérifié
Apo C, E
Figure 4 : Echanges de lipides et d’apolipoprotéines entre HDL et LRTG
22
B. Les récepteurs hépatiques : capture des remnants
Les résidus des LRTG appauvris en TG appelés remnants et les IDL issues du
catabolisme des VLDL sont captés par le foie grâce à la liaison de l’apoE à des récepteurs
spécifiques : le LDL-R (récepteur aux LDL ou récepteur apoB/E) et le LRP (LDL receptor
related protein). La capture des remnants par ces 2 récepteurs nécessite l’interaction de l’apoE
avec les HSPG de surface. En effet, la capture des remnants par le LRP ou le LDL-R
fonctionnels est supprimée par le traitement préalable des cellules par une héparinase, ou par
des mutations de l’apoE empêchant sa fixation sur les HSPG [Coh’00, Mah’03]. Des travaux
récents suggèrent que les HSPG pourraient intervenir directement dans la capture hépatique
des remnants, indépendamment des récepteurs LRP ou LDL-R [Mac’07, Mah’07]. Après leur
capture, les remnants sont internalisés par endocytose et dégradés par l’hépatocyte [Mah’03,
Mah’07].
III. Métabolisme des chylomicrons
En période post-prandiale, après absorption des graisses d’origine alimentaire,
l’intestin grêle (duodénum et jéjunum) sécrète des chylomicrons dans la circulation
lymphatique mésentérique qui rejoint ensuite la circulation générale. La demi-vie des
chylomicrons est très courte de l’ordre de quelques minutes. Les chylomicrons natifs sont
constitués majoritairement de TG. Ils contiennent également du cholestérol, des
phospholipides et des apolipoprotéines : l’apoB-48, l’apoAI et l’apoAIV. Secondairement, ils
acquièrent l’apoE et les apoCI, CII, CIII provenant des HDL dans la circulation (Figure 4). La
LPL, activée par l’apoCII, hydrolyse les TG générant des chylomicrons appauvris en TG ou
remnants. L’action de la CETP permet également l’échange de TG avec des esters de
cholestérol provenant des HDL, et ainsi l’enrichissement des chylomicrons en cholestérol
estérifié (Figure 4). Les remnants de chylomicrons sont captés par le foie après liaison de
l’apoE au LRP ou au LDL-R (Figure 5) [Coh’00, Mah’03].
23
IV. Métabolisme des VLDL
Les VLDL sont synthétisées dans le foie. Leur production est stimulée par les AG
libres captés par la foie après un repas riche en graisse ou libérés par le tissu adipeux à jeun.
Les VLDL nouvellement synthétisées contiennent des TG, du cholestérol, de l’apoB-100, de
l’apoE et de faibles quantités d’apoC. Durant leur métabolisme, elles vont acquérir à partir
des HDL des apoC et de l’apoE mais aussi des esters de cholestérol, échangés contre des TG,
sous l’action de la CETP (Figure 4). Dans la circulation, les VLDL subissent rapidement
l’action de la LPL qui les transforme en IDL. Ces IDL sont enrichies en esters de cholestérol
et contiennent l’apoB-100, l’apoE mais peu d’apoC. Ensuite, les IDL sont transformées en
LDL par la LH. Pendant la conversion des IDL en LDL, la majorité de l’apoE et de l’apoC
vient s’associer aux HDL. Les LDL ainsi formées contiennent alors majoritairement l’apoB100. Environ 50 % des VLDL sont transformées en LDL ; le reste est capté par le foie sous
forme de remnants de VLDL ou d’IDL grâce à la liaison de l’apoE au LDL-R ou au LRP
(Figure 5) [Coh’00, Mah’03].
Les LDL formées peuvent ensuite entrer dans 2 voies métaboliques :
-
internalisation et dégradation dans le foie ou les tissus périphériques après liaison de
l’apoB-100 au LDL-R,
-
oxydation et captation par les récepteurs scavengers des macrophages, impliqués dans
la genèse de la plaque d’athérome [Coh’00].
24
Graisses alimentaires
LPL
Remnants de
Chylomicrons
Chylomicrons
INTESTIN
AG
Tissu
Adipeux
Acides
biliaires
Tissus
périphériques
AG
AG
VLDL
FOIE
LDL-R
LRP
LPL
IDL
LH
LDL
Apo E
Apo B
Apo E
Figure 5 : Schéma du métabolisme des chylomicrons et des VLDL
25
CHAPITRE 2.
Les hyperchylomicronémies : diagnostic positif, étiologies
I. Diagnostic positif des hyperchylomicronémies
A. Circonstances de découverte
Le plus souvent, les hyperchylomicronémies sont silencieuses et sont donc
découvertes fortuitement sur un bilan lipidique systématique. Plus rarement, le bilan lipidique
aura été réalisé dans une situation clinique à risque important de dyslipidémie secondaire
(diabète type 2, éthylisme …) ou dans le cadre d’une enquête familiale réalisée devant la
notion d’une HTG sévère chez un apparenté [Mou’06, Cug’08].
Le diagnostic peut parfois être posé à l’occasion d’une complication aiguë. Les deux
principales complications sont un risque athéromateux et surtout le plus risque de pancréatite
aiguë. Le risque de complications cardiovasculaires ischémiques semble modéré dans de
petites séries, mais est controversé notamment du fait de l’intrication fréquente avec un
syndrome d’insulinorésistance. La principale complication est la survenue de pancréatites
aiguës, qui peuvent être récidivantes et engager le pronostic vital. Ce risque est très variable
selon les individus. En effet, une majorité de patients ne présenteront pas de pancréatites
aiguës malgré des poussées récurrentes d’HTG supérieures à 30 mmol/l, alors que d’autres
développeront une pancréatite aiguë pour TG inférieurs à 10 mmol/l [Mou’06, Cug’08]. Il
existe probablement des facteurs génétiques de susceptibilité aux pancréatites aiguës. Des
mutations ou des variants polymorphiques des gènes du trypsinogène cationique PRRS1, de
l’inhibiteur du trypsinogène SPINK1 (Serine peptidase inhibitor, Kazal type 1), de la fibrose
cystique CFTR (Cystic fibrosis transmenbrane conductance regulator), ont été identifiés dans
les pancréatites aiguës idiopathiques récurrentes [Kei’06, Tze’07]. Récemment, une équipe
chinoise a montré qu’une mutation (Ile556Val) et un variant (Met470Val) de CFTR et le
variant 863A du promoteur de TNF (Tumor necrosis factor), étaient significativement
associés au risque de pancréatite aiguë dans cohorte de 126 sujets avec HTG, mais pas les
variants de SPINK1 ou PRSS1 [Cha’08a].
26
Exceptionnellement,
le
diagnostic
est
porté
devant
un
syndrome
hyperchylomicronémique qui comporte classiquement une asthénie, des douleurs abdominales
non spécifiques. L’hépatosplénomégalie est inconstante, et la xanthomatose éruptive
caractéristique est très rare (< 1% cas) [Mou’06].
Il existe donc une grande variabilité individuelle dans la présentation des
hyperchylomicronémies et la plupart des patients sont asymptomatiques.
B. Diagnostic biologique
Les hyperchylomicronémies correspondent le plus souvent à une dyslipidémie de type
V (chylomicrons + VLDL) et beaucoup plus rarement à une dyslipidémie de type I
(chylomicrons isolés) [Fre’71]. La triglycéridémie dépasse 15 mmol/l avec un rapport TG/CT
(en g/l) > 2.5. Le seuil de 15 mmol/l est utilisé car au-delà de cette valeur, il existe
systématiquement des chylomicrons. Les concentrations de HDL cholestérol (HDLc) et LDL
cholestérol (LDLc) après ultracentrifugation sont abaissées et les concentrations d’apoB sont
modérément augmentées [Mou’06].
II. Hyperchylomicronémies primitives
Les anomalies génétiques identifiées dans les hyperchylomicronémies correspondent
le plus souvent à des anomalies de la lipolyse intravasculaire et concernent la LPL et l’apoCII.
A. Mutations de la LPL
Comme on l’a vu précédemment, la LPL est l’enzyme clé de la lipolyse
intravasculaire. Les mutations du gène LPL sont considérées comme rares, avec une
prévalence de 1/500. La fréquence des hyperchylomicronémies primitives par mutation
homozygote ou hétérozygote composite de la LPL est l’ordre de 1/10
6
pour cette maladie
autosomique récessive [Mah’03]. Plus de 100 mutations différentes ont été décrites avec des
phénotypes variables selon la nature des mutations [Mer’02]. Le déficit homozygote est donc
27
rare, apparaît souvent dès l’enfance. En revanche, plus fréquemment, un déficit hétérozygote,
dont le phénotype habituel est une normotriglycéridémie ou une HTG modérée, peut conduire
à une dyslipidémie de type V lorsqu’elle est combinée avec une hyperlipémie combinée
familiale (HCF) et/ou une forte pression environnementale. Il a été également observé un cas
d’hyperchylomicronémie majeure réfractaire au traitement provoqué par l’association d’une
mutation non-sens hétérozygote S172fsX179 et d’anticorps anti-LPL neutralisants [Pru’05b].
Les mutations les plus fréquentes sont des mutations ponctuelles faux-sens affectant le site
catalytique de l’enzyme (AA 120-216). La mutation G188S est la plus fréquente mais reste
rare
dans
la
population
caucasienne
[Mer’02].
La
caractérisation
d’une
hyperchylomicronémie implique un séquençage complet du gène de la LPL.
Le phénotype lipidique comporte un aspect de dyslipidémie de type V voire
exceptionnellement de type I. Les concentrations de l’apoCII et d’apoCIII sont élevées
harmonieusement (rapport CII/CIII normal), proportionnellement à l’intensité de l’HTG. La
mesure de l’activité LPL post-héparinique est abaissée, mais ce dosage délicat. Enfin, la
concentration plasmatique de LPL peut être normale, abaissée ou augmentée selon la nature
de la mutation [Mer’02, Cug’08].
B. Mutations de l’ApoCII
L’apolipoprotéine CII est un co-facteur activateur nécessaire à l’activité de la
lipoprotéine lipase. Les mutations du gène APOC2 sont extrêmement rares. Une dizaine de
mutations seulement ont été décrites. Ces mutations ont une expression autosomique
récessive. Dans la plupart des cas, il s’agit de mutations non-sens ou décalant le cadre de
lecture : les apoCII tronquées (sans la partie protéique C terminale) perdent leur capacité
d’activation de la LPL. Le phénotype clinique des mutations de l’apoCII semble globalement
moins sévère que les mutations de la LPL avec la possibilité de poussées de dyslipidémies de
type V très espacées. Certains malades peuvent se présenter sous un phénotype d’HTG
modérée (type IV). Le dosage de l’apoCII montre des valeurs effondrées uniquement dans le
cas des mutations non sens. Le test diagnostique de perfusion de plasma frais n’est plus
pratiqué [Jon’99, Mah’03, Cug’08].
28
C. Variants de l’apoE
L’apoE est l’apolipoprotéine jouant un rôle central dans l’épuration des remnants de
chylomicrons et des IDL. Elle permet la captation hépatique des IDL par les récepteurs LRP
et LDL-R. Le gène APOE possède un polymorphisme avec trois allèles (ε2, ε3, ε4) produisant
trois isoformes (E2, E3, E4), répartis inégalement dans la population caucasienne (E2 ≈ 8%,
E3 ≈ 78%, E4 ≈ 14%). Le génotype le plus fréquent est E3/E3 (environ 60%). Le génotype
E2/E2 est présent dans seulement 1% des cas. L’allèle E2 correspond à une substitution
arginine - cystéine en position 158 induisant une diminution de la charge positive au niveau
du site de liaison de l’apoE et réduisant l’affinité des remnants de VLDL ou de chylomicrons
pour les récepteurs à l’apoE [Mah’03].
L’homozygotie
E2/E2
participe
classiquement
à
la
survenue
de
dysbêtalipoprotéinémie ou dyslipidémie de type III (défaut de clairance des remnants de
chylomicrons et IDL) [Mah’99]. Néanmoins, certains malades peuvent être identifiés à
l’occasion d’une décompensation sous forme d’une dyslipidémie de type V. Dans ce cas, le
rapport TG/CT n’est pas élevé. Enfin, le génotype rare E2E4 est un également un cofacteur
génétique associé à la survenue d’hyperchylomicronémies [Gre’83, Mar’00].
III. Hyperchylomicronémies secondaires
A. Circonstances physiopathologiques
De
nombreuses
circonstances
physiopathologiques
peuvent
s’accompagner
d’hyperchylomicronémie :
-
Dans le diabète de type 2 ou du syndrome métabolique, les hyperchylomicronémies sont
généralement contemporaine de période de déséquilibre avec relâchement diététique.
-
L’hypothyroïdie, bien que classiquement associée à une hypercholestérolémie, peut
s’accompagner d’une HTG et d’une hyperchylomicronémie en particulier chez les
malades obèses, par diminution de la clairance des VLDL et de l’activité LPL [Abr’81].
29
-
La deuxième partie de la grossesse est une situation où l’on peut rencontrer des
décompensations ; on retrouve fréquemment dans cette situation une mutation homo ou
hétérozygote de la LPL.
-
Les intoxications éthyliques aiguës s’accompagnent d’une augmentation de la production
hépatique de VLDL et d’une inhibition de la LPL.
Parmi les causes médicamenteuses, les antirétroviraux employés dans le traitement du
VIH entraînent fréquemment des hyperchylomicronémies. L’ethinyl-oestradiol par voie orale,
les corticoïdes peuvent également générer des HTG sévères.
Cependant, seule une minorité de sujets soumis à ces facteurs secondaires comme une
intoxication alcoolique, un syndrome métabolique, un diabète de type 2, une grossesse, un
traitement œstrogénique, un traitement antirétroviral, ou des corticoïdes, décompense en
présentant une dyslipidémie de type V. Ceci suggère la présence de cofacteurs génétiques
pouvant conférer une susceptibilité particulière aux altérations de la lipolyse. Ces cofacteurs
peuvent provoquer des HTG modérées dans la population générale en dehors de toute
pression environnementale. [Mou’06, Cug’08]
B. Co-facteurs génétiques
L’apoCIII est un inhibiteur de l’action de la lipoprotéine lipase. L’insuline diminue la
transcription du gène de l’apoCIII en agissant au niveau d’un élément de réponse dans la
région promotrice de ce gène. Des études génétiques ont montré une forte association entre
l’allèle S2 du polymorphisme Sst-1 du gène APOC3 et l’HTG dans différente population
[Gro’01]. Ce polymorphisme est en déséquilibre de liaison avec les polymorphismes -455T>C
et -482C>T situés dans l’élément de réponse à l’insuline au niveau du promoteur de l’APOC3.
Les polymorphismes -455T>C et -482C>T altèrent l’inhibition de l’insuline sur la
transcription du gène ce qui provoquerait une augmentation des taux d’apoCIII et de ce fait
une diminution de l’activité LPL [Li’95], mais non confirmées chez l’homme [Dal’01].
Ces différents polymorphismes de l’apoCIII peuvent être associés chez un même
individu à d’autres cofacteurs génétiques comme les différents génotypes de l’apoE, à des
mutations hétérozygotes de la LPL [Mar’00] et/ou des facteurs métabolique [Sij’99], pour
générer une dyslipidémie de type V.
30
IV. Nouveaux gènes candidats pour l’étude des hyperchylomicronémies
Nous ne détaillerons pas ici l’APOA5 qui fera l’objet d’un chapitre spécifique dans ce
travail. Récemment, plusieurs nouveaux gènes impliqués dans la régulation de la lipolyse ont
été identifiés ainsi que des mutations de ces 2 gènes chez des patients avec HTG sévère.
A. GPIHBP1
Le
gène
GPIHBP1
(Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-anchored
High-density
lipoprotein Binding-Protein 1) a été découvert en 2003 [Iok’03]. Initialement impliqué dans la
liaison au HDLc et dans le transport du cholestérol, ce gène parait en fait jouer un rôle majeur
dans « la plateforme lipolytique endothéliale » des chylomicrons selon des travaux récents
[Bei’07]. En effet, les souris déficientes pour le gène gpihbp1 (gpihbp1 -/-) présentent une
HTG majeure avec un déficit de catabolisme des chylomicrons et une activité LPL basse
[Bei’07]. GPIHBP1 est fortement exprimée chez la souris dans le tissu adipeux, le cœur et
plus faiblement dans le muscle squelettique, exclusivement dans les cellules endothéliales, et
se retrouve à la face luminale des capillaires endothéliaux où elle est ancrée dans la membrane
cellulaire par liaison à un groupement GPI spécifiquement clivable par la PIPLC
(phosphatidylinositol-specific phospholipase C) [Iok’03, Bei’07]. GPIHBP1 peut lier la LPL,
les chylomicrons et l’apoAV dans des modèles cellulaires surexprimant gbihbp1 [Bei’07].
Le séquençage systématique du gène GPIHBP1 dans une cohorte de 160 patients non
apparentés présentant une hyperchylomicronémie, sans mutation identifiée de la LPL ou de
l’APOC2, a permis d’identifier une mutation homozygote (G56R). Le cas index était une
patiente de 47 ans présentant une hyperchylomicronémie réfractaire avec pancréatites aiguës
récidivantes depuis l’âge de 22 ans. La mutation homozygote G56R a également été retrouvée
chez son frère aîné de 52 ans avec la même présentation phénotypique, accompagnée d’un
triple pontage aorto-coronarien à l’âge de 44 ans pour angor instable [Wan’07a]. Toutefois,
l’implication de cette mutation dans la dyslipidémie n’est pas claire. En effet, l’activité LPL
post-héparinique chez les patients homozygotes G56R est normale [Wan’07a] et l’étude de
cette mutation n’a pas révélée de défaut dans la localisation de la protéine à la surface
cellulaire ni dans la liaison de la protéine mutée aux chylomicrons, à la LPL ou à l’apoAV
[Gin’07]. Si la mutation est délétère, elle pourrait intervenir davantage sur l’activation de la
LPL (non testée) que sur la liaison entre les différents acteurs.
31
GPIHBP1 apparait donc comme un nouvel acteur majeur de « la plateforme
lipolytique endothéliale ». GPHBP1 étant capable de se lier à l’apoAV, l’étude des
interactions entre ces deux protéines sera probablement intéressante pour la compréhension de
la modulation la formation des complexes lipolytiques et/ou l’activité de la LPL.
B. LMF1
Les souris homozygote cld/cld, identifiées il y a près de 25 ans, présentent une HTG
sévère avec un déficit combiné en lipase lié à un défaut de maturation des LPL et LH
naissantes dans le réticulum endoplasmique. Ce n’est qu’en 2007 que l’équipe de Peterfy et
al. ont identifié le gène porteur de cette mutation chez la souris, Lmf1 (Lipase maturation
factor 1). Ce gène est exprimé dans de nombreux tissus dont le tissu adipeux, le muscle, le
cœur et le foie. Il code pour une protéine à 5 domaines transmembranaires située dans le
réticulum endoplasmique.
Une mutation homozygote du gène orthologue humain LMF1 a été identifiée chez un sujet au
sein d’une cohorte de 11 patients avec HTG sévère et activité LPL diminuée. La mutation
Y439X est située sur l’exon 9 du gène et crée une troncature prématurée, éliminant les 127
AA de l’extrémité C terminale de la protéine. Le sujet Y439X avait des TG entre 7 et 70 fois
les valeurs contrôles, des xanthomes tubéreux, des lipodystrophies et a présenté plusieurs
épisodes de pancréatites aiguës. Il avait, comme les souris, un déficit combiné en lipase avec
une LPL diminuée de plus de 90 % et une activité LH diminuée de 50 % [Pet’07].
Le gène LMF1 (Lipase Maturation Factor 1), jouerait donc un rôle dans le transport
et/ ou la maturation de la LPL et de la lipase hépatique à la surface endothéliale.
C. ANGPTL3 et 4
Les protéines angiopoïétin-like 3 et 4 (Angptl3 et Angptl4) sont deux membres de la
famille des angiopoïétines inhibant l’activité de la LPL. Angptl4 est exprimée dans de
nombreux tissus surtout le foie, le tissu adipeux mais également le muscle, le cœur, alors que
Angptl3 est exprimée uniquement dans le foie [Li’06]. La surexpression adénovirale de
Angptl3 (et hépatique de Angptl4) chez la souris entraîne une augmentation des TG (3 à 10
fois les contrôles) avec diminution de la clairance des VLDL par inhibition de l’activité LPL
32
post-héparinique (>70 %), sans effet sur la production hépatique des VLDL. Inversement, les
souris KO pour angptl3 et angptl4 ont une hypotriglycéridémie avec augmentation de
l’activité LPL [Shi’02, Kos’05]. L’inhibition de la LPL par Angptl3 nécessiterait l’interaction
avec les HSPG puisque la mutation d’un domaine putatif de liaison à l’héparine abolit cet
effet inhibiteur. Cette séquence putative de liaison à l’héparine n’est pas retrouvée sur
Angptl4 qui pourrait interagir directement avec la LPL [Li’06]. Angptl4 transformerait la
LPL, active sous forme de dimères, en monomères inactifs dans le tissu adipeux [Suk’06].
Angptl3 inhibe également l’activité lipase endothéliale, qui hydrolyse les PL des HDL
[Shi’07].
L’expression d’Angptl3 est peu influencée par le statut nutritionnel alors que Angptl4 est
exprimée surtout en état de jeun. Angptl3 et 4 sont régulés de manière différente par des
récepteurs nucléaires [Ge’05]. Par ailleurs, le « processing » de Angptl4 serait variable selon
les tissus et influencerait soit sa sécrétion dans le plasma avec une action endocrine comme
dans le foie, soit une action locale autocrine/paracrine comme dans le tissu adipeux [Li’06].
Seule une mutation avec perte de fonction de Angptl3 a été mise en évidence chez des
souris avec hypotriglycéridémie malgré une insulinorésistance et une hyperglycémie [Shi’02].
Le rôle physiopathologique de ces deux protéines chez l’homme n’est pas établi. Bien que
leur implication dans les HTG soit moins probable que les gènes précédents, on pourrait
imaginer des mutations gains de fonction à l’origine d’HTG chez l’homme.
Malgré les progrès dans la connaissance du métabolisme des triglycérides,
l’identification de mutations sur les gènes impliqués ne permet actuellement d’élucider
qu’environ 30 % des situations d’hyperchylomicronémies. Les co-facteurs génétiques de
susceptibilité, présents dans environ 30 % des cas sans mutation, ne suffisent généralement
pas à expliquer l’intensité du tableau clinique [Mou’06]. L’identification de nouveaux gènes
candidats et l’exploration systématique des sujets hyperchylomicronémiques est donc cruciale
pour améliorer la compréhension des mécanismes de régulation de la lipolyse des LRTG.
33
CHAPITRE 3.
L’apolipoprotéine AV, un nouvel acteur du métabolisme
des triglycérides : revue de la littérature
I. Découverte du gène APOA5
Le gène de cette nouvelle apolipoprotéine a été identifié en 2001 de manière
concomitante par deux équipes indépendantes, en utilisant deux approches très différentes.
A. RAP 3 – régénération hépatique précoce chez le rat
L’équipe hollandaise de Van Der Vliet et al. a identifié 3 gènes inconnus dénommés
Regeneration Associated
Protein (RAP) 1, 2 et 3, exprimés à la phase précoce de
régénération hépatique après hépatectomie partielle (70 %) chez le rat [Van’01]. Le gène
RAP3 était celui dont l’ARNm était le plus fortement exprimé. La séquence de l’ADN
complémentaire (ADNc) de RAP3, identifiée à partir d’une banque d’ADNc hépatique de rat,
présentait 90 % d’homologie avec une séquence inconnue d’un clone d’expression d’ADNc
de foie de souris, et 80 % avec une séquence du chromosome humain 11q23 située à
proximité du cluster APOA1/C3/A4.
La protéine RAP3 codée par ce gène jusque-là inconnu, possédait un peptide signal
clivable traduisant la capacité sécrétoire de cette protéine exprimée dans le foie, une
homologie de 20 à 28 % avec les apolipoprotéines AIV et AI de différentes espèces, et une
structure secondaire de type alpha-hélicoïdale. L’ensemble de ces caractéristiques, puis la
mise en évidence de la protéine dans la plasma de rat témoin associée aux particules HDL, ont
finalement permis de la renommer apolipoprotéine AV (apoAV).
34
B. Comparaison génomique entre l’homme et la souris
La comparaison génomique consiste à un réaliser un séquençage comparatif du
génome de différentes espèces afin d’identifier des régions hautement conservées au cours de
l’évolution, et donc susceptibles de comporter des séquences fonctionnelles importantes. La
mise à disposition de la carte complète du génome humain ainsi que de diverses espèces
animales a permis l’essor de ce type d’approche ces dernières années. Ainsi, de nouveaux
gènes ou séquences régulatrices ont pu être identifiés [Pen’03].
L’équipe américaine de Pennacchio et al. [Pen’01] s’est intéressée à la région du
cluster APOA1/C3/A4 sur le chromosome 11q23, région d’intérêt particulier dans le
métabolisme des lipides [Gro’01]. Ainsi, en comparant l’ADN génomique de l’homme et de
la souris sur une région de 200 kb, ils ont identifié une séquence putative d’apolipoprotéine
appelée apoAV. De nouveau, l’étude de la protéine codée par ce gène a révélé une forte
homologie avec l’apoAIV et des caractéristiques de liaison aux lipides propres aux
apolipoprotéines [Pen’01]. Par ailleurs, comme il sera détaillé ultérieurement, l’étude de
modèles animaux transgéniques puis les études d’association génétique chez l’homme ont
montré l’implication de l’apoAV dans le métabolisme des TG.
II. Le gène humain APOA5 : caractéristiques structurales et expression
A. Structure du gène et des transcrits
Le gène APOA5 se situe environ 27 kb en aval du gène APOA4 au sein du cluster
APOA1/C3/A4 sur le chromosome humain 11q23 (Figure 6) [Pen'01, Van'01].
APOA1
APOC3
APOA4
APOA5
Sens de la transcription
Figure 6 : Représentation simplifiée du cluster APOA1/C3/A4/A5
D’après [Van’01]
35
Le nombre d’exons et l’organisation structurale de la région 5’ du gène,
contradictoires dans les études princeps [Pen’01, Van’01], ont été élucidés grâce aux études
de transcrits de Prieur et al. [Pri’03]. Le gène est composé de 4 exons avec une organisation
structurale très proche de celle des autres apolipoprotéines du cluster APOA1/C3/A4. Ces
similarités suggèrent l’existence d’un gène ancestral commun à l’origine de ces
apolipoprotéines au cours de l’évolution (Figure 7) [Pri’03].
17
63
157
659
APOA1
196
186
588
17
68
124
308
APOC3
625
162
135
1837
127
1180
APOA4
357
12
777
57/81
112
1155/1698
APOA5
511/487
114
518
Les chiffres indiquent les distances en pb. Les exons sont représentés par les rectangles avec les régions
transcrites en noir et les introns par les lignes les séparant.
Figure 7 : Comparaison de la structure des gènes APOA1/C3/A4 et A5
D’après [Pri’03]
Un seul site initiateur de la transcription a été identifié (+1), comme le suggérait la
présence 30 nucléotides en amont d’une TATA box. Le premier exon contient seulement 12
nucléotides non traduits. La transcription de l’exon 2 comprend soit 57 nucléotides (exon 2b)
soit 81 nucléotides (exon 2a + 2b) en fonction de l’utilisation ou non d’un site interne
accepteur d’épissage dans l’exon 2. Ainsi les transcrits peuvent contenir 2 types des
36
séquences non traduites en 5’. L’exon 4 contient 2 sites alternatifs de polyadénylation
différents seulement par la taille de leur région 3’ non codante [Pri'03], comme l’avaient
initialement supposés Pennacchio [Pen’01] et Van der Vliet [Van’01] en constatant
l’existence de 2 transcrits d’environ 1,3 et 1,9 kb dans le foie humain (Figure 8). On ignore si
les régions 3’ et 5’ non codantes alternatives ont une fonction différentielle. Il existe par
ailleurs deux codons ATG en phase dans l’exon 2, distants de 9 pb, mais seul le premier est
utilisé comme site initiateur de la traduction [Pri'03, Tal'05].
site accepteur interne
+1
ATG
3’UTR
2a 2b
exon 1
exon 2
exon 3
exon 4
Les exons sont représentés par les rectangles avec les régions transcrites en noir.
Les lignes relient les sites d’épissage. +1 est le site initiateur de la transcription.
Figure 8 : Structure du gène APOA5 et transcription
B. L’apolipoprotéine AV
1. Structure et propriétés physico-chimiques
L’apolipoprotéine AV (apoAV) est une protéine composée de 366 acides amines (AA)
chez l’homme. Les 23 premiers AA de la protéine constituant un peptide signal clivable,
l’apoAV mature contient 343 AA et possède une masse molaire moléculaire de 39
kDa [Bec’03, Alb’06]. Elle présente 27 % d’identité avec l’apoAIV [Pen’01]. On ne trouve
pas de site de glycosylation ou de modification lipidique dans la structure de la protéine, mais
quelques sites communs de phosphorylation [Bec’03, Wei’03].
37
L’apoAV possède des propriétés différentes des autres apolipoprotéines échangeables
[Wei’03]. Elle est très faiblement soluble seule en solution entre les pH 3,5 et 9,0, mais est
soluble à pH neutre associée aux lipides [Bec’03]. Les études de surface chimique ont montré
une grande affinité, une faible élasticité et une cinétique d’interaction lente avec les surfaces
hydrophobes [Wei’03]. Ceci suggère une liaison forte aux lipides dans les lipoprotéines, une
faible échangeabilité, ou une forte liaison intracellulaire aux membranes [Bec’03, Wei’03].
Les analyses informatiques de la séquence de la protéine ont révélé une structure
secondaire riche en alpha (α) hélices (47 à 83 % selon les logiciels) mais également en
feuillets bêta (β) et coudes β [Bec’03, Wei’03]. Ces régions α-hélicoïdales, séparées par des
résidus proline, en font une apolipoprotéine originale à domaines multiples dont les propriétés
physiques différentes pourraient leur conférer des rôles fonctionnels distincts [Wei’03,
Sun’06]. Weinberg et al. ont ainsi identifié cinq régions :
- la région des AA 1 à 60 est une région hydrophile, modérément amphipathique,
typique du domaine globulaire N-terminal des apoAI, IV et E.
-
la région des AA 61 à 170 est très hydrophobe mais peu amphipathique.
-
la région des AA 171 à 245 comporte 3 α-hélices très hydrophobes et fortement
amphipathiques, et est prédite pour avoir la plus forte activité de surface.
-
les régions 246-295 et 296-343, délimitées par les prolines multiples, sont relativement
hydrophiles sans structure secondaire prédominante (Figure 9) [Wei’03].
Sun et al. ont ultérieurement publié une structure très proche séparée en 6 domaines :
AA 1-51, AA 51-128, AA 132-188, AA 192-238, AA 246-299, AA 301-343. Par des
techniques d’expression in vitro de protéines mutantes délétées successivement pour chaque
domaine identifié, le domaine 192-238 est apparu nécessaire à la fois pour l’activation de la
LPL et pour la liaison aux lipides [Sun’06]. L’extrémité C-terminale (AA 301-343 [Sun’06]
ou 296-343 [Bec’07]) interviendraient également fortement dans la liaison de l’apoAV aux
lipides (Figure 9).
L’extrémité C-terminale de l’apoAV présenterait également 55 % d’identité avec le domaine
239-260 de la MTP de la souris, enzyme clé pour l’assemblage intra-hépatique des
lipoprotéines [Wei’03]. L’absence d’implication de la région C-terminale (AA 293-242) dans
la structure α-hélicoïdale de la protéine a été confirmée dans une autre étude [Bec’06]. En
revanche, l’extémité N-terminale (AA 1-146) adopterait bien une structure en α-hélice
amphipathique [Won’08].
38
Enfin, un domaine putatif de liaison à l’héparine a été identifié entre les AA 186 à 227,
région riche en charges positives [Loo’05]. Cette région serait également impliquée dans la
liaison de l’apoAV à la famille des récepteurs du LDLc dont le récepteur LRP. La mutation de
2 AA chargés positivement au milieu de cette région (Arginine 210 et Lysine 211) diminuait
de manière très importante la liaison de l’apoAV à la fois à l’héparine et aux R-LDL [Nil’07].
hydrophobe ++
amphipathique ++
hydrophile
amphipathique
NH2
1
hydrophobe ++
amphipathique +/-
60
170
hydrophile
245
343
COOH
domaine de liaison
à l’héparine
domaine d’activation
de la LPL
domaines de
liaison aux lipides
Figure 9 : Schéma des différents domaines de l’apolipoprotéine AV mature
D’après [Wei’03, Loo’05, Sun’06, Bec’07]
2. Expression tissulaire et distribution sur les lipoprotéines circulantes
L’apoAV est sécrétée par le foie et circule dans le plasma liée aux lipoprotéines
VLDL, HDL et chylomicrons mais pas aux LDL [Pen’01, Van’01, Obr’05, Alb’06], ni aux
IDL, ni dans la fraction non liée aux lipides du plasma [Alb’06]. Ceci suggère d’une part que
l’apoAV ne circule pas sous forme libre dans le plasma, et d’autre part que la conversion des
VLDL en IDL s’accompagne de la perte de l’apoAV, probablement par échange avec les
HDL [Alb’06], en accord avec les propriétés physico-chimiques de faible solubilité en
l’absence de lipides et de forte liaison aux lipides [Bec’03, Wei’03]. Il existerait également
39
des transferts d’apoAV des HDL vers les VLDL : l’apoAV pourrait être majoritairement liée
aux HDL à jeun et être transférée sur les VLDL en phase post-prandiale [Pru’05a]. Ce
transfert d’apoAV des HDL vers les VLDL, dont la signification n’est pas claire, a également
été constaté chez les souris lors de la stimulation de la lipolyse [Fru’04, Mer’05a].
Par ailleurs, l’apoAV ne circulerait que sous forme monomérique et non sous forme homo ou
hétéro-dimérique [Alb’06].
Pendant longtemps, l’apoAV a semblé exclusivement synthétisée au niveau hépatique
chez l’homme et la souris [Pen’01, Van’01]. Bien que la liaison de l’apoAV aux
chylomicrons laissait suspecter une expression intestinale du gène APOA5, avec assemblage
de l’apoAV aux chylomicrons dans les entérocytes, la recherche d’ARNm par Northern Blot
[Pen’01] ou dans des lignées cellulaires humaines par RT-PCR [Pri’05a] s’était révélée
négative en dehors du tissu hépatique dans les premières études. La présence d’apoAV dans
les chylomicrons était alors supposée provenir des échanges d’apolipoprotéines avec les
autres lipoprotéines circulantes dont les HDL.
Cependant, deux communications récentes de l’équipe espagnole de Ribalta ont révélé une
expression intestinale de l’APOA5 chez l’homme avec détection d’ARNm dans l’intestin
grêle, principalement le duodénum [Gua’07, Gua’08], dans le colon [Gua’08], et dans une
lignée cellulaire intestinale (TC7) [Gua’07, Gua’08].
3. Concentrations plasmatiques d’apoAV
Les concentrations plasmatiques d’apoAV sont très faibles, de l’ordre du µg/l (ou
ng/ml). Les valeurs moyennes d’apoAV mesurées dans des échantillons de sujets sains de
petite taille sont très variables entre 10 et 400 µg/l avec des intervalles de valeurs très larges
(Tableau 1). Ces variations pourraient s’expliquer par les origines ethniques variées des
populations étudiées et les différentes techniques de dosages ELISA (Enzyme-linked immuno
absorbent assey) utilisées. En effet, il n’existe actuellement pas de dosage standardisé de
l’apoAV, permettant une comparaison fiable entre les différentes études. Les dosages de
Schaap et Hahne [Sch’06, Hah’08] semblent donner des valeurs plus élevées que ceux
Ishihara et O’Brien [Ish’05, Obr’05] dans des populations caucasiennes. Les dosages
d’Ishihara et Zhao donnent des résultats proches pour des populations d’origine asiatique
[Ish’05, Zha’07] (Tableau 1).
40
Réf. de
Population
[apoAV]
[apoAV]
Réf. du
Lim. de
l’étude
(H/F)
mini-max*
moy +/- DS*
dosage
détection*
[Ish’05]
196 (105/91)
japonaise
nd
179.2+/-74.8
[Ish’05]
nd
[Obr’05]
40 (nd)
américaine
24 - 406
157
[Obr’05]
17
[Pru’05a]
12 (12/0)
française
nd
10
[Fru’04]
nd
[Sch’06]
42 (21/21)
hollandaise
8.3 - 742
258+/-146
[Sch’06]
0.2
[Tal’06]
299 (299/0)
britannique
nd
113+/-50.3
[Ish’05]
nd
[Zha’07]
92 (50/42)
chinoise
5.4 - 455.6
182.7+/-104.7
[Zha’07]
8
[Hah’08]
22 (12/10)
européenne
nd
400+/-153
[Sch’06]
0.2
Origine
* en µg/l
[apoAV] : concentration d’apoAV; H/F : homme/femme ; Lim : limite ; Mini-maxi : valeur minimale et
maximale ; Moy. +/- DS : moyenne +/- Déviation standard ; Nd : non disponible ; Réf : référence.
Tableau 1 : Concentrations plasmatiques d’apoAV chez les sujets sains
Les variations physiologiques des concentrations plasmatiques d’apoAV sont mal
connues. Une étude a rapporté une corrélation négative entre les concentrations d’apoAV et
l’âge [Zha’07] mais pas une autre [Hah’08]. Les résultats concernant une éventuelle
association des concentrations d’apoAV avec l’IMC (Indice de masse corporelle) sont très
discordants : une étude a mis en évidence une corrélation négative de l’apoAV avec l’IMC
[Zha’07] et une autre une corrélation positive [Tal’06]. Une 3ème n’a pas retrouvé
d’association avec l’IMC : les concentrations d’apoAV n’étaient pas significativement
différentes entre sujets obèses et sujets témoins [Hah’08]. Toutefois, il pourrait exister une
variation selon le sexe : les concentrations plasmatiques d’apoAV étaient significativement
plus élevées chez les femmes que chez les hommes (+ 20 et 40 %) dans 2 études [Ish’05,
Hah’08] y compris après ajustement sur l’âge et l’IMC [Hah’08], avec une tendance non
significative dans une autre étude [Zha’07].
En comparaison avec d’autres lipoprotéines circulantes, les concentrations d’apoAV
sont 10 000 fois plus faibles que les concentrations d’apoAI, qui sont autour de 1 g/l. En
termes de répartition sur les lipoprotéines, il a été estimé que seulement 1/1000 lipoprotéine
contenant une molécule d’apoB contient aussi une molécule d’apoAV [Obr’05]. Il est donc
41
peu vraisemblable qu’il s’agisse d’une simple protéine de structure. En fait, ce calcul était
basé sur les concentrations d’apoB. Or, seulement 6 % de l’apoB est associé aux VLDL et
l’apoAV n’est pas liée aux LDL. Merkel a donc estimé que 1/24 VLDL contiendrait une
molécule d’apoAV [Mer’05b].
III. Régulation de l’expression du gène APOA5
A. Régulation par les récepteurs nucléaires
1. Rappels
Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription pouvant être activés par
des ligands. Ces récepteurs agissent généralement sous forme d’homodimères ou
d’hétérodimères avec le récepteur à l’acide rétinoïque RXR, et se lient à des séquences
d’ADN spécifiques appelés éléments de réponse (responsive elements) au niveau des
promoteurs des gènes. Ils régulent l’activité du promoteur et la transcription des gènes cibles
[Edw’02].
2. Régulation par PPARα
PPARα (Peroxysome proliferator-activated Receptor alpha) est un récepteur nucléaire
activé par les acides gras (AG). Il joue un rôle clé dans la régulation des gènes impliqués dans
le métabolisme des TG. Il augmente le transport et la capture des AG par le foie, leur
catabolisme par β-oxydation, et diminue ainsi les substrats disponibles pour la synthèse des
TG et des VLDL par le foie. Il stimule la lipolyse et la clairance des LRTG par le foie en
augmentant l’activité de la LPL, d’une part par activation directe de son expression hépatique
et d’autre part en diminuant la sécrétion hépatique de l’apoCIII [Tor’01, Fra’03]. Les fibrates,
agonistes PPARα, sont des hypolipémiants qui diminuent les TG, le LDLc et augmentent le
HDLc [Fra’03].
42
Deux équipes ont simultanément identifié au sein du promoteur de l’APOA5 un
élément de réponse PPARα fonctionnel de type DR1 (Direct Repeat 1), différant seulement de
1 nucléotide de la séquence consensus classique (position -271 à -259) (Figure 10). Dans des
lignées hépatocytaires humaines, PPARα et ses agonistes activent le promoteur de l’APOA5 et
stimulent la transcription du gène, par fixation spécifique du dimère PPARα-RXR sur la
séquence consensus DR1 [Pri’03, Vud’03]. De même, dans un modèle cellulaire intestinale
(TC7), l’expression de l’APOA5 est stimulable par un agoniste PPARα [Gua’07, Gua’08]. Les
effets des agonistes PPARα ont été confirmés in vivo chez le singe : l’administration d’un
agoniste PPARα diminue les triglycérides de 50 % et multiplie les concentrations circulantes
d’apoAV et le rapport apoAV/apoCIII par 2 [Sch’05].
-1131T>C
DR4
E box
E box
-3A>G
Figure 10 : Schéma du promoteur de l’APOA5
43
Les fibrates régulent de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme des lipides
mais l’APOA5 serait le premier gène d’apolipoprotéines diminuant les TG formellement
identifié comme une cible positive directe des agonistes PPARα [Vud’03].
Dans l’hypothèse où l’apoAV diminuerait la synthèse ou la sécrétion des VLDL, la régulation
de l’expression de l’APOA5 par PPARα pourrait rediriger les TG de la voie sécrétoire vers la
voie oxydative [Van’04].
La modulation de l’APOA5 par PPARα ouvre de nouvelles stratégies d’intervention
pour corriger l’HTG et limiter l’effet des TG dans les maladies métaboliques et sur le risque
cardiovasculaire.
3. Régulation par FXR
FXR (Farnesoid X-activated Receptor), activé par les acides biliaires, est également un
récepteur nucléaire décrit comme clé dans le métabolisme des TG [Edw’02]. Chez la souris,
les ligands des FXR diminuent les TG de plus de 50 % [Kas’01]. Les souris déficientes en
FXR ont des TG augmentés de 150 % [Sin’00]. Outre son rôle essentiel dans le métabolisme
des acides biliaires, FXR intervient dans le métabolisme des lipoprotéines : il induit en
particulier l’expression de l’apoCII, activateur de la LPL, augmentant ainsi l’hydrolyse des
LRTG [Kas’01, Edw’02].
Prieur et al. ont identifié un élément de réponse FXR fonctionnel dans le promoteur de
l’APOA5, dénommé IR8 (Inverted repeat) (position -103 à 84, Figure 10). Les agonistes FXR
ou les acides biliaires sont capables d’activer le promoteur de l’APOA5. Mais
paradoxalement, ils n’augmentent pas significativement la transcription des ARNm de
l’APOA5 dans les cultures d’hépatocytes [Pri’03]. D’autres éléments pourraient interférer
dans la régulation de l’APOA5 par FXR, en particulier d’autres facteurs de transcription.
44
4. Régulation par LXR et SREBP-1c
LXR (Liver X-activated Receptor) joue un rôle important dans la régulation du
métabolisme du cholestérol et des AG. LXR est activé par les oxystérols, dérivés monooxydés du cholestérol. Outre le contrôle de gènes impliqués dans la synthèse hépatique du
cholestérol et le transport inverse du cholestérol, LXR module l’expression de gènes
impliqués dans le métabolisme des TG : stimulation de l’expression la LPL, de l’apoCII, et de
l’apoE [Mil’03]. Les effets lipogéniques de LXR sont attribués en grande partie à l’action de
SREBP-1c (Sterol regulatory element binding protein 1c) [Yos’01]. SREBP-1c est un facteur
de transcription de type hélice-boucle-hélice leucine zipper, régulant la transcription de
nombreux gènes du métabolisme des AG et des TG. L’expression de SREBP-1c est stimulée
par LXR [Yos’01] mais aussi par l’insuline [For’99].
Jakel et al. ont montré qu’un ligand de LXR (T0901317) entraîne une diminution de
l’expression des ARNm de l’APOA5. L’effet est dépendant de SREBP-1c qui se lie au
promoteur de l’APOA5 et réprime son activité. Deux motifs de type E-box capables de lier
spécifiquement SREPB-1c ont été mis en évidence dans le promoteur de l’APOA5 en position
-81/-76 et +10/+15. Mais seule la mutation de la E-box en position +10/+15 supprime l’action
de SREBP-1c. Le rôle de SREBP-1c dans la régulation de l’APOA5 par LXR a été confirmé
in vitro en utilisant des siRNA (small interference RNA) qui suppriment spécifiquement
l’expression de SREBP-1c, et in vivo chez les souris transgéniques APOA5 : le ligand de LXR
augmente l’expression ARNm de SREBP-1c, diminue de l’expression des ARNm de
l’APOA5, avec au final une diminution des concentrations plasmatiques de l’apoAV et une
majoration des TG (Figure 11) [Jak’04].
Ces travaux ouvrent des perspectives pour développer un ligand sélectif de LXR
hypotriglycéridémiant qui bloquerait l’action de SREBP-1c.
45
Ligand
LXR
FXR
Gène SREBP-1c
ARNm SREBP-1c
Protéine SREBP-1c
Gène APOA5
E box
ARNm APOA5
APOAV
TG
Figure 11 : Régulation de l’expression de l’APOA5 par LXR et SREBP-1c
5. Régulation par RORα
Le récepteur RORα appartient à la famille des récepteurs nucléaires orphelins, c'est-àdire ne possédant pas de ligand connu. RORα joue un rôle protecteur contre l’athérosclérose
chez la souris, notamment dans le métabolisme lipidique et dans l’inflammation. RORα
stimule directement la transcription des gènes APOA1 et APOC3 conduisant respectivement à
augmenter le HDLc protecteur et diminuer les TG. Il diminue également la production de
cytokines pro-inflammatoires [Bou’04].
Les travaux des équipes de Genoux et de Lind ont mis en évidence une fixation
spécifique de RORα sur la séquence consensus DR1 du promoteur de l’APOA5, déjà
identifiée pour les PPARα. RORα stimule l’activité transcriptionnelle du promoteur de
l’APOA5 de manière dose-dépendante dans les lignées hépatocytaires humaines [Gen’05,
Lin’05]. L’élément de réponse DR1 de l’APOA5 est donc commun à PPARα et à RORα ; il
46
pourrait exister une coopération ou une compétition entre ces 2 récepteurs nucléaires [Lin’05].
Or, les AG activent PPARα alors que le cholestérol pourrait être un ligand de RORα
[Bou’04]. L’APO5 pourrait ainsi être activée de manière différentielle en fonction du contexte
physiopathologique.
Il n’existe actuellement pas de ligand synthétique de RORα, mais leur développement
pourrait s’avérer intéressant pour approfondir ses mécanismes d’action.
6. Régulation par HNF-4α
HNF-4α est un récepteur nucléaire orphelin qui joue un rôle important dans la
régulation de la transcription de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et
lipidique, comme les gènes du cluster APOA1/C3/A4, de l’APOC2, de l’APOB, de la MTP et
de la glucose-6-phosphatase (G6Pase). Le KO hépatique sélectif du gène hnf-4α chez la
souris entraîne une stéatose hépatique et réduit drastiquement les concentrations plasmatiques
de cholestérol total (CT) et de TG par diminution de la sécrétion des VLDL [Hay’01]. Des
mutations de HNF-4α sont responsables d’une forme monogénique de diabète, le diabète
MODY1 (Maturity onset diabetes of the young 1) [Yam’96]. Les ligands de HNF-4α ne sont
pas clairement identifiés. HNF4α serait plutôt activé par des co-activateurs comme PGC-1α
(PPARγ-coactivator-1α), également impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique
[Rhe’03, Dud’04].
Prieur et al. ont étudié la régulation de l’APOA5 par HNF-4α. Leurs travaux ont
montré que HNF-4α active l’expression du gène APOA5 par fixation directe des dimères
d’HNF-4α sur 2 types de séquences consensus du promoteur précédemment identifiées : DR1
(position -271 à - 259) et IR8 (position -103 à -84) (Figure 10). Le co-activateur PGC-1α est
capable de stimuler la transactivation du promoteur de l’APOA5 par HNF-4α. De plus, cette
étude a mis en évidence que les voies de signalisation MAP-kinase et AMPK (AMP-activated
protein kinase) réguleraient l’expression du gène APOA5 au moins en partie via HNF-4α : la
phosphorylation de HNF-4α par ces 2 voies empêcherait sa dimérisation et sa fixation sur les
séquences DR1 et IR8, et donc diminuerait l’expression de l’APOA5 [Pri’05a].
47
Le KO hépatique sélectif de hnf-4α chez la souris entraînant une diminution des TG par
[Hay’01], on se serait donc plutôt attendu à une inhibition de l’expression de l’APOA5 par
HNF-4α. La régulation du métabolisme des TG par l’action d’HNF-4α est donc probablement
plus complexe.
L’élément de réponse DR1 de l’APOA5 est commun avec PPARα et RORα et
l’élément IR8 avec FXR, suggérant une grande complexité avec des interactions potentielles
multiples entre les différentes voies de régulation de l’expression de l’APOA5. Par exemple,
on sait que les acides biliaires réduisent l’expression de HNF-4α et ainsi l’expression de ces
gènes cibles [Dud’04], donc possiblement celle de l’APOA5. Or, comme on l’a vu
précédemment, les acides biliaires, agonistes FXR, sont également capables d’activer le
promoteur de l’APOA5 après fixation de FXR sur IR8 [Pri’03]. Il pourrait donc exister une
balance entre ces deux voies de régulation de l’expression de l’APOA5 par les acides biliaires
via IR8 (Figure 12).
Acides biliaires
+
-
FXR
HNF4α
Figure 12 : Régulation de l’expression de
l’APOA5 par les acides biliaires
IR8
Activité du
promoteur APOA5
48
B. Régulation par l’insuline et par le glucose
L’insuline et le glucose joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme
glucidique et lipidique au niveau hépatique, du tissu adipeux et du muscle [Obr’96, Vau’00].
L’insuline régule notamment l’oxydation hépatique des AG, la lipogenèse à partir du glucose
dans le foie et le tissu adipeux, ainsi que l’exportation des AG du foie vers les tissus
périphériques [Obr’96]. Le glucose est également impliqué dans le métabolisme des AG en
activant la synthèse d’enzymes des voies glycolytique et lipogénique [Vau’00]. Chez
l’homme, les états d’insulinorésistance observés dans le syndrome métabolique ou le diabète
de type 2 s’accompagnent d’une HTG [Kra’04]. Cependant, les mécanismes de régulation des
gènes impliqués dans le métabolisme lipidique par l’insuline ou par le glucose ne sont pas
complètement identifiés.
1. Régulation par l’insuline
Nowak et al. ont étudié la régulation de l’APOA5 par l’insuline et les voies de
signalisation impliquées. Leurs travaux ont mis en évidence que l’expression du gène APOA5
est réprimée par l’insuline de manière dose-dépendante dans différentes lignées cellulaires
hépatiques et in vivo chez le rat. L’insuline inhibe l’activité du promoteur de l’APOA5 de
manière indirecte par l’intermédiaire de facteurs de transcription de type USF1/2 (Upstream
Stimulatory Factor 1 et 2). USF1/2 se fixent spécifiquement sur la E-box en position -81/-76
et stimulent l’activité du promoteur de l’APOA5. L’insuline agirait en diminuant la fixation
des USF sur la E-box. Or, la fixation d’USF1/2 sur le promoteur de l’APOA5 dépend de leur
état de phosphorylation : les formes non-phosphorylées d’USF1/2 se lient à la E-box alors que
les formes phosphorylées perdent leur capacité de fixation. La répression de gène APOA5 par
l’insuline impliquerait la phosphorylation d’USF1/2 via la voie Pi3 kinase, indépendamment
de la voie MAP kinase-PKC (Figure 13) [Now’05].
49
Gène APOA5
E box
USF1/2
INSULINE
ARNm APOA5
PP1/
PP2A
Pi3K
+
GLUCOSE
+
P
USF1/2
Gène APOA5
E box
ARNm APOA5
Figure 13 : Régulation de l’expression du gène APOA5 par l’insuline et par le glucose
On a vu que SREBP-1c et USF1/2 se fixent sur les E-box du promoteur de l’APOA5.
Bien qu’il semble exister une certaine spécificité des USF et de SREBP-1c respectivement
pour la 1ère (-81/-76) et la 2ème E-box (+10/+15), on peut imaginer une compétition entre ces 2
facteurs de transcription pour la régulation de l’APOA5 (Figure 14).
Insuline
LXR
+
-
SREBP-1c
USF1/2
E-Box
Figure 14 : Compétition des USF
et de SREBP-1c sur les E-box
du promoteur de l’APOA5
Transcription
de l’APOA5
50
Par ailleurs, chez l’homme, l’hyperinsulinémie expérimentale, induite lors d’un clamp
euglycémique hyperinsulinique, s’accompagne d’une diminution des concentrations
plasmatiques d’apoAV sans toutefois augmenter la triglycéridémie [Now’05].
2. Régulation par le glucose
Nowak et al. ont également étudié le rôle du glucose dans la régulation de l’expression
d’APOA5. Ils ont mis en évidence une activation spécifique, temps et dose dépendante de
l’expression du gène APOA5 par le glucose dans différentes lignées hépatocytaires. Le
glucose active indirectement le transcription du gène APOA5 en facilitant la liaison d’USF1/2
au promoteur par la voie PP1/PP2A (type 1 and 2a protein phosphatase) : les formes
déphosphorylées d’USF1/2 se fixent ensuite sur la 1ère E-Box (-81/-76) et stimulent l’activité
du promoteur de l’APOA5 (Figure 13). L’implication d’USF1/2 et de PP1/PP2A a dans la
régulation de l’APOA5 par le glucose a été confirmée par utilisation de siRNA spécifique
[Now’08].
En résumé, l’insuline réprime l’expression de l’APOA5 alors que le glucose stimule
son expression. Or, en pratique clinique, l’action de l’insuline est hypotriglycéridémiante et
on s’attendrait à une activation du gène l’APOA5. De même, l’hyperglycémie dans le diabète
de type 2 s’accompagne d’une HTG, et on aurait plutôt envisagé un rôle inhibiteur du glucose
sur l’expression de l’APOA5. La régulation de l’APOA5 par l’insuline et le glucose est donc
probablement plus complexe avec peut-être des effets variables en fonction du niveau
d’insulinosécrétion, d’hyperglycémie et du degré insulinorésistance. Les données actuelles ne
permettent donc pas d’intégrer de manière évidente l’apoAV dans la physiopathologie des
dyslipidémies du diabète de type 2.
C. Régulation par les hormones thyroïdiennes
Prieur et al. ont montré que l’hormone thyroïdienne T3 et un agoniste des récepteurs
nucléaires β aux hormones thyroïdiennes (TRβ) augmentent l’expression de l’ARNm de
l’APOA5 et la sécrétion de la protéine apoAV dans des cultures d’hépatocytes. Après
51
hétérodimérisation avec RXR, le récepteur aux hormones thyroïdiennes se fixe sur le
promoteur de l’APOA5 sur une séquence consensus de type DR4 en position -113/-98 (Figure
10). Une activation synergique du promoteur de l’APOA5 par les facteurs de transcription
USF et par le récepteur aux hormones thyroïdiennes a également été mise en évidence. In
vivo, chez le rat rendu hypothyroïdien par le PTU, on note une diminution significative des
concentrations plasmatiques d’apoAV restaurées par l’administration de T3. Ceci suggère une
corrélation entre les concentrations plasmatiques d’apoAV et le statut hormonal thyroïdien.
L’agoniste sélectif de TRβ augmente les concentrations plasmatiques d’apoAV, ainsi que la
clairance des VLDL, et diminue fortement les TG [Pri’05b].
Ces travaux fournissent donc un mécanisme potentiel pour expliquer la diminution de
la clairance des VLDL et la diminution de l’activité LPL notée chez les patients
hypothyroïdiens, et au contraire la stimulation de l’activité LPL par les hormones
thyroïdiennes et dans l’hyperthyroïdie [Abr’81, Ito’03]. Par ailleurs, le développement
d’agonistes hépato-séléctifs de TRβ qui, contrairement aux hormones thyroïdiennes, seraient
dépourvus
d’effets
secondaires
cardiovasculaires,
pourrait
constituer
une
piste
pharmacologique intéressante pour le traitement des HTG.
D. Pas de régulation par l’APOC3 enhancer
L’APOC3 enhancer est un élément de régulation situé en amont du gène APOC3
(position -890 à -490) contrôlant l’expression hépatique et intestinale des gènes du cluster
APOA1/C3/A4 [Zan’01] (Figure 15). Afin de définir si l’expression du gène APOA5, dernier
membre identifié de ce même cluster, est également régulée par l’APOC3 enhancer, Gao et al.
ont généré des souris transgéniques surexprimant le cluster APOA1/C3/A4/A5 humain, soit
intact, soit avec une délétion de la séquence APOC3 enhancer. La délétion de l’APOC3
enhancer réduit de manière drastique l’expression des gènes APOA1, APOC3 et APOC4 mais
ne modifie pas l’expression hépatique de l’APOA5 [Gao’05].
52
APOA1
APOAC3
APOC3 enhancer
APOA4
APOA5
Région intergénique APOA5-APOA4
0
10
20
30
40
50
Distance (en kb)
Figure 15 : Cluster APOA1/C3/A4/A5 et position de l’APOC3 enhancer
Il semble intéressant de comprendre pourquoi l’APOC3 enhancer situé seulement 35
kb en amont du gène APOA5 ne régule pas l’expression de ce gène alors que d’autres
enhancers sont capables de contrôler des promoteurs situés à des distances de plus de 100 kb.
Deux études ont proposées récemment des hypothèses distinctes.
La première étude est basée sur l’étude de la structure chromatinique du cluster
APOA1/C3/A4/A5. En effet, les histones jouent un rôle essentiel au maintien de la structure de
la chromatine et leur acétylation ou méthylation jouent un rôle clé dans « l’ouverture » des
régions promotrices nécessaire à la formation des complexes de transcription. Li et al. ont
montré chez des souris transgéniques que l’APOC3 enhancer contrôlerait l’acétylation ou la
méthylation des histones des promoteurs et des régions intergéniques des gènes
APOA1/C3/A4 pour créer une région chromatinique hyperacétylée « ouverte » et activer la
transcription de ces gènes. Le gène APOA5 serait « séparer » de cette région chromatinique
« ouverte » et l’expression de l’APOA5 ne serait donc pas régulée par l’APOC3 enhancer
[Li’08].
La deuxième étude a montré l’existence d’une zone très riche en séquences de type Alu dans
la région intergénique APOA5-APOA4 qui pourraient bloquer l’action de l’APOC3 enhancer
sur le promoteur de l’APOA5 [Rui’08]. En effet, les séquences Alu sont des séquences
53
répétitives d’environ 300 nucléotides, spécifiques du génome des primates, qui contiennent un
promoteur pour l’ARN polymérase de type III et des éléments régulateurs pour l’ARN
polymérase de type II [Sha’04a]. Les séquences Alu sont capables de réguler l’expression des
gènes de voisinage et de bloquer l’activité de séquence enhancer [Has’06].
E. Régulation au cours de l’inflammation
Les processus inflammatoires et infectieux sont impliqués dans la physiopathologie de
l’athérosclérose. Ces états peuvent s'accompagner de modifications du métabolisme lipidique
pro-athérogènes : HTG, diminution du HDLc et présence de LDL petites et denses [Coh’00,
Kho’00]. Khovidhunkit et al. ont étudié la régulation de l’expression de l’APOA5 dans des
conditions d’infection ou d’inflammation en injectant une endotoxine bactérienne chez la
souris, ou en utilisant des cytokines pro-inflammatoires dans des lignées cellulaires
hépatiques humaines. L’endotoxine bactérienne et l’interleukine 6 (IL-6) stimulent la
transcription hépatique de l’ARNm de l’apoAV, mais pas l’IL-1β ou le TNFα [Kho’04].
Précédemment, une équipe a montré que l’expression des ARNm de PPARα et FXR étaient
diminués après injection d’endotoxine chez la souris [Bei’00, Kim’03]. L’augmentation de
l’expression de l’apoAV au cours de l’inflammation ne serait donc pas médiée par ces 2
récepteurs nucléaires.
En conclusion, les effets des différents éléments de régulation de l’expression de
l’APOA5 identifiés sont résumés dans le tableau 2. La connaissance des mécanismes de
régulation du gène APOA5 permettra peut-être dans le futur de mieux connaître la
physiopathologie de certaines dyslipidémies comme dans le diabète, et offre des perspectives
thérapeutiques intéressantes. Cependant la signification biologique de ces régulations in vivo
et l’intégration des différentes voies explorées devront être précisées.
54
Elément de
réponse
Régulation du
promoteur
Effet sur la transcription
du gène APOA5
PPARα
DR1
directe
FXR
IR8
directe
→*
LXR
-
par SREBP-1c/E-box
DR1
directe
HNF-4α
DR1-IR8
directe
Insuline
-
par USF/E-box
Glucose
-
par USF/E-box
H. Thyroïdiennes
DR4
directe
apoC3 enhancer
-
-
→
IL-6 / toxines bact.
-
-
RORα
* activation du promoteur seulement. Bact : bactériennes.
Tableau 2 : Eléments de régulation de l’expression du gène APOA5
IV. ApoAV et paramètres lipidiques
A. Etude des modèles animaux
Les modèles animaux ont fourni les premières preuves tangibles de l’implication de
l’apoAV dans le métabolisme des TG.
1. Souris transgéniques APOA5 et souris KO apoa5
Pennacchio et al. ont montré que les souris transgéniques surexprimant le gène humain
APOA5 avaient une triglycéridémie divisée par 3 par rapport aux souris témoins, alors que les
55
souris dont on invalidait les 2 copies du gène murin apoa5 (KO apoa5) avaient des TG
multipliés par 4 par rapport aux souris témoins, sans modification significative du cholestérol
[Pen’01].
2. Surexpression adénovirale de l’apoa5 chez la souris
Les travaux de Van der Vliet et al. sur des souris surexprimant le gène murin apoa5
grâce à un vecteur adénoviral ont confirmé les résultats précédents : diminution des TG de 70
%, en particulier des TG des VLDL. De plus, ces souris avaient un LDLc mais surtout HDLc
significativement réduit (-40 %), suggérant également un rôle de l’apoAV dans le
métabolisme du cholestérol. Cette discordance avec le modèle précédent pourrait être liée aux
concentrations plasmatiques d’apoaV beaucoup plus élevées dans le modèle adénoviral
[Van’02].
B. Etudes des polymorphismes dans la population générale chez l’homme
1. Polymorphismes nucléotidiques
On désigne par polymorphismes nucléotidiques ou SNP (Single nucleotide
polymorphisms) la mutation d’une base dans le gène définissant un allèle rare ou muté par
opposition à l’allèle fréquent ou sauvage. Pennacchio a décrit les principaux polymorphismes
de l’apoAV étudiés dans la littérature : polymorphismes SNP 1 à 4, puis SNP5 (S19W) et
Kozak [Pen’01, Pen’02]. Olivier les a recensés de manière exhaustive [Oli’04]. Les
principaux polymorphismes étudiés dans la littérature et leurs différentes dénominations sont
présentés dans le tableau 3. Leurs positions dans la séquence du gène sont représentées sur la
figure 16.
56
Numéro SNP
Référence §
-12238 T>C
SNP4
rs625524
-1131 T>C
SNP3
rs662799
Polymorphisme*
-3 A>G
Autres dénominations
rs651821
Kozak
170 C>G
SNP5
rs3135506
S19W – c.56C>G**
751 G>A
SNP2
rs2072560
IVS3+476G>A
1089 G>A
rs3135507
V153M – c.457G>A**
1185 G>T
rs2075291
G185C – c.553G>T**
rs2266788
c.1259T>C**
1891 T>C
SNP1
* position sur l’ADN génomique par rapport à l’ATG
** position sur la séquence codante par rapport à l’ATG,
§
base de données SNP http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/projects/SNP/
Tableau 3 : Principaux polymorphismes du gène APOA5
APOA5
APOA1/C3/A4
5’ UTR
ATG
(+1)
codon
stop
3’ UTR
promoteur
EXON 1
-12238 T>C
SNP4
-1131 T>C
SNP3
EXON 2
-3 A>G
Kozak
EXON 3
170 C>G
S19W
EXON 4
751 G>A 1089 G>A 1185 G>A
SNP2
V153M
G185C
1891 T>C
SNP1
Figure 16 : Localisation des principaux polymorphismes du gène APOA5.
57
2. Haplotypes
Un haplotype est un ensemble de polymorphismes situés à proximité sur un même
chromosome, cohérités ou en déséquilibre de liaison chez de nombreux individus dans la
population. Ainsi, l’identification de l’allèle d’un polymorphisme permet de prédire l’allèle
des autres. Pennacchio et al. [Pen’01, Pen’02] puis Talmud et al. [Tal’02] ont défini trois
haplotypes indépendants : APOA5*1, APOA5*2, APOA5*3 définis par les allèles de 5
polymorphismes du gène (Tableau 4).
Haplotypes
APOA5*1
APOA5*2
APOA5*3
APOA5*4
-1131T>C
T
C
T
C
-3A>G
A
G
A
G
S19W
C
C
G
C
SNP2
G
A
G
G
SNP1
T
C
T
T
Tableau 4 : Principaux haplotypes du gène APOA5
APOA5*1 est l’haplotype sauvage, c'est-à-dire présentant les allèles fréquents de chacun des
polymorphismes.
APOA5*2 est défini par la présence des allèles rares des polymorphismes SNP1, SNP2,
-3A>G et -1131T>C. Tous les polymorphismes étant en fort déséquilibre de liaison avec
-1131T>C, -1131C peut servir de marqueur pour identifier l’haplotype APOA5*2.
APOA5*3 est défini par la présence de l’allèle rare du polymorphisme S19W.
Ces 3 haplotypes représentent environ 98 % des haplotypes chez les caucasiens
[Pen’02] et plus de 90 % chez les asiatiques [Lai’03, Aus’04]. Un autre haplotype fréquent a
été ultérieurement décrit et dénommé APOA5*4 (Tableau 3), retrouvé uniquement chez les
asiatiques [Lai’03, Aus’04] avec une fréquence estimée à 8 % chez les japonais [Aus’04].
58
Les nombreuses études d’association génétique publiées concernent dans leur grande
majorité les polymorphismes -1131T>C et S19W, pour lesquels des effets sur les paramètres
lipidiques ont été observés. Nous présenterons donc essentiellement la fréquence et les effets
lipidiques de ces 2 polymorphismes dans la population générale.
3. Fréquence des polymorphismes dans la population générale
Les nombreuses études publiées ont permis d’établir la fréquence des allèles rares dans
la population générale et montré leur variation en fonction des origines ethniques.
Chez les caucasiens, la fréquence de l’allèle rare -1131C variait entre 5.7 et 9.2 %
selon les études [Pen’01, Pen’02, Tal’02, Mar’03, Hub’04a, Hub’04b, Lai’04, Lee’04, Sza’04,
Klo’05, Elo’06, Gra’07, Lai’07]. Seul Olivier a publié une fréquence nettement inférieure à
3,8 % [Oli’04]. L’allèle rare -1131C était plus fréquent chez les américains d’origine
hispanique (16 %) [Pen’02]. Chez les afro-américains, les résultats sont discordants :
fréquence à 12 % dans une étude [Pen’02] et à 6.6 % dans une autre [Klo’05]. Chez les
Asiatiques, l’allèle rare était très nettement surreprésenté par rapport aux caucasiens : 28.5 à
34.9 % chez les Chinois [Bau’03, Lai’03, Bi’04, Li’04, Bau’07], 30.5 à 38 % chez les
Japonais [End’02, Nab’02, Aus’04, Yam’07a], 29,6 % chez les Malaisiens et 23,2 % chez les
Indiens [Lai’03].
b. Polymorphisme S19W
Chez les caucasiens, la fréquence de l’allèle rare 19W variait entre 3,8 et 7,8 % selon les
études [Pen’01, Pen’02, Tal’02, Hub’04a, Mar’03, Lai’04, Lee’04, Klo’05, Elo’06, Gra’07,
Lai’07, Dal’08] et était comparable chez les afro-américains (6 à 7 %) [Pen’02, Klo’05].
Hubacek a retrouvé une fréquence à 11,75 % chez des Tchèques, mais ceux-ci présentaient en
fait une HTG modérée [Hub’04b]. Chez les Américains d’origine hispanique, la fréquence
était supérieure, estimée à 15 % [Pen’02]. En revanche, ce polymorphisme était très rare chez
59
les asiatiques : 0,6 % chez les Japonais [Aus’04], 2,3 % dans une étude cas-témoins chinoise
[Liu’05]
c. Autres polymorphismes
Le polymorphisme G185C était fréquent dans les populations d’origine asiatique (4 à
13.5 %) [Kao’03, Jia’05, Hsu’06, Tan’06, Mat’07, Pul’08, Yam’08] mais rare (2 %) [Rui’05,
Wri’06] voire absent [Pen’02, Hub’04a, Oli’04, Chi’05] dans les populations d’origine
caucasienne.
La fréquence du polymorphisme V153M était entre 3 et 6 % chez des caucasiens
tchèques [Hub’04a, Hub’04b, Chi’05], mais très faible (0.3 %) dans une autre cohorte
caucasienne [Hub’08b] et plus élevée chez les asiatiques (10.3 %) [Kao’03].
4. Association des polymorphismes aux paramètres lipidiques
a. Triglycérides
Pennacchio [Pen’01, Pen’02] et Talmud [Tal’02] ont, les premiers, montré une
association entre les allèles rares des polymorphismes -1131T>C ou S19W et une
augmentation de la triglycéridémie dans plusieurs cohortes indépendantes de sujets caucasiens
sains. Ils ont mis en évidence un effet indépendant et additif de chaque polymorphisme.
De nombreuses études ont ensuite confirmé l’association entre le polymorphisme
-1131T>C et les TG dans la population générale caucasienne [Aou’03, Mar’03, Hub’04a,
Hub’04b, Lai’04, Lee’04, Sza’04, Klo’05, Elo’06, Gra’07, Lai’07] et au sein de différentes
groupes ethniques : Chinois [Bau’03, Lai’03, Bi’04, Li’04, Liu’05], Japonais adultes [Nab’02,
Yam’07a] et enfants [End’02], Malaisiens et Indiens [Lai’03], Coréens [Jan’04]. Seule la
triglycéridémie des afro-américains n’était pas significativement influencée par ce
polymorphisme dans les 2 études sur cette population [Pen’02, Klo’05].
Les données sont un peu moins univoques pour le polymorphisme S19W. En effet,
une association significative entre le polymorphisme S19W et les TG a été mise en évidence
dans certaines études chez les caucasiens [Pen’02, Tal’02, Won’03, Hub’04a, Lai’04, Klo’05,
Elo’06, Gra’07, Lai’07, Dal’08], les afro-américains [Pen’02, Klo’05], les femmes hispano-
60
américaines [Pen’02], mais pas dans d’autres [Mar’03, Hub’04b, Lee’04]. Ce polymorphisme
a été très peu étudié chez les asiatiques du fait de sa très faible fréquence.
L’ampleur de l’effet des 2 polymorphismes -1131T>C et S19W était très variable
selon les études : les triglycérides étaient augmentés de 10 à 30 % chez les hétérozygotes par
rapport aux homozygotes pour l’allèle fréquent.
L’allèle rare du polymorphisme G185C a été associé à des TG plus élevés dans des
populations asiatiques [Kao’03, Jia’05, Tan’06, Hsu’07, Mat’07, Pul’08, Yam’08b]. Le
polymorphisme V153M n’était pas associé aux TG [Kao’03, Hub’04a, Hub’04b, Hub’08].
b. HDL cholestérol
Seules certaines études ont rapporté une association significative entre une diminution
du HDLc et les allèles rares -1131C ou 19W, chez les caucasiens [Tal’02, Lai’04, Lee’04,
Elo’06, Gra’07, Lai’07] et les asiatiques [End’02, Bau’03, Lai’03, Li’04, Yam’07a].
c. Autres paramètres lipidiques
Peu d’équipes ont publié des résultats significatifs sur d’autres paramètres lipidiques.
Deux études chinoises ont retrouvé une association significative entre l’allèle -1131C et une
augmentation du cholestérol total [Lai’03, Li’04, Elo’06, Gra’07], ou du LDLc et de l’apoB
[Lai’04, Gra’07]. Certains travaux ont rapporté une augmentation des VLDL ou de leur
remnants chez les porteurs de l’allèle rare -1131C [Pen’01, Aou’03, Lai’04, Tal’04, Lai’06]
ou 19W [Lai’04, Lai’07] mais d’autres pas [Hub’04b]. Pour Lee, l’allèle rare -1131C était
associé à augmentation de la FERHDL (% fraction estérifiée du cholestérol des lipoprotéines
non apoB), index de la composition des HDL [Lee’04]. Enfin, l’allèle -1131C a été associé à
une augmentation des concentrations de LDL petites et denses [Aus’04, Lai’04, Jan’04], ainsi
que l’allèle 19W [Lai’07].
61
5. Association des polymorphismes aux variations physiologiques des TG
a. Durant la grossesse
L’augmentation de la production hépatique des VLDL durant la grossesse
s’accompagne d’une augmentation physiologique des triglycérides. Ward et al ont montré une
augmentation significative des triglycérides chez les porteuses des allèles rares des
polymorphismes -1131T>C et S19W (+11 et +16 % respectivement), sans altération des
paramètres biométriques fœtaux [War’03].
b. En période post-prandiale
Plusieurs équipes se sont intéressées aux relations entre les polymorphismes de
l’APOA5 et l’hyperlipémie postprandiale, avec des résultats discordants. Quatre études ont
trouvé une augmentation significativement plus importante des TG, après un repas riche en
graisse chez les porteurs des allèles rares des polymorphismes -1131T>C [Jan’04, Mor’06,
Mor’07, Ola’08] et S19W [Lai’07, Mor’07], comparés aux porteurs des allèles fréquents. En
revanche, 2 autres études n’ont pas montré d’influence des polymorphismes -1131T>C
[Mar’03] et S19W [Mar’03, Ola’08] sur la réponse postprandiale des TG après un repas riche
en graisse et/ou une charge orale en glucose.
C. Relation entre les concentrations plasmatiques d’apoAV et les paramètres
lipidiques chez l’homme sain.
Les données publiées sont peu nombreuses et discordantes, réalisées sur de faibles
effectifs de sujets sains (Tableau 1). Deux études ont mis en évidence une corrélation négative
modeste, mais significative, entre les concentrations plasmatiques d’apoAV et les TG dans
des populations asiatiques, uniquement chez les femmes [Obr’05, Ish’05]. Dans des
populations caucasiennes, 2 études n’ont pas retrouvée de corrélation avec les TG [Pru’05a,
Sch’06] et 3 autres études ont montré une corrélation positive avec les TG [Tal’06, Vae’06,
Hah’08].
62
Deux études ont trouvé une corrélation positive entre les concentrations d’apoAV et le
cholestérol total [Sch’06, Tal’06] mais pas deux autres [Zha’07, Hah’08]. Il n’a pas été mis en
évidence de corrélation avec le LDLc [Zha’07].
Certaines études ont également mis en évidence une corrélation positive significative entre les
concentrations d’apoAV et le HDLc [Ish’05, Zha’07] ou l’apoCIII [Sch’06, Hah’08]. Dans
l’étude de Hahne, si on introduisait dans un modèle statistique l’apoCIII et l’apoAV comme
variable indépendante, l’apoCIII prédisait significativement la triglycéridémie mais pas
l’apoAV. Le ratio apoCIII/apoAV était toutefois significativement associé aux TG [Hah’08].
Ces variations peuvent là aussi être liées aux différents dosages utilisés, aux origines
ethniques, et peut-être à des problèmes de puissance. Toutefois, ces données suggèrent que les
concentrations plasmatiques de l’apoAV ne sont peut-être pas un bon reflet de la
triglycéridémie dans la population générale chez l'homme.
En ce qui concerne l’association entre les concentrations plasmatiques d’apoAV et les
variants polymorphiques, les résultats sont également discordants. Les concentrations
d’apoAV étaient significativement plus basses chez les porteurs de l’allèle rare -1131C que
chez les porteurs de l’allèle -1131T dans 2 études [Ish’05, Vae’06], mais pas dans une 3ème
étude [Tal’06]. Au contraire, 2 études ont mis en évidence des concentrations plasmatiques
d’apoAV significativement plus élevées chez les porteurs de l’allèle rare 19W que chez les
porteurs de l’allèle S19 [Tal’06, Vae’06], indépendamment de l’IMC, des TG et du CT
[Tal’06].
63
V. Mécanismes d’action de l’apoAV : Connaissances actuelles et hypothèses
Les mécanismes par lesquels l’apoAV exerce son effet hypotriglycéridémiant sont
encore mal connus. Si des études récentes ont permis de les préciser, les données sont parfois
contradictoires. L’apoAV pourrait agir sur un ou plusieurs stades du métabolisme des LRTG :
assemblage/sécrétion, lipolyse intravasculaire ou capture hépatique.
A. Effet de l’apoAV sur la synthèse des LRTG
A partir de l’étude des propriétés physico-chimiques qui montrait une forte affinité de
l’apoAV pour les lipides et une faible élasticité (contrairement à l’apoB), Weinberg a proposé
que l’apoAV pourrait réduire la production hépatique des VLDL en freinant leur assemblage
ou leur sécrétion [Wei’03]. Cette hypothèse est supportée par différents arguments :
- Dans la lignée cellulaire Cos-1, l’apoAV était retenue dans le réticulum endoplasmique et
passait faiblement dans le golgi. L’apoAV serait faiblement sécrétée ce qui expliquerait ses
faibles concentrations circulantes. Ces données sont plus en faveur d’une action intracellulaire
de l’apoAV que d’un rôle de structure ou d’activateur enzymatique.
- l’apoAV possède une forte homologie avec un domaine de la MTP et pourrait perturber
l’assemblage intra-hépatique des lipoprotéines par exemple en interagissant avec un cofacteur de la MTP [Wei’03].
L’action intracellulaire comme frein à la 2ème étape de l’assemblage intra-hépatique
des VLDL a également été soutenue par Schaap et al. [Sch’04]. Chez les souris avec
surexpression adénovirale de l’apoAV, l’apoAV diminuait de manière dose-dépendante la
production hépatique des TG des VLDL. Comme la concentration d’apoB des VLDL était
inchangée, et donc le nombre de particules VLDL, l’apoAV pourrait inhiber la lipidation des
VLDL sans affecter la quantité de VLDL produite [Sch’04]. Dans cette hypothèse, la
surexpression de l’apoAV à la phase aiguë de la régénération hépatique chez le rat
hépatectomisé [Van’01] permettrait de conserver les lipides pour la synthèse de novo des
membranes cellulaires et comme substrat énergétique. A l’état normal, l’apoAV pourrait ainsi
réguler le flux hépatique sortant de lipides en fonction du régime alimentaire et des besoins
métaboliques [Wei’03].
64
Par ailleurs, comme on l’a vu précédemment, deux communications récentes ont mis
en évidence une sécrétion intestinale d’apoAV chez l’homme [Gua’07, Gua’08]. Dans un
modèle de cellules intestinales humaines, l’expression du gène APOA5 était inversement
corrélée à celle de l’APOB et de la MTP : les agonistes PPARα stimulaient l’expression du
gène APOA5 de 60 % et diminuaient l’expression des gènes APOB et MTP de 30 et 50 %
respectivement. Ceci suggère une relation inverse entre l’expression de l’APOA5 et la
synthèse intestinale des chylomicrons [Gua’08].
Cependant, les travaux chez les souris transgéniques surexprimant l’APOA5 (trAPOA5) n’ont pas confirmé d’effet de l’apoAV sur la synthèse des LRTG. Aucune différence
dans la production des LRTG, ni des chylomicrons dans l’intestin [Mer’05a], ni des VLDL
dans le foie [Fru’04, Mer’05a], n’a été mise en évidence entre les souris tr-APOA5 et les
souris témoins. De même, Grosskopf et al. n’ont pas montré de différence sur la production
hépatique de LRTG entre les souris KO apoa5 -/- et les souris contrôles [Gro’05].
Cette contradiction entre le modèle murin transgénique et le modèle adénoviral est
probablement liée au niveau d’expression de l’apoAV. En effet, dans le modèle adénoviral de
Schaap, la synthèse d’apoAV était 10 à 30 fois supérieure aux concentrations physiologiques,
alors que dans le modèle transgénique les concentrations d’apoAV étaient proches de la
physiologie humaine. Par ailleurs, dans un autre modèle de surexpression adénovirale de
l’APOA5 chez la souris, avec des concentrations plus faibles d’apoAV que dans le modèle de
Schaap, il n’a pas non plus été retrouvé d’effet de l’apoAV sur la production des VLDL
[Qu’07].
De plus, Shu et al. ont montré que la surexpression de l’apoAV dans une lignée
hépatocytaire (Hep3B) n’influençait pas la sécrétion des LRTG ni leur lipidation. Cette étude
a révélé que l’apoB et l’apoAV étaient localisées dans des compartiments intracellulaires
différents, que l’apoAV était sécrétée associée à des gouttelettes lipidiques et que
l’association de l’apoAV aux VLDL se faisait après leur sécrétion respective. Il existait
également un pool d’apoAV intracellulaire non sécrété [Shu’07].
Ces données sont en accord avec les constatations de localisation prédominante de l’apoAV
sur les HDL et de transfert des HDL vers les VLDL, constatations jusque là inexpliquées.
L’apoAV serait transportée sur les HDL [Pru’05a, Shu’07] puis transférée sur les VLDL lors
de la stimulation de la lipolyse comme constaté chez les animaux transgéniques [Fru’04,
Mer’05a] ou chez l’homme [Pru’05a].
65
Bien que les données expérimentales soient discordantes, il ne semble pas y avoir
d’effet de l’apoAV sur l’assemblage ou la sécrétion des LRTG.
B. Effet de l’apoAV sur le catabolisme des LRTG
1. ApoAV et lipolyse
L’apoAV pourrait activer la cascade lipolytique des LRTG en agissant sur la LPL.
Dans les modèles de souris tr-APOA5 ou avec surexpression adénovirale, on notait
une augmentation de la clairance des VLDL et une diminution nette de réponse post-prandiale
des TG après ingestion de lipides, suggérant un effet de l’apoAV sur l’hydrolyse des
lipoprotéines riches en TG par la LPL. La stimulation de la LPL par l’apoAV a été confirmée
in vitro [Sch’04, Fru’04]. In vivo, l’activité LPL post-héparinique était également stimulée
chez les souris tr-APOA5 [Fru’04]. L’accélération du catabolisme des LRTG chez les souris
tr-APOA5 était totalement abolie après injection d’un inhibiteur de la LPL [Mer’05a].
Inversement, deux équipes ont montré un défaut de catabolisme des LRTG chez les
souris KO apoa5 -/- [Gro’05, Nel’08], avec diminution de l’activité LPL post-héparinique in
vivo et diminution de la lipolyse des lipoprotéines déficientes en apoa5 in vitro [Gro’05].
Afin de déterminer les rôles respectifs de la LPL et de l’apoAV dans la lipolyse,
Merkel et al. ont généré des souris transgéniques surexprimant la LPL et KO pour l’apoAV, et
d’autres souris transgéniques surexprimant l’apoAV déficientes en LPL. Ils ont montré que
l’augmentation de l’activité LPL compensait complètement la déficience en apoAV chez les
souris, alors que la surexpression de l’apoAV ne modulait que faiblement les TG quand la
LPL était faiblement exprimée. Ceci suggère que l’effet de l’apoAV est limitée par les
quantités de LPL : à partir d’un certain ratio apoAV/LPL, la LPL serait stimulée au maximum
[Mer’05a].
Il est donc bien établi que l’apoAV stimule la lipolyse des LRTG par la LPL. L’effet
de l’apoAV est dépendant de la LPL qui reste l’élément déterminant dans le catabolisme des
LRTG.
66
2. Mécanisme d’action de l’apoAV sur la LPL
La stimulation de la LPL par l’apoAV pourrait résulter d’un effet direct de l’apoAV
sur l’enzyme ou être médiée par d’autres acteurs de la lipolyse comme les apolipoprotéines
CII, CIII ou les HSPG.
a. Rôle de l’apoCII et de l’apoCIII
L’activité de la LPL est régulée par l’apoCII et l’apoCIII, respectivement co-activateur
et inhibiteur de la LPL. L’action de l’apoAV pourrait donc être dépendante de ces deux
apolipoprotéines.
ApoCII
Schaap a montré une activation de la LPL uniquement en présence d’apoCII [Sch’04],
mais Lookeene a mis en évidence une activation de la LPL par l’apoAV indépendante de
l’apoCII, en utilisant in vitro des chylomicrons ou des VLDL dépourvus d’apoCII [Loo’05].
Ceci pourrait suggérer que l’apoAV aurait une action similaire à l’apoCII, comme activateur
allostérique de la LPL. Mais, en physiologie, les faibles concentrations d’apoAV circulantes
rendent cette hypothèse peu probable.
ApoCIII
Chez les souris transgéniques surexprimant l’APOC3 (tr-APOC3) et KO pour l’apoc3,
les variations de TG étaient opposées à celles des souris tr-APOA5 ou KO pour l’apoa5
(Tableau 5) [Ito’90, Mae’94, Pen’01, Van’02]. De plus, les souris tr-APOA5 avaient des
concentrations d’apoCIII diminuées de 40 %, alors que les souris KO pour l’apoa5 des
concentrations d’apoCIII augmentées de 90 % [Pen’01, Fru’04]. L’action de l’apoAV pourrait
donc être liée aux variations des concentrations d’apoCIII.
67
APOC3
TG
APOA5
KO
surexpression
KO
surexpression
Tableau 5 : Effets de la surexpression ou du KO des gènes APOA5 et APOC3
sur les TG chez la souris.
Cependant, les souris tr-APOA5 avaient des TG nettement plus bas (- 70 %) [Pen’01,
Van’02] que les souris KO pour l’apoc3 (- 30 %) [Mae’94], ce qui suggère que les effets de
l’apoAV sont au moins en partie indépendants des variations de l’apoCIII. Cette hypothèse a
été confirmée in vivo et in vitro. Les souris doubles transgéniques surexprimant l’APOA5 et
l’APOC3 ou double KO avaient des TG normaux [Bar’04]. De même, la surexpression
adénovirale de l’APOA5 corrigeait l’hypertriglycéridémie des souris tr-APOC3 [Qu’07]. In
vitro, l’effet inhibiteur de l’apoCIII sur la LPL était complètement corrigé par l’adjonction
d’apoAV in vitro [Sch’04]. Merkel a également confirmé une action de l’apoAV sur la
lipolyse indépendante des autres lipoprotéines en utilisant comme source d’apoAV une
protéine recombinante, et non des HDL contenant de l’apoAV qui apportaient également
d’autres apolipoprotéines [Mer’05a]. De plus, chez les souris surexprimant le gène humain
APOE2, l’HTG pouvait être corrigée par la surexpression de l’apoa5 mais pas par la délétion
de l’apoc3 [Ger’08], suggérant un effet dominant des variations d’apoAV sur les variations
d’apoCIII.
L’ensemble de ces résultats montre donc que l’apoAV module les triglycérides en
activant la lipolyse, au moins en partie indépendamment des variations de l’apoCIII et avec un
effet dominant de l’apoAV par rapport à l’apoCIII sur la lipolyse.
68
b. Rôle des HSPG
Physiologiquement, la LPL est active sous forme de dimères liés aux HSPG à la
surface de l’endothélium capillaire. Deux études se sont intéressées aux liens unissant LPL,
HSPG et ApoAV.
Ces travaux ont montré qu’in vitro l’apoAV ne modifiait pas l’activité de la LPL libre
en l’absence d’HSPG [Loo’05, Mer’05a], alors que qu’elle augmentait de manière dosedépendante l’hydrolyse des TG des VLDL par la LPL en présence d’HSPG, que la LPL soit
liée ou non aux HSPG préalablement [Mer’05a]. Ces résultats ont été confirmés sur des
lignées cellulaires déficientes ou non en HSPG [Mer’05a], mais sont en contradiction avec 2
études précédentes : Fruchart-Najib et Schaap ont montré une stimulation in vitro de la LPL
libre par l’apoAV [Fru’04, Sch’04]. Merkel a proposé que ces discordances pourraient être
liées aux fortes concentrations d’apoAV utilisées par ces 2 équipes (1000 fois les
concentrations plasmatiques chez l’homme). A des concentrations très élevées, l’apoAV
pourrait entrer dans des liaisons hydrophobes non spécifiques augmentant l’hydrolyse ou
stabilisant la LPL de manière prolongée [Mer’05a].
Les possibilités d’interaction entre l’apoAV et la LPL ou les HSPG ont été examinées.
L’apoAV était capable de se fixer à la LPL [Fru’04, Loo’05, Mer’05a]. La séquence de
l’apoAV mature possède un segment de 42 acides aminés fortement chargés positivement et
sans charge négative qui pourrait être le domaine de liaison avec les HSPG (AA 186 à 227).
L’apoAV avait une forte capacité de liaison à l’héparine, et favorisait la liaison des LRTG
déficientes en apoCII à l’héparine ou à la LPL liée aux HSPG in vitro [Loo’05].
Chez l’homme, il n’a pas été détecté de différence de concentration d’apoAV entre des
sérums pré et post-hépariniques confirmant un relargage d’apoAV liée aux HSPG. Des
problèmes méthodologiques sont évoqués tels que des concentrations d’héparine insuffisantes
ou une cinétique de relargage plus lente pour l’apoAV que pour la LPL [Loo’05].
Malgré des données contradictoires, ces résultats suggèrent que l’activation de la LPL
par l’apoAV est dépendante de la présence des HSPG. L’apoAV faciliterait les interactions
entre les LRTG, les HSPG et la LPL et pourrait ainsi stimuler directement ou indirectement la
lipolyse. Cependant les mécanismes restent à élucider.
69
c. Hypothèses actuelles
Différentes hypothèses ont été proposées dans la littérature quant au rôle de l’apoAV
au sein des complexes LRTG/LPL/HSPG. Dans la couche d’HSPG, l’apoAV pourrait
« diriger » les LRTG sur les sites d’hydrolyse. Ceci est soutenu par le fait qu’in vitro son effet
est aboli en présence de fortes concentrations de LPL, c'est-à-dire qu’elle ne serait plus
nécessaire quand les HSPG sont saturés de LPL. L’apoAV pourrait également agir comme
activateur allostérique de la LPL soit en favorisant sa dimérisation, soit en se fixant sur un site
d’activation non accessible sur la LPL libre, ou encore en stabilisant les complexes LPLHSPG [Mer’05a]. Mais les faibles concentrations circulantes d’apoAV sont peu en faveur
d’un tel rôle et l’apoAV n’existerait pas sous forme dimérique [Alb’06]. L’apoAV pourrait
aussi changer la conformation des VLDL et augmenter l’accessibilité des TG à la LPL
[Loo’05, Mer’05a]. La liaison de l’apoAV aux HSPG pourrait également permettre la
transduction d’un signal aux cellules et stimuler par exemple la synthèse ou la fixation de la
LPL à la surface endothéliale [Cha’05b].
3. ApoAV et capture hépatique des lipoprotéines
L’apoAV pourrait, comme l’apoB et l’apoE, se fixer sur un récepteur aux
lipoprotéines par une séquence fortement chargée positivement [Mah’03]. Les interactions
entre l’apoAV et les HSPG pourraient alors favoriser la capture hépatique des lipoprotéines
par les HSPG [Loo’05] ou par les récepteurs LRP et R-LDL, comme décrit pour l’apoE
[Mah’03]. Il n’existe pas de séquence consensus connue de reconnaissance des récepteurs de
la famille des récepteurs aux LDL. Récemment, deux équipes ont rapporté la capacité de
l’apoAV aviaire [Dic’07] et humaine [Nil’07] à se lier aux R-LDL, LRP ou SorLa. Le
domaine de liaison aux récepteurs serait situé dans la même région que le domaine de liaison
à l’héparine [Nil’07].
Dans les modèles animaux de souris surexprimant l’apoAV, plusieurs équipes ont
évoqué une accélération de la capture des LRTG par le foie [Sch’04, Fru’04, Mer’05a].
Inversement, chez les souris ko apoa5 -/-, Grosskopf et al. ont montré que la capture
hépatique des remnants de LRTG était altérée, non par diminution du nombre de R-LDL (au
contraire augmentée) mais par diminution de l’affinité des LRTG pour le R-LDL [Gro’05].
70
Cette diminution de l’affinité pour les R-LDL pourrait ne pas être lier à un effet direct de
l’apoAV mais à la modification du contenu en apolipoprotéines des LRTG, en particulier en
apoE : la diminution significative de l’apoE dans les remnants des souris apoa5 -/- pourraient
expliquer la diminution de leur affinité pour les R-LDL et de leur capture hépatique [Gro’05,
Nel’08].
C. ApoAV et métabolisme du cholestérol
On a précédemment vu que quelques études d’association ont mis en évidence un lien
entre apoAV et cholestérol. L’apoAV est par ailleurs présente sur les HDL. Beackstead a
étudié son rôle comparativement à l’apoAI, apolipoprotéine majoritaire des HDL. L’apoAV
était un très faible activateur de la LCAT (lecithin cholesterol acyl transférase) in vitro ; elle
n’induisait que faiblement l’efflux de cholestérol des cellules et indépendamment du
transporteur ABCA1 [Bec’03]. Toutefois, des travaux récents de Qu et al. sur des souris
transgéniques surexprimant l’APOC3 avec surexpression adénovirale de l’APOA5, suggère
que l’APOA5 influencerait également le métabolisme des HDL. Chez ces souris tr-APOC3,
l’augmentation des concentrations d’apoAV s’accompagnait d’un remodelage des HDL avec
augmentation du nombre de particule HDL et de leur taille, ainsi qu’une augmentation de leur
contenu en cholestérol, en apoE et une diminution de leur contenu en apoCIII et apoAI. Cet
enrichissement des HDL en cholestérol s’accompagnait d’une augmentation significative de
l’activité LCAT et d’une augmentation de l’efflux de cholestérol des macrophages [Qu’07].
L’apoAV pourrait ainsi stimuler la voie de transport inverse du cholestérol.
Les connaissances actuelles sur le rôle de l’apoAV dans le métabolisme des TG sont
encore incomplètes. Il est établi que l’apoAV active la lipolyse des LRTG par la LPL, au
moins en partie indépendamment des variations de l’apoCIII, mais uniquement en présence
d’HSPG. L’apoAV jouerait un rôle important dans les interactions entre les LRTG et le
complexe LPL-HSPG. Le rôle de l’apoAV sur la lipolyse intravasculaire n’exclut pas un rôle
sur les autres étapes du métabolisme des TG. Des données récentes ont relancé l’hypothèse
d’un rôle de l’apoAV sur la capture hépatique des LRTG, mais les données actuelles sont
encore insuffisantes en particulier en l’absence de données physiopathologiques chez
l’homme.
71
VI. Détermination de la fonctionnalité des polymorphismes de l’APOA5
Le gène APOA5 se situe à proximité des gènes APOA1/C3/A4 sur le chromosome
11q23. Deux hypothèses peuvent expliquer l’influence des polymorphismes de l’APOA5 sur
les paramètres lipidiques :
- soit des effets fonctionnels propres de ces polymorphismes
- soit un déséquilibre de liaison avec d’autres variants fonctionnels de gènes voisins affectant
le métabolisme des TG, en particulier l’APOC3.
A. Relation entre les polymorphismes du cluster APOA1/C3/A4/A5
Dans la littérature, plusieurs polymorphismes des gènes APOA1/C3/A4 ont été
associés à l’augmentation des concentrations plasmatiques de TG et à l’hypertriglycéridémie,
dont les polymorphismes Sst-1, -482C>T et -455T>C de l’APOC3 [Gro’01]. Plusieurs études
ont analysé les relations entre les polymorphismes de l’APOA5 et les autres polymorphismes
du cluster en utilisant des techniques informatiques de modélisation des haplotypes.
Olivier et al. ont montré, par des analyses de recombinaison, que les gènes APOA5 et
APOC3 n’appartiendraient pas à un bloc haplotypique continu mais seraient séparés par une
région à fort taux de recombinaison. Ceci supporte l’idée d’un effet propre des
polymorphismes de l’APOA5 [Oli’04].
Les analyses d’haplotypes suggèrent que l’haplotype APOA5*3 exercerait son effet
indépendamment des polymorphismes de l’APOC3. En revanche, l’haplotype APOA5*2
serait en fort déséquilibre de liaison avec les allèles rares des polymorphismes Sst-1 (3238
G>C) et du promoteur (-482C>T et -455T>C) de l’APOC3 [Tal’02, Oli’04]. Les effets
lipidiques des polymorphismes de l’haplotype APOA5*2 (-1131T>C, -3A>G, SNP2, SNP1)
pourraient ainsi refléter les effets des polymorphismes de l’APOC3. La fonctionnalité du
polymorphisme Sst-1 de l’APOC3 n’est pas établie, mais il est en fort déséquilibre de liaison
avec les 2 polymorphismes du promoteur qui interrompent un élément de réponse à l’insuline
(IRE) [Dal’01, Gro’01]. In vitro et chez la souris, l’insuline diminue de manière dosedépendante la transcription de l’APOC3 [Obr’96]. Les variants rares des polymorphismes du
promoteur de l’APOC3 entraînent une perte de la réponse à l’insuline in vitro [Li’95]. Ils
72
pourraient ainsi augmenter les concentrations d’apoCIII mais cela n’a pas été confirmé dans la
littérature [Dal’01].
Par ailleurs, il n’a pas été noté d’association significative des polymorphismes de l’APOA5
avec les polymorphismes de l’APOA1 et A4 [Oli’04].
Ainsi, l’haplotype APOA5*3, portant le variant rare du polymorphisme S19W,
exercerait un effet indépendant des autres polymorphismes du cluster. En revanche, les effets
lipidiques de l’haplotype APOA5*2, portant les variants rares des polymorphismes SNP1,
SNP2, -3A>G et -1131T>C, pourraient résulter d’un déséquilibre de liaison avec des
polymorphismes fonctionnels de l’APOC3. Toutefois, la ré-analyse des données de Talmud
de 2002 [Tal’02] avec des modèles statistiques de régression multiple, suggère un effet du
polymorphisme -1131T>C sur les TG indépendant des polymorphismes de l’APOC3 [Pal’08].
B. Etudes fonctionnelles des polymorphismes de l’APOA5
Trois études se sont intéressés à la caractérisation fonctionnelle des polymorphismes
constituant les haplotypes APOA5*2 et APOA5*3 [Tal’05, Ahi’07, Pal’08].
1. Haplotype APOA5*3 - étude du polymorphisme S19W
Le polymorphisme S19W entraîne la substitution d’un AA hydrophile sérine par un
AA hydrophobe tryptophane en position -5 du site de clivage du peptide signal de l’apoAV,
ce qui pourrait affecter la translocation de la protéine à travers le réticulum endoplasmique
(RE). Le variant 19W pourrait réduire la quantité de protéine mature sécrétée à travers le RE
[Tal’02].
Les études de modélisation moléculaire ont montré que les peptides signaux s’insèrent
obliquement dans les membranes lipidiques et que leur angle d’inclinaison conditionne la
translocation des protéines. Ainsi, un angle d’insertion de 45° confère la plus grande activité
de translocation. La modélisation du peptide signal de l’apoAV montre un angle d’insertion
de 40° pour le peptide signal « sauvage » 19S et de 65° pour le variant 19W (Figure 17). Cette
augmentation de l’angle prédit, selon les auteurs, une diminution de l’activité de translocation
à travers le RE. Cette hypothèse a été vérifiée in vitro dans un modèle cellulaire utilisant une
protéine de fusion : la sécrétion de la protéine possédant le peptide signal 19W était
73
effectivement réduite de 49 % par rapport à la protéine avec un peptide signal 19S, et par
rapport à la protéine contrôle [Tal'05].
peptide signal 19S
40°
peptide signal 19W
65°
Figure 17 : Modélisation de l’insertion des peptides signaux 19S et 19W
dans une membrane lipidique. D’après [Tal’05]
Ces données ont été ensuite confirmées in vivo chez des souris transgéniques
surexprimant les différents haplotypes du gène humain APOA5 : les souris surexprimant une
copie de l’haplotype APOA5*3 avaient des concentrations plasmatiques d’apoAV 3 fois plus
basses que les souris surexprimant l’haplotype APOA5*1. De plus, il n’existait pas de
différence importante sur l’expression hépatique des ARNm entre les souris surexprimant
l’haplotype APOA5*3 ou APOA5*1, ce qui indique que le polymorphisme interviendrait bien
à un niveau post-transcriptionnel, comme suggéré dans les travaux de modélisation et in vitro.
Toutefois, les concentrations de TG étaient peu modifiées chez ces souris peut-être du fait de
concentrations d’apoAV très faibles (2 à 6 µg/l) [Ahi’07].
Le variant rare du polymorphisme S19W diminuerait donc la sécrétion de la protéine
apoAV de 50 à 70 % selon les modèles, ce qui pourrait expliquer l’augmentation des TG chez
les porteurs de l’haplotype APOA5*3. Ces résultats sont toutefois en contradiction avec les
74
mesures de concentrations plasmatiques d’apoAV chez l’homme retrouvée dans plusieurs
études : les concentrations plasmatiques d’apoAV étaient significativement plus élevées chez
les porteurs de l’allèle rare 19W que chez les porteurs de l’allèle S19 [Dal’06a, Tal’06,
Vae’06, Hen’07, Hah’08]. Dans l’une étude de ces études, l’augmentation de l’apoAV chez
les porteurs de l’allèle rare 19W chez l’homme était associée paradoxalement à une
diminution des concentrations d’ARNm de l’APOA5 mesurées sur des biopsies hépatiques
[Hah’08].
2. Etude indépendante des polymorphismes de l’haplotype APOA5*2
Talmud et al. ont cherché à caractériser l’effet propre de chaque polymorphisme
composant l’haplotype APOA5*2 [Tal’05].
Le polymorphisme -1131T>C est situé en amont du promoteur. L’allèle -1131C est
situé sur l’haplotype APOA5*2 à proximité du variant rare -3G. Aucun site consensus de
liaison d’un facteur de transcription n’a été identifié à leur niveau [Tal’02, Pri’03]. Le
polymorphisme -1131T>C pourrait cependant moduler la transcription du gène APOA5. Cette
hypothèse se s’est pas vérifiée : il n’existait pas de différence significative de transcription
d’un gène rapporteur, entre un promoteur -1131T et -1131C [Tal’02, Pri’03], ou bien entre un
promoteur -1131T/-3A et -1131C/-3G [Tal’05].
b. Polymorphisme -3A>G ou Kozak
Ce polymorphisme est situé 3 nucléotides en amont du codon méthionine AUG, site
d’initiation de la traduction, au sein d’une séquence dite « Kozak » [Koz’84]. Kozak a montré
l’existence d’une séquence consensus de type GCCRCCaugG (R étant une purine)
comprenant le codon AUG. Cette séquence régule la traduction des ARNm en protéine et
notamment la reconnaissance de l’AUG par les ribosomes. Des variations de la séquence
Kozak ont été impliquées en pathologie humaine [Gon’02]. La présence d’une purine en
position -3 (A ou G) en amont de l’AUG est cruciale au sein de cette séquence. Les
75
modifications de la séquence Kozak peuvent affecter l’efficacité de la traduction, qui pourra
éventuellement débuter sur un AUG en aval [Koz’84, Koz’86, Koz’03].
Or il existe sur le gène APOA5 un 2ème AUG en phase avec le premier, 9 nucléotides
en aval, qui pourrait être utilisé alternativement [Pri’03]. Mais, si la séquence de l’APOA5 est
assez différente de cette séquence consensus (CAGATAaugG), le polymorphisme -3A>G ne
constitue pas selon les règles de Kozak un changement majeur. On trouve d’ailleurs très
fréquemment un G en position -3 chez les vertébrés [Per’01]. L’étude de Talmud a confirmé
in vitro l’absence de différence, en terme d’efficacité de traduction, entre les ADNc contenant
l’un ou l’autre variant du polymorphisme -3A>G. Il n’existait pas non plus de différence sur
le site d’initiation de la traduction, seul le premier AUG étant utilisé [Tal’05].
c. Polymorphisme 751A>G (SNP2)
Ce polymorphisme est situé dans l’intron 2. Les analyses informatiques n’ont pas mis
en évidence de site pouvant affecter l’épissage à ce niveau, ni de site potentiel de liaison de
facteur de transcription [Pal’08]
d. Polymorphisme 1891T>C (SNP1)
L’analyse de la séquence du gène APOA5 a identifié en 3’UTR un site potentiel de
liaison du facteur de transcription Oct-1 en position +1883 / +1897 interrompu par le
polymorphisme 1891T>C. Cependant, aucune influence de ce polymorphisme sur la
transcription d’un gène rapporteur n’a été mise en évidence [Tal’05].
3. Etude combinée des polymorphismes de l’haplotype APOA5*2 : recherche
d’interactions fonctionnelles entre les polymorphismes.
En l’absence d’effet évident de chaque polymorphisme pris indépendamment, il
semblait intéressant d’étudier l’effet de l’haplotype dans son intégralité et de rechercher des
interactions fonctionnelles potentielles entre les différents polymorphismes.
76
Tout d’abord, in vivo chez les souris transgéniques, les concentrations plasmatiques
d’apoAV et l’expression hépatique des ARNm n’étaient pas significativement différents entre
les souris surexprimant les haplotypes humains APOA5*2 ou APOA5*1 [Ahi’07]. De même
chez l’homme, il n’y avait pas de différence de concentrations d’ARNm de l’APOA5
mesurées sur des biopsies hépatiques entre porteurs de l’allèle -1131C et non porteurs
[Hah’08]. Ces résultats n’étaient donc pas en faveur d’un effet transcriptionnel de l’haplotype
APOA5*2.
Cependant, des travaux ultérieurs ont mis en évidence l’existence d’interactions
fonctionnelles entre les polymorphismes composant l’haplotype APOA5*2. Par l’analyse de
combinaisons multiples des différents allèles des 3 polymorphismes -1131T>C, -3A>G,
1891T>C sur la trancription d’un gène rapporteur, Palmen et al. ont rapporté que :
-
la présence combinée des 3 allèles rares diminuait de 54 % l’activité du gène
rapporteur comparée aux 3 allèles sauvages, suggérant une coopération entre les 3
polymorphismes.
-
le polymorphisme -3A>G avait l’effet fonctionnel le plus important
-
la présence des 3 variants rares étaient nécessaires pour obtenir l’effet maximal sur la
transcription mais la combinaison la plus importante était celle des polymorphismes
-3A>G et 1891T>C [Pal’08].
Selon les auteurs, la séquence Kozak pourrait donc se révéler fonctionnelle lorsqu’elle
est associée aux autres variants, et affecter l’efficacité de la traduction des ARNm. Le
polymorphisme 1891T>C est situé dans la partie 3’ UTR au sein d’une séquence qui aurait
une forte similitude avec une séquence précédemment impliquée dans la stabilité des ARNm.
La modification de cette séquence par l’allèle 1891C pourrait donc affecter la stabilité des
ARNm [Pal’08].
Ces données expérimentales suggérant une possible diminution de l’expression du
gène APOA5 chez les porteurs de l’haplotype APOA5*2 ont été corroborées par les données
cliniques chez l’homme : les concentrations plasmatiques d’apoAV étaient significativement
plus basses chez les porteurs de l’allèle rare -1131C que chez les porteurs de l’allèle fréquent
-1131T [Ish’05, Dal’06a, Vae’06, Hah’08].
77
En conclusion, les effets sur les paramètres lipidiques de l’haplotype APOA5*3,
contenant le variant rare du polymorphisme S19W, pourraient s’expliquer par une diminution
de la sécrétion hépatique de l’apoAV, liée à un défaut de translocation de la protéine à travers
le RE. Toutefois ces données fonctionnelles ne sont pas concordantes avec l’augmentation de
concentrations plasmatiques d’apoAV chez les porteurs de l’allèle 19W.
Concernant l’haplotype APOA5*2, ses effets ont longtemps été attribué à un déséquilibre de
liaison avec un polymorphisme fonctionnel du gène APOC3. Mais, les travaux récents
apportent des arguments en faveur d’une fonctionnalité propre de l’haplotype APOA5*2 : il
existerait une coopération entre les polymorphismes composant l’haplotype, qui affecterait
l’efficacité de la traduction des ARNm et/ou leur stabilité. Ces données sont en accord avec la
diminution des concentrations plasmatiques d’apoAV chez les porteurs de l’allèle -1131C.
VII. Polymorphismes de l’APOA5 et dyslipidémies
L’apoAV est un déterminant important du métabolisme des TG. Elle pourrait donc
jouer
un
rôle
dans
la
physiopathologie
des
dyslipidémies
comportant
une
l’hypertriglycéridémie (HTG). Un certain nombre d’études ont montré une association entre
les polymorphismes de l’apoAV et des pathologies comme l’HTG modérée ou sévère ou
l’hyperlipémie combinée familiale (HCF).
A. Hypertriglycéridémie
Une augmentation de la fréquence des allèles rares de certains polymorphismes de
l’APOA5 a été retrouvée dans différentes populations présentant une HTG d’intensité
variable.
1. HTG modérée
La fréquence des allèles rares des polymorphismes -1131T>C [Pen’01, Eva’03] et
S19W [Pen’02] était significativement plus élevée chez des patients caucasiens avec des TG
supérieurs au 90ème percentile de la population. Dans une autre population caucasienne (nord78
irlandaise), les variants rares des polymorphismes -3A>G et S19W étaient significativement
plus fréquents chez les sujets présentant une HTG (TG > 5 mmol/l) que les témoins (TG < 2
mmol/l) et indépendamment de polymorphismes de l’APOCIII [Wri’06].
De nombreuses études ont également été réalisées dans des populations d’origine
asiatique. Deux études japonaises [Aus’04, Mat’07], trois études taïwanaises [Kao’03,
Chi’08a, Chi’08b] et une étude chez des américains d’origine chinoise [Pul’08] ont montré
que les allèles rares des polymorphismes -3A>G [Aus’04], SNP1 [Kao’03, Aus’04, Mat’07],
SNP2 [Kao’03], -1131T>C [Mat’07, Chi’08a] et G185C [Kao’03, Mat’07, Chi’08b, Pul’08],
étaient plus fréquents chez des sujets modérément hypertriglycéridémiques (TG moyen 2 à 7
g/l) et par rapport à des témoins normotriglycéridémiques.
En terme d’haplotypes, l’haplotype APOA5*2 était environ 1,5 à 2 fois plus fréquent
chez des sujets hypertriglycéridémiques taiwanais [Kao 03, Chi’08a] et japonais [Mat’07] que
chez les témoins. Par ailleurs, les haplotypes portant l’allèle rare du polymorphisme G185C
étaient plus fréquents chez les sujets hypertriglycéridémiques [Kao’03, Mat’07, Chi’08b,
Pul’08], avec un effet hypertriglycéridémiant indépendant des polymorphismes SNP1 et
SNP2 dans une étude [Kao’03]. Cependant, il n’est pas certain que l’effet du polymorphisme
G185C soit indépendant de celui du polymorphisme -1131T>C. En effet, dans les autres
études, le polymorphisme G185C était en fort déséquilibre de liaison (non complet) avec le
polymorphisme -1131T>C [Chi’08a, Mat’07, Pul’08].
2. HTG sévère
Les 5 études d’association des polymorphismes -1131T>C et S19W avec le risque
d’HTG sévère (TG > 10 mmol/l), réalisées dans des populations européennes ou nordaméricaines, sont concordantes. Les variants rares des polymorphismes -1131T>C [Hor’03,
Hen’07, Sou’08, Wan’08a] et S19W [Vra’03, Hen’07, Wan’07b, Wan’08a] étaient 2 à 5 fois
plus fréquents chez les patients hypertriglycéridémiques que chez les témoins. En revanche, il
n’existait pas d’association significative pour les polymorphismes V153M [Hub’04c
Wan’07b] et G185C [Hub’04c].
79
Par ailleurs, dans deux études, les valeurs de concentrations plasmatiques d’apoAV
étaient significativement plus élevées chez les sujets avec HTG sévère comparées aux
données publiées dans la population générale (965 µg/l) [Hen’07] ou mesurées chez des
témoins (1987 vs 256 µg/l) [Sch’06]. Les concentrations d’apoAV étaient positivement
corrélées aux TG [Sch’06, Hen’07], et aux concentrations d’apoCIII [Sch’06] chez les sujets
hypertriglycéridémiques. En revanche, une seule étude a retrouvé une corrélation positive
entre
concentration
d’apoAV
et
présence
du
variants
19W
dans
le
groupe
hypertriglycéridémique [Hen’07] et aucune pour le variant -1131C [Sch’06, Hen’07].
Ces données ont été confirmées dans une large étude d’association des
polymorphismes -1131T>C et S19W aux dyslipidémies avec HTG modérées ou sévères
quelque soient leur type (type I excepté) : hyperlipidémie de type IV (HTG isolée < 10
mmol/l), de type IIb (mixte), de type III (mixte avec génotype E2/E2), ou type V (HTG > 10
mmol/l avec hyperchylomicronémie documentée). Cette étude incluait 678 patients
dyslipidémiques suivis en service spécialisé comparés à une cohorte de 373 témoins non
dyslipidémiques.
Les
porteurs
des
allèles
rares
des
2
polymorphismes
étaient
significativement plus nombreux pour dans tous les types de dyslipidémies avec HTG mais
pas dans la dyslipidémie de type IIa (hypercholestérolémie pure) (Figure 18). Les allèles rares
étaient également associés aux TG répartis en quartile dans la population dyslipidémique
(Figure 19) [Wan’08b].
Les variants rares des polymorphismes de l’APOA5 sont donc clairement associés à la
survenue des HTG modérées ou sévères. On retrouve chez les sujets avec une HTG sévère la
corrélation positive entre apoAV circulante et TG, mise en évidence dans la population
générale [Vae’06, Tal’06, Hah’08].
80
A
Total
B
Total
/
C
Total
Augmentation du risque
Les carrés noirs représent les Odds ratio et les lignes noires les intervalles de confiance à 95%.
HLP2B : Hyperlipidémie de type IIb, HLP3: hyperlipidémie de type III, HLP4 : hyperlipidémie de type
IV, HLP5: hyperlipidémie de type V, selon la classification de Fredrickson [Fre’71].
Figure 18 : Risque de dyslipidémies chez les porteurs des polymorphismes
APOA5 S19W (A), -1131T>C (B) ou les deux (C). D’après [Wan’08b]
Fréquence des
polymorphismes (%)
Triglycérides
(mmol/l)
Les histogrammes représentent les moyennes de TG pour chaque quartile (échelle de droite).
Sont représentés le pourcentage de porteurs de l’allèle rare des polymorphismes APOA5 S19W (cercles),
ou -1131T>C (carrés), ou les 2 (triangles), pour chaque quartile de TG (échelle de gauche).
Figure 19 : Fréquence des polymorphismes de l’APOA5 en fonction des quartiles de TG.
D’après [Wan’08b]
81
B. Hyperlipémie Combinée Familiale
L’hyperlipémie combinée familiale (HCF) est une pathologie lipidique complexe, de
pénétrance incomplète. Sa fréquence est estimée autour de 1 à 2 % dans les pays occidentaux
mais est 10 fois plus fréquente chez les survivants d’infarctus du myocarde, suggérant son
rôle dans la pathologie cardiovasculaire. L’HCF est caractérisée par une augmentation des TG
et/ou du cholestérol, une diminution du HDLc, la présence de LDL petites et denses et une
augmentation de l’apoB. Le phénotype lipidique peut varier dans une famille d’un individu à
un autre, mais aussi chez un même individu au cours du temps. Si une forte association avec
le cluster APOA1/C3/A4 a été rapportée depuis de nombreuses années, les études sont
discordantes et la génétique de l’HCF est encore largement méconnue [Mah’03, Sho’04].
Les variants rares des polymorphismes ont été associés à une augmentation des TG
[Rib’02, Aou’03, Eic’04, Mar’04] et à une diminution du HDLc [Van’07], de la taille des
LDL [Mar’04] dans l’HCF. De plus, une augmentation de la fréquence de ses variants rares a
été mise en évidence dans cette population.
Dans un groupe de patients espagnols présentant une HCF, la fréquence de l’allèle rare
du polymorphisme -1131T>C était multipliée par 2 par rapport à des témoins non apparentés
normolipémiques, et par 2,7 par rapport à des apparentés normolipémiques. Au sein de ces
familles d’HCF, le fait de posséder au moins un allèle rare -1131C multipliait le risque de
développer une dyslipidémie par 3,25 (IC 95% : 1.10-9.65) [Rib’02]. Cette association entre
-1131T>C (ou de l’haplotype APOA5*2) et HCF a été retrouvée par Eichembaum-Voline et
al. [Eic’04] mais pas dans 3 autres études [Aou’03, Mar’04, Van’07].
De même, 3 études ont montré une augmentation significative de la fréquence (1.6 à
3.4 fois) de l’allèle rare du polymorphisme S19W (ou de l’haplotype APOA5*3) chez les
sujets HCF par rapport aux témoins [Eic’04, Mar’04, Van’07]. Le génotype S19W
expliquerait de 7,3 à 13,8 % de la variance des TG chez les sujets avec HCF [Eic’04].
Les polymorphismes de l’APOA5 pourraient donc contribuer au terrain génétique
complexe de prédisposition à l’HCF ou moduler l’expression du phénotype lipidique.
82
C. Interaction avec les génotypes de l’APOE
L’apoE joue un rôle majeur dans la capture des remnants des LRTG par les récepteurs
hépatiques LRP et LDL-R. Comme on l’a vu précédemment, l’apoE existe sous 3 isoformes
principaux, apoE2, E3 et E4, répartis inégalement dans la population. 60 % des individus
environ sont homozygotes apo E3/E3 [Mah’03]. La quasi-totalité des patients présentant une
dyslipidémie de type III sont porteurs du génotype E2/E2. Cependant, 95 % des porteurs
E2/E2 sont normolipémiques, ce qui suggère l’intervention d’autres facteurs génétiques ou
environnementaux [Mah’99]. Par ailleurs, les isoformes E2 et E4 ont été associés aux
dyslipidémies de type V chez des diabétiques [Mar’00] ou non diabétiques [Gre’83].
Evans et al. ont étudié les interactions entre génotype de l’APOE et de l’APOA5 chez
des patients présentant des dyslipidémies variées (dyslipidémie de type III exclue) : les
porteurs de l’allèle rare -1131C avaient des TG significativement plus élevés, aussi bien dans
le groupe APOE3/E3 que dans le groupe APOE4/* (4/4 ou 3/4 ou 2/4), avec un effet plus
marqué chez les porteurs de l’allèle E4. Chez les patients dyslipémiques de type III avec un
génotype E2/E2, la fréquence de l’allèle rare -1131C était également augmentée [Eva’03].
Le polymorphisme S19W pourrait agir comme co-facteur du développement d’une
HTG chez les patients porteurs du génotype E2/E2. En effet, dans une étude portant sur 170
patients présentant une HTG modérée (TG>2g/l), seulement 7 patients étaient E2/E2, et parmi
eux 6 étaient également hétérozygotes pour S19W [Sch’04b]. Mais, cette interaction entre les
variants E2 et 19W n’a pas été retrouvé dans une autre étude incluant des patients avec HTG
sévère (TG > 10 mmol/l). Il existait en revanche une association entre le variant 19W et les
génotypes E2/E4 ou E3/E4 [Hub’05a].
Il pourrait également exister un effet synergique entre le génotype E2 et le variant rare
du polymorphisme -1131T>C sur le risque d’HTG majeure (TG > 10 mmol/l) : dans l’étude
de Sousa, la présence d’un allèle E2 n’augmentait pas significativement le risque d’HTG
sévère, la présence d’un allèle -1131C multipliait le risque par 4.1 (IC 95% : 2.02-8.24) et la
présence des 2 allèles -1131C et E2 majorait le risque d’HTG sévère par 45.2 (IC 95% : 4.92415.47). Dans la même étude, l’effet des allèles E4 et -1131C était additif : la présence d’un
allèle E4 augmentait le risque d’HTG sévère par 3.0 (IC 95% : 1.68-5.86), et la présence des 2
par 6.4 (IC 95% : 2.28-18.01) [Sou’08].
83
Les interactions entre les polymorphismes de l’apoAV et les variants rares de l’apoE,
particulièrement E2, pourraient favoriser le développement des HTG modérée et surtout
sévère.
D. Modulation de la triglycéridémie dans l’hypercholestérolémie familiale
Dans une étude portant sur des patients présentant une hypercholestérolémie familiale
hétérozygote, les triglycérides étaient environ 30 % plus élevés chez les porteurs de l’allèle
rare du polymorphisme -1131T>C [Ber’04].
E. Autres dyslipidémies
1. Hypoalphalipoprotéinémie et hyperalphalipoprotéinemie
Aouizerat n’a pas mis en évidence d’association entre l’allèle -1131C et l’hypoalphaou l’hyperalphalipoprotéinémie malgré l’association constatée du polymorphisme aux TG
dans ces deux pathologies [Aou’03].
2. Dyslipidémies chez les patients HIV+ traités par antirétroviraux
La dyslipidémie des patients HIV + traités par anti-rétroviraux (ART) est caractérisée
par une HTG, une diminution du HDLc, une augmentation du non-HDLc, du LDLc, et
participe à l’augmentation du risque cardiovasculaire de cette population [Gri’05]. Une étude
s’est intéressée à l’influence des haplotypes de l’APOA5 sur les paramètres lipidiques d’une
cohorte de 438 patients HIV+ traité ou non par ART. Les TG étaient significativement plus
élevés et le HDLc significativement plus bas chez les porteurs d’haplotypes variants
APOA5*2 ou APOA5*3. Ces haplotypes variants participaient à un « score génétique »
défavorable, interagissant avec les différents traitements (surtout le ritonavir) pour favoriser le
risque d’HTG [Arn’07].
84
3. Dyslipidémie sous antipsychotiques chez les patients schizophrènes
Les patients schizophrènes traités par antipsychotiques de seconde génération (surtout
olanzapine, clozapine) développent fréquemment des dyslidipémies avec HTG et/ou
hypercholestérolémie souvent associés à un diabète de type 2 ou à un syndrome métabolique.
Une équipe s’est intéressée aux possibles interactions entre les traitements antipsychotiques et
les variants génétiques de l’APOA5 (-1131T>C et S19W) sur les paramètres lipidiques de 189
patients schizophrènes répartis en 3 groupes de traitement : olanzapine ou clozapine,
risperdone, traitement conventionnel (1ère génération). Les patients porteurs de l’allèle -1131C
avaient un cholestérol total (CT) plus élevé sous traitement conventionnel et plus bas sous
traitement de seconde génération (olanzapine, clozapine ou risperdone) que les porteurs de
l’allèle -1131T. Il n’y avait pas d’interaction traitement/génotype significative pour les TG, ni
avec le polymorphisme –1131T>C, ni avec le polymorphisme S19W. Il faut signaler que dans
cette étude, il n’y avait pas d’effet des polymorphismes sur les TG et le CT sauf de manière
inhabituelle une association entre l’allèle -1131C et des TG plus bas ! Il existait peut-être des
facteurs de confusion non pris en compte. Par ailleurs, l’étude était de faible puissance
[Smi’08].
F. Polymorphismes de l’APOA5 et réponse aux fibrates
Le gène APOA5 contient un élément de réponse PPARα et son expression est stimulée
par les agonistes PPARα in vitro, avec diminution de la triglycéridémie chez l’animal [Pri’03,
Vud’03, Sch’05]. Chez l’homme, une étude s’est intéressée à la réponse aux fibrates en
fonction des génotypes -1131T>C et S19W dans une cohorte de sujets américains (GOLDN
study) [Lai’07]. Après 3 semaines de traitement (160 mg/j de fénofibrate), les concentrations
de TG, de HDLc, de LDL petites et denses et la réponse postprandiale des TG s’amélioraient
de manière significativement plus importante chez les porteurs de l’allèle rare 19W que chez
les non porteurs, y compris après ajustement sur les TG et HDLc de base pour s’affranchir
d’un effet de régression à la moyenne (TG -35.8+/-2.8 % vs -27.9 +/-0.9% et HDLc +11.8+/1.3% vs + 6.9+/-0.5% respectivement). En revanche, il n’y avait pas de différence de réponse
au traitement sur les TG, le HDLc, la taille des LDL ou les TG postprandiaux pour le
polymorphisme -1131T>C, ni sur le LDLc ou le CT pour les 2 polymorphismes [Lai’07].
85
Chez les porteurs de l’allèle 19W, l’augmentation des TG ayant été corrélée à une
augmentation des concentrations plasmatiques d’apoAV [Ish’05, Vae’06], la réponse aux
fibrates ne s’expliquerait pas par une augmentation de l’expression de l’APOA5. Lai et al. font
l’hypothèse d’une dysfonction de la protéine variante apoAV-19W, responsable d’un défaut
de lipolyse soit par défaut de liaison aux HSPG ou d’activation de la LPL. Les fibrates par un
mécanisme inconnu, favoriseraient les échanges de TG et cholestérol entre HDL et VLDL,
conduisant à une réduction des TG des VLDL et de leur remnants [Heg’07, Lai’07].
Bien que les sujets de ces études ne correspondent pas à la population cible classique
des traitements par fibrates, leur TG étant quasi-normaux à l’entrée dans l’étude, et que le
traitement ait été trop court pour juger des effets maximaux sur les lipides, ces données
suggèrent que les variations génétiques individuelles pourraient influencer la réponse aux
fibrates, et peut-être moduler le bénéfice cardiovasculaire inconstamment retrouvé dans les
essais cliniques d’intervention avec les fibrates [Gar’07]. Des études ultérieures de
pharmacogénétique pourraient permettre de mieux cibler les individus qui pourraient
bénéficier d’un traitement par fibrates [Heg’07].
En conclusion, ces études, bien que parfois discordantes, montrent une association
entre les variants rares de polymorphismes de l’APOA5 et différentes pathologies lipidiques
comprenant une HTG modérée ou sévère. Bien que le lien de causalité ne soit pas clairement
établi, l’APOA5 apparaît comme un facteur de susceptibilité génétique important dans la
survenue de ces dyslipidémies. Par ailleurs, le polymorphisme S19W pourrait moduler la
réponse aux fibrates dans le traitement des HTG.
86
VIII. APOA5 et syndrome métabolique
Le syndrome métabolique est caractérisé par un ensemble d’anomalies métaboliques et
de facteurs de risque cardiovasculaire en relation avec l’insulinorésistance [Rea’88]. Il est
associé à une augmentation du risque de diabète de type 2 et du risque cardiovasculaire
[For’05]. Les facteurs de susceptibilité génétique jouent un rôle important dans le
développement de l’insulinorésistance et du syndrome métabolique, et de nombreux gènes
impliqués dans le métabolisme glucidique, lipidique ou l’inflammation ont été associés au
syndrome métabolique [Phi’06].
A. Définitions du syndrome métabolique
Afin d’identifier les patients à risque, différentes définitions du syndrome métabolique
ont été établies par les sociétés savantes dont les principaux critères communs sont l’obésité
abdominale, l’hyperglycémie, l’hypertension artérielle (HTA), l’hypertriglycéridémie, la
diminution du HDLc (Tableau 6) [Alb’98, Exe’01, Kah’05].
Définitions
Critères
Obésité abdominale
TA
Dyslipidémie
Microalbuminurie
Glycémie à jeun
OMS [ALB’98]
NECP-ATPIII [EXE’01]
IDF [KAH’05]
Résistance à l’insuline
(GAJ et GPP) + 2 critères
3 critères/5
Obésité abdominale
+ 2 critères
Femme : T/H>0.85
Homme : T/H>0.90
Femme : TT>88 cm
Homme : TT>102 cm
Femme : TT≥80 cm
Homme : TT≥94 cm
≥ 140/90
≥ 130/80
≥ 130/85 ou traitement
Femme : HDL<0.40 g/l
(1.03mmo/l)
Homme : HDL<0.35mg/dl
(0.9 mmol/l)
et/ou
TG > 1.50 g/l
(1.7 mmol/l)
TG ≥ 1.50 g/l
(1.7 mmol/l)
(1.29 mmol/l)
Homme : HDL<0.40 g/l
(1.03 mmol/l)
(1.29 mmol/l)
Homme : HDL<0.40 g/l
(1.03 mmol/l)
ou
traitement
positive
-
-
-
≥ 1.10 g/l (6.1 mmol/l)
≥ 1g/l ou
diabète de type 2
GAJ : glycémie à jeun, GPP, glycémie post-prandiale, TA : Tension artérielle, TT : Tour de taille, T/H : rapport
tour de taille sur tour de hanche,
Tableau 6 : Définitions du syndrome métabolique
87
B. APOA5 et insulinorésistance
On dispose de peu de données dans la littérature. Le déficit en apoAV s’accompagne
d’un état d’insulinorésistance chez l’animal : les souris KO apoa5 -/- étaient
insulinorésistantes [Gro’05]. Certains polymorphismes de l’APOA5 ont été associés à
l’insulinorésistance. Chiu et al. ont réalisé un clamp euglycémique hyperinsulinémique chez
67 sujets américains d’origine caucasienne, normotolérants au glucose, normolipémiques. Les
sujets hétérozygotes pour le polymorphisme V153M (VM) étaient significativement plus
insulinorésistants que les sujets homozygotes pour l’allèle fréquent (MM), avec une
augmentation de leur réponse insulinique, ainsi bien 1ère phase que seconde phase [Chi’05].
De même, pour le polymorphisme SNP4 (-12238 T>C), les sujets homozygotes CC avaient
une augmentation significative de l’AUC et du pic d’insuline au cours d’une HGPO, après
ajustement sur l’insulinémie à jeun [Mar’03]. En revanche, les polymorphismes -1131T>C et
S19W n’étaient pas associés aux paramètres d’insulinosécrétion [Mar’03, Jan’04].
C. Etude des polymorphismes de l’APOA5 dans le syndrome métabolique
La majorité des études d’association des polymorphismes de l’APOA5 réalisées dans
le syndrome métabolique sont des études cas-témoins. Seules 2 études de cohorte ont été
publiées (Tableau 7).
1. Association aux paramètres lipidiques
Dans la majorité des études, les allèles rares des polymorphismes de l’APOA5 ont été
associés à une augmentation des TG chez les patients présentant un syndrome métabolique,
dans des populations d’origine caucasienne ou asiatique (Tableau 7) : -1131T>C [Gra’07,
Maa’07, Yam’07a, Nic’07, Kom’08], S19W [Yam’08b, Gra’08], -3A>G et G185C
[Yam’08b], V153M [Gra’07], SNP1 et SNP2 [Kis’08]. Seules les 2 études hongroises n’ont
pas retrouvée d’association de l’allèle 19W avec les TG [Nic’07, Kom’08].
En revanche, l’association des allèles rares avec un HDLc plus bas était plus inconstantes,
retrouvée uniquement dans 3 études [Gra’07, Yam’07a, Yam’08b].
88
2. Association au risque de syndrome métabolique
Les études ont montré de manière inconstante un sur-risque de syndrome métabolique
chez les porteurs des allèles rares 19W (2 études / 4) et -1131C (4 études /5) avec des Odds
ratio entre 1.30 et 3.62. Les polymorphismes SNP1, SNP2, -3A>G, situés sur le même
haplotype que -1131T>C (haplotype APOA5*2), ont aussi logiquement été associés au risque
de syndrome métabolique, ainsi que le polymorphisme G185C mais pas V153M (Tableau 7).
Toutefois, ces résultats n’étaient pas ajustés sur les TG, ni sur l’IMC dans certaines études,
alors que ces paramètres étaient significativement différents entre les porteurs ou non des
allèles rares. Ainsi, après ajustement sur les TG réalisé dans 2 études, l’association entre les
polymorphismes et le risque de syndrome métabolique n’était plus significative [Gra’07,
Dal’08]. Dallongeville et al. ont montré de manière intéressante que l’association du
polymorphisme S19W au risque de syndrome métabolique disparaissait après ajustement sur
les TG mais pas sur les autres composantes du syndrome métabolique. Par ailleurs, dans cette
étude, le choix de la définition du syndrome métabolique (NCEP-ATPIII ou IDF)
n’influençait pas les résultats [Dal’08].
Ainsi, les polymorphismes de l’APOA5 ont été associés au risque de syndrome
métabolique, mais cette association pourrait seulement refléter leur association aux TG dans
cette population.
89
A. Etudes [Référence]
Définition SM
Population
N (Cas/Contrôles)
Polymorphismes
étudiés
Fréquence allèles rares
(cas vs contrôles)
OR ajusté
Dalongeville et al.
[Dal’08]
NCEP-ATPIII
IDF
Française
WHO-MONICA
932/2206
S19W
6.97 vs 5.69%
1.30 (1.03-1.66)a
Kisfali et al.
[Kis’08]
NCEP-ATPIII
modifiée°
Hongroise
213/142
IVS3+G476A
(SNP2)
1259T>C (SNP1)
8.05 vs 2.47 %
8.29 vs 7.52 % (NS)
3.53 (1.31-9.03) b
0.97 (0.51-1.85) b
Maasz et al.
[Maa’08]
NCEP-ATPIII
Hongroise
201/210
-1131T>C
11% vs 6.2 %
3.62 (1.20-10.93) c
Niculescu et al.
[Nic’08]
NCEP-ATPIII
Roumaine
279/ -
-1131T>C
S19W
-
significatif
pour -1131C
Yamada et al.
[Yam’07a]
NCEP-ATPIII
modifiée°
Japonaise
1017/771
-1131T>C
38.84 vs 30.55 %
1.57 (1.29-1.90) d
Yamada et al.
[Yam’08b]
NCEP-ATPIII
modifiée°
Japonaise
1522/895
-3A>G
S19W
G185C (553G>T)
38.89 % vs 30.28%
9.09% vs 6.09%
1.57 (1.32-1.86) d
NS
1.62 (1.27- 2.08) d
B. Etudes [Référence]
Définition SM
Population
N
Prévalence du SM
Polymorphismes
étudies
OR ajusté
Allemande*
1354 *
26 %
-1131T>C
S19W
Autrichienne§
1770 §
28 %
Turque
1564
Grallert et al.
[Gra’07]
Komurcu-Bayrak et
al. [Kom’08]
NCEP-ATPIII
NCEP-ATPIII
V153M
-1131T>C
S19W
NS *§
1.43 (1.04-1.99) * e
1.48 (1.10-1.99) § e
NS *§
significatif pour
-1131C chez les
femmes
° le critère tour de taille est remplacé par IMC > 25 kg/m2
a
ajusté sur âge, sexe, centre, b ajusté sur âge, sexe, CT, IDM, AVC; c ajusté sur âge, sexe, IMC, CT, IDM, AVC ; d ajusté sur âge, sexe, tabagisme ; e ajusté sur âge et sexe
OR : odds ratio, NS : non significatif,
* Etude KORA, § Etude SAPHIR
Tableau 7 : Etude des polymorphismes de l’APOA5 dans le syndrome métabolique. A : Etudes cas-témoins, B : Etudes de cohorte
90
IX. APOA5 et interaction gène-nutrition
A. Interaction gène-nutrition : effet sur l’IMC et l’obésité
Deux études se sont intéressées aux possibles interactions entre apports alimentaires et
variants génétiques de l’APOA5 sur l’IMC ou le risque d’obésité [Abe’05, Cor’07].
Dans une première étude, un groupe de 606 hommes allemands présentant une HTG modérée
(TG 3,6 g/l en moyenne) et un surpoids (IMC moyen 28 kg/m2) ont été soumis à un régime
pauvre en lipides (< 50 g/j) pendant 3 mois. Alors que les IMC n’étaient pas significativement
différents initialement entre les porteurs on non porteurs de l’allèle -1131C, au bout de 3 mois
de régime, les porteurs de l’allèle -1131C avaient perdu significativement plus de poids que
les non porteurs (IMC –13.4 % vs –0.4 %, p=0.002). On constatait par ailleurs une
amélioration des paramètres lipidiques (TG, CT, LDLc) similaires dans les 2 groupes sous
régime [Abe’05].
Dans la deuxième étude, réalisée dans la cohorte Framingham Offspring Study (2280 sujets
des 2 sexes), il existait une association statistiquement significative entre le polymorphisme
-1131T>C mais pas S19W et les apports lipidiques sur l’IMC [Cor’07]. Cette interaction était
dose-dépendante, sans différence selon le sexe. Ainsi, les porteurs de l’allèle rare -1131C
avait un risque plus faible de surpoids (OR 0.61 (0.39-0.98), p=0.032) et d’obésité (OR 0.63
(0.41-0.96), p=0.031) dans le groupe aux apports lipidiques élevés (≥ 30% apports
énergétiques journaliers (AEJ)) mais pas pour des apports lipidiques plus faibles (< 30%
AEJ). Parmi les AG, les AG mono-insaturés (AGMI) étaient les plus significativement
associés à cette interaction polymorphisme-IMC : les sujets consommant le plus d’AGMI (≥
11% AEJ) et porteurs de l’allèle rare -1131C avait un risque plus faible d’obésité (OR 0.62
(0.41-0.94), p=0.026). Il existait une forte corrélation entre les apports d’AG saturés et
d’AGMI dans les enquêtes alimentaires, dans cette cohorte [Ord’02]. Cette relation
paradoxale entre une consommation plus élevée d’AGMI et un IMC plus faible a déjà été
rapportée pour le variant rare du polymorphisme Pro12Ala de PPARγ [Mim’03]. Pour le
polymorphisme -1131T>C, les auteurs ont suggéré que la diminution de la lipolyse médiée
par la LPL pourrait diminuer les TG disponibles pour le stockage adipocytaire, d’où l’effet
favorable sur le poids en cas de régime hyperlipidique [Cor’07].
91
Comme dans l’étude précédente, les polymorphismes n’étaient pas associés à l’IMC au début
de l’étude. Il n’y avait pas d’interaction gène –nutrition sur l’IMC avec le polymorphisme
S19W [Cor’07].
B. Interaction gène-nutrition : effet sur les paramètres lipidiques
Dans la même cohorte Framingham Offspring Study, Lai et al. ont montré l’existence
d’une interaction entre le polymorphisme -1131T>C et les apports d’AG polyinsaturés
(AGPI) sur les TG, les concentrations de remnants, mais pas avec le polymorphisme S19W :
les porteurs de l’allèle -1131C avaient des TG et des remnants plus élevés dans le groupe
consommant le plus d’AGPI (> 6 % AEJ) mais pas dans le groupe aux apports faibles (< 6 %
AEJ) [Lai’06]. Andersen et al. ont également rapporté une interaction significative entre le
polymorphisme -1131T>C et les apports en AGMI sur les TG [And’06].
Une autre étude a rapporté une diminution significativement plus importante du cholestérol
total chez les porteurs de l’allèle 19W que chez les S19 (- 20 % vs - 8%) sur une période de 8
ans alors que dans le même temps, l’alimentation a évolué dans cette population avec une
diminution de la consommation de protéines et de produits d’origine animale avec
augmentation de la consommation de fruits et légumes. Aucune différence n’était noté pour le
polymorphisme V153M ou -1131T>C. Toutefois, les faibles effectifs (n=117 à 133),
l’absence de données alimentaires individuelles, l’absence d’ajustement statistique rendent
cette étude peu convaincante, d’autant plus que le lien physiopathologique reste incertain
[Hub’06, Hub’07].
En conclusion, le polymorphisme -1131T>C pourrait moduler l’effet des apports
lipidiques sur le poids et le risque d’obésité, et également sur les paramètres lipidiques.
92
X. APOA5 et diabète de type 2
Comme on l’a vu précédemment, l’expression du gène APOA5 est régulée par
l’insuline et le glucose. L’APOA5 et ses variants pourraient être associées à
l’insulinorésistance, au syndrome métabolique, et participer à des interactions gène-nutrition
en particulier dans l’obésité. Des équipes se sont donc intéressées à l’influence des
polymorphismes l’APOA5 sur le risque de diabète de type 2 et sur la dyslipidémie du diabète
de type 2, caractérisée par une HTG et une diminution du HDLc, paramètres associés aux
variants de l’APOA5 dans la population générale.
A. Polymorphismes de l’APOA5 et risque de diabète de type 2
Une seule étude s’est intéressée spécifiquement au lien entre le risque de survenue
d’un diabète de type 2 et la fréquence des polymorphismes de l’APOA5: dans une cohorte
prospective de 2490 hommes britanniques, aucune association n’a été mise en évidence entre
le risque de survenue de diabète durant les 15 ans de suivi et la fréquence allélique ou
génotypique des polymorphismes -1131T>C et S19W. Il n’y avait pas non plus d’association
des polymorphismes avec l’ancienneté ou l’âge de survenue du diabète dans cette étude
[Tal’06].
Ce résultat a été corroboré par l’absence de différence significative entre les
fréquences des polymorphismes -1131T>C et S19W (ou des haplotypes APOA5*2 et
APOA5*3) entre les groupes diabétiques et :
- les groupes contrôles non diabétiques dans 4 études cas-témoins [Cha’05a, Yan’05, Bau’07,
Dor’07]
- les données publiées dans la population générale de même origine ethnique dans d’autres
études [Est’04, Dor’07, Qi’07].
Il n’y avait pas non plus de différence de fréquence du polymorphisme G182C entre
diabétiques et non diabétiques dans une population taiwanaise [Jia’05].
Par ailleurs, le polymorphisme -1131T>C n’était pas plus fréquent chez les patients
présentant une néphropathie diabétique [Bau’07].
93
B. Polymorphismes de l’APOA5 et paramètres lipidiques dans le diabète de type 2
1. Polymorphismes -1131T>C et S19W
On dispose de moins d’études que dans la population générale, mais un effet similaire
des polymorphismes -1131T>C et S19W sur les TG a été mis en évidence chez les patients
diabétiques de type 2 d’origine ethnique variée. Le variant rare du polymorphisme -1131T>C
a été associé à des TG significativement plus élevés dans la majorité des études [Cha’05a,
Est’04, Yan’05, Bau’07, Dor’07, Qi’07], sauf 2 [Dal’06a, Dor’07]. D’autres études ont
également rapporté des TG significativement plus élevés chez les porteurs de l’allèle 19W
[Tal’06, Dor’07, Qi’07], mais pas toutes [Dal’06a, Dor’07]. De même, les haplotypes
APOA5*2 et APOA5*3 ont été associés à une augmentation significative des TG par rapport
à l’haplotype APOA5*1 [Qi’07]. Lorsqu’elle était précisée, l’amplitude de l’effet des variants
rares sur les TG dans le diabète de type 2 était comparable aux données obtenues en
population générale (+10 à 15 %) [Tal’06, Dor’07].
En revanche, une seule étude a rapporté une association de l’allèle -1131C à un HDLc
plus bas (-5.5 %) [Dor’07] et aucune étude pour l’allèle 19W. Esteve et al. ont également
publié une association du variant -1131C à une augmentation des fractions LDL petites et
denses [Est’04].
2. Polymorphisme G185C
Le polymorphisme G185C a été également associé à des TG significativement plus
élevés dans une population taiwanaise avec un effet plus marqué de l’allèle rare chez les
diabétiques (+ 43 %) que chez les non diabétiques (+ 26%). Il existait dans cette étude une
interaction significative entre le polymorphisme G185C et la glycémie à jeun chez les patients
diabétiques, non retrouvée chez les non diabétiques : plus la glycémie à jeun était élevée, plus
l’effet de l’allèle rare sur les TG était marqué [Jia’05].
94
3. Polymorphismes et hypertriglycéridémie modérée dans le diabète de type 2
Les variants rares des polymorphismes de l’APOA5 pourraient favoriser la survenue
d’une HTG modérée chez les diabétiques de type 2. En effet, chez des patients diabétiques de
type 2 tunisiens, la fréquence de l’allèle rare -1131C était significativement plus élevée dans
le groupe TG > 2.2 mmol/l que dans le groupe TG ≤ 2.2 mmo/l) (20.5 vs 13.5%, p=0.011)
[Cha’05a]. De même, le risque d’HTG modérée (TG>3 mmol/l) était significativement
augmenté chez les porteurs de l’allèle rare du polymorphisme G182C chez des diabétiques
taiwanais (OR 3.81 (1.73-8.40), p<0.001) [Jia’05]. On ne dispose pas d’étude sur l’effet des
polymorphismes de l’APOA5 sur le risque d’HTG sévère chez les diabétiques de type 2.
C. Concentrations plasmatiques d’apoAV chez les diabétiques de type 2
1. Concentrations d’apoAV et relation avec les triglycérides
Les concentrations plasmatiques d’apoAV chez les patients diabétiques de type 2
apparaissent très hétérogènes, comme dans la population générale, avec des discordances
selon les études quant à leur corrélation avec les concentrations plasmatiques de TG.
Les concentrations plasmatiques d’apoAV chez les diabétiques de type 2 seraient plus
basses que chez les non diabétiques selon Ishihara et al. (69.4+/-44.3 µg/l vs 179.2+/-74.8
µg/l, p<0.01) avec une corrélation négative aux concentrations plasmatiques de TG [Ish’05].
Dans l’étude de Pruneta et al., il n’y avait pas de différence significative de concentrations
plasmatiques d’apoAV entre diabétiques et non diabétiques, ni de corrélation entre
concentration d’apoAV et les TG [Pru’05a].
En revanche, 3 autres études ont retrouvé des concentrations moyennes d’apoAV plus élevées
chez les patients diabétiques que les valeurs normales précédemment publiées en population
générale, avec une corrélation positive (r=0.40 à 0.60) entre les concentrations plasmatiques
d’apoAV et de TG [Dal’06a, Alb’07, Kah’07]. Les valeurs moyennes de concentrations
d’apoAV étaient assez proches dans ces 3 études, mais avec des intervalles de variation
importants : 268+/-98 µg/l [Kah’07], 275 +/-30 µg/l [Alb’07] et 257+/156 µg/l [Dal’06a].
95
Dans l’HTG sévère, Schaap et al. ont également montré une augmentation significative des
concentrations d’apoAV chez les diabétiques par rapport aux témoins non diabétiques
(respectivement 2941 vs 1005 µg/l) [Sch’ 06].
2. Concentrations d’apoAV et polymorphismes de l’APOA5
Chez les patients diabétiques de type 2, les concentrations d’apoAV étaient
significativement plus élevées chez les porteurs de l’allèle rare 19W et plus basses chez les
porteurs de l’allèle rare -1131C dans une étude [Dal’06a], comme retrouvé dans la population
générale [Tal’06, Vae’06], ou chez les patients avec une HTG sévère [Hen’07, Sch’06].
3. Concentrations d’apoAV en phase post-prandiale
3 équipes ont mis en évidence une augmentation post-prandiale de l’apoAV chez les
patients diabétiques de type 2 après un repas riche en graisses [Pru’05a, Ten’07, Kah’07].
Cette augmentation était significativement corrélée à l’augmentation postprandiale des TG
(VLDL et chylomicrons) dans deux études [Ten’07, Kah’07] mais pas dans une autre
[Pru’05a], avec peut-être un défaut de puissance dans cette dernière. Néanmoins, il n’y avait
pas de corrélation entre les concentrations plasmatiques d’apoAV basale ou post-prandiale et
l’activité LPL [Pru’05a, Kah’07]
Ces données suggèrent que l’apoAV ne joueraient pas un rôle direct ou immédiat sur
la régulation de la triglycéridémie post-prandiale dans le diabète de type 2, et que
l’augmentation post prandiale de l’apoAV ne pourrait qu’être un reflet de l’augmentation des
chylomicrons et VLDL en phase post-prandiale.
En conclusion, les variants rares des polymorphismes de l’apoAV ne favoriseraient
pas la survenue d’un diabète de type 2, mais ils sont associés à une augmentation de la
triglycéridémie comme dans la population générale, et pourraient favoriser la survenue d’une
HTG modérée. Les données chez les patients diabétiques de type 2 confirment une corrélation
positive entre les concentrations plasmatiques d’apoAV et les TG chez l’homme.
96
XI. APOA5 et risque cardiovasculaire
On a vu précédemment que les variants rares des polymorphismes de l’APOA5 ont été
associés dans la littérature à des paramètres lipidiques pro-athérogènes : triglycérides plus
élevés, HDLc plus bas, LDL petites et denses, ainsi qu’à différents types de dyslipidémies
athérogènes. On dispose actuellement de peu de données concernant l’association de l’APOA5
à des marqueurs intermédiaires du risque cardiovasculaire. En revanche, beaucoup d’études,
majoritairement des études cas-témoins, ont exploré l’association entre les polymorphismes
de l’APOA5 et la survenue d’évènements cardiovasculaires, coronariens ou d’accidents
vasculaires cérébraux (AVC). Par ailleurs, des travaux expérimentaux récents chez l’animal
sont en faveur d’un rôle athéroprotecteur de l’apoAV
A. Arguments expérimentaux en faveur d’un rôle athéroprotecteur de l’apoAV
Dans un modèle de souris présentant une dyslipidémie mixte (souris ApoE2-K1),
Mansouri et al. ont montré que la surexpression du gène humain APOA5 diminuait non
seulement les TG, mais réduisait significativement l’apparition des lésions athéromateuses
aortiques d’environ 50 %. Par ailleurs, cet effet protecteur était majoré par l’administration de
fénofibrate, activateur PPARα, qui augmentait l’expression hépatique de l’ARNm de
l’APOA5 et des taux circulants d’apoAV [Man’08].
B. Polymorphismes de l’APOA5 et marqueurs intermédiaires du risque
cardiovasculaire
1. Etudes d’association à l’épaisseur intima-média carotidienne (EIMc)
L’EIMc est considéré comme un marqueur prédictif précoce d’IDM ou d’AVC
ischémique chez les sujets asymptomatiques [Ole’99]. Deux études ont été publiées
concernant l’association des polymorphismes de l’APOA5 à l’EIMc avec des résultats
discordants.
97
Dans la Framingham Heart Study (n=2267), l’haplotype APOA5*3 (portant le
polymorphisme S19W) était associé à augmentation significative de l’EIMc au niveau de la
carotide commune alors que l’haplotype APOA5*2 (portant notamment le polymorphisme
-1131T>C) était associé à augmentation de l’EIMc uniquement chez les sujets obèses. L’effet
était indépendant des autres FRCV et des paramètres lipidiques dont les TG [Elo’06].
En revanche, dans l’étude beaucoup moins puissante (n=444) de van der Vleuten et al., les
porteurs des allèles rares des polymorphismes -1131T>C et S19W ne présentaient pas
d’augmentation significative de l’EIMc [Van’07].
2. Etudes d’association à la CRP
Seules 2 études, aux résultats là encore discordants, se sont intéressées à l’association
des polymorphismes de l’APOA5 à la CRP : Hubacek n’a pas retrouvé chez des caucasiens
[Hub’05b] l’association entre le variant -1131C et l’augmentation de la CRP décrite chez des
Coréens [Jan’04].
C.
Etudes
d’association
des
polymorphismes
de
l’APOA5
au
risque
cardiovasculaire
1. Etudes cas-témoins
a. Etudes d’association au risque coronarien
Quinze études cas-témoins réalisées dans des populations d’origines ethniques variées
ont été publiées avec des résultats discordants. Les polymorphismes -1131T>C et S19W ont
été les plus étudiés (Tableau 8). Toutes les études ont retrouvé l’association significative entre
les allèles rares des polymorphismes étudiés et la triglycéridémie dans les groupes contrôles
ou l’ensemble de population étudiée, sauf 2 études avec le polymorphisme S19W [Lee’04,
Rui’05] une avec G185C [Rui’05], une où les données n’étaient pas disponibles [Yam’08a].
Dans les groupes de patients coronariens, cette association aux TG a été également retrouvée
[Bi’04, Sza’04, Cha’05a, Liu’05, Tan’06] sauf dans une étude avec le poly -1131T>C
[Hub’04a]. En revanche, seules 2 études dans les groupes témoins [Lee’04, Hsu’06], et une
98
seule étude dans le groupe coronarien [Liu’05], ont retrouvé une association de l’allèle
-1131C à une diminution du HDLc.
La moitié des études cas-témoins sur (6/12) ont rapporté une augmentation
significative de la fréquence d’une coronaropathie chez les porteurs de l’allèle rare C du
polymorphisme -1131 T>C par rapport aux porteurs de l’allèle sauvage, chez les caucasiens
[Sza’04, Vae’06] et chez les asiatiques [Bi’04, Liu’05, Tan’05, Yan’05]. L’augmentation du
risque coronarien chez les porteurs de l’allèle rare -1131T>C variait entre 1,3 et 2,3 fois. Par
ailleurs l’étude de Bi et al. a montré en plus un effet indépendant du polymorphisme -482T>C
de l’APOC3 [Bi’04] et celle de Vaessen et al. un effet indépendant des concentrations
plasmatiques d’apoAV [Vae’06] (Tableau 8).
Concernant le polymorphisme S19W, une seule étude sur 7 a mis en évidence une
augmentation de la fréquence de l’allèle rare 19W dans le groupe coronarien par rapport au
groupe contrôle (4.7 % contre 0 %) [Liu’05]. Dans l’étude de Hubacek et al., il existait une
augmentation de la fréquence des génotypes homozygotes -1131 CC et/ou 19 WW chez des
hommes tchèques ayant survécu à un IDM comparé à des témoins, mais pas en terme de
fréquence allélique ou de génotypes analysés individuellement entre les cas et les témoins
[Hub’04a].
2 études ont également retrouvé un sur-risque coronarien chez les porteurs chinois de l’allèle
rare du polymorphisme et G185C [Hsu’06, Tan’06]. Mais dans d’autres populations japonaise
[Yam’08a] ou hispanique [Rui’05], ni le polymorphisme G185C [Rui’05, Yam’08a], ni les
polymorphismes -3A>G, SNP2 et SNP1 [Rui’05], n’étaient associés à une augmentation du
risque coronarien (Tableau 8).
Toutefois ces études présentent un certain nombre de limites rendant leur
interprétation et comparaison difficile. Tout d’abord, les critères d’ajustement en particulier
des études positives sont très variables. Quatre études positives n’étaient pas ajustées sur les
autres facteurs de risque cardiovasculaires (FRCV) [Bi’04, Liu’05, Yan’05, Tan’06]. Les
deux autres études positives étaient ajustées sur les FRCV et les paramètres lipidiques, dont
les TG pour celles de Szalai [Sza’04] mais pas celle de Vaessen [Vae’06]. Dans cette dernière
étude, l’ajustement sur les TG faisait disparaître la significativité des résultats. Deux autres
études ajustées sur les FRCV et les TG étaient négatives [Hsu’06, Mar’07].
99
N
(cas / tém)
Population
Définition
des cas
Polym.
étudiés
Freq allèles
rares (cas vs
témoins)
OR §
312/317
chinoise
angio
-1131T>C
39.9 vs 33.3 %*
1.80 (1.04-1.70) µ
[Cha’05a]
74/78 DT a
57/99 non
DT b
tunisienne
clinique
+ angio
-1131T>C
16.2 vs 14.7 % a
14.9 vs 14.6 % b
0.87 (0.41-1.83) a
1.29 (0.6-2.77) b
[Dal’06b]
442/475
française
pontage
angioplastie
ou IDM
S19W
7.7 vs 4.8 %*
1.46 (0.96-2.23)
[Hsu’06]
211/677
chinoise
angio
-1131T>C
G185C
31 vs 29.7%
10.9 vs 6.5 %*
0.86 (0.31-2.41)
2.17 (1.13-4.18)
[Hub’04a]
435/2559
tchèque
1er IDM non
fatal
-1131T>C
S19W
10.6 vs 8.5 %
8.7 vs 7.2 %
NS
NS
[Lee’04]
302/107
nordaméricaine
angio
-1131T>C
S19W
8.4 vs 8.4 %
7.0 vs 7.6 %
ND
[Liu’05]
483/502
chinoise
angio
-1131T>C
S19W
39.1 vs 29.9%*
4.7 vs 0 %*
1.60 (1.24-2.07)
ND
[Mar’07]
669/244
italienne
angio
-1131T>C
S19W
9.7 vs 8.8 %
5.1 vs 5.1 %
0.85 (0.51-1.41)
1.02 (0.52-1.99)
3.1 vs 3.2 %
14.1 vs 13.9%
9.6 vs 10.2%
10.5 vs 9.0%*
2.1 vs 2.2 %
10.2 vs 9.5%
NS pour tous les
polym.
Références
[Bi’04]
[Rui’05]
1703/1703
costaricaine
1er IDM non
fatal
-1131T>C
-3A>G
S19W
SNP2
G185C
SNP1
[Sza’03]
308/310
hongrois
angio
-1131T>C
10.9 vs 5.7 %*
1.98 (1.14-3.48)
[Tan’05]
235/262
chinoise
angio
-1131T>C
40.4 vs 34.3 %*
2.28 (1.22-4.27) µ
[Tan’06]
232/302
chinoise
angio
G185C
7.8 vs 4.0 %*
2.09 (1.14-3.83)
[Vae’06]
1034/2031
britannique
ECoro fatal
ou non
-1131T>C
S19W
6.9 vs 5.6 %*
5.9 vs 5.9 %
1.30 (1.01-1.69)
0.95 (0.72-1.24)
[Yam’08a]
1328/2105
japonaise
IDM clinique
+ angio
S19W
G185C
ND
NS
NS
113 DT
/155
chinoise
angio
-1131T>C
37.2 vs 27.7 %*
ND
[Yan’05]
* p<0.05, § OR : Odds ratio du risque cardiovasculaire des porteurs des allèles rares des polymorphismes
étudiés versus porteurs des allèles fréquents, µ CC vs TT. Angio : angiographique, DT : diabétique de type 2,
ECoro : événement coronarien, IDM : infarctus du myocarde, Freq : fréquence, ND : non disponible, NS : non
significatif, Tem : témoin.
Tableau 8 : Association entre les polymorphismes de l’APOA5 et la survenue
d’évènements coronariens - Etudes cas-témoins
100
Ensuite, des critères très variables ont été utilisés pour définir les cas. Se pose le problème de
la pertinence des critères purement angiographiques pour définir les cas, dont la définition
varie selon les études, comparés à des critères « durs » d’événements coronariens cliniques.
Le choix des témoins est également crucial dans ce type d’études.
Enfin, des problèmes de puissance statistique insuffisante peuvent être évoqués pour les
populations dans lesquelles les polymorphismes sont rares : la majorité des études positives
pour le polymorphisme -1131T>C (4/6) ont été réalisées dans des populations asiatiques dans
lesquelles la fréquence de l’allèle -1131C est proche de 30 % alors que chez les caucasiens, la
fréquence est inférieure à 10 %. Il faudrait peut-être des populations de plus grande taille
comme dans l’étude de Vaessen pour pouvoir mettre en évidence une différence significative
chez les caucasiens [Vae’06].
b. Etudes d’association au risque d’AVC ischémiques
Deux études cas-témoins hongroises ont étudié l’association des polymorphismes
-1131T>C [Hav’06] et S19W [Maa’08] au risque d’AVC ischémiques. Les allèles rares des 2
polymorphismes étaient associés à une augmentation significative des TG chez les patients
ayant présenté un AVC ischémique. La fréquence de l’allèle -1131C était significativement
plus élevée dans le groupe AVC que dans le groupe témoin (10-12 % vs 5%) [Hav’06] alors
que la fréquence de l’allèle 19W n’était significativement plus élevée que dans le sous groupe
d’AVC ischémiques des gros vaisseaux (10.9 vs 4.6 %), mais pas pour les AVC des petits
vaisseaux ou mixtes [Maa’08]. Après ajustement sur les FRCV mais pas sur les TG, l’allèle
-1131C était associé à un risque significativement plus élevé d’AVC ischémique quelqu’en
soit le type (OR 2.1 (1.3-4.7)) [Hav’06] et l’allèle 19W à un risque significativement plus
élevé d’AVC ischémiques des gros vaisseaux seulement (OR 2.1 (1.18-3.84) [Maa’08]. On ne
sait donc pas si ce sur-risque était indépendant des TG.
2. Etudes de cohorte
Quatre études de cohorte ont étudié l’association des polymorphismes -1131T>C et
S19W au risque cardiovasculaire. Leurs caractéristiques sont détaillées dans le tableau 9.
101
Les 2 premières, NPHSII (Northwick Park Heart Study II) [Won’03] et Framingham [Lai’04],
ont étudié la relation entre les polymorphismes et la survenue primaire d’évènements
coronariens. La 3ème est une étude de cohorte allemande de sujets normolipémiques,
apparentés à des patients présentant une HCF, dans laquelle a été étudié l’association des
polymorphismes au risque cardiovasculaire (coronarien, vasculaire cérébral ou périphérique et
chirurgie vasculaire) [Van’07]. La 4ème est une étude de suivi de la progression
angiographique de l’athérome coronarien en prévention secondaire chez des hommes ayant
subi un pontage aorto-coronarien avec un HDL ≤ 1.1 mmol/l, dérivée de la LOCAT study,
étude d’efficacité du gemfibrozil versus placebo [Tal’04].
Dans la cohorte allemande et dans l’étude NPHSII, aucun des polymorphismes
-1131T>C ou S19W n’était associé à une augmentation significative du risque
cardiovasculaire ou coronarien [Won’03, Van’07]. Toutefois, dans l’étude NPHSII,
l’haplotype porteur du polymorphisme S19W (APOA5*3) était le 4ème haplotype associé au
risque cardiovasculaire, et celui associé aux TG les plus élevés [Won’03]. Dans la cohorte de
Framingham, seules les femmes porteuses de l’allèle rare -1131C présentaient un risque
d’IDM significativement plus élevé par rapport aux porteuses de l’allèle sauvage (OR=1.85,
p=0.04) [Lai’04]. Dans l’étude LOCAT, on notait seulement une tendance non significative à
la progression angiographique de l’athérome coronarien (diminution du diamètre coronarien
moyen) chez les porteurs de l’allèle rare 19W (p=0.08) [Tal’04].
Réf
Nom de
l’étude
Population
étudiée
N
(H/F)
Durée
(ans)
Fréq.
allèle
-1131C
Fréq.
allèle
19W
% Evt
Coro
Association
au RCV
[Won’03]
NPHSII
Britannique
2808
/0
9
6.0 %
5.7 %
6.7 %
NS
[Lai’04]
Framingham
Nord
Américains
Blancs
1129
/ 1262
22,5
6.9 %
5.9 %
9.8 %
S pour les
femmes
-1131C
[Van’07]
-
Allemande
208/
246
5
8%
11 %
4.9 %
NS
[Tal’04]
LOCAT
Finlandaise
372
/0
2
9.5 %
7.2 %
ND
NS
Evt Coro : évènements coronariens, Freq : fréquence, H/F : hommes/femmes, ND: non donné, NS : non
significatif, S: significatif, Réf : référence, RCV : risque cardiovasculaire
Tableau 9 : Association entre les polymorphismes -1131T>C et S19W de l’APOA5
et la survenue d’évènements cardiovasculaires - Etudes de cohorte
102
En conclusion, ces résultats illustrent la difficulté à mettre en évidence un lien
statistique entre les polymorphismes géniques et les maladies cardiovasculaires. Un certain
nombre d’études cas-témoins ont mis en évidence une augmentation du risque coronarien et
d’AVC ischémiques chez les porteurs de l’allèle rare du polymorphisme -1131T>C de
l’APOA5, mais non clairement confirmée dans les études de cohorte. Les résultats sont
beaucoup plus incertains pour le polymorphisme S19W. Par ailleurs, les données sont
insuffisantes pour préciser si cette augmentation du risque cardiovasculaire est liée à l’effet
des polymorphismes sur les TG ou est un effet indépendant.
Les liens entre l’APOA5 et le risque cardiovasculaire pourraient être précisés par la
réalisation d’études de cohorte dans des populations à fréquence allélique plus élevée (comme
les asiatiques) ou ciblant des populations à risque cardiovasculaire plus élevé, ou encore par la
réalisation de méta-analyses.
La génétique des maladies cardiovasculaires est une question complexe en raison de la
multiplicité des gènes potentiellement impliqués et des interactions gènes - environnement qui
modulent l’expression de ces gènes.
103
XII. Mutations de l’APOA5 identifiées chez des patients avec HTG sévères
Comme on l’a vu dans la revue de la littérature, le gène APOA5 s’est révélé être un
gène candidat de choix pour l’étude des HTG. Plusieurs équipes se sont intéressées, comme la
nôtre, à la recherche et à la caractérisation de mutation de l’APOA5 chez des patients
présentant une HTG sévère, généralement définie par des TG > 10 mmol/l.
Nous présenterons ici les mutations identifiées dans la littérature. Les mutations
décrites par notre équipe seront détaillées dans la partie expérimentale. La comparaison des
données sera réalisée dans la 3ème partie « discussion » de ce mémoire.
A. Mutations avec troncature prématurée de l’apoAV
L’équipe italienne de Priore Oliva et al. a successivement décrit 3 mutations de
l’APOA5 en séquençant le gène dans une cohorte de 30 patients avec HTG sévère et pour
lesquels aucune mutation de la LPL ou de l’APOC2 n’avait été retrouvée. Ils ont identifiés 2
mutations non-sens (Q148X et Q97X) et une mutation intronique (c.161 + 3g>c), toutes
responsables d’une troncature prématurée de l’apoAV [Pri’05c, Pri’06, Pri’08]. Ces mutations
n’ont pas été retrouvées dans une cohorte de 100 témoins normolipémiques. Une autre
mutation intronique, proche de la précédente (c.161 + 5g>c), a également été décrite
[Hen’08].
1. Mutation Q148X
La mutation Q148X est l’une des deux premières mutations identifiées en 2005 avec la
mutation Q139X, qui sera décrite dans la partie expérimentale. Cette mutation a été identifiée
à l’état homozygote chez un enfant italien, d’origine tunisienne, qui a présenté à partir de
l’âge de 5 ans, plusieurs épisodes d’HTG sévère (TG>50 mmol/l) avec des douleurs
abdominales et une xanthomatose éruptive, sans épisode de pancréatite aiguë [Pri’05c].
L’apoCIII était augmentée (27.4 mg/dl, normale 7 à 10). Son génotype APOE était E3/E3 et il
portait également le variant rare du polymorphisme -482C>T à l’état homozygote. Le
104
traitement par des TG à chaîne moyenne (TCM) s’est révélé inefficace. En revanche,
l’association d’un régime pauvre en graisses (< 20 g/j) et d’une supplémentation en AG
omega 3 (3.4 g/j) a permis de maintenir les TG entre 1.96 et 9.12 mmol/l pendant les 3 années
de suivi (Tableau 10).
L’enquête familiale a permis de retrouver la mutation Q148X chez 10 apparentés à
l’état hétérozygote dont chez les 2 parents, cousins germains. Aucun d’entre eux n’a présenté
d’HTG sévère. Un porteur hétérozygote de la mutation présentait une dyslipidémie mixte
modérée (II.3). Certains membres de la famille présentaient une HTG modérée qu’ils soient
porteurs (II.2, III.1, III.2, III.6, III.7) ou non (II.1, III.5) de la mutation, avec une forte
pénétrance du surpoids (9/12) ou de l’obésité (2/12) ainsi que de l’hyperglycémie modérée ou
du diabète de type 2 (5/12) chez les adultes, traduisant probablement une forte prévalence du
syndrome métabolique dans cette famille. Toutefois, le sujet le plus gros (III.3) avec un
diabète de type 2, porteur de la mutation Q148X, était normotriglycéridémique (Figure 20).
I
?
?
1
2
II
1
3
2
4
III
1
2
3
4
5
6
7
1
2
8
9
IV
Carré : femme, Cercle : homme, Figure noire pleine : homozygote Q148X, Figure à moitié pleine
noire : hétérozygote Q148X, Flèche : cas index, ? : patient non génotypé.
Figure 20 : Arbre généalogique de la famille Q148X.
D’après [Pri’05c]
105
Les analyses de ségrégation dans la famille ont permis de mettre en évidence que
l’haplotype mutée Q148X portait également le variant rare 19W. Les porteurs hétérozygotes
de la mutation Q148X présentaient tous comme second haplotype, un haplotype sauvage
APOA5*1.
La mutation Q148X introduit un codon stop prématuré et prédit la formation d’une
protéine tronquée de 135 AA, en amont des domaines de liaison à l’héparine (AA 186-227) ,
aux lipides (AA 192-238 et 301-343) et d’activation de la LPL (192-238) [Loo’05, Sun’06,
Won’07]. L’activité LPL post-héparinique du cas index était diminuée (5.08 +/- 0.39 µmol
AG/ml/h, normale entre 8 et 15), avec une activité LH normale. Les activités LPL des parents
et du frère du cas index étaient normales. Priore Oliva et al. ont également montré que
l’activité LPL d’un témoin était significativement réduite en présence du plasma du cas index,
suggérant la présence d’un inhibiteur de la LPL dans le plasma du cas index. Cette action
inhibitrice du plasma du cas index pourrait être liée à la fois à l’absence d’apoAV activatrice
et à l’augmentation de l’apoCIII, inhibiteur de la LPL [Pri’05c].
Il n’a pas été réalisé d’autres tests fonctionnels permettant de documenter la perte de fonction
induite par la mutation. On ne sait pas non plus si la protéine tronquée prédite par la mutation
était présente dans la circulation, liée ou non aux lipoprotéines.
Priore Oliva et al. ont donc identifiée l’une des 2 premières mutations faux–sens de
l’APOA5 responsable à l’état homozygote d’un syndrome précoce d’hyperchylomicronémie
sévère avec défaut d’activité lipolytique. Les hétérozygotes n’exprimaient pas la mutation
sous forme d’HTG sévère dans cette étude [Pri’05c].
2. Mutation Q97X
La mutation Q97X a été identifiée en premier lieu à l’état homozygote par Priore
Oliva et al. chez un adolescent italien qui avait présenté à l’âge de 2 ans une syndrome
hyperchylomicronémique (TG 9.65 mmol/l) avec xanthomatose éruptive sans pancréatite
aiguë [Pri’08]. Sous régime pauvre en graisses et en sucres simples avec AG omega 3 (3 g/j),
les TG sont restés entre 2.82 et 5.28 mmol/l pendant 2 ans (de 12 à 14 ans), avec une nouvelle
poussée d’HTG sévère à l’âge de 15 ans (TG 12.03 mmol/l). Le cas index n’avait pas de
106
surpoids ni de diabète. Son génotype de l’APOE était E3/E4 et il était homozygote CC pour le
polymorphisme -482C>T (Tableau 10).
L’enquête familiale a permis de mettre en évidence la mutation à l’état hétérozygote
chez les 2 parents et chez son frère de 7 ans, tous normolipémiques. Le cas index et ses
apparentés ne portaient aucun allèle rare des polymorphismes classiques de l’APOA5
(-1131T>C,-3A>G, S19W, SNP2, SNP1).
La mutation Q97X introduit un codon stop prématuré et prédit la formation d’une
protéine tronquée, comme la mutation Q148X, en amont des domaines de liaison à l’héparine
(AA 186-227), aux lipides (AA 192-238 et 301-343) et d’activation de la LPL (192-238)
[Loo’05, Sun’06, Won’07]. La protéine tronquée prédite par la mutation n’a pas été mise en
évidence dans le plasma du cas index en western blot. L’activité LPL post-héparinique du cas
index mesurée à l’âge de 12 ans, en situation d’HTG modérée (TG 3.73 mmol/l) était normale
(9.5 µmol AG/ml/h, normale entre 8 et 15). En revanche, les concentrations plasmatiques
d’apoAV étaient indétectables chez le cas index confirmant la déficience complète en apoAV
et étaient normales chez son père. Les concentrations plasmatiques d’apoCIII étaient
légèrement augmentées chez le cas index et normales chez son père.
On ne dispose pas de test fonctionnel complémentaire dans cette étude.
Priore Oliva et al. ont donc identifiée la 3ème mutation faux–sens de l’APOA5 décrite
dans la littérature de l’APOA5 responsable à l’état homozygote d’un syndrome précoce
d’hyperchylomicronémie sévère avec déficience en apoAV. Les hétérozygotes n’exprimaient
pas la mutation sous forme d’HTG sévère [Pri’08].
La mutation intronique c.161 + 3g>c a été identifiée par l’équipe de Priore Oliva et al.
en 2006, à l’état hétérozygote, chez un homme de 51 ans avec une HTG sévère (TG 15.9
mmol/l), asymptomatique, de poids normal, non diabétique, sans pathologie cardiovasculaire
associée [Pri’06].
107
L’enquête familiale a révélé que son père, âgé de 75 ans, présentant une HTG sévère
(TG 47.6 mmol/l) avec IDM à 61 ans, était également porteur hétérozygote de la mutation. On
ignore l’ancienneté et l’âge de révélation de cette HTG sévère ainsi que les éventuels autres
facteurs de risque cardiovasculaire associés chez ce sujet. La fille du cas index, âgée de 16
ans, avait un bilan lipidique normale et n’était pas porteuse de la mutation.
Le cas index et son père étaient tous les deux hétérozygotes pour le polymorphisme
-1131T>C, l’allèle rare -1131C étant situé semble-t-il sur le même chromosome que la
mutation. Aucun ne portait le variant 19W. Le deuxième haplotype non muté était
probablement un haplotype APOA5*1.
Le cas index était homozygote T/T pour le polymorphisme -482 C>T de l’APOC3, et son père
était hétérozygote C/T. Tous les deux avaient un génotype APOE E3/E4. L’activité LPL du
cas index était modérément diminuée (4.5 µmol AG/ml/h, normale entre 9.5 +/- 2.5), avec une
concentration d’apoAV normale (269 µg/l, normale 258 +/- 146) et une concentration
d’apoCIII augmentée (15.3 mg/l, normale 5.6 +/- 2) (Tableau 10).
L’analyse informatique a révélé que la mutation c.161 + 3g>c est située au niveau
d’un site d’épissage donneur de l’intron 3, suggérant un défaut d’épissage. Ce défaut
d’épissage a été caractérisé in vitro dans un modèle cellulaire exprimant la mutation : le
préARNm muté était plus court de 110 pb avec une excision complète de l’exon 3. La réunion
des exons 2 et 4 créait un codon stop prématuré dans l’exon 4. La transcription de cet ARNm
correspondrait à un peptide tronqué de 18 AA, avec absence de tous les domaines
fonctionnels connus de la protéine.
Priore Oliva et al. ont donc décrit la 1ère mutation intronique de l’APOA5, responsable
d’un tableau familial d’HTG sévère à l’état hétérozygote, avec défaut de lipolyse. Cette
mutation entraîne un défaut d’épissage et une troncature très précoce de la protéine. Le
possible déficit partiel en apoAV n’était pas détectable sur la mesure de concentration
plasmatique d’apoAV, normale chez le cas index [Pri’06].
La mutation c.161 + 5g>c a été identifié en 2007 par Henneman et al., à l’état
homozygote, chez une femme hollandaise de 31 ans, qui présentait une HTG sévère (TG 19.4
108
mmol/l) découverte fortuitement, asymptomatique, sous contraception oestro-progestative.
Son poids était normal [Hen’07]. Sous régime pauvre en graisses, les TG sont restés entre 6 et
13 mmol/l puis se sont descendus à 1.80 mmol/l après l’arrêt de la pilule. Toutefois, elle a
présenté un nouvel épisode d’HTG majeure durant sa grossesse (TG à 54 mmol/l), avec
normalisation dans le post-partum.
La patiente présentait un génotype APOE de type E3/E2, était homozygote S2/S2 pour le
polymorphisme Sst-1 de l’APOC3. L’apoAV était indétectable dans son plasma avec une
augmentation de l’apoCIII en période d’HTG (Tableau 10).
L’enquête familiale a révélé les parents du cas index étaient tous les deux porteurs à
l’état hétérozygote de la mutation c.161 + 5g>c. Le père était normolipémique et la mère
présentait une dyslipidémie mixte modérée (CT 6.7 mmol/l, TG 3.9 mmol/l) associée à une
obésité (IMC 30.2 kg/m2). Les analyses de ségrégation des haplotypes ont montré que
l’haplotype muté portait également le variant rare du polymorphisme -1131T>C. Le second
haplotype des hétérozygotes était un haplotype sauvage APOA5*1.
L’analyse informatique a révélé que cette mutation est située au niveau d’un site
d’épissage donneur de l’intron 3, avec probable défaut d’épissage. On ne disposait pas de test
fonctionnel, ni de dosage d’activité LPL.
Bien que l’implication de la mutation ne soit pas formellement prouvée dans cette
étude, la mutation c.161 + 5 g>c est probablement responsable d’un défaut d’épissage avec
troncature précoce de la protéine, par analogie avec la mutation c.161 + 3g>c. Le déficit en
apoAV était confirmé par une concentration plasmatique d’apoAV indétectable chez le cas
index. En revanche, l’expression phénotypique de la mutation c.161 + 5g>c était très
différente de la précédente puisqu’elle s’exprimait uniquement à l’état homozygote sous
forme d’une HTG sévère, révélée à l’âge adulte, probablement induite par les oestrogènes, car
apparaissant uniquement sous pilule et durant la grossesse. Les hétérozygotes n’exprimaient
pas d’HTG sévère [Hen’07].
109
MUTATIONS
Q148X
Q97X
C.161 + 5G>C
C.161 + 3G>C
C.161 + 3G>C
E255G
G271C
H321L
[Pri’05c]
[Pri’08]
[Hen’07]
[Pri’06]
[Pri’06]
[Dor’08]
[Dor’08]
[Dor’08]
Statut HMZ/HTZ
HMZ
HMZ
HMZ
HTZ
HTZ
HTZ
HTZ
HTZ
Age de découverte
5 ans
2 ans
31 ans
51 ans
75 ans ?
32 ans ?
43
37
Récurrence
+++
+
Non
sauf grossesse
?
?
grossesse
+
+
TG max (mmol/l)
> 50
12.03
54
15.9
47.6
75
20
63.4
TG entre poussées
(mmol/l)
1.96 à 9.12
2.83 à 5.90
Normalisés après
arrêt pillule
?
?
2 à 10
6.30
8.2
Pancréatites aiguës
non
non
non
non
non
non
non
OUI
Diabète de type 2
non
non
non
non
non
non
non
OUI
MCV
non
non
non
non
OUI
non
non
non
normal
19.5
normal
24
-
-
28
24.6
indétectable
indétectable
indétectable
normale (269 µg/l)
-
-
élevée
-
diminuée
(≈ 50 %)
normale
(sans htg)
-
diminuée
(≈ 50 %)
-
-
normale
-
TT
WW
TT
SS
CC
SS
TC
SS
TC
SS
TT
SW
CC
SS
TT
SW
E3/E3
TT
E3/E4
CC
E3/E2
E3/E4
TT
E3/E4
CT
Référence
IMC (kg/m2)
[apoAV] plasmatique
Activité LPL
post-héparinique
Poly. APOA5
-1131T>C
S19W
Autres variants
génétiques
APOE
APOC3 -482C>T
APOC3 Sst-I
LPL
S2/S2
W86G (hmz)
P207L (htz)
[ApoAV]: concentation d’apoAV, Hmz : homozygote, Htz : hétérozygote, MCV : maladies cardiovasculaires, Poly : polymorphismes
Tableau 10 : Caractéristiques des patients présentant une HTG sévère et porteurs de mutations de l’APO5, identifiés dans la littérature.
110
B. Mutations faux –sens de l’APOA5
3 mutations faux-sens ont été identifiées en 2008 par Dorfmeister et al. dans une
cohorte de 130 patients d’origine britannique, hollandaise ou tchèque, présentant une HTG
sévère (TG > 10 mmol/l), les mutations E255G, G271C, H321L. Aucune enquête familiale
n’a été possible chez les 3 cas index. Dans la même cohorte, ont été identifié deux mutations
introniques (IVS1 + 87 g>a et IVS2 + 45t>c) n’affectant pas l’épissage en analyse
informatique [Dor’08]. Le variant A315V a également été décrit dans cette cohorte chez 3
patients tchèques [Dor’08] et chez un patient de la cohorte de Wang et al. [Wan’07b], mais ce
variant avait précédemment été identifié comme un variant polymorphique dans une cohorte
tchèque [Hub’08b].
1. Description des cas index
a. Mutation E255G
La mutation E255G a été décrite à l’état hétérozygote chez une femme de 32 ans,
d’origine asiatique, qui a présenté une dyslipidémie de type I gestationnelle, récurrente lors de
ces deux grossesses avec TG à 75 mmol/l et xanthomatose éruptive. Entre ces grossesses, les
TG oscillaient entre 2 et 10 mmol/l. Elle était également hétérozygote pour le polymorphisme
S19W (Tableau 10). Toutefois le variant E255G a été retrouvé dans une cohorte de témoins
asiatiques avec une fréquence de 1.7% mais pas dans une cohorte de témoins caucasiens. Les
TG n’étaient pas significativement différents chez les porteurs de l’allèle G que chez les non
porteurs. Le variant E255G est donc possiblement un polymorphisme rare de population chez
les asiatiques, dont l’association aux TG n’est pas établie [Dor’08].
Par ailleurs le cas index E255G était également homozygote pour le variant W86G de
la LPL [Dor’08], préalablement associé à des dyslipidémies de type I pédiatriques [Mai’97].
Des HTG gestationnelles sévères, surtout au 3ème trimestre, ont déjà été rapporté chez des
patientes présentant des mutations homozygotes ou hétérozygotes composites de la LPL
[Mur’98, Als’02] (Tableau 10).
111
b. Mutation G271C
Cette mutation a été identifiée à l’état hétérozygote chez une allemande de 43 ans qui
présentaient une HTG sévère persistante (TG à 20 mmol/l) avec poussées de pancréatites
aiguës. Elle avait un surpoids modéré, et pas d’antécédents familiaux cardiovasculaires ou de
dyslipidémie. Sous régime pauvre en graisses, ses TG ont diminué à 6.30 mmol/l. Sa
concentration d’apoAV plasmatique était très augmentée (3762 µg/l, moyenne des témoins
257 µg/l). Son activité LPL post-héparinique était normale ainsi que la masse de LPL.
La patienta présentait également le variant rare -1131C à l’état homozygote. Ses deux
haplotypes mutés et non mutés étaient donc probablement des haplotypes APOA5*2. Le
séquençage de la LPL ou l’APOC2 n’a pas révélé d’anomalie. La mutation G271C n’a été
retrouvée chez les 265 sujets contrôles [Dor’08] (Tableau 10).
c. Mutation H321L
La mutation H321L a été identifiée à l’état hétérozygote chez un homme tchèque de
46 ans, qui présentait une dyslipidémie non traitée depuis l’âge de 28 ans, avec HTG sévère à
l’âge de 37 ans (TG à 63.4 mmol/l) avec pancréatite aiguë et diabète de type 2, sans surpoids.
Il y avait des antécédents de diabète de type 2 et d’HTA chez sa mère et de dyslipidémie
sévère (non précisée) chez son père.
Le patient était hétérozygote pour le polymorphisme S19W. Le séquençage de l’APOC2 était
normal mais celui de la LPL a révélé la présence de la mutation hétérozygote P207L, décrite
chez les Québécois et associée à une diminution de 50 % de l’activité LPL post-héparinique
[Jul’98]. On ne dispose pas d’activité LPL, ni de dosage d’apoAV chez ce sujet. La mutation
H321L n’a été retrouvée chez les 265 sujets contrôles [Dor’08] (Tableau 10).
2. Etudes fonctionnelles des mutations E255G, G271C, H321L.
a. Effet sur la lipolyse in vitro
Dorfmeister et al. ont testé l’impact fonctionnel des 3 mutations sur la lipolyse des
LRTG in vitro grâce à des protéines recombinantes mutées mise en présence de VLDL et de
112
LPL liée aux HSPG. Comparées à la protéine apoAV sauvage, les protéines ApoAV-L321,
-G255 activaient significativement moins la LPL, respectivement -36 et -25 %. En revanche,
la protéine apoAV-C271 avait un effet non significatif sur l’activation de la LPL (-11%)
[Dor’08].
b. Effet sur la liaison aux récepteurs
Les protéines apoAV-L321, -E255 se liaient de manière comparable à la protéine
sauvage au récepteur LR8 (famille des R-LDL) et LRP1 alors que l’apoAV-C271 ne se liait
pas à ces deux récepteurs [Dor’08].
c. Western blot
L’analyse des protéines apoAV recombinantes en western blot en condition non
dénaturante a montré que l’apoAV-C271 apparaissait sous forme de 2 bandes, une majoritaire
inhabituelle de 120 kDa environ et une minoritaire classique d’environ 40 kDa, suggérant la
formation de multimères d’apoAV. Les autres protéines recombinantes migraient de manière
attendue vers 40 kDa [Dor’08].
3. Implication des 3 mutations non-sens en pathologie
L’implication des mutations E255G et H321L dans les phénotypes des cas index n’est
pas certaine puisque ceux-ci présentaient également soit une mutation homozygote de la LPL
(W86G), soit une mutation hétérozygote de l’apoAV, impliquées dans les HTG sévères dans
la littérature [Mai’97, Jul’98]. De plus, le variant E255G semble être un polymorphisme de
population asiatique, peu fréquent sans association aux TG dans cette étude. Toutefois, ces 2
variants pourraient contribuer, même modestement, à l’HTG des cas index puisqu’ils
s’accompagnaient d’un défaut d’activation de la LPL in vitro [Dor’08]. L’hétérozygotie pour
le polymorphisme S19W pourrait également influencer l’expression phénotypique chez ces 2
patients.
La mutation G271C n’influençait pas l’activité LPL in vitro, en accord avec l’activité
LPL normale chez le cas index. En revanche, elle pourrait entraîner la formation de formes
113
multimériques de l’apoAV et un défaut de liaison aux récepteurs R-LDL ou LRP. Les auteurs
ont suggéré que l’apparition d’un résidu cystéine en position 271 permettrait la création de
ponts disulfures avec l’unique autre cystéine en position 227, et donc favoriserait la formation
de multimères. Les formes multimériques d’apoAV pourraient entraîner un encombrement
stérique des récepteurs et bloquer leur activation par l’apoAV sauvage monomérique
[Dor’08]. La présence du variant rare -1131C à l’état homozygote pourrait également
favoriser l’expression du phénotype chez le cas index.
Différentes mutations avec troncature de l’APOA5 ou mutations faux-sens ont été
identifiées dans la littérature chez des patients présentant une HTG sévère. Les
caractéristiques de ces patients sont résumées dans le tableau 10. Les présentations
phénotypiques sont variables, et les hétérozygotes n’expriment pas tous une HTG sévère. Un
déficit en apoAV a été mis en évidence chez les 3 patients homozygotes (Q148X, Q97X et
c.161 + 5G>C) avec un défaut de lipolyse chez l’un d’entre eux (Q148X) et chez un patient
hétérozygote (c.161 + 3G>C) [Pri’05c, Pri’06, Hen’07]. L’implication des mutations fauxsens n’est actuellement pas clairement établie.
114
XIII. Conclusion de la revue de la littérature
Dans cette revue générale de la littérature, nous avons montré que l’apoAV, nouvelle
apolipoprotéine, est un acteur important du métabolisme des TG chez l’animal grâce aux
modèles de surexpression et de KO du gène APOA5, ainsi que chez l’homme essentiellement
grâce aux études d’association génétique. Celles-ci ont mis en évidence l’association des
variants polymorphiques de l’APOA5 aux TG dans des populations d’origines ethniques
variées, à leurs variations physiologiques et pathologiques dans différents types de
dyslipidémies, ainsi que peut-être au risque cardiovasculaire. Les mécanismes d’action de
l’apoAV ne sont pas complètement élucidés : l’apoAV activerait la lipolyse par la LPL en
favorisant la formation des complexes LRTG/LPL/HSPG. Les mécanismes de régulation du
gène APOA5, en particulier par les récepteurs nucléaires, font de cette apolipoprotéine une
cible thérapeutique prometteuse pour le traitement des HTG, avec le développement potentiel
d’agonistes sélectifs.
Le gène APOA5 apparaît donc comme un bon gène candidat pour l’étude des facteurs
de prédisposition aux HTG chez l’homme, en particulier dans les formes sévères. L’étude de
ce gène candidat dans une population de patients dyslipidémiques de type V, initiée en 2001
dès la découverte du gène, alors que la majorité des connaissances sur l’apoAV n’était pas
publiée, nous a permis de découvrir plusieurs mutations du gène APOA5. Nous allons
présenter l’étude de ces mutations dans la 2ème partie de cette thèse.
115
2EME PARTIE :
ETUDE EXPERIMENTALE
116
Article 1: “APOA5 Q139X truncation predisposes to late-onset
hyperchylomicronemia due to lipoprotein lipase impairment”
L’APOA5, nouveau gène candidat pour l’étude des HTG sévères, a été séquencé dans
une cohorte de patients dyslipidémiques de type V (n=140). Nous avons découvert une
mutation Q139X de l’APOA5, responsable d’une troncature prématurée de la protéine, chez 3
patients non apparentés, 2 hétérozygotes et un homozygote.
La mutation Q139X est l’une des 2 premières mutations de l’APOA5 décrites chez l’homme
responsable d’un syndrome hyperchylomicronémique. Une mutation homozygote Q148X a
été décrite peu avant chez un enfant italien mais sans explorations fonctionnelles [Pri’05b].
L’étude des familles des 2 cas-index hétérozygotes nous a permis de mettre en évidence une
expression phénotypique variable et inconstante chez les hétérozygotes. Nous avons proposé
pour la première fois le rôle possible du 2ème haplotype non muté variant de type APOA5*2
ou APOA5*3 dans l’expression de la mutation chez les hétérozygotes. Nous avons également
suggéré l’influence des anomalies métaboliques associées comme le diabète de type 2.
Chez les porteurs de la mutation, il existait un défaut de présence de l’apoAV tronquée et
sauvage sur les lipoprotéines. Nous avons mis en évidence un défaut majeur de catabolisme
des VLDL dans les études de cinétique de l’apoB100, chez 3 hétérozygotes avec HTG sévère.
L’activité LPL post-héparinique des sujets hyperchylomicronémiques était effondrée avec un
défaut de présence de la LPL à la surface endothéliale.
Des données complémentaires sont présentées après l’article, résultant de l’exploration
ultérieure de la famille du patient homozygote Q139X (CI1).
117
[Cha’08b] Charriere S, Bernard S, Aqallal M, et al. Association of APOA5 -1131T>C and
S19W gene polymorphisms with both mild hypertriglyceridemia and hyperchylomicronemia
in type 2 diabetic patients. Clinical Chimica Acta, 2008 vol. 394, n°1-2, pp. 99-103.
156
Résultats complémentaires – Famille Q139X-C
Après la publication de l’article 1, nous avons pu poursuivre l’exploration de la famille
Q139X-C initialement perdue de vue. L’arbre généalogique de la famille est présenté en
Figure 21 (la dénomination du cas index comme sujet CI1 a été conservée par soucis de clarté
avec les données de l’article 1).
Les parents du cas index sont décédés, le père (C-I1) d’un AVC à 70 ans. On ne
connaît pas leur statut lipidique. Le frère (CI-1) présenterait une dyslipidémie mixte et la sœur
(CI-2) serait normolipémique (Figure 21).
Les 2 filles du cas index (CII2 et CII3) et 4/6 de leurs enfants ont pu être explorés. La
1
ère
fille (CII2), âgée de 39 ans, a présenté une hypercholestérolémie modérée sous pilule,
normalisée à l’arrêt. L’exploration lipidique n’a pas révélé d’HTG mais des valeurs normales
hautes de LDLc et d’apoB (Tableau 11). Par ailleurs, son EIMc était légèrement épaissie d’un
côté à 0.9 mm, dans un contexte de tabagisme estimé à 15 paquets/année.
La 2ème fille (CII3), âgée de 35 ans, aurait présenté une HTG sévère durant sa 3ème grossesse
(maximum non précisé), sans dyslipidémie ultérieure y compris sous oestro-progestatifs. Son
bilan lipidique (Tableau 11) et son EIMc sont strictement normaux.
Les 4 petits enfants du cas index explorés (CIII1, CIII2, CIII5 et CIII6) sont en bonne santé et
ne présentent pas d’anomalies lipidiques (Tableau 11). Aucun d’entre eux ne présente
d’obésité ou de diabète (glycémies à jeun normales).
Tous les sujets porteurs hétérozygotes de la mutation (CII2, CII3, CIII5),
normotriglycéridémiques, portaient un 2ème haplotype non muté sauvage (APOA5*1). Aucun
membre de la famille ne présentait de variant rare de l’APOE (Tableau 11).
Le contexte familial est évocateur d’une hyperlipémie combinée familiale.
126
-I
1
2
3
4
I
-2
-1
1
2
1
2
1
2
3
3
4
4
5
4
II
III
3
6
Décédé
HTG gravidique
HTG majeure avérée
Cas index
Dyslipidémie mixte rapportée
Hypercholestérolémie
Figure 21 : Arbre généalogique de la famille Q139X-C
CI1
CII2
CII3
CIII1
CIII2
CIII5
CIII6
Age (années)
54
39
35
16
14
8
3
IMC (kg/m2)
24
18
18.4
18
21.4
15
15.3
14.07
7.55
0.58
nd
1.1
88
190
0.46
1.16
6.06
1.54
4.09
1.26
48
119
0.40
0.72
5.19
1.67
3.25
0.90
27
82
0.33
0.53
3.66
1.40
2.06
0.61
29
78
0.37
0.71
3.70
1.47
1.97
0.65
31
76
0.41
1.46
5.29
1.61
3.14
0.91
42
87
0.48
0.85
4.12
1.77
2.04
0.67
25
50
0.50
+/+
+/-
+/-
-/-
-/-
+/-
-/-
Q139X
/Q139X
Q139X
/1
Q139X
/1
1/1
1/1
Q139X
/1
1/1
E3/E3
E3/E3
E3/E3
E3/E3
E3/E3
E3/E3
E3/E3
TG (mmol/l)
CT (mmol/l)
HDLc (mmol/l)
LDLc (mmol/l)
ApoB (g /l)
ApoCII (mg/l)
ApoCIII (mg/l)
APOCII/CIII
Mutation
Q139X
Haplotypes
APOA5 §
Génotype
APOE
Valeurs normales adultes : TG = 0.5 à 2.0 mmol/l
HDLc = 1.05 à 1.80 mmol/l
apoCII = 21 à 47 mg/l RATIO CII/CIII= 0.3 à 0.5
CT = 3.8 à 6.0 mmol/l
LDLc = 2.0 à 4.20 mmmol/l
apoCIII = 60 à 120 mg/l apoB = 0.55 à 1.30 g/l
nd : non déterminé
-/- homozygote non muté +/- hétérozygote pour la mutation
§ Q139X correspond à l’haplotype I (voir Tableau 1 - Article 1), 1 correspond à l’haplotype APOA5*1 (voir Tableau 4),
Tableau 11 : Explorations lipidiques et génotypes de la famille Q139X-C
127
Article 2: “Modulation of phenotypic expression of APOA5 Q97X
and L242P mutations by genetic and metabolic factors”
Cet article a été soumis le 17 octobre 2008 à la revue Arteriosclerosis, Thrombosis and
Vascular Biology (annexe).
La poursuite du séquençage du gène APOA5 dans notre cohorte prospective de
patients présentant une dyslipidémie de type V nous a permis d’identifier 4 nouveaux porteurs
de la mutation Q97X récemment publiées [Pri’08] et un nouveau variant faux-sens L242P. Le
but de cette étude était d’apporter de nouvelles données phénotypiques et fonctionnelles
concernant les mutations de l’APOA5, et d’identifier les facteurs génétiques et métaboliques
influençant leur expression.
Nous avons confirmé pour la mutation Q97X les anomalies fonctionnelles mises en évidence
précédemment, avec un déficit lipolytique chez les sujets avec HTG sévères et surtout défaut
de liaison de l’apoAV sauvage aux lipoprotéines chez les porteurs de la mutation. En
revanche, l’implication causale de la mutation L242P n’a pas été établie avec certitude.
L’expression phénotypique chez les hétérozygotes était clairement influencée par
l’hétérozygotie composite avec un haplotype variant de l’APOA5 comme dans l’article 1,
mais également par des facteurs génétiques additionnels. En revanche, l’influence des facteurs
métaboliques comme le diabète, le syndrome métabolique s’est avérée moindre que supposée
précédemment.
128
Modulation of phenotypic expression of APOA5 Q97X and L242P mutations by genetic
and metabolic factors.
First author’surname: Charriere
Short Title: APOA5 Q97X/L242P mutations in hyperchylomicronemia
S. Charriere1,2, C. Cugnet2, M. Guitard2, S. Bernard1,2, L. Groisne2, V. Pruneta-Deloche1, M.
Merlin3, S. Billon3, M. Delay3, A. Sassolas4, P. Moulin1,2, C. Marçais1,3
1
Université de Lyon, F-69008 ; INSERM, U870, F-69008 ; INRA, U1235, F-69008 ; INSA-
Lyon, RMND, F-69621 ; Univ Lyon 1, F-69003 ; Hospices Civils de Lyon, F-69229, Lyon,
France.
2
Fédération d’endocrinologie, maladies métaboliques, diabète et nutrition, Hôpital Louis
Pradel, Hospices Civils de Lyon, 69677 Bron Cedex, France
3
Laboratoire de biochimie, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 69495
Pierre-Bénite Cedex, France
4
Laboratoire de biochimie, Hôpital Louis Pradel, Hospices Civils de Lyon, 69677 Bron
Cedex, France
Address correspondence and reprint requests to:
Dr Sybil Charrière
Fédération d’endocrinologie, maladies métaboliques, diabète et nutrition
Hôpital cardiovasculaire et pneumologique Louis Pradel
28 avenue Doyen Lépine, 69677 Bron Cedex, France
E-mail: [email protected]
Tel: 00 33 4 72 68 13 01
Fax: 00 33 4 72 68 13 07
Keywords: APOA5, mutation, hypertriglyceridemia, hyperchylomicronemia, type V
hyperlipidemia
Word count of body: 4455
Word count of abstract: 198
Number of Figures and Tables: 6
129
Abstract
Objective: To provide phenotypic and functional data in new families with APOA5 mutations
and to identify genetic and metabolic factors influencing their phenotypic expression.
Methods and Results: We identified 4 probands with Q97X mutation (3 heterozygotes and 1
homozygote) and one heterozygote with L242P mutation in a cohort of 286
hyperchylomicronemic subjects, free of LPL or APOC2 mutations. Postheparin LPL activity
level was reduced by about 50% in Q97X heterozygotes and more than 90% in Q97X
homozygote, but was normal in L242P patient after resolution of hyperchylomicronemia. In
western blot studies, the association of apoAV with plasma lipoproteins was altered in Q97X
carriers but not in the L242P carrier. Hyperchylomicronemic heterozygotes for both mutations
carried an additional APOA5 variant haplotype and/or APOE variant (E2 or E4). Type 2
diabetes or metabolic syndrome were not a major phenotypic determinant.
Conclusions: L242P mutation was present in a hyperchylomicronemic proband but its causal
involvement remains to be established. The Q97X mutation was clearly involved in
hyperchylomicronemia with concomitant altered intravascular lipolysis. The phenotypic
expression variability of APOA5 mutations was mostly influenced by compound
heterozygosity with APOA5 variant haplotypes plus additional genetic factors, and in a lesser
extent by the metabolic environment.
Condensed Abstract
We identified 4 novel carriers of APOA5 Q97X mutation with altered intravascular lipolysis
and a new missense L242P mutation, with unaltered LPL activity after resolution of
hyperchylomicronemia. The phenotypic expression of these mutations was influenced by the
association with APOA5 variant haplotypes, and additional genetic or metabolic factors.
130
Fasting hyperchylomicronemia (classified as type I or type V hyperlipidemia) is a metabolic
disease highly modulated by complex interactions between environmental and genetic factors.
Occurrence of severe fasting hypertriglyceridemia (HTG) (TG >15 mmol/l) is influenced by
diet, metabolic syndrome and diabetes. Only a few genetic disorders were involved in
hyperchylomicronemia such as lipoprotein lipase (LPL) or apolipoprotein CII (apoCII)
deficiency.1,2 Polymorphisms of LPL and other genes involved in intravascular lipolysis or
removal of triglyceride rich lipoproteins (TGRL) such as APOC3 or APOE were also
associated with occurrence of fasting hyperchylomicronemia.1,3-5 However, in many cases, the
genetic alterations causing the disease remain to be identified.5,6
More recently, apolipoprotein A5 gene (APOA5) was identified as a strong modulator of
plasma triglycerides (TG) concentration. Mice overexpressing human APOA5 had about 30%
lower plasma TG compared to control mice, while mice lacking apoa5 had a 4-fold increase
in plasma TG.7 In humans, two variant APOA5 haplotypes (APOA5*2 or APOA5*3) were
demonstrated as strong determinants of plasma TG variability in genetic association studies.810
The specific function of apoAV is still uncertain but apoAV could increase LPL activity by
facilitating the interaction between TGRL and proteoglycan-bound LPL.11,12
In 2005, Priore Oliva et al. identified the APOA5 Q148X homozygous mutation13 and we
identified a Q139X mutation in two heterozygotes and one homozygote presenting recurrent
episodes of hyperchylomicronemia highly resistant to conventional treatment12. Subsequently,
two novel APOA5 mutations responsible for premature protein truncation were identified in
hyperchylomicronemic patients: the heterozygous intron mutation c.161 +3g>c, responsible
for a splicing defect14 and the homozygous Q97X mutation.15 Recently, heterozygous
missense variants (E255G, G271C, H321L) were also identified.16 These studies have shown
a highly variable phenotypic expression of APOA5 mutants, especially in heterozygous
carriers. Furthermore, the impact on LPL activity level was not systematically documented. In
APOA5 heterozygous deficiency, we and others suggested that phenotypic expression was
under strong influence of compound heterozygosity with APOA5 variant haplotypes as well as
the presence of diabetes or abdominal obesity.12,13,15
We identified four new unrelated carriers of the Q97X mutation and a new APOA5 L242P
mutation. This study aimed to characterize the L242P mutation and to provide further
phenotypic and functional data in families with the previously reported Q97X mutation. We
also studied the influence of additional genetic factors such as APOA5 variant haplotypes and
other TG raising polymorphisms in APOE and APOC3, as well as the contribution of the
metabolic
environment,
on
the
phenotypic
expression
of
APOA5
mutations.
131
METHODS
Patients and population studied
Information about probands and families are detailed in Results. We sequenced APOA5 in a
cohort of 286 unrelated patients consecutively selected when referred to our lipid clinic for
current or history of documented episodes of severe fasting HTG, without mutation on
APOC2 or LPL genes. Fasting plasma TG concentration was over 15 mmol/l with a TG/Total
cholesterol (TC) ratio above 2.5 (in g/l))17, or plasma fasting TG was over 10 mmol/l with a
family history of HTG. 200 unrelated normolipidemic control subjects were also screened for
mutations. A written informed consent was obtained from all subjects included in the study
and from parents for children.
APOA5 genomic sequence analysis
APOA5 gene mutation analysis
Genomic DNA was extracted from blood leukocytes, amplified by PCR and sequenced as
previously described.12
Screening for the APOA5 Q97X and L242P mutations by dHPLC
Genomic
DNA
(0.1
µg)
was
amplified
(5’-TACTGGCCAGGGCTAGGCAAAGAG-3’)
and
by
PCR
APOA5sR3
with
primers
APOA5F3
for
Q97X
screening and with APOA5sF6 and APOA5sR6 primers for L242P screening (sequences
detailed in reference12), generating respectively 343 and 582 pb PCR products. PCR was
performed with Taq-polymerase optimase as indicated (Transgenomic), primers (0.4 µmol/l
each), DMSO 5% and dNTP (0.2 µmol/l). After 15 cycles at a denaturing temperature of 95°C
(30 sec) followed by annealing temperature of 67.5°C for Q97X or 64.9°C for L242P (30 sec,
-0.5°C/cycle) and extension temperature at 72°C (30 s), 25 cycles were performed identically
with annealing temperature of 60.5°C for Q97X or 57.9°C for L242P (30 sec). In order to
differentiate wild-type DNA from homozygous mutation, all PCR products were mixed in a
1:1 proportion with a control DNA and denatured 10 min at 95°C to allow heteroduplex
formation. DHPLC was carried out using the WAVEMAKE DNA fragment analysis system
(Transgenomic). Hetero- and homodimer analysis were performed with an acetonitrile
gradient formed by mixing buffers A and B (WAVE Optimized, Transgenomic). DNA was
detected at 260 nm and analyzed under at 62°C and 62.4°C for Q97X screening and 65.5°C,
66.2°C, 68.2°C for L242P screening.
132
APOA5 haplotype analysis
To assess haplotypes without ambiguity, 7040 pb APOA5 PCR products were generated and
subcloned in the pGEM-T easy vector system (Promega) prior to sequencing as previously
described.12 To complete the analysis of the end of exon 3, we also subcloned in the same
vector 1943 pb APOA5 PCR products. The PCR primers were APOA5sF1 and APOA5sR8,
previously published.12 PCRs (30 cycles) were performed using the expand high-fidelity PCR
system as described by the manufacturer (Roche Diagnostics Corp.). Q97X and L242Ppositive and negative clones were subsequently sequenced with primers APOA5sF1,
APOA5sR1, APOA5sF2, APOA5sR2, APOA5sF3, APOA5sR3, APOA5sF4, APOA5sR4,
APOA5sF5, APOA5sR5, APOA5sF6, APOA5sR6, APOA5sF7, APOA5sR7, APOA5sF8,
APOA5sR8, which sequences are detailed in reference12.
Screening for additional common gene mutations or polymorphisms in candidate genes
modulating plasma TG
APOE genotypes were determined as reported previously.18 LPL gene mutation and
polymorphism screening was determined by dHPLC and verified by direct sequencing.
ApoC3 SSt-I polymorphism was determined by PCR-RFLP using SacI restriction enzyme.19
ApoAV Western Blot analysis
Proteins were extracted from lipoprotein ultracentrifugation fractions and western blot
analysis was performed with 20 µg of total protein for each sample on a 12% SDS-PAGE,
then transferred to nitrocellulose and revealed by ECL+ (Amersham Biosciences) as
previously described.12
LPL activity
Postheparin plasma was obtained 10 minutes after an intraveinous injection of heparin (50
UI/kg) and lipoprotein and hepatic lipase (HL) activities were determined using 14C-triolein
emulsions as previously described.12 Plasma of normolipidemic healthy subjects (n=12) were
used as controls.
Assessment of diabetes, metabolic syndrome and insulin resistance
Diabetes was defined by 2 fasting glycemia > 7.0 mmol/l and impaired fasting glucose (IFG)
by glycemia between 6.1 mmol/l and 6.9 mmol/l.20 We use the NCEP-ATPIII criteria to
133
defined metabolic syndrome.21 Insulin resistance was calculated by the homeostasis model
assessment of insulin resistance (HOMA-IR) using the following formula: HOMA-IR = index
calculated by fasting plasma glucose (mmol/l) * fasting plasma insulin (mUI/l) / 22.5. Insulin
resistance was defined as HOMA-IR > 2.5.22
134
RESULTS
1. Identification of Q97X and L242P APOA5 gene mutation
By systematic sequencing of APOA5 gene, after exclusion of classical LPL and APOC2
mutations, in a cohort of 286 patients referred to our lipid clinic for hyperchylomicronemia,
we identified two APOA5 mutations in exon 4, in addition to previously described Q139X
mutation.12 The first mutation was a g.C921T substitution, on the first nucleotide of codon 97
(CAG), generating a Q97X nonsense mutation. The Q97X mutation was identified in four
unrelated probands, three heterozygotes (subjects AIII1, B, C) and one homozygote (subject
D). The second APOA5 mutation identified in one proband (subject EII2), was a heterozygote
L242P mutation due to a g.T1257C substitution on the second nucleotide of codon 242
(CTG). None of these two mutations were found in a group of 200 normolipidemic control
subjects screened by dHPLC (allele frequency < 0.25%).
One proband (D) was homozygous for the Q97X mutation and for the rare allele of g.C1764T
polymorphism as determined by direct sequencing of genomic DNA. In the other probands,
we performed haplotypes analysis by subcloning and sequencing large PCR products
encompassing the APOA5 coding sequences as well as upstream sequence (from nucleotide
-3100 to +1800). All the Q97X heterozygote probands (AIII1, B, C) had the same haplotype
carrying both Q97X and g.1764T as found in proband D (Table 1). Haplotype analysis
suggests that Q97X is a founder mutation with a common ancestral haplotype for the four
probands. In the Q97X heterozygotes AIII1 and B, the second APOA5 haplotype harboured
the rare variants of SNP2, SNP3 and -3A>G polymorphisms, defining the APOA5*2 minor
haplotype.8 In patients AIII1, an additional rare allele of g.-1464T polymorphism was present
on this haplotype (APOA5*2b haplotype). By contrast, in patient C, the second haplotype was
the common APOA5*1 haplotype (Table 1).
In patient EIII2, the L242P bearing haplotype carried an additional polymorphic allele,
g.a-2200t. The second haplotype of EIII2 was APOA5*2 (Table 1).
2. Case reports
Family A
The index case (AIII1) carrying a Q97X heterozygous mutation is a 42-year-old white male
(Figure 1). He was 36 years old when a moderate mixed hyperlipidemia was discovered. He
presented two episodes of hyperchylomicronemia at 37 and 41 years old with maximum
135
documented plasma TG concentration at 15.13 mmol/l. TG remained between 1 and 5 mmol/l
under treatment (strict diet + fibrate + rosuvastatine). He never suffered from acute
pancreatitis. He had no identified cause of secondary dyslipidemia (alcohol, diabetes,
metabolic syndrome, hypothyroidism, renal insufficiency...) and had normal insulin
sensitivity (Table 2).
The proband’s father (AII1), 70 years old, presented a moderate mixed hyperlipidemia
(Figure 1). He had a metabolic syndrome with a slight insulin resistance (Table 2) and a mild
renal insufficiency (calculated creatinin clearance 45 ml/min). The proband’s grand mother
(AI2) was known to have hypercholesterolemia. The proband’s children (AIV1, AIV2, AIV3)
had normal lipid parameters (data not shown) (Figure 1) and were not genotyped.
Family A data are in favour of a familial combined hyperlipidemia (FCHL) phenotype with
episodes of transient type V hyperlipidemia only in the proband (AIII1).
Family B
The second proband (subject B) carrying a Q97X heterozygous mutation is a 32-year-old
white woman. Moderate HTG was discovered when she was about 20 years old under oral
contraception. She subsequently developed several episodes of hyperchylomicronemia with
TG level reaching 16 mmol/l at the age of 31. TG normalized under dietetic and fenofibrate
treatment. She never suffered from acute pancreatitis. She was not diabetic, had no identified
cause of secondary hyperlipidemia except for moderate overweight with normal insulin
sensitivity, and without metabolic syndrome (Table 2). Her father and her paternal grand
father also had a history of HTG (data not available). They were not genotyped.
Proband B presented recurrent episodes of transient type V hyperlipidemia with a familial
history of undocumented HTG without history of metabolic syndrome.
Family C
Proband C, carrying a Q97X heterozygous mutation, is a 59-year-old man who presented a
documented type V dyslipidemia episode at 30 years old with TG at 20 mmol/l. TG remained
between 4 and 8 mmol/l for many years. Type 2 diabetes was discovered at 57 years old with
moderate overweight. At the time of the analysis he had moderate HTG (Table 2) with good
glycemic control (HbA1c 5.9 %). He never had acute pancreatitis. The patient was lost to
follow-up after the identification of the mutation. His two sisters were reported to have HTG
(data not available). They were not genotyped.
136
Subject C presented a transient type V dyslipidemia with persisting moderate HTG in a
familial context of HTG, but without evidence for a metabolic syndrome.
Family D
The Q97X homozygous proband is a 58-year-old white man who presented several episodes
of type V hyperlipidemia since the age of 25 years old (TG between 32.1 mmol/l and 40
mmol/l despite a low fat diet without hypolipemic drug). TG were normal or moderately
elevated (< 5 mmol/l) between type V episodes. He relapsed just before blood drawing (Table
2). The patient was lost to follow-up after the identification of the mutation. He had normal
weight and never suffered from acute pancreatitis. We did not identify any other cause of
secondary dyslipidemia, nor metabolic syndrome (Table 2). Subject D’s father (obligated
heterozygote) had a history of type V hyperlipidemia. His son presented a mild HTG at 27
years old. His daughter was normolipidemic at 9 years old. They were not genotyped.
Subject D presented early severe type V dyslipidemia with a familial history of severe HTG
without evidence for metabolic syndrome.
Family E
In
the
L242P
heterozygous
proband
(EII2),
a
44-year-old
white
man,
the
hyperchylomicronemia was discovered when he was 40 (TG 18.63 mmol/l). He presented
later two additional documented episodes (maximum TG 37.45 mmol/l). He had a mild
abdominal obesity (waist circumference 104 cm) with metabolic syndrome. He never suffered
from acute pancreatitis. At the time of this analysis, he had moderate HTG under fenofibrate
(Table 3). There was no history of familial dyslipidemia. Proband’s wife and his eldest sons
(EIII1 and EIII2) had normal lipid parameters but the youngest, a 11-year-old son (EIII3),
presented moderate HTG (Table 3) (Figure 1).
Subject E presented recurrent episodes of type V hyperlipidemia in a context of metabolic
syndrome.
3. Screening for APOA5 mutations and haplotype study in families
The heterozygous Q97X mutation was also identified in the family A proband’s father (AII1).
The second haplotype of this moderately hypertriglyceridemic subject is the common
haplotype APOA5*1 (Table 2). Unfortunately, we could not genotype APOA5 proband’s
children (AIV1, AIV2, AIV3) due to their father’s refusal.
137
For family E, none of the studied members (EII3, EIII1, EIII2, EIII3) carried the L242P
mutation. All the proband’s children (EIII1, EIII2, EIII3) had inherited APOA5*1 haplotype
from their mother and APOA5*2 haplotype from their father (Table 3).
4. Screening for additional common gene mutation or polymorphisms in candidate genes
modulating plasma TG
As detailed in table 2 and 3, no LPL gene variants were found in probands or their families.
APOE variants were present in probands B (E2E3 genotype), C (E3E4 genotype), D (E2E3
genotype), and E (E2E4 genotype). Heterozygous APOC3 Sst-I S1S2 polymorphism
(C3238G) was present only in subject B and E. Proband AIII1 did not harbour APOE or
APOC3 minor alleles.
5. ApoAV distribution in lipopoproteins
Q97X mutation is predicted to determine an APOA5 truncation at residu 84 in the mature
apoAV protein, generating a 10-kDa peptide. We perfomed Western blotting analysis of
apoAV in lipoprotein subfractions, obtained after plasma ultracentrifugation, in order to study
apoAV distribution on lipoproteins in Q97X carriers and to assess the expression of the
putative truncated peptide. The predicted truncated peptide was not detected in either VLDL
(d<1.006) (Figure 2), LDL + HDL (1.019<d<1.210) or the unbound fraction to lipoprotein
(d>1.21) (data not shown), from subjects AII1, AIII1 and B. The 40-kDa full-length apoAV
was detected in VLDL in normolipidemic control but VLDL associated apoAV was strongly
reduced in all the Q97X carriers tested, especially in subject B (Figure 2). Wild type apoAV
present on VLDL was reduced not only in Q97X carriers who had presented type V
hyperlipidemia (AIII1, B) but also in those who had not (AII1) (Figure 2). Samples were
unavailable for subject C and D. In patient EII2 (L242P carrier), apoAV distribution in VLDL
was similar to that observed in controls (Figure 2).
6. LPL activity
Except for subject D, LPL activity was not measured during transient episodes of severe
HTG. At this time, subject B was normotriglyceridemic whereas AIII1 and EII2 were
moderately hypertriglyceridemic (Tables 2 and 3).
The homozygous Q97X carrier (D) had a dramatically reduced LPL activity with less than
10% of normolipidemic control levels. The heterozygous Q97X carriers with history of severe
HTG (AIII1, B) had reduced LPL activities by over 50% compared with controls. A lipolysis
138
defect was detectable althought these subjects were not severely hypertriglyceridemic at the
time of the analyses. By contrast, LPL activity for the L242P carrier (EII2) was normal while
he was only mildly hypertriglyceridemic (Figure 3).
HL activities were normal for all the heterozygous Q97X and L242P probands tested:
(AIII1:10.3; B:10.9; EIII1:13.0) and slightly reduced for the homozygous Q97X carrier (D:
4.5) compared to controls (7.7 +/- 2.3 µmol FFA/ml/h). LPL and HL activities were not
available for subjects AII1 and C.
139
DISCUSSION
In this study, we have resequenced APOA5 gene in a cohort of 286 patients with a
documented history of fasting hyperchylomicronemia free of LPL or APOC2 mutation. This
led us to identify four novel cases of hyperchylomicronemia associated with the Q97X
mutation (one homozygote and three heterozygotes) and one case with a new heterozygous
L242P missense mutation.
We provide additional evidence that the Q97X mutation contributes to the occurrence of
hyperchylomicronemia in the four probands: (a) Q97X was identified in four unrelated
patients with history of severe HTG and free of LPL or APOC2 gene mutation ; (b) Q97X was
associated with a major lipolysis defect in an homozygote patient (D) and with milder
lipolysis defect in the two heterozygous carriers tested (AIII1, B) (Figure 3); (c) ApoAV
association with plasma lipoprotein was altered in the three Q97X carriers tested (AIII1, AII1,
B) whether they had presented or not severe HTG (Figure 2). These findings are in agreement
with our previous data on APOA5 Q139X mutation carriers.12
The Q97X mutation causes an apoAV truncation at residu 84 of the mature protein,
generating a 10kDa peptide. If secreted, this truncated peptide would lack the domains
involved in lipid binding (residues 192-238 and 301-343), LPL activation (residues 192-238)
and heparin binding (residues 186-227).23-25 This highly suggests a major apoAV functional
defect which causes LPL dysfunction in vivo. Likewise, we demonstrated a dramatic LPL
activity loss in the Q97X homozygote during his hyperchylomicronemia episodes, whereas
two Q97X heterozygotes displayed a 50% loss of LPL activity (Figure 3). These findings are
in agreement with our previous results on Q139X homozygote and heterozygotes.12 The
observed loss of wild type apoAV binding to VLDL in Q97X heterozygotes suggested the
hypothesis of a functional interference between the truncated peptide and the wild type
apoAV encoded by the second allele. However, we were unable to detect this predicted 10
kDa peptide in VLDL or in any of the lipoprotein subfractions analysed in three heterozygous
carriers (Figure 2). This confirms the results obtained in the Italian Q97X carriers15 and
suggests that either the Q97X mutated mRNA may be not translated, unstable, or the peptide
may be not secreted. The loss of wild type apoAV binding to VLDL observed in Q97X
heterozygotes, as well as in Q139X carriers12, is at present unexplained.
While apoAV truncation mutants are clearly involved in hyperchylomicronemia, the impact
of apoAV missense mutations is still poorly documented. The new L242P mutant is unlikely
140
to be a population polymorphism as it was not found in 200 normolipidemic controls and was
not reported in the numerous population studies previously published. L242P mutation occurs
in apoAV protein near the lipid binding domain (residues 192-238 and 301-343) and the LPL
activation domain (residues 192-238).23,25 This highly amphipathic region is composed of
three very hydrophobic alpha helixes, with a strong predicted surface activity.26 The
substitution of leucine (helix former) for a proline (helix breaker) is likely to severely affect
the secondary structure of apoAV protein. The critical alpha helical secondary structure could
be disrupted as well described for other apolipoprotein mutants: APOB L4372P27 and APOC2
L72P mutants28 respectively causing a loss of binding to lp(a)27 and LPL28.
However, family E was poorly informative with only one adult L242P carrier available for the
study, the proband (EII2). His LPL activity could not be tested while he suffered from severe
HTG, but was normal while his TG level was normal. This normal level might be expected
was expected because even a homozygous subject for APOA5 Q97X mutant may not display
lipolysis defect between the hyperchylomicronemia episodes.15 Normal apoAV binding to
plasma lipoprotein may suggest little impact on apoAV function. Alternatively, it is likely that
the mechanisms involved in apoAV impairment are different for missense or truncation
mutations and not detected by present functional tests. A role of the L242P mutation on
binding to LDL- receptor family and removal of TGRL is unlikely since the L242P mutation
is not located in the putative receptor binding domains identified by Dorfmeister et al.16
Overall, in proband E, the involvement of the new L242P mutant in hyperchylomicronemia is
likely but can not be fully established.
Our work clearly confirms the high phenotypic variability of APOA5 homozygous and
heterozygous deficiency syndromes. Severe homozygous phenotypes were reported with
either early or late-onset in adulthood. For the Q97X homozygote (proband D), the onset was
at 25 years old, earlier than in the Q97X heterozygotes in our study. His episodes were more
severe with ageing and became more resistant to diet. We previously reported permanent
hyperchylomicronemia in a Q139X homozygote with late onset at 30 years old12. By contrast,
early-onset hyperchylomicronemia was reported in a Q148X homozygote child (onset at 5
years old)13 and in the only previously reported Q97X homozygote (onset at 2 years old)15.
This highly variable age of onset of homozygote phenotypes, even for deleterious nonsense
mutants, suggests a crucial influence of environmental factors. This is confirmed by the
observation that a homozygous carrier of APOA5 truncation may only display an intermittent
141
lipolysis defect, as demonstrated with the Italian Q97X homozygote who displayed normal
LPL activity when he had only moderate HTG (3.73 mmol/l).15
Phenotypic variability was more obvious for the heterozygotes. We observed among the
Q97X heterozygotes various phenotypes ranging from severe recurrent episodes of
hyperchylomicronemia (AIII1 and B), to single documented episode of severe HTG (C), or to
only mild HTG (AII1). In another pedigree, the Q97X heterozygotes were all
normotriglyceridemic.15 These data are in agreements with our previous study with only half
of the heterozygous Q139X carriers displaying severe hyperchylomicronemia12 and with all
heterozygous Q148X carriers (n=10) displaying either normal TG levels or mild HTG.13
Phenotypes were also extremely variable among APOA5 heterozygous missense mutations,
comparing the L242 carrier and the three recently reported patients with mutations E255G,
G271C and H321L.16
Overall, the phenotypic expression of APOA5 mutations appears to depend on the presence of
both genetic and metabolic additional factors. Haplotype analyses in heterozygotes revealed a
strong influence of the second APOA5 haplotype. In our study, all Q97X and L242P
heterozygotes with history of hyperchylomicronemia, except one, carried a minor APOA5
haplotype (APOA5*2 or APOA5*2b) on the second chromosome (Table 1). Only proband C
harboured a common APOA5*1 as second haplotype. These findings are in agreement with
our previous study indicating that all the Q139X heterozygotes with either APOA5*2 or
APOA5*3 as second haplotype presented hyperchylomicronemia, whereas none of those with
the common APOA5*1 as second haplotype did.12 Similarly, the three new missense APOA5
mutations were also all associated with one of the variant APOA5*2 or APOA5*3
haplotypes.16 Conversely, none of the heterozygous carriers of Q148X mutation (n=10)13 or
the Italian Q97X heterozygotes (n=3)15, all of whom had the common APOA5*1 as second
haplotype, expressed severe HTG. Consequently, our present study strengthens the paradigm
that the phenotypic expression of heterozygous deleterious APOA5 mutation is strongly
influenced by compound heterozygosity with APOA5 TG raising variant haplotypes.
Population studies showed that the two APOA5*2 and APOA*3 haplotypes are strong
determinants of plasma TG variability in various human populations.8,9,10 and are associated
with various types of hyperlipidemia.29-33 Functional studies indicated that in APOA5*3
haplotype, the S19W variant in the signal peptide sequence is responsible for a 50% decrease
of protein secretion in vitro.34 Palmen et al. recently showed that a functional interaction
142
between the polymorphisms of APOA5*2 haplotype is also responsible for a 50 % lower
APOAV expression in vitro.35
Gene polymorphisms modulating TG metabolism such as in APOE and APOC3 may also
modulate phenotypic expression of Q97X and L242P mutations. Such variants were present
in all mutation carriers except in family A. Probands B, C, D expressed one APOE variants
(E2 and/or E4) and proband E was E2/E4. Probands B and E also carried an APOC3 S2 allele,
at heterozygous state (Tables 2 and 3). These genetic variants have already been associated
with severe HTG.3,4,5 Moreover, several studies have suggested an interaction between APOE
polymorphisms (E2 or E4) and APOA5*2 orAPOA5*3 haplotypes in patients with severe
HTG.36-40
The phenotypic expression of APOA5 mutations could also be influenced by the metabolic
background. We previously showed that the expression of Q139X mutation in heterozygotes
was clearly influenced by the presence of diabetes or abdominal obesity.12 These metabolic
states are associated with moderate HTG mostly due to increased VLDL synthesis.41 By
contrast, most of the severely hypertriglyceridemic Q97X carriers in our present study
(proband AIII1, B, D) had a normal insulin sensitivity, were not diabetic nor displayed
metabolic syndrome. In the Q97X heterozygous proband C, hyperchylomicronemia occurred
before the onset of type 2 diabetes. Metabolic syndrome may have contributed to the severity
of the phenotype of the L242P mutation carrier (proband E), but did not lead to
hyperchylomicronemia in subject AII1 who expressed only moderate HTG, as well as in some
young Q139X heterozygous carriers.12 The presence of a metabolic syndrome is probably
neither sufficient nor necessary to trigger severe HTG in heterozygous carriers of APOA5
mutations.
In conclusion, we identified a new APOA5 missense mutation, L242P. Even though the
mutation was present in a hyperchylomicronemic proband and occurs near the lipid binding
domain and LPL activation domain, its causal involvement remains to be established.
However, we confirm through the study of four novel families that the Q97X mutation is
involved in familial intermittent hyperchylomicronemia with concomitant alteration of
intravascular lipolysis. We highlight the large variability of phenotypic presentation and the
strong influence of compound heterozygosity with APOA5 variant haplotypes and additional
genetic factors in the expression of mutations in heterozygotes, with only a mild influence of
metabolic syndrome in these patients.
143
Acknowledgements
This work was supported by Hospices Civils de Lyon and INSERM.
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Figure Legends
Figure 1: Family A and E pedigrees.
Arrows: probands; double line: false twins; asterix: heterozygous carriers of APOA5 mutation
(Q97X or L242P); black boxes: hyperchylomicronemia; grey boxes: moderate HTG; black
striped boxes: reported hypercholesterolemia; empty boxes: normolipidemic subjects; black
dot boxes: no lipidic data.
Figure 2: Western Blot analysis of ApoAV distribution in plasma VLDL
The 40 kDa strip corresponds to apoAV. The two secondary strips at about 50 kDa (AIII1 and
EII1) and 25 kDa (EII1) were due to non-specific binding of the second antibody peroxidase
conjugate12, verified by western blot (data not shown).
CT: normolipidemic controls.
Figure 3: Post heparin LPL activity
148
Table 1: APOA5 haplotypes identified in Q97X and L242P carriers.
SNP/mutat
ion
dbSNP
identifier*
Q97X
Haplotype
L242P
Haplotype
APOA5*1
Haplotype
APOA5*2
Haplotype
APOA5*2b
Haplotype
g.A-2200T
rs1787690
A
T
A
A
A
g.C-1464T
rs10750097
C
C
C
C
T
g.T-1131C
rs662799
SNP3
T
T
T
C
C
g.A-3G
rs651821
Kozak
A
A
A
G
G
g.C170G
rs3135506
S19W
C
C
C
C
C
g.G751A
rs2072560
SNP2
G
G
G
A
A
g.C921T
Q97X
T
C
C
C
C
g.T1257C
L242P
T
C
T
T
T
T
C
C
C
C
g.C1764T
rs619054
ApoA5
* as shown on the Single Nucleotide Polymorphism database (http://ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)
149
Table 2: Characteristics, lipid parameters and genetic studies of Q97X carriers
AII1
AIII1
B
C
D
70
42
32
59
55
Maximum TG
(mmol/l)
5.51
15.13
16
20
40
TG (mmol/l)*
3.12
5.81
1.35
2.27
12.84
HDLc (mmol/l)*
1.16
1.05
1.18
1.15
0.56
LDLc (mmol/l)* †
2.51
2.19
2.89
3.58
1.22
Glycemia (mmol/l)
N
N
N
BMI (kg/m2)
26
21
28
27
21
Metabolic
syndrome‡
Yes
No
No
No
No
HOMA-IR
2.66
1.92
0.79
NA
NA
APOE genotype
E3/E3
E3/E3
E2/E3
E3/E4
E2/E3
APOC3 Sst
plymorphism
S1/S1
S1/S1
S1/S2
S1/S1
S1/S1
LPL genotype
N
N
N
N
N
APOA5*Q97X
/APOA5*1
APOA5*Q97X
/APOA5*2b
APOA5*Q97X
/APOA5*2
APOA5*Q97X
/APOA5*1
APOA5*Q97X
/APOA5*Q97X
Age (years)
APOA5 haplotypes§
BMI: Body mass index; N: Normal; NA : not available; : Impaired fasting glucose; : diabetes.
* TG at the time of the study
† LDLc determined after ultracentrifugation when TG > 3.5 mmol/l
‡ NCEP-ATPIII criteria21
§ haplotypes are defined in Table 1.
150
Table 3: Characteristics, lipid parameters and genetic studies of family E studied
members
EII2
EII3
EIII1
EIII2
EIII3
44
39
17
17
11
BMI (kg/m2)
30.2
23
19.2
20.9
16.3
Maximum TG (mmol/l)
37.45
-
-
-
-
TG (mmol/l)
3.27
0.86
0.43
1.12
1.80
HDLc (mmol/l)
1.16
1.60
1,56
1,84
1,69
LDLc (mmol/l)†
2.31
1.88
1,68
1,81
0,92
N
N
N
N
N
Yes
No
No
No
No
ApoE genotype
E2/E4
E2/E3
E2/E4
E2/E4
E2/E2
ApoC3 Sst
polymorphism
S1/S2
S1/S1
S1/S2
S1/S2
S1/S2
LPL genotype
N
N
N
N
N
APOA5*L242P
/APOA5*2
APOA5*1
/APOA5*1
APOA5*2
/APO5*1
APOA5*2
/APO5*1
APOA5*2
/APO5*1
Age (years)
Glycemia
Metabolic syndrome‡
APOA5 haplotype
BMI: Body mass index; N: Normal; NA: not available
* TG at the time of the study
† LDLc determined after ultracentrifugation when TG > 3.5 mmol/l
‡ NCEP-ATPIII criteria21
151
.
Figure 1
I
1
.
*
II
1
III
2
.
.
1
2
3
2
*
.
.
I
1
*
II
1
2
3
2
III
IV
1
2
Family A (Q97X)
3
1
2
3
Family E (L242P)
152
Figure 2
Q97X
kDa
55
43
34
CT
B
AII1 AIII1
L242P
EII2
kDa
50
37
26
25
17
11
20
153
Figure 3
µmol AGL/ml/h
10
Q97X
8
L242P
6
4
2
0
Controls AIII1
B
D
EII2
154
Article 3: “Association of APOA5 -1131T>C and S19W gene
polymorphisms with both mild hypertriglyceridemia and
hyperchylomicronemia in type 2 diabetic patients”
Les haplotypes variants de l’APOA5, APOA5*2 et APOA5*3, représentés
respectivement par les polymorphismes -1131T>C et S19W, sont d’importants déterminants
de la variabilité des TG chez l’homme, dans des populations d’origines ethniques variées. Ces
polymorphismes ont été associés à différents types de dyslipidémies dans la littérature, mais
leur rôle dans la dyslipidémie diabétique est moins bien documenté en particulier dans l’HTG
majeure.
Nous avons donc étudiée la fréquence des polymorphismes -1131T>C et S19W au
sein d’une cohorte lyonnaise de 400 diabétiques de type 2 (cohorte DIACOR) séparée en 2
groupes, normotriglycéridémiques (group N, 130 patients avec TG < 90ième percentile pour
l’âge et le sexe) et modérément hypertriglycéridémiques (group M, 270 patients). Un 3ème
groupe (group H) composé de 51 patients diabétiques et dyslipidémiques de type V a
également été étudié.
Nous avons montré une forte association des deux allèles rares -1131C et 19W à
l’HTG majeure et une association de l’allèle -1131C à l’HTG modérée dans le diabète de type
2.
155
[Cha’08b] Charriere S, Bernard S, Aqallal M, et al. Association of APOA5 -1131T>C and
S19W gene polymorphisms with both mild hypertriglyceridemia and hyperchylomicronemia
in type 2 diabetic patients. Clinical Chimica Acta, 2008 vol. 394, n°1-2, pp. 99-103.
156
3EME PARTIE :
DISCUSSION
161
I. Place des mutations de l’APOA5 dans les étiologies génétiques des
hyperchylomicronémies
Le séquençage systématique du gène APOA5, dans une population de 316 patients
dyslipémiques de type V non apparentés, dont 249 cas sporadiques (80 %) et 67 cas
pédiatriques ou familiaux (20 %), a permis l’identification d’une mutation homozygote ou
hétérozygote composite de l’APOA5 chez 15 patients soit dans 4,7 % des cas. Dans cette
population, seulement 30 autres anomalies génétiques causales (9.5 %) ont pu préalablement
être identifiées : 11 déficits homozygotes en LPL, 16 déficits hétérozygotes en LPL dont un
avec auto-anticorps anti-LPL [Pru’05b], 1 déficit homozygote en apoCII et 2 déficits
hétérozygotes en apoCII. Par ailleurs, 11 sujets (3,5 %) présentaient un génotype E2E2 ou une
mutation de l’apoE (1 patient avec forme sporadique). Aucun des patients porteurs d’une
mutation de l’APOA5 ne présentait de déficit en LPL ou en apoCII, ni n’étaient E2/E2 (Figure
22).
Parmi les 15 patients présentant une mutation homozygote ou hétérozygote composite de
l’APOA5, outre les 8 cas-index présentant les mutation Q139X, Q97X ou L242P rapportées
dans nos 2 articles, nous avons mis en évidence 5 autres mutations faux-sens hétérozygotes et
2 insertions avec troncature par création d’un codon stop dans l’exon 3 (données non
publiées).
Ainsi cette étude confère une place importante aux mutations de l’APOA5 au sein des
étiologies génétiques identifiées des hyperchylomicronémies. En terme quantitatif, la
prévalence des mutations de l’APOA5 représente près de 50 % de celle des mutations homo
ou hétérozygotes de la LPL. Cependant, dans plus de la moitié des cas manifestement soustendus par une cause génétique du fait du contexte familial ou d’une révélation pédiatrique,
l’étiologie de l’hyperchylomicronémie reste inconnue. La situation est encore plus critique
dans les formes sporadiques, majoritaires, puisqu’un facteur génétique déterminant n’est
retrouvé que moins de 15 % des cas, laissant un large champ d’investigation pour l’étude de
nouveaux gènes candidats (Figure 22).
162
Deux autres cohortes, avec un nombre plus faible de patients avec HTG sévères (> 10
mmol/l), ont été publiées dans la littérature avec une prévalence de mutations de l’APOA5
inférieure à celle de notre cohorte :
- dans la cohorte de Dorfmeister et al., sur 130 patients présentant une dyslipidémie de
type I ou de type V (britanniques, hollandais et tchèques), 3 porteurs de mutations
hétérozygotes de l’APOA5 ont été identifiés, soit 2.3 % [Dor’08].
- dans la cohorte de Wang et al. de 110 patients, aucune mutation de l’APOA5 n’a été
identifiée mais environ 10 % des sujets présentaient une mutation de la LPL (6.4 %) ou de
l’apoCII (3.6 %), pourcentage comparable à nos résultats [Wan’07b].
En revanche, dans la petite cohorte de 48 patients de Priore Oliva et al., la fréquence
des mutations était plus élevée : 18 patients présentaient une anomalie sur la LPL ou l’apoCIII
(37.5 %), et 3 mutations de l’APOA5 ont été identifiées parmi les patients sans anomalie sur la
LPL ou l’apoCIII [Pri’05c, Pri’06, Pri’08], soit une prévalence de 6.2 %. Il semble exister des
cas pédiatriques dans cette cohorte puisque que parmi les 3 mutations de l’APOA5, 2 ont été
identifiées chez des enfants (mutation Q148X et Q97X) [Pri’05c, Pri’08]. Ceci pourrait
expliquer la prévalence plus élevée de mutations de l’APOA5 dans cette cohorte, avec des
résultats proches de ceux obtenus notre sous-groupe de cas pédiatriques ou familiaux (Figure
22).
La prévalence des mutations de l’APOA5 parait donc variable dans la littérature. Les
critères de sélection des patients, mal précisés dans les publications en dehors des valeurs de
TG, pourraient expliquer ces variations. Notre cohorte comportait uniquement des sujets avec
une dyslipidémie de type V, et pas de dyslipidémie de type I. Nous avons choisi
volontairement des critères plus stringents que les critères habituels avec une valeur de TG >
15 mmol/l et non 10 mmol/l, car au-delà de 15 mmol/l la présence de chylomicrons est
certaine [Bru’95]. Par ailleurs, il pourrait exister un effet fondateur dans notre région pour les
mutations Q97X et Q139X puisque l’haplotype porteur de la mutation était commun à tous les
cas index pour les 2 mutations.
163
Formes pédiatriques ou familiales
Formes sporadiques
(n=67)
(n=249)
3%
LPL homo ou
hétérozygote*
16 %
9%
65%
7%
0,4 % 6,4 %
2%
3%
ApoC2 homo ou
hétérozygote*
Apo E2/E2 ou
mutation de l’apoE
APOA5 homo ou
hétérozygote composite
88,2%
Pas d’anomalies
identifiées
Figure 22 : Anomalies génétiques identifiées dans une cohorte de patients
hyperchylomicronémiques (n=316).
II. Implication des mutations de l’APOA5 en pathologie
A. Mutations Q139X et Q97X
Nos 2 études, analysant plusieurs familles porteuses des mutations Q139X et Q97X,
ont apporté des arguments forts en faveur de l’implication de ces 2 mutations dans
l’hyperchylomicronémie observée. Les mutations Q139X et Q97X ont été identifiées
respectivement chez 3 et 4 cas index non apparentés, ne présentant pas de mutation sur le
gène APOCII ou LPL. Dans les familles, la pathologie lipidique n’apparaissait que chez les
porteurs des mutations Q139X ou Q97X, associée à un défaut de lipolyse.
164
1. Anomalies fonctionnelles induites par les mutations Q139X et Q97X
a. Chez tous les hétérozygotes
Les mutations Q139X et Q97X prédisent une protéine mature respectivement de 115
AA (15 kDa), et 84 AA (10 kDa), c'est-à-dire tronquée en amont des domaines identifiés de
liaison aux lipides (AA 192-238 et 301-343), d’activation de la LPL (AA 192-238) et de
liaison à l’héparine (AA 186-227) [Loo’05, Sun’06, Won’07] (Figure 23).
Pour la mutation Q139X, nous avons pu mettre en évidence la protéine tronquée en
western blot chez tous les patients porteurs de la mutation que nous avons étudiés, mais
uniquement dans la fraction non liée aux lipoprotéines (d>1.21). Du fait de la perte du
domaine de liaison aux lipides, la protéine apoAV-139X est probablement faiblement liée aux
lipoprotéines et est donc « décrochée » par l’ultracentrifugation, alors que l’apoAV sauvage
chez les contrôles reste liée aux VLDL et HDL (Figure 2 - Article 1), comme décrit dans la
littérature [Obr’05].
En revanche, chez les patients porteurs de la mutation Q97X, la protéine tronquée n’a été
détectée dans aucune des fractions lipoprotéiques (Figure 2 – Article 2), en accord avec les
données de Priore Oliva : la protéine tronquée apoAV-97X n’était pas retrouvée dans le
plasma de l’enfant homozygote Q97X, analysé en western blot [Pri’08]. Ceci suggère que soit
la protéine est dégradée dans la cellule, soit que l’ARNm-97X avec un codon stop plus
précoce que l’ARNm-139X, est dégradé par le système intracellulaire NMD (Nonsense
mediated mRNA decay) [Ame’06, Cal’06].
Cependant, qu’une protéine tronquée soit retrouvée ou non, tous les porteurs
hétérozygotes Q139X ou Q97X explorés présentaient une altération similaire de la liaison de
l’apoAV sauvage (40 kDa) aux VLDL et aux HDL (Figure 2 – Article 1, Figure 2 – Article
2).
165
domaine d’activation
de la LPL
domaine de liaison
domaines de
à l’héparine
liaison aux lipides
Q97X
NH2
1
Q139X
60
170
245
343
COOH
apoAV-139X
NH2
COOH
apoAV-97X
NH2
COOH
Figure 23 : Schéma des protéines tronquées générées par les mutations Q139X et Q97X
b. Chez tous les porteurs des mutations Q139X et Q97X exprimant une
dyslipidémie de type V
Une diminution de l’activité LPL post-héparinique a été mise en évidence chez les
patients portant la mutation Q139X et sévèrement dyslipidémiques, confirmée chez les
patients portant la mutation Q97X hyperchylomicronémiques (Figure 4 – Article 1, Figure 3 Article 2). Les 2 patients homozygotes Q139X (Q139X-CI1) et Q97X (Q97X-D) avaient les
activités LPL les plus basses, comparables à celles de patients présentant un déficit
homozygote en LPL avec des mutations non-sens (R192X, Y288X, IVS1-1G>A). Les
activités LPL post-hépariniques de 2 sujets hétérozygotes Q139X sans antécédents d’HTG
sévère (Q139X-BIII4, BIII5) étaient en revanche normales (Figure 4 – Article 1).
Le déficit lipolytique a été confirmé pour la mutation Q139X grâce aux études
cinétiques in vivo de l’apoB100. Celles-ci ont montré clairement une altération majeure du
catabolisme des LRTG, touchant surtout les VLDL mais également les IDL, chez 3
hétérozygotes pour la mutation Q139X ayant une HTG sévère (Q139X-AII1, AIII2, BIII3).
Une augmentation modérée de la production hépatique de VLDL a été notée chez une seule
166
patiente (Q139X-BIII3), mais comparable aux résultats habituellement notés chez les
diabétiques [Duv’00] (Tableau 2, Figure 3 – Article 1). Malheureusement, cette étude n’a pu
être conduite chez le patient homozygote (Q139X-CI1) du fait de son décès prématuré, ni
chez un hétérozygote sans HTG sévère.
De
plus,
chez
tous
les
patients
porteurs
de
la
mutation
Q139X
hyperchylomicronémiques (Q139X-AII1, AIII2, BIII2, BIII3, CI1), le défaut de lipolyse était
associé à une absence de LPL dans le plasma post-héparinique, alors que la LPL était
normalement présente dans le plasma post-héparinique des hétérozygotes sans antécédents
d’HTG majeure (Q139X-BIII4, BIII5) (Figure 4 – Article 1). Ceci suggère un déficit en LPL
liée aux HSPG à la surface de l’endothélium vasculaire chez les porteurs de la mutation
hyperchylomicronémiques.
Ainsi, l’étude des anomalies fonctionnelles induites par les mutations Q139X et Q97X
a donc mis en évidence d’une part une altération de la liaison de l’apoAV sauvage aux
lipoprotéines chez tous les porteurs de mutations étudiés, et d’autre part un déficit majeur de
la lipolyse par la LPL uniquement chez ceux qui ont présenté une hyperchylomicronémie.
2. Mécanismes de la dyslipidémie chez les porteurs des mutations Q97X et
Q139X
A partir des anomalies fonctionnelles mises en évidence chez les sujets porteurs des
mutations Q139X et Q97X et grâce aux données de la littérature, on peut tenter de proposer
un modèle physiopathologique des mécanismes conduisant à l’hyperchylomicronémie chez
ces patients. Différentes hypothèses peuvent être formulées pour expliquer le défaut de
lipolyse.
a. Défaut d’activation de la LPL
Des études ont montré que la stimulation du catabolisme des LRTG par l’apoAV
implique sa liaison aux lipides et aux HSPG. Expérimentalement, l’apoAV stimule la lipolyse
par la LPL liée aux HSPG, mais pas par la LPL libre [Loo’05, Mer’05a]. L’apoAV peut se
167
lier aux HSPG [Loo’05] et à la LPL [Mer’05a]. Elle favoriserait la lipolyse en facilitant les
interactions entre les LRTG et les complexes LPL-HSPG [Loo’05, Mer’05a].
L’apoAV tronquée, privée de ses domaines de liaison aux lipoprotéines, aux HSPG, et
d’activation de la LPL, pourrait logiquement perdre sa capacité à favoriser les interactions
entre les LRTG et la LPL liée aux HSPG, et/ou à stimuler la lipolyse (Figure 24). Malgré
l’absence de protéine tronquée chez les porteurs de la mutation Q97X dans nos familles
(Article 2) ou chez le cas index italien [Pri’08], un défaut de lipolyse est également présent.
De plus, Dorfmeister et al. ont montré récemment qu’in vitro la protéine recombinante
apoAV-139X ne diminuait l’activation de la LPL que d’environ 20 % par rapport à l’apoAV
sauvage [Dor’08]. Ceci suggère que chez les patients porteurs de la mutation Q139X, le
défaut d’activation de la LPL serait plutôt lié au déficit en apoAV sauvage qu’à un défaut
d’activation par la protéine tronquée. Ainsi, l’altération de la liaison de l’apoAV sauvage aux
lipoprotéines pourrait être une condition nécessaire pour induire le défaut de lipolyse.
Nos travaux ne permettent pas cependant pas de comprendre comment les mutations
de l’apoAV induisent un défaut de liaison de l’apoAV sauvage aux lipoprotéines chez les
sujets hyperchylomicronémiques. Pour la mutation Q139X, on pouvait supposer que la
protéine tronquée perturbait la liaison de l’apoAV sauvage aux lipoprotéines soit en
empêchant la formation de dimères d’apoAV, soit en perturbant la liaison à un autre facteur
nécessaire à la liaison de l’apoAV aux lipoprotéines. Là encore, l’absence de protéine
tronquée pour les patients porteurs de la mutation Q97X, n’est pas en faveur de cette
hypothèse. Par ailleurs, l’existence d’une forme dimérique de l’apoAV a été infirmée depuis
par Alborn et al. [Alb’06].
168
VLDL / Chylomicrons
TG
+
apo
AV
AG
LPL
ApoCII
A
HSPG
Tissus
VLDL / Chylomicrons
TG
AG
apoAV
ApoCII
B
LPL
HSPG
Figure 24 : Schéma du mécanisme d’action de l’apoAV en physiologie (A)
et en présence de la mutation Q139X ou Q97X (B), d’après les données de la littérature
169
b. Déficit en LPL à la surface endothéliale
Nos résultats suggèrent également une autre hypothèse. En effet, chez les
hétérozygotes Q139X qui développent une HTG sévère, il existait plus qu’un simple défaut de
stimulation d’une protéine LPL normalement exprimée à la surface de l’endothélium, mais
également un déficit de LPL liée aux HSPG. On ne sait actuellement pas comment ce déficit
en LPL survient. Initialement, nous avons émis l’hypothèse que la protéine tronquée pourrait
affecter directement ou indirectement l’expression de la LPL à la surface de l’endothélium,
par un gain de fonction. Les données récentes obtenues avec la mutation Q97X et l’absence
de protéine tronquée dans ces familles, nous font penser que l’effet serait plus probablement
lié au déficit en apoAV sauvage, et donc une perte de fonction. Le déficit en LPL à la surface
endothéliale pourrait s’expliquer par différentes hypothèses :
- Une anomalie au niveau des HSPG
Ceci est peu probable puisque la lipase hépatique était correctement détachable des
HSPG après injection d’héparine. Mais, il pourrait exister une anomalie spécifique de
l’interaction LPL-HSPG.
- Une dégradation de la LPL
Merkel et al. ont proposé que la LPL liée aux HSPG pourrait être dégradée en
présence d’une protéine tronquée. En se liant à la fois aux LRTG, aux HSPG et à la LPL,
l’apoAV sauvage pourrait stabiliser les complexes lipolytiques ou les dimères de LPL et ainsi
augmenter la lipolyse. L’apoAV tronquée ne se lie pas aux lipoprotéines mais pourrait se lier
sous forme libre à la LPL ou aux HSPG, et entraîner une dégradation de la LPL [Mer’05b].
Toutefois, la protéine est tronquée en amont des domaines de liaison aux HSPG (Figure 23).
L’absence d’apoAV liée aux LRTG pourrait alternativement être à l’origine de la dégradation
de la LPL (Figure 25).
170
VLDL / Chylomicrons
TG
AG
apoAV
ApoCII
LPL
Dégradation
HSPG
Figure 25 : Hypothèse de dégradation de la LPL en présence d’une mutation non-sens
de l’APOA5, d’après [Mer’05b]
- Un défaut d’expression ou d’adressage de la LPL
L’altération de la liaison de l’apoAV aux lipoprotéines pourrait perturber la
transmission d’un signal de sécrétion ou d’adressage de la LPL à la surface endothéliale,
normalement transmis aux cellules adipeuses ou musculaires sous endothéliales lors de la
liaison des lipoprotéines aux complexes LPL-HSPG (Figure 26). On pourrait imaginer des
interactions avec le gène LMF1 récemment identifié qui jouerait un rôle dans le transport et/
ou la maturation de la LPL et de la LH à la surface endothéliale [Pet’07]. Toutefois, il devrait
alors exister en déficit combiné en LPL et en LH, ce qui n’était pas le cas chez les patients
Q139X et Q97X que nous avons étudiés. On ne peut pas exclure une action intracellulaire
endothéliale de l’APOA5 mais son expression dans les cellules endothéliales n’a pas été
étudiée dans la littérature.
L’étude d’animaux transgéniques aurait été intéressante pour mieux comprendre les
anomalies induites par les mutations. Malheureusement, les souris transgéniques APOA5Q139X développées en collaboration avec l’équipe de Pennacchio n’exprimaient pas la
protéine tronquée et n’ont donc pas permis d’apporter d’informations complémentaires.
171
VLDL / Chylomicrons
TG
+
apo
AV
AG
LPL
ApoCII
Expression
/ adressage
A
HSPG
+
Tissus
LPL
Adipocyte / Myocyte
VLDL / Chylomicrons
TG
AG
apoAV
ApoCII
LPL
Expression
/ adressage
HSPG
B
LPL
Adipocyte / Myocyte
Figure 26 : Hypothèse d’action de l’apoAV en physiologie (A) et en présence de la
mutation Q139X (B) : contrôle de l’expression ou de l’adressage de l’apoAV
172
3. Comment expliquer la révélation tardive et fluctuante du syndrome ?
On a vu que l’hyperchylomicronémie apparaissait dans nos familles à l’âge adulte, de
manière intermittente et pour certains s’aggravant avec l’âge pour devenir permanente. On ne
sait pas comment l’expression de la LPL serait progressivement altérée, conduisant à une
HTG sévère.
L’étude des souris KO pour le gène apoa5 a montré que la surexpression de la LPL
pouvait compenser le déficit en apoav et normalisait les TG [Mer’05a]. Ainsi, on peut
proposer qu’il existe initialement un pré-syndrome : le défaut d’expression ou d’adressage de
la LPL, lié à l’altération de la liaison de l’apoAV aux lipoprotéines, serait compensé par une
augmentation de la production de LPL. Par la suite, des facteurs liés à l’âge pourraient
progressivement limiter les mécanismes de compensation, et le défaut de lipolyse responsable
de l’HTG majeure apparaîtrait. Le diabète ou le syndrome métabolique, présents chez certains
patients,
aggraverait
le
défaut
de
lipolyse
et
favoriserait
l’apparition
de
l’hyperchylomicronémie, en augmentant la production hépatique de VLDL, et en diminuant
l’activité et la masse de LPL [Kra’04, Pru’04]. De même, les erreurs nutritionnelles
déborderaient rapidement les capacités réduites de lipolyse.
173
B. Mutation L242P
L’impact de la mutation L242P est moins bien documenté que celui des mutations
Q139X et Q97X. En effet, l’absence d’autres porteurs de la mutation L242P dans la famille
n’a pas permis de réaliser d’analyse de ségrégation. Toutefois, il est peu probable que cette
mutation soit un polymorphisme de population puisqu’elle n’a pas été retrouvée dans une
population de 200 témoins normolipémiques, ni dans les nombreuses études de population
publiées dans la littérature, et en particulier dans l’étude exhaustive d’Olivier et al. [Oli’04].
La mutation L242P se situe sur la séquence de la protéine à proximité des domaines de liaison
aux lipides (AA 192-238 et 301-343) et du domaine d’activation de la LPL (AA 192-238)
[Sun’06, Won’07]. Cette région de l’apoAV (AA 171-245) comporte trois hélices alpha très
hydrophobes et fortement amphipathiques, et est prédite pour avoir la plus forte activité de
surface [Wei’03]. La substitution d’une leucine (« helix former ») pour une proline (« helix
breaker ») est susceptible d’affecter drastiquement la structure secondaire de la protéine. La
structure secondaire en alpha hélice, primordiale pour la fonction des apolipoprotéines,
pourrait être interrompue comme décrit dans la littérature pour d’autres mutations
d’apolipoprotéines : la mutation L4372P de l’apoB et la mutation L72P de l’apoCII entraînent
respectivement un défaut de liaison de l’apoB à la Lp(a) [Sha’04b] et de l’apoCII à la LPL
[Lam’06].
Nous avons étudié l’impact de la mutation L242P sur la structure et la fonction de l’apoAV
par une analyse informatique en utilisant les modèles de prédiction automatique de
substitution
d’acides
aminés
par
alignements
de
séquences
PolyPhen
(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) [Sun’00, Sun’01, Ram’02] et SIFT (Sorting Intolerant
From Tolerant: http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) [Ng’01, Ng’02]. La mutation L242P est
prédite comme étant « probablement délétère » (PSIC score difference 2.243) dans Polyphen
et « affectant la fonction de la protéine » dans SIFT. Le nucléotide et l’acide aminé sont très
conservés entre les espèces (sur 10 espèces) avec un écart physico-chimique important entre
Leucine et Proline.
Cependant, nous n’avons pas mis en évidence de défaut de lipolyse chez le porteur de
la mutation L242P. En effet, son activité LPL post-héparinique, mesurée en dehors d’une
période d’HTG sévère, était normale. Ceci n’exclut pas la possibilité d’un défaut de lipolyse
induit par la mutation puisque l’activité LPL peut être normale en dehors des périodes
174
d’hyperchylomicronémie y compris pour des patients présentant une mutation délétère à l’état
homozygote comme le patient homozygote Q97X italien [Pri’08].
La liaison de l’apoAV sauvage aux lipoprotéines n’était pas altérée chez le sujet L242P ce qui
peut suggérer soit l’absence d’impact de la mutation sur la fonction de l’apoAV, soit un
mécanisme d’action différent des mutations non-sens qui n’a pas pu être mis en évidence par
les tests fonctionnels utilisés. La mutation L242P n’intervient peut-être pas sur la liaison de
l’apoAV aux lipides. Elle pourrait intervenir sur la capacité d’activation de la LPL in vivo. Si
la LPL est correctement liée aux HSPG, l’activité LPL post-héparinique in vitro serait alors
normale. Il est, en revanche peu probable que la mutation L242P intervienne sur la capacité de
liaison de l’apoAV aux récepteurs de la famille LDL et sur la capture des LRTG puisqu’elle
ne se situe pas au niveau du domaine de liaison aux récepteurs (AA 186-227) identifié par
Dorfmeister et al. [Dor’08].
Ainsi, l’implication de la mutation L242P dans l’hyperchylomicronémie du cas index
est possible mais n’a pas pu être établie avec certitude pour l’instant.
III. Variabilité de l’expression phénotypique des mutations de l’APOA5
A Mutations non-sens
Nos 2 études, conduites dans plusieurs familles, nous ont permis de décrire
l’expression phénotypique des mutations non-sens de l’APOA5 et d’en documenter l’extrême
variabilité aussi bien chez les homozygotes que chez les hétérozygotes.
Tout d’abord, l’âge de révélation est très variable. Les 2 homozygotes Q139X et
Q97X que nous avons décrits (Q139X-CI1, Q97X-D), ont révélé une hyperchylomicronémie
sévère à l’âge adulte, respectivement à 34 et 25 ans. Mais, l’apparition de
l’hyperchylomicronémie était beaucoup plus précoce dans la petite enfance, à l’âge de 2 ans
pour l’autre homozygote Q97X rapporté dans la littérature [Pri’08], et à l’âge de 5 ans pour
l’homozygote Q148X [Pri’05c]. Chez les hétérozygotes exprimant une HTG sévère dans nos
175
2 études, la révélation était assez précoce à l’âge adulte dans la 2ème ou la 3ème décade pour les
2 mutations Q139X et Q97X, sauf dans un cas (Q139X-BIII3) révélé à l’âge de 54 ans.
L’absence de révélation plus précoce chez les homozygotes dans nos 2 études est surprenante.
En effet, dans les déficits homozygotes en LPL ou en apoCII, la dyslipidémie sévère apparaît
généralement dans l’enfance [Ben’96a, Jon’99, Mer’02, Mah’03]. On ne peut pas exclure que
chez certains le phénotype soit apparu plus précocement du fait du caractère souvent
asymptomatique et/ou intermittent des poussées d’HTG majeure. Toutefois, l’homozygote
Q139X n’a pas présenté d’épisodes de pancréatite aiguë avant l’âge de 34 ans.
Les homozygotes ont systématiquement présenté une hyperchylomicronémie mais
avec soit une HTG sévère permanente, résistante aux mesures diététiques et aux
hypolipémiants, soit des poussées récurrentes d’HTG entrecoupées de périodes d’HTG
modérée pour notre sujet homozygote Q97X (Q97X-D), ou les 2 enfant homozygotes Q97X
et Q148X [Pri’08, Pri’05c]. Globalement, le phénotype de l’homozygote Q139X (Q139XCI1) apparaît plus sévère que l’homozygote adulte Q97X (Q97X-D) avec plusieurs
pancréatites aiguës et des complications cardiovasculaires. On ne dispose pas de recul à l’âge
adulte pour les deux enfants Q97X et Q148X [Pri’08, Pri’05c].
En revanche, tous les hétérozygotes ne développent pas une HTG sévère. Pour la
mutation Q139X, si on rajoute les données complémentaires de la famille C, seuls 4/11
hétérozygotes pour la mutation ont exprimé une HTG sévère, les autres étant soit
normotriglycéridémiques, soit modérément HTG. Pour la mutation Q97X, dans notre étude,
3/4 hétérozygotes ont présenté une HTG sévère (sujets Q97X-AIII1, B, C) et un hétérozygote
une HTG modérée (Q97X-AII1), alors que dans l’étude de Priore Oliva, tous les
hétérozygotes (n=3) avaient des TG normaux [Pri’08]. Les 10 hétérozygotes de la famille
Q148X étaient également soit normo, soit modérément hypertriglycéridémiques [Pri’05c].
Parmi les hétérozygotes qui ont exprimé une HTG sévère dans nos 2 études, les hétérozygotes
Q139X présentaient des tableaux cliniques plus sévères avec une HTG majeure devenant
permanente avec l’âge et résistante aux mesures diététiques et aux hypolipémiants alors que
les hétérozygotes Q97X présentaient soit des poussées récurrentes d’HTG sévères (Q97XAII1, B), soit un seul épisode documenté (Q97X-C).
176
B. Mutations faux-sens
Les données concernant l’expression phénotypique des mutations faux-sens de
l’APOA5 sont réduites puisque nous n’avons identifié dans la famille qu’un seul porteur de la
mutation L242P, le cas index, et que pour les 3 autres mutations publiées récemment (E255G,
G271C, H321L), il n’y a pas eu d’enquête familiale [Dor’08].
Tous ont présenté une HTG sévère après 30 ans. Le sujet L242P a présenté des
épisodes récurrents d’HTG sévère à partir de l’âge de 40 ans. Les 3 autres porteurs de
mutations
faux-sens
présentaient
des
tableaux
variables :
hyperchylomicronémie
gestationnelle à 32 ans pour la mutation E255G (mais associé à une mutation homozygote
délétère de la LPL W86G !), HTG sévère persistante avec pancréatite aiguë à 43 ans pour la
mutation H321L et un épisode d’HTG sévère à 37 ans avec pancréatite aiguë pour la mutation
H321L (également associée à une mutation hétérozygote de la LPL P207L) [Dor’08].
Ainsi, parmi les porteurs de mutations de l’APOA5, les homozygotes exprimaient tous
une hyperchylomicronémie mais pas les hétérozygotes. Ceci est cohérent avec nos données
fonctionnelles : les formes homozygotes étaient associées à l’activité LPL la plus basse aussi
bien pour la mutation Q139X (Figure 4 – Article 1) que pour la mutation Q97X (Figure 3 –
Article 2).
C. Facteurs influençant l’expression des mutations de l’APOA5
La grande variabilité de l’expression phénotypique des mutations de l’APOA5 suggère
l’intervention d’autres facteurs génétiques, environnementaux, ou des pathologies associées
dans la révélation ou modulation du phénotype lipidique.
1. Facteurs génétiques
a. Rôle des haplotypes de l’APOA5
L’étude des haplotypes a révélé, dans nos 2 études, le rôle majeur du 2ème haplotype
dans l’expression des mutations de l’APOA5 chez les hétérozygotes.
177
Dans notre première étude, nous avons suggéré pour la première fois dans la littérature
une possible implication du 2ème haplotype dans l’expression du phénotype lipidique chez les
patients hétérozygotes pour la mutation Q139X. En effet, tous les porteurs hétérozygotes de la
mutation Q139X ayant présenté une hyperchylomicronémie avaient soit l’haplotype
APOA5*2, soit l’haplotype APOA5*3 comme second haplotype non muté, alors que les
porteurs hétérozygotes Q139X avec l’haplotype commun APOA5*1 comme second
haplotype n’avaient jamais présenté d’HTG sévère (Tableau 1- Article 1). Ceci a été confirmé
chez les 2 filles et le petit fils du patient homozygote Q139X (Q139X-CII2, CII3, CIII5),
hétérozygotes obligatoires, qui ne présentaient pas d’HTG et avaient un 2ème haplotype de
type APOA5*1. De même, dans la littérature, les 10 hétérozygotes porteurs de la mutation
Q148X, qui avaient tous un haplotype APOA5*1 comme second haplotype, avaient soit des
TG normaux, soit une HTG modérée [Pri’05c].
Les données ultérieures sur les porteurs de la mutation Q97X ont conforté cette
hypothèse. Dans notre étude, tous les patients porteurs hétérozygotes pour la mutation Q97X
qui présentaient une HTG sévère, sauf un, avaient un haplotype variant (APOA5*2 ou
APOA5*2b) comme second haplotype (Tableaux 2 et 3, Article 2). En revanche, le sujet
Q97X-AII1 de notre étude, avec une HTG modérée, avait un haplotype APOA5*1 comme
second
haplotype,
comme
les
3
hétérozygotes
Q97X
italiens
qui
étaient
normotriglycéridémiques [Pri’08]. De même, les hétérozygotes pour la mutation intronique
c.161 + 5 g>c, portant un haplotype APOA5*1 comme second haplotype, avaient des TG
normaux ou modérément augmentés [Hen’07]. Seul le cas index Q97X-C présentait une
hyperchylomicronémie et un 2ème haplotype APOA5*1 dans notre étude. Les 2 hétérozygotes
pour la mutation intronique c.161 + 3G>C qui présentaient une HTG sévère, étaient
également hétérozygotes pour le polymorphisme -1131T>C, sans qu’il soit précisé si le
polymorphisme et la mutation était sur le même haplotype ou non [Pri’06].
Dans nos 2 études, parmi les hétérozygotes composites Q139X / APOA5*1, 4 sujets
normolipémiques étaient trentenaires (Q139X-BIV1, BIV6, CII2, CII3) et un était un enfant
(CIII5). On ne peut donc exclure qu’ils puissent présenter une HTG sévère plus tardivement.
Mais plusieurs sujets hétérozygotes Q139X ou Q97X avaient plus de 50 ans et étaient
toujours soit normolipémiques (Q139X-BIII4), soit modérément hypertriglycéridémiques
178
(Q139X-BIII5 et Q97X-AII1) dans un contexte d’obésité androïde ou de syndrome
métabolique.
En ce qui concerne les mutations faux-sens, malgré le nombre restreint de sujets
décrits, les données sont comparables. Dans notre étude, le cas index hétérozygote L242P
présentait un 2ème haplotype de type APOA5*2 comme second haplotype. Dans l’étude de
Dorfmeister, le variant hétérozygote G271C était associé à un variant -1131CC, donc à un
haplotype APOA5*2 comme 2ème haplotype. Les 2 autres variants faux-sens hétérozygotes
(E255G, H321L) étaient associés au polymorphisme S19W à l’état hétérozygote, sans que
l’on sache s’ils étaient présents sur le même haplotype ou non [Dor’08].
Par conséquent, nos 2 études ont apporté des arguments forts en faveur d’un rôle
déterminant de l’hétérozygotie composite avec un haplotype variant (APOA5*2 ou
APOA5*3) dans l’expression phénotypique des mutations hétérozygotes de l’APOA5.
b. Rôle fonctionnel des 2 haplotypes APOA5*2 et APOA5*3
Comme on l’a vu dans la revue de la littérature, les haplotypes APOA5*2 et
APOA5*3 sont d’importants déterminants indépendants des variations de la triglycéridémie
chez l’homme dans différentes populations [Pen’01, End’02, Nab’02, Pen’02, Tal’02, Oli’04,
Bau’03]. De plus, ces haplotypes ont été associés aux TG dans divers dyslipidémies comme
l’HTG modérée [Kao 03, Mat’07, Chi’08a] ou sévère [Vra’95, Hor’03, Hen’07, Wan’07b,
Sou’08, Wan’08a, Wan’08b], l’hyperlipémie combinée familiale [Rib’02, Aou’03, Eic’04,
Mar’04, Van’07]. Nous avons également montré, dans notre 3ème article, que les
polymorphismes S19W et -1131T>C étaient associés au risque d’HTG sévère, et le
polymorphisme -1131T>C au risque d’HTG modérée chez les diabétiques de type 2.
En 2005, Talmud a montré que le polymorphisme S19W, présent sur l’haplotype
APOA5*3, réduisait d’environ 50 % la sécrétion de la protéine apoAV dans un modèle
cellulaire de translocation de la protéine à travers le RE [Tal’05]. Toutefois, ces données
expérimentales n’ont pas été confirmées par les mesures de concentrations plasmatiques chez
l’homme : les concentrations d’apoAV étaient augmentées et non pas diminuées chez les
porteurs de l’allèle 19W [Dal’06, Tal’06, Vae’06, Hen’07, Hah’08].
179
Le rôle fonctionnel de l’haplotype APOA5*2 a longtemps été attribué à un déséquilibre de
liaison avec un polymorphisme fonctionnel du gène APOC3 [Tal’02, Oli’04]. Mais, des
travaux récents ont apporté des arguments en faveur d’une fonctionnalité propre de
l’haplotype APOA5*2 : Palmen et al. ont mis en évidence une coopération entre les
polymorphismes composant l’haplotype APOA5*2 qui affecterait l’efficacité de la traduction
des ARNm et/ou leur stabilité, et diminuerait de près de 50% l’activité du gène [Pal’08]. Pour
l’haplotype APOA5*2, les données expérimentales ont été corroborées chez l’homme : les
concentrations plasmatiques d’apoAV étaient significativement plus basses chez les porteurs
de l’allèle rare -1131C que chez les porteurs de l’allèle fréquent -1131T [Ish’05, Dal’06,
Vae’06, Hah’08].
Ainsi, chez les hétérozygotes composites, la présence d’un haplotype variant de type
APOA5*2 ou APOA5*3 pourrait réduire les quantités d’apoAV sauvages fonctionnelles et
ainsi aggraver la déficience en apoAV induite par la mutation. On peut imaginer l’existence
d’un seuil critique d’expression de l’APOA5 en dessous duquel l’activation la LPL
deviendrait insuffisante pour assurer un niveau de lipolyse normal :
-
Chez les hétérozygotes sans HTG majeure, présentant tous un 2ème haplotype
APOA5*1, l’expression de l’APOA5 serait réduite de 50 % par la mutation, et
l’activation de la lipolyse serait normale.
-
Chez les hétérozygotes avec antécédents d’hyperchylomicronémie, tous associés à un
haplotype APOA5*2 ou APOA5*3, l’expression du gène sauvage pourrait être réduite
à environ 25 % de la normale, seuil critique pour assurer un niveau de lipolyse correct.
Le défaut de lipolyse se révèlerait alors au moindre facteur environnemental de
surcroît, ou comme précédemment évoqué avec un déficit lipolytique lié à l’âge, un
syndrome métabolique ou un diabète de type 2.
c. Rôle des autres variants génétiques modulant la triglycéridémie
Variants de l’apoE
D’autres facteurs génétiques pourraient moduler l’expression de la mutation,
notamment les variants de l’apoE. La présence des variants E2 et E4 pourrait favoriser le
développement d’une HTG sévère [Gre’83, Mar’00]. Le variant E2 réduit l’affinité des
180
remnants de VLDL ou de chylomicrons pour les récepteurs à l’apoE [Mah’03]. En diminuant
la capture hépatique des remnants, il aggraverait le défaut de catabolisme lié à l’anomalie de
lipolyse induite par les mutations, et ainsi favoriser l’apparition d’une HTG sévère.
Comme on l’a vu dans la revue de la littérature, plusieurs auteurs ont suggéré une
possible interaction entre les variants de l’apoE, particulièrement E2, et les variants rares des
polymorphismes -1131T>C et S19W dans le développement des HTG modérées [Sch’04] ou
sévères [Eva’03, Hub’05, Oli’08]. Dans une étude récente, Sousa et al. ont suggéré un effet
synergique entre les variants -1131C et E2 et additif entre les variants -1131C et E4, sur le
risque d’HTG sévère (TG>10 mmol/l) [Sou’08].
Dans l’étude sur la mutation Q139X, le variant E2 de l’APOE était associé à la
mutation dans la famille A. Parmi les 2 hétérozygotes Q139X de la famille présentant une
HTG sévère dans la famille B, une portait le variant E4 (Q139X-BIII2), mais pas l’autre
(Q139X-BIII3). De même, dans l’étude sur les mutations Q97X et L242P, excepté dans la
famille Q97X-A, les cas index présentaient tous un variant de l’apoE : les sujets Q97X-B, C,
D étaient soit E2E3, soit E3/E4 et le sujet L242P était E2/E4. En revanche, le génotype APOE
E2 ou E4 n’est pas suffisant pour le développement d’une HTG majeure chez les porteurs de
mutations de l’APOA5, puisque le sujet hétérozygote Q139X-BIII5, qui avait un génotype
E3/E4 mais pas de 2ème haplotype APOA5 variant, n’a pas présenté d’HTG majeure.
Ainsi, le génotype apoE ne suffit pas à la survenue d’une dyslipidémie de type V,
mais l’association des variants rares de l’APOE et de l’APOA5 pourrait coopérer pour
influencer le développement d’une HTG majeure chez les porteurs de la mutation de
l’APOA5.
Polymorphismes de l’APOC3
Le variant S2 du polymorphisme SSt-I de l’APOC3 a été associé à l’HTG dans
différentes populations [Tal’97, Mar’00]. La fonctionnalité de ce polymorphisme n’est pas
établie mais il est en fort déséquilibre de liaison avec les polymorphismes -455T>C et
-483C>T situé dans l’élément de réponse à l’insuline du promoteur de l’APOC3 [Dal’01]. Les
polymorphismes -455T>C et -483C>T altèrent la capacité d’inhibition de l’insuline sur la
transcription de l’apoCIII [Li’95], ce qui provoquerait une augmentation des concentrations
d’apoCIII et donc une diminution de l’activité de la LPL.
181
Dans notre 2ème étude, nous avons retrouvé le variant S2 du polymorphisme Sst-I de
l’APOC3, à l’état hétérozygote, chez un porteur de la mutation Q97X (Q97X-B) et le cas
index L242P, ces deux patients présentant également un variant de l’APOE, avec
respectivement un génotype E2/E3 et E2/E4.
L’association de plusieurs variants génétiques associés à la survenue d’une HTG
sévère, pourrait influencer l’expression du phénotype des patients porteurs de mutations de
l’APOA5, dans sa précocité comme chez le sujet Q97X–B qui a révélé une HTG sévère dans
sa 2ème décade, ou dans l’intensité des poussées ou leur récurrence comme pour le sujet
L242P, dont le phénotype est assez proche de l’homozygote Q97X dans notre étude.
2. Facteurs métaboliques et nutritionnels
Le diabète ou le syndrome métabolique mis en évidence chez les patients porteurs de
la mutation Q139X (Q139X-AII1, BIII2 et BIII3), ou chez le cas index L242P pourraient
favoriser l’apparition d’une HTG sévère. En effet, le diabète s’accompagne d’une
augmentation de la production hépatique des VLDL et d’une diminution de la lipolyse
[Kra’04], et pourrait constituer un facteur de surcroît. Cependant, ces anomalies métaboliques
ne sont pas nécessaires au développement de l’HTG sévère puisque parmi les patients
porteurs de mutations ayant présenté une HTG sévère, les sujets Q139X-AIII2 et CI1
n’étaient pas diabétiques, et la majorité des sujets Q97X (Q97X-AIII1, B, D) avaient une
sensibilité à l’insuline normale et ne présentaient ni syndrome métabolique ni diabète de type
2. De plus, les sujets Q139X-AII1 et Q97X-C sont devenus diabétiques bien après la
découverte de l’hyperchylomicronémie, avec des diabètes de nosologie incertaine, sans
syndrome métabolique.
La présence d’un syndrome métabolique ou d’un diabète pourrait contribuer à la
sévérité du phénotype comme chez le sujet L242P, Q139X-AII1 ou BIII3, mais elle n’est pas
suffisante pour déclencher une HTG sévère chez les porteurs hétérozygotes de mutation : les
sujets Q97X-AII1 et Q139X-BIII5 ne présentaient qu’une HTG modérée et le sujet Q139XBIII4 était normotriglycéridémique.
182
Si les écarts diététiques favorisaient la décompensation chez la majorité des sujets
ayant présenté une HTG sévère, le respect d’un régime strict pauvre en graisses et en sucres
rapides, habituellement efficace dans les dyslipidémies de type V, ne permettait pas toujours
de contrôler le syndrome et ses décompensations, en particulier chez les porteurs de la
mutation Q139X (Q139X-AII1, BIII2, BIII3 et CI1).
Ainsi, contrairement à nos spéculations initiales relatives à la mutation Q139X, la
présence d’un syndrome métabolique ou d’un diabète de type 2 n’est ni suffisante, ni
nécessaire pour déclencher une HTG sévère chez les porteurs d’une mutation de l’APOA5,
mais pourrait participer à l’aggravation du phénotype.
D. Mutation non-sens de l’APOA5 : expression dominante ou récessive ?
A l’état homozygote, bien qu’il existe une variabilité dans l’expression phénotypique,
les mutations non-sens de l’APOA5, Q139X, Q148X et Q97X s’expriment sous forme d’une
dyslipidémie de type V sévère [Mar’05, Pri’05c, Pri’08] (Article 2). En revanche, chez les
hétérozygotes, il existe une pénétrance incomplète dans l’expression de la mutation dans les
familles particulièrement notable pour la mutation Q139X, pour laquelle 3 familles ont pu être
explorées de manière assez complète : dans la famille B seulement 2/6 porteurs de la mutation
ont exprimé une HTG majeure, et 0/3 hétérozygotes dans la famille C [Mar’05]. De même,
pour la mutation Q97X, seul un hétérozygote sur deux a présenté une HTG sévère dans la
famille A (Article 2) et aucun dans l’étude italienne [Pri’08]. Aucun hétérozygote Q148X n’a
présenté de dyslipidémie sévère [Pri’05c]. Au total, la prévalence du phénotype complet
atteint seulement 25 % (7/28) chez les hétérozygotes contre 100 % chez les homozygotes. Il
ne s’agit certainement pas d’un syndrome dominant, mais pas non plus d’un syndrome de
type récessif puisque certains hétérozygotes expriment la maladie. On n’est donc pas en
présence d’une hérédité classique monogénique de type mendélienne classique mais plutôt
devant une hérédité multifactorielle : le phénotype ne se révèle que sous l’influence
d’interactions complexes entre des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques, avec
un rôle original des haplotypes mineurs de l’apoAV portant le second allèle non muté.
183
IV. Complications cliniques des mutations de l’APOA5
A. Pancréatites aiguës
Le risque principal des HTG majeures est la survenue d’une pancréatite aiguë qui peut
s’avérer fatale. Classiquement, le risque de pancréatite aiguë est à craindre dès que les TG
dépassent 10 mmol/l, mais il existe également pour TG plus bas [Ben’96a, Mah’03, Coh’00,
Nie’05]. La prévalence de cette complication n’est pas établie. Les mécanismes de survenue
de la pancréatite associeraient une production excessive de radicaux libres, une altération de
la microcirculation pancréatique et une inflammation du pancréas liée la génération locale
d’AG par les lipases pancréatiques [Mah’03, Nie’05]. Récemment, une équipe chinoise a
montré que des mutations et variants du gène CFTR et du promoteur de TNF (Tumor necrosis
factor), étaient significativement associés au risque de pancréatite aiguë chez les patients avec
HTG [Cha’08a].
Dans les familles étudiées pour les 3 mutations Q97X, Q139X et L242P, parmi les
patients ayant présenté une HTG sévère, seul le patient homozygote Q139X-CI1 a présenté
des épisodes de pancréatites aiguës (soit 1 sur 10). Cette complication pourrait être en rapport
avec la sévérité des anomalies fonctionnelles induite par son statut homozygote. Cependant,
ni notre patient homozygote Q97X (Q97X-D), ni les 2 sujets homozygotes Q148X et Q97X
décrits par Priore Oliva [Pri’05c, Pri’08] n’ont présenté d’épisode de pancréatite aiguë.
Ainsi, la fréquence de survenue d’une pancréatite aiguë s’avère faible dans notre série
de patients porteurs d’une mutation de l’APOA5 (1/17 soit 5.8 %). Sur l’ensemble de notre
cohorte de dyslipidémie de type V, le risque est nettement plus élevé : 62 patients sur 316
(19.6 %) ont présenté un ou plusieurs épisodes de pancréatites aiguës. Cependant, le nombre
restreint d’observations pour les mutations de l’APOA5 ne permet pas de tirer de conclusions
générales à ce stade.
B. Complications cardiovasculaires
L’élévation de TG est considérée comme un facteur de risque cardiovasculaire
indépendant dans certaines études mais encore controversé [Hok’96, Gar’07]. Le bénéfice du
184
traitement d’une HTG modérée sur la morbi-mortalité cardiovasculaire n’est pas clairement
établi. En effet, les études d’intervention thérapeutique avec les fibrates ont révélé un bénéfice
inconstant en particulier en prévention primaire [Kee’05, Gar’07]. Par ailleurs, on ne sait pas
si les HTG majeures augmentent significativement le risque cardiovasculaire [Mah’03,
Nie’05]. Certaines études ont rapporté une athérosclérose précoce périphérique ou coronaire
chez des patients présentant un syndrome familial d’hyperchylomicronémie par déficit
homozygote en lipoprotéine lipase [Ben’96b, Sai’03] mais d’autres pas [Nie’05].
Dans les familles présentant la mutation Q139X de l’APOA5, seul le patient
homozygote (Q139X-CI1) a présenté des complications cardiovasculaires coronaires et
périphériques précoces (avant 50 ans) avec toutefois un tabagisme important. Les patients
hétérozygotes Q139X dyslipidémiques de type V n’ont pas présenté d’évènements
cardiovasculaires, mais ils n’ont pas été explorés systématiquement notamment à la recherche
de lésions asymptomatiques. Toutefois, le sujet Q139X-AII1, pour lequel on dispose d’un
recul de 25 ans et d’explorations complémentaires, présentait un athérome carotidien et
fémoral, en l’absence de tabagisme. En revanche, tous les patients porteurs des mutations
Q97X et L242P, sauf le cas index Q97X-B, ont bénéficié d’un doppler carotidien avec mesure
de l’épaisseur intima-média carotidienne (EIMc) par le même examinateur expérimenté. Tous
présentaient une augmentation de l’EIMc ajusté sur l’âge (Q97X-AII1, AIII1, C, D, L242PEII2) et plusieurs des plaques carotidiennes (Q97X-AII1, AIII1, C). Un seul était fumeur
(Q97X-AIII1). Les deux sujets Q97X-AII1 et C ont également réalisé un ECG d’effort qui
s’est avéré négatif (données non publiées). L’EIMc étant corrélé au risque cardiovasculaire
[Ole’99], on peut penser au le risque cardiovasculaire de ces patients est accru. Mais seul le
suivi à long terme permettra de préciser la survenue ou non d’évènements cardiovasculaires.
Le sur-risque cardiovasculaire de ses patients pourrait être lié aux haplotypes variants
de l’APOA5. Nous avons étudié l’association des polymorphismes -1131T>C et S19W au
risque cardiovasculaire dans un sous groupe de 196 patients diabétiques de type 2 de la
cohorte DIACOR présentée dans l’article 3, suivi pendant 5 ans. 24/196 patients (12.2%) ont
présenté un évènement coronarien majeur (décès d’origine coronarienne, IDM fatal ou non,
angor instable, angor stable) 6/24 (25 %) était classé initialement dans le groupe
normotriglycéridemique (group N) and 15/24 (75 %) dans le groupe modérément
hypertriglycéridémique
(group
M).
La
présence
de
l’allèle
-1131C
allèle
était
significativement associée à une augmentation du risque cardiovasculaire (OR=3.52 [1.299.64], p=0.010). Après ajustement sur les facteurs de risque usuels (âge, sexe, IMC,
tabagisme, HTA LDLc, HDLc), l’association restait inchangée (OR=3.51 [1.13-10.94],
185
p=0.030). En revanche, l’allèle 19W n’était pas associé à la survenue d’un évènement
cardiovasculaire (OR=0.25 [0.03-1.97], p=0.158) (données non publiées). Ces résultats
préliminaires devront être confirmés sur la totalité de la cohorte, mais sont concordants avec
les données de la littérature. Comme on l’a vu précédemment, plusieurs études cas-témoins
ont montré une association significative entre l’allèle -1131C et l’augmentation du risque
coronarien dans des populations d’origines ethniques diverses [Bi’04, Sza’04, Liu’05, Tan’05,
Tan’06, Vae’06] mais pas avec l’allèle 19W sauf dans une étude [Liu’05]. Toutefois, ces
résultats n’ont pas été confirmés dans les précédentes études de cohorte [Won’ 03, Tal’04,
Van’07] sauf une (cohorte de Framingham) : les femmes porteuses de l’allèle rare -1131C
présentaient un risque d’IDM significativement plus élevé par rapport aux porteuses de
l’allèle sauvage (OR=1.85, p=0.04) [Lai’04].
Au total, d’après les données de nos études et de la littérature, les complications de
type pancréatite aiguë ou complications cardiovasculaires s’avèrent rares chez les patients
hyperchylomicronémiques porteurs d’une mutation de l’APOA5. Toutefois, compte tenu du
nombre restreint de patients, d’une courte durée de suivi pour beaucoup, en particulier pour
les enfants homozygotes Q139X et Q97X [Pri’05c, Pri’08], ces constatations ne peuvent être
généralisées et la prudence s’impose.
V. Conséquences en termes de diagnostic et de pronostic
A.
Quelle
stratégie
proposer
pour
le
diagnostic
étiologique
des
hyperchylomicronémies ?
La grande variabilité dans l’expression phénotypique et l’âge de révélation du
syndrome hyperchylomicronémique ne permet pas de dégager des critères cliniques
permettant de cibler le dépistage génétique des mutations de l’APOA5.
Sur le plan biologique, les concentrations plasmatiques d’apoAV sont informatives
seulement chez les homozygotes puisqu’elles sont alors indétectables [Pri’05c, Hen’07,
Pri’08]. En revanche, dans notre étude, chez les hétérozygotes Q139X, les concentrations
plasmatiques d’apoAV étaient extrêmement variables, comme chez les sujets indemnes de la
mutation. Chez un sujet hétérozygote pour la mutation c.161 +3g>c, la concentration
186
d’apoAV était également considérée comme normale [Pri’06]. Les concentrations
plasmatiques d’apoAV ne sont donc pas un paramètre informatif pour détecter un déficit
partiel en apoAV.
De plus, le dosage de l’apoAV n’est pas encore standardisé, avec différents tests ELISA
rapportés dans la littérature, rendant difficile la comparaison des résultats des études. Comme
on l’a vu dans la revue de la littérature, les valeurs normales ne sont pas encore bien définies
et apparaissent très variables dans les populations témoins (Tableau 1).
L’activité LPL post-héparinique ne permet pas non plus un bon screening des patients,
ni homo, ni hétérozygotes. Une activité LPL normale n’exclut pas la présence d’une mutation
de l’APOA5, en particulier si elle a été réalisée en dehors d’une poussée d’HTG sévère,
comme montré chez l’homozygote Q97X italien [Pri’08] ou chez le sujet hétérozygote L242P
(Article 2). Si elle est diminuée, l’activité LPL ne permet pas non plus de préjuger d’une
mutation de la LPL plutôt que de l’APOA5, puisque les porteurs homozygotes de la mutation
Q97X ou Q139X dans nos études avaient des valeurs d’activité LPL comparables à des sujets
porteurs de mutations faux-sens de la LPL. Par ailleurs, le dosage de l’activité LPL posthéparinique est difficile, nécessitant une conservation drastique des échantillons et l’inhibition
des autres activités lipasiques. Comme pour l’apoAV, la variabilité des dosages entre les
laboratoires rend les comparaisons de résultats difficiles.
Ainsi, il n’y a pas de critères cliniques ou biologiques simples permettant de suspecter
la présence d’une mutation de l’APOA5. On conseille donc la recherche génétique
systématique d’une mutation de l’APOA5 chez les sujets ayant présenté une HTG majeure,
d’autant que Dorfmeister a montré récemment qu’une mutation hétérozygote de l’APOA5
peut s’associer à une mutation faux-sens de la LPL [Dor’08].
B. Quel pronostic clinique pour les sujets porteurs de mutations de l’APOA5 ?
L’identification de la mutation et des facteurs qui conditionnent l’expression d’une
dyslipidémie de type V chez les hétérozygotes peut avoir des conséquences cliniques. Les
hétérozygotes composites avec un haplotype variant APOA5*2 ou APOA5*3 (et les
homozygotes) sont à haut risque de développer une dyslipidémie de type V à l’âge adulte.
Une prise en charge médicale avec une surveillance biologique régulière doit leur être
proposée. En revanche, chez les hétérozygotes avec un 2ème haplotype APOA5*1, nos
187
observations chez les sujets de plus de 50 ans sont plutôt rassurantes et suggèrent pour les
sujets jeunes un risque ultérieur faible de développer une dyslipidémie de type V. La
surveillance pourra être espacée. Toutefois, une certaine prudence s’imposera en présence de
pathologie intercurrente comme un diabète de type 2 et du fait d’un recul limité pour certains
patients.
Le dépistage présentera un intérêt chez les femmes hétérozygotes composites (ou
homozygotes) qui présenteront un risque plus élevé d’HTG sévère sous contraception orale
oestroprogestative et probablement un risque d’hyperchylomicronémie gestationnelle comme
décrit chez les patientes porteuses de mutations de la LPL [Mur’98, Als’02]. Dans nos études,
l’hyperchylomicronémie du cas index Q97X-B a été détectée sous oestroprogestatif (Article
2). Il apparaît licite de contre-indiquer une contraception oestroprogestative en cas
d’antécédents d’HTG majeure. En l’absence de dyslipidémie sévère constatée, on pourra
introduire un oestroprogestatif sous surveillance étroite du bilan lipidique chez ces patientes.
De même une surveillance systématique du bilan lipidique sera à prévoir en cas de grossesse.
Par ailleurs, le risque de transmission du syndrome sévère à la descendance paraît
faible. En effet, les hétérozygotes présentant une dyslipidémie de type V ont 1 chance sur 2 de
transmettre la mutation, et les homozygotes la transmettent obligatoirement. Mais nos
résultats et ceux de Priore Oliva [Pri’05c, Pri’08] suggèrent que la mutation transmise à l’état
hétérozygote ne s’exprimera sévèrement que si le second parent transmet un haplotype rare de
l’APOA5, dont la fréquence allélique est inférieure à 10 % chez les caucasiens [Pen’01,
Pen’02, Tal’02, Oli’04].
VI. Apports des mutations Q139X et Q97X dans la connaissance du rôle
physiologique de l’apoAV
Les hypothèses concernant les mécanismes d’action physiologique de l’apoAV
reposaient dans la littérature jusqu’en 2005 sur des modèles expérimentaux in vitro ou in
vivo, cellulaires ou murins. La description de familles portant des mutations de l’APOA5 a
fourni pour la première fois un modèle clinique permettant de valider ces hypothèses chez
l’homme. La mutation Q139X a été l’une des 2 premières mutations de l’APOA5 décrite dans
la littérature, impliquée dans une pathologie lipidique familiale chez l’homme, avec la
188
mutation Q148X publiée chez un seul cas peu avant en 2005 [Pri’05c]. Notre étude sur la
mutation Q139X a apporté les premières études fonctionnelles mettant clairement en évidence
le défaut de lipolyse induit par une mutation de l’APOA5 et établissant le lien fonctionnel
entre apoAV et LPL chez l’homme. La mutation Q97X a été publiée pour la première fois
dans une famille italienne en 2008, mais sans donnée fonctionnelle ni preuve de défaut de
lipolyse chez le cas index [Pri’08].
Les arguments de la littérature sont discordants quand à l’existence d’un rôle intrahépatique de l’apoAV sur la sécrétion ou l’assemblage des LRTG, et d’un possible rôle sur la
capture des LRTG et de leurs remnants par les récepteurs hépatiques. Récemment,
Dorfmeister et al. ont montré in vitro que les protéines recombinantes apoAV-139X et
apoAV-148X ne se liaient pas aux récepteurs de type LDL-R ou LRP [Dor’08]. L’étude
cinétique de l’apoB100 in vivo chez les porteurs de la mutation Q139X ne confirme pas
l’hypothèse d’un rôle intra-hépatique de l’apoAV ni d’un rôle sur la capture hépatique des
remnants (Article 1) [Mar’05].
Outre la preuve in vivo chez l’homme d’un lien fonctionnel entre apoAV et LPL, notre
travail soulève une nouvelle hypothèse quand au mode d’action de l’apoAV, non repérée lors
des études expérimentales in vitro et chez les animaux transgéniques : l’apoAV régulerait la
lipolyse des LRTG par la LPL en modulant son expression ou son adressage sur les HSPG à
la surface endothéliale (Figure 26). Notre modèle n’est pas en contradiction avec le modèle de
stimulation de l’activité LPL par l’apoAV en favorisant les interactions entre les lipoprotéines
et le complexe LPL-HSPG [Loo’05, Mer’05]. Les faibles concentrations circulantes d’apoAV
sont cependant plus en faveur d’un rôle indirect de l’apoAV que d’une activation allostérique
de la LPL.
VII. Perspectives
L’émergence de nouveaux gènes candidats, en particulier GPIHBP1, pourrait
permettre d’améliorer la connaissance des mécanismes impliqués dans la lipolyse
intravasculaire des LRTG. Ce nouveau gène parait en effet jouer un rôle majeur dans « la
plateforme lipolytique endothéliale » des chylomicrons selon des travaux récents [Bei’07]. En
189
effet, les souris déficientes pour le gène gpihbp1 (gpihbp1 -/-) présentent une HTG majeure
avec un déficit de catabolisme des chylomicrons et une activité LPL effondrée [Bei’07].
Gpihbp1 est fortement exprimée chez la souris notamment dans le tissu adipeux, à la face
luminale des capillaires endothéliaux où elle est ancrée dans la membrane cellulaire [Iok’03,
Bei’07]. GPIHBP1 peut lier la LPL, les chylomicrons et l’apoAV [Bei’07]. Une mutation
homozygote
de
GPIHBP1
a
été
identifiée
chez
un
patient
présentant
une
hyperchylomicronémie réfractaire avec pancréatites aiguës récidivantes depuis l’âge de 22 ans
et a également été retrouvée chez son frère aîné de 52 ans avec la même présentation
phénotypique [Wan’07a]. Les capacités de liaison de GPIHBP1 à l’apoAV nous font émettre
l’hypothèse que l’interaction entre ces 2 protéines pourrait moduler la formation des
complexes lipolytiques et/ou l’activité de la LPL.
Dans le cadre d’un poste d’accueil INSERM, nous allons poursuivre l’étude des
mécanismes physiopathologiques impliqués dans les hyperchylomicronémies. Nos travaux
auront plusieurs objectifs :
1. Préciser le profil d’expression tissulaire, en particulier endothéliale, de l’APOA5 et de
GPIHBP1 chez l’homme,
2. Etudier l’impact des formes sauvages et mutées de l’APOA5 et de GPIHBP1 sur la
lipolyse des LRTG dans des modèles in vitro et cellulaires.
3. Etudier les interactions potentielles entre l’APOA5 et GPIHBPI au niveau de l’activité de
la LPL, de l’expression de GPIHBP1 et de la fixation de la LPL à la surface endothéliale.
Nous poursuivrons également le séquençage des gènes candidats, anciens et nouveaux, et
la caractérisation phénotypique détaillée des familles porteuses de mutation non encore
explorées et des nouvelles mutations qui seront identifiées. Les anomalies phénotypiques
pourront ainsi être confrontées aux mécanismes physiopathologiques identifiés et de
nouvelles études pourront être réalisées chez ces patients et à partir des échantillons collectés,
en fonction de l’avancée des connaissances.
190
VIII. Conclusions
L’apolipoprotéine AV (apoAV), nouvel acteur du métabolisme des triglycérides, est
un déterminant important de la triglycéridémie chez l’homme. Nous avons étudié l’APOA5
comme
gène
candidat
pour
identifier
les
mécanismes
responsables
des
hyperchylomicronémies, encore largement méconnus et avons pu identifier une prédisposition
génétique liée à l’APOA5 dans près de 5 % des cas, dans une cohorte de 316 patients
hyperchylomicronémiques.
L’étude de plusieurs familles porteuses des mutations nous a permis de confirmer le
lien fonctionnel entre apoAV et LPL établi jusque là in vitro ou vivo dans des modèles
animaux transgéniques. Nous avons confirmé le rôle clé de l’apoAV dans la lipolyse
intravasculaire des LRTG, mais pas sur la synthèse hépatique des LRTG ou leur recapture
hépatique. Les mécanismes intimes par lesquels l’apoAV interagit avec la LPL ne sont encore
pas précisément établis mais nos études, conjuguées aux données de la littérature, nous
conduisent à proposer un nouveau modèle d’interaction entre apoAV, LPL et HSPG :
l’apoAV régulerait la lipolyse des LRTG en agissant au niveau de l’expression ou de
l’adressage de la LPL sur les HSPG à la surface de l’endothélium vasculaire.
L’étude des 3 mutations de l’APOA5, Q139X, Q97X, L242P, nous a également permis
de mettre en évidence une grande variabilité dans l’expression phénotypique des mutations en
particulier chez les porteurs hétérozygotes, témoignant d’une maladie génétique
multifactorielle. Nous avons montré le rôle original et fondamental dans l’expression des
mutations de l’hétérozygotie composite avec un 2ème haplotype variant de l’APOA5
(APOA5*2 ou APOA5*3) ou de la présence d’autres facteurs génétiques impliqués dans le
métabolisme des TG comme les variants de l’apoE, ainsi que dans une moindre mesure
l’influence de l’environnement métabolique. Nous avons par ailleurs, confirmé l’importance
des haplotypes variants de l’APOA5 dans la survenue des HTG sévères en montrant pour la
première fois l’association des haplotypes variants de l’APOA5 avec la survenue d’une HTG
majeure chez les diabétiques de type 2.
L’étude de nouveaux gènes candidats et des partenaires potentiels de l’apoAV comme
GPIHPB1 permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques du
métabolisme des LRTG. Ces travaux correspondent à des besoins cliniques au niveau
191
diagnostique mais également thérapeutique. En effet, le traitement des HTG majeures est
actuellement décevant aussi bien à la phase aiguë que chronique. L’apoAV pourrait constituer
dans le futur une cible thérapeutique : sa régulation par des récepteurs nucléaires dont
PPARα, cible des fibrates, pourrait permettre le développement d’agonistes sélectifs pour le
traitement des HTG. A l’heure où des essais de thérapie génique sont en cours avec la LPL
aux Pays-Bas [Nie’05], la caractérisation de ses nouveaux partenaires parait indispensable et
permettra peut-être de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans les HTG majeures, et
également dans les HTG modérées, beaucoup plus fréquentes et possiblement athérogènes
[Hok’96].
Notre travail a permis d’accroître la proportion d’anomalies génétiques majeures
identifiées comme responsables des hyperchylomicronémies. Cependant, il faut reconnaître
que, dans l’absolu, les mécanismes génétiques sous jacents demeurent encore majoritairement
méconnus et qu’il existe encore un champ d’investigation très important autour de cette
problématique.
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208
ANNEXE
Soumission de l’article 2
ATVB/2008/179267 Acknowledgment of Manuscript
De : [email protected]
Date : Vendredi, 17 Octobre 2008, 23:21
A : Sybil Charriere <[email protected]>
MS ID#: ATVB/2008/179267
MS TITLE: Modulation of phenotypic expression of APOA5 Q97X and L242P mutations
by genetic and metabolic factors
Doctor Sybil Charriere
Hopital Louis Pradel
Fédération d'endocrinologie
28 avenue Doyen Lépine
BRON CEDEX 69677
France
00 33-(0)4 72 68 13 01
Dear Dr. Charriere,
This note confirms receipt of your manuscript, submitted to Arteriosclerosis,
Thrombosis, and Vascular Biology.
Your manuscript is in the review process. We will inform you of the initial
decision as soon as possible. In future correspondence, please refer to the
manuscript number noted above.
Your decision will be sent to you by email. We will use the email address on
the cover page of your manuscript, unless you indicate otherwise. If you do not
want the decision sent to you by email, please let us know.
Thank you for sending your manuscript to us.
ATVB Editorial Office
209
FOLIO ADMINISTRATIF
THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES
DE LYON
NOM : CHARRIERE
(avec précision du nom de jeune fille, le cas échéant)
DATE de SOUTENANCE : 05/02/2009
Prénoms : Sybil
TITRE : Implication de l’apolipoprotéine AV dans le déterminisme des hyperchylomicronémies
NATURE : Doctorat
Numéro d'ordre : 09 ISAL
Ecole doctorale : EDISS
Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19
/
et
bis
CLASSE :
RESUME :
Le gène de l’apolipoprotéine (apo) AV, est un nouveau gène candidat pour étudier les mécanismes
des hyperchylomicronémies, largement méconnus. Nous avons identifié, dans une cohorte de 286 patients ayant
présenté une hyperchylomicronémie, indemnes de mutation de la LPL ou de l’apoCII, 3 mutations de l’APOA5 :
Q139X et Q97X, et L242P. Nous présentons, à travers 2 études, la description phénotypique et génotypique des
cas index et de leurs familles ainsi que la caractérisation fonctionnelle des mutations. Les mutations Q97X et
Q139 ont été clairement impliquées à l’hyperchylomicronémie, et associée à un défaut de lipolyse
intravasculaire. L’expression phénotypique des mutations était très variable, influencée par des co-facteurs
génétiques et plus faiblement par l’environnement métabolique. Par ailleurs, nous avons dans une 3ème étude
montré l’association des haplotypes variants de l’APOA5 et la survenue d’une hypertriglycéridémie modérée ou
d’une hyperchylomicronémie dans une cohorte de patients diabétiques de type 2.
Nos travaux on permis de confirmer pour la première fois chez l’homme le lien fonctionnel entre
l’apoAV et la lipoprotéine lipase (LPL). Nous proposons un nouveau modèle d’interaction entre ces deux
protéines : l’apoAV régulerait la lipolyse intravasculaire par la LPL en agissant sur son expression à la surface
de l’endothélium vasculaire.
MOTS-CLES : apolipoprotéine AV, dyslipidémie de type V, hyperchylomicronémie, hypertriglycéridemie,
lipolyse, génétique, mutation.
Laboratoire (s) de recherche : Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabète. INSERM U870 (Equipe 2).
11 avenue Jean Capelle. 69100 VILLEURBANNE
Directeur de thèse: Pr Philippe MOULIN
Président de jury : Pr Michel LAGARDE
Composition du jury : Dr Pascale BENLIAN, Mr Xavier COLLET, Pr Alexandre FREDENRICH, Pr Michel
LAGARDE, Pr Philippe MOULIN,
210
RESUME en français
Le gène de l’apolipoprotéine (apo) AV, est un nouveau gène candidat pour étudier les
mécanismes des hyperchylomicronémies, largement méconnus. Nous avons identifié, dans
une cohorte de 286 patients ayant présenté une hyperchylomicronémie, indemnes de mutation
sur la lipoprotéine lipase (LPL) ou l’apoCII, 3 mutations de l’APOA5 : Q139X et Q97X, et
L242P. Nous présentons, à travers 2 études, la description phénotypique et génotypique des
cas index et de leurs familles ainsi que la caractérisation fonctionnelle des mutations. Les
mutations Q97X et Q139X ont été clairement impliquées dans l’hyperchylomicronémie à
l’état homo ou hétéroygote, et associée à un défaut de lipolyse intravasculaire. L’expression
phénotypique des mutations chez les hétérozygotes était très variable, influencée par des cofacteurs génétiques, en particulier les haplotypes variants de l’APOA5, et plus faiblement par
l’environnement métabolique. Par ailleurs, nous avons montré, dans une 3ème étude,
l’association des haplotypes variants de l’APOA5 et la survenue d’une hypertriglycéridémie
modérée ou sévère dans une cohorte de patients diabétiques de type 2. Nos travaux ont permis
de confirmer pour la première fois chez l’homme le lien fonctionnel entre l’apoAV et la
lipoprotéine lipase (LPL). Nous proposons un nouveau modèle d’interaction entre ces deux
protéines : l’apoAV régulerait la lipolyse intravasculaire par la LPL en agissant sur son
expression à la surface de l’endothélium vasculaire.
TITRE et RESUME en anglais
Role of apolipoprotein AV in the determinism of hyperchylomicronemia
The apolipoprotein (apo) AV gene is a new candidate for the study of the mechanisms
involved in hyperchylomicronemia, largely unknown. We identified, in a cohort of 286
patients with hyperchylomicronemia, free of LPL or apoCII mutations, 3 APOA5 mutations:
Q139X, Q97X and L242P. We present two studies dealing with phenotypic and genotypic
description of probands and their families with functional data for these 3 mutations. We
clearly involved Q139X and Q97X mutations in hyperchylomicronemia at homozygous or
heterozygous state, associated with a lipolysis defect. The phenotypic expression of APOA5
mutations in heterozygotes was highly variable, influenced by genetic associated factors,
mostly APOA5 variant haplotypes, and at a lesser extends by metabolic environment. In a
third study, we show the association of APOA5 variant haplotypes with both moderate and
severe hypertriglyceridemia in a cohort of type 2 diabetic patients. Our studies confirmed the
functional link between apoAV and lipoprotein lipase (LPL) in human and led us to propose a
new model of interaction between these two proteins: apoAV would modulate intravascular
lipolysis by regulating LPL expression at the surface of vascular endothelium.
MOTS-CLES en français
Apolipoprotéine AV, dyslipidémie de type V,
hypertriglycéridemie, lipolyse, génétique, mutation.
génétique,
MOTS-CLES en anglais
Apolipoprotein AV, genetic, hyperchylomicronemia,
mutation, type V hyperlipidemia.
hyperchylomicronémie,
hypertriglyceridemia,
lipolysis,
INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE DE RATTACHEMENT
Laboratoire : Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabète. INSERM U870 (Equipe 2).
11 avenue Jean Capelle. 69100 VILLEURBANNE.

Implication de l`apolipoprotéine AV dans le déterminisme des

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