Circulating Fragments of N-Terminal Pro–B

Circulating Fragments of N-Terminal Pro–BType Natriuretic Peptides in Plasma of Heart
Failure Patients
Fragments circulant de pro-peptide
natriurétique de type B dans le plasma de
patients souffrant d’insuffisance cardiaque
Jared Yong Yang Foo1,†, Yunxia Wan1,†, Benjamin L. Schulz2,†, Karam Kostner3,4, John
Atherton3,5, Justin Cooper-White1,6, Goce Dimeski3,7 et Chamindie Punyadeera1,6,8,*
Affiliations des auteurs
1
L’institut australien de bioingénierie et de nanotechnologie,
Faculté de chimie et de bioscience moléculaire, et
3
Faculté de médecine, Université du Queensland, Brisbane, Queensland, Australie ;
4
Département de cardiologie, Hôpital Mater pour adultes, Brisbane, Queensland, Australie
;
5
Département de cardiologie, Hôpital Royal Brisbane pour femmes, Brisbane, Queensland,
Australie ;
6
Faculté d’ingénierie chimique, Université du Queensland, Brisbane, Queensland,
Australie ;
7
Pathologie chimique, Hôpital Princesse Alexandra, Brisbane, Queensland, Australie ;
8
affiliation actuelle : Groupe Saliva Translational Research, Université du Queensland
Institut Diamantina, Woolloongabba, Australie.
2
* Adresse de correspondance de cet auteur : Saliva Translational Research Group, The
University of Queensland Diamantina Institute, Level 6, TRI | 37 Kent St. |, Woolloongabba,
QLD 4102, Australie. Fax +61-(0)7-3443-6966; e-mail [email protected].
Résumé
CONTEXTE : L'utilisation de dosages de pro-peptides natriurétiques de type B N-terminaux
(NT-proBNP) non standardisé peut contribuer à une erreur de diagnostic de l'insuffisance
cardiaque (IC). En outre, il faut encore établir un consensus commun en ce qui concerne les
formes circulantes de NT-proBNP à utiliser dans les dosages actuels. Nous avons cherché à
caractériser et quantifier les différentes formes de NT-proBNP dans la circulation de patients
souffrant d’IC.
MÉTHODES : Des échantillons de plasma ont été prélevés auprès de patients souffrant d'IC (n
= 20) au repos et stockés à -80 °C. Le NT-proBNP a été enrichi à partir du plasma des patients
souffrant d’IC par immunoprécipitation suivie d'une analyse par spectrométrie de masse. Des
dosages immunologiques AlphaLISA® homogènes sandwich personnalisés ont été élaborés et
validés pour quantifier 6 fragments de NT-proBNP.
RÉSULTATS : La spectrométrie de masse a identifié la présence de plusieurs formes
transformées de manières N- et C-terminales de NT-proBNP circulant, avec une protéolyse
physiologique entre Pro2-leu3, leu3-Gly4, Pro6-Gly7 et Pro75-Arg76. En conformité avec ce
résultat, les dosages immunologiques AlphaLISA ont montré que des anticorps ciblant les
extrémités N- ou C-terminales donnaient une faible concentration apparente de NT-proBNP
circulant. La concentration apparente de NT-proBNP circulant a été augmentée avec des
anticorps ciblant les épitopes non glycosylés et non terminaux (P <0,05).
CONCLUSIONS : Dans le plasma prélevé auprès de patients souffrant d’IC, le NT-proBNP
immunoréactif était présent sous forme de plusieurs fragments tronqués de manière N- et Cterminale de la molécule de NT-proBNP pleine longueur. L'immunodétection de NT-proBNP a
été significativement améliorée grâce à l'utilisation d'anticorps qui ne ciblent pas ces régions
terminales. Ces résultats soutiennent le développement d'une nouvelle génération de dosages de
NT-proBNP ciblant les épitopes non terminaux et permettant également d’éviter la région
glycosylée centrale de cette molécule.
L'insuffisance cardiaque (IC)9 est un problème de santé mondial, associé à de mauvais pronostics
cliniques et un fardeau économique important pour les systèmes de santé à travers le monde (1).
Environ 23 millions de personnes dans le monde vivent avec une IC, et ce nombre est susceptible
d'augmenter dans un avenir proche en raison d'une population vieillissante et croissante (2). La
mesure du peptide natriurétique de type B (BNP) dans le plasma ou du proBNP N-terminal (NTproBNP) a permis une amélioration de la précision du diagnostic chez les patients chez lesquels
une IC est suspectée (3–5). Cependant, l'utilité de ces peptides pour l’IC est limitée par des
variations importantes d’un patient à l’autre, la présence de diverses formes du peptide NTproBNP dans le sang (3), et de grandes différences d'imprécision entre les méthodes de détection
utilisées. Ce dernier point devient particulièrement pertinent lorsque les patients ont accès à
différents laboratoires qui utilisent différentes plateformes de diagnostic (4, 5). En outre, il n'y a
pas non plus de consensus sur les fragments circulants de NT-proBNP dérivés du proBNP
précurseur sécrété dans le tissu cardiaque au cours d’une IC. Cette absence de consensus est
davantage compliquée par des signes croissants que les dosages immunologiques actuels de NTproBNP peuvent détecter le proBNP dans le sang des patients souffrant d’IC, qui est causé par
une insuffisance de transformation du proBNP précurseur par la furine et la corine protéase
convertase présentes dans la circulation (6–8).
Pour évaluer les différences de performance analytique et les résultats cliniques des dosages
immunologiques de BNP et de NT-proBNP, un programme de test d'aptitude, appelé l'étude
CardioOrmoCheck, a été réalisé par Clerico et al. pour déterminer l'imprécision de mesure
(8,7 %) des concentrations de NT-proBNP en utilisant 3 dosages immunologiques actuels de NT-
proBNP qui utilisent des anticorps et des normes provenant de Roche Diagnostics (9). Il ressort
également de l'étude CardioOrmoCheck que la plupart des laboratoires italiens utilisaient NTproBNP à la place de BNP. Les dosages de NT-proBNP de Roche utilisent différents anticorps
(polyclonaux et monoclonaux) ciblant différents épitopes de NT-proBNP (10).
Ala-Kopsala et al. ont démontré qu'il existe des variantes (troncatures à la fois aux extrémités
amino et carboxyle) de NT-proBNP circulant dans le plasma prélevé auprès de patients souffrant
d’IC (11), donnant lieu à plusieurs molécules de NT-proBNP immunoréactives plus petites que
le fragment de pleine longueur de 76 acides aminés. Cependant, cette étude n'a pas porté sur la
quantification et l'identification des formes de NT-proBNP circulant chez les patients souffrant
d’IC. La quantification et le fait de parvenir à un consensus sur les principales formes
moléculaires de NT-proBNP en circulation sont susceptibles de conduire à une amélioration de
la précision du dosage de NT-proBNP pour le diagnostic et la prise en charge des patients
souffrant d'IC.
Les objectifs de cette étude étaient d'identifier et de quantifier la principale forme de NT-proBNP
circulant dans le plasma prélevé chez des patients souffrant d’IC, des informations qui peuvent
être utilisées pour aider au développement de tests de diagnostic de nouvelle génération.
Matériel et méthodes
PARTICIPANTS ET PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS
Cette recherche a été approuvée par le conseil institutionnel d’éthique médicale de l'Université
du Queensland et le Conseil d'examen d’éthique médicale de l’hôpital Mater. Tous les
participants avaient plus de 18 ans et ont donné leur consentement éclairé par écrit avant de
donner des échantillons pour notre étude. Nous avons recruté des patients souffrant
d’insuffisance cardiaque symptomatique [n = 20 ; classe fonctionnelle 3 selon la New York
Heart Association (NYHA)] avec une fraction d'éjection ventriculaire gauche < 40 % provenant
d'un service de cardiologie générale. Le diagnostic d’IC a été confirmé par le cardiologue de
l'hôpital Mater pour adultes selon les lignes directrices pour la prévention, la détection et la prise
en charge de l’insuffisance cardiaque chronique en Australie (12). On a demandé à tous les
participants de l'étude de s'abstenir d'exercice 24 h avant le prélèvement des échantillons. Les
participants étaient originaires d'Europe, d'Afrique et d’Asie et ne présentaient pas de symptômes
de fièvre et/ou d’infection des voies respiratoires. Les échantillons de sang ont été prélevés dans
des tubes d’EDTA (Greiner Vacuette® ; Greiner BioOne) afin de minimiser la dégradation in
vitro de NT-proBNP et immédiatement centrifugés à 500 g à 4 °C pendant 10 min. Les
échantillons ont été divisés en aliquotes et conservés à -80 °C.
CARACTÉRISATION PAR PURIFICATION ET SPECTROMÉTRIE DE
MASSE DE NT-proBNP ENDOGÈNE
Afin d’identifier les principaux produits protéolytiques de NT-proBNP dans la circulation, on a
utilisé du plasma provenant de patients souffrant d’IC (n = 4) pour les réactions
d'immunoprécipitation (IP). En résumé, l'anticorps monoclonal de NT-proBNP (ciblant 13 à 20
acides aminés) a été couplé chimiquement à Dynabeads® M-270 Epoxy (Invitrogen) en utilisant
la
chimie
d’EDS-NHS
[1-éthyl-3-(3-diméthylamino-propyl)-carboimide
et
Nhydroxysuccinimide] conformément aux instructions du fabricant.
Le NT-proBNP plasmatique enrichi a été digéré avec de la trypsine dans 50 mmol/l de Tris-HCl
pH 7,5 avec 10 mmol/l de dithiothréitol à 37 °C pendant 16 h, dessalé en utilisant une colonne
C18 ZipTips (Millipore), et analysé par chromatographie liquide (CL)-ionisation par
électropulvérisation-spectrométrie de masse en tandem (SM/SM) en utilisant un système
Proeminence nanoLC (Shimadzu) sur un spectromètre de masse TripleTof 5600 avec une
interface Nanospray III (AB SCIEX), comme décrit précédemment (13). Environ 2 µg de peptide
ont été dessalinisés sur une trappe Agilent C18 (taille de pores de 300 Å, taille des particules de
5 µm, d.i. de 0,3 mm x 5 mm) à un débit de 30 µl/min pendant 3 minutes, puis séparés sur une
colonne HPLC C18 en phase inverse Vydac Everest (taille des pores de 300 Å, taille des
particules de 5 µm, d.i. de 150 µm x 150 mm) à un débit de 1 µl/min. Les peptides ont été
séparés avec un gradient de 10 % à 60 % de tampon B (80 % d'acétonitrile avec de l'acide
formique à 0,1 %) pendant 45 min, avec un tampon A (1 % d'acétonitrile et de l'acide formique à
0,1 %) et un tampon B. Les réglages de tension et de gaz ont été ajustés selon les besoins. Un
scanner MS-TOF à partir d'un m/z de 350 à 1800 a été effectué pendant 0,5 s suivi par une
acquisition dépendante des informations de SM/SM avec une sélection par électrophorèse
capillaire automatisée des 20 meilleurs peptides de m/z de 40 à 1800 pendant 0,05 s par spectre.
Les protéines ont été identifiées en utilisant le logiciel ProteinPilot (AB SCIEX), recherchant la
base
de
données
LudwigNR
(à
télécharger
depuis
http://www.wehi.edu.au/faculty/advanced_research_technologies/proteomics/wehi_systems_biol
ogy_mascot_server mis à jour le 27 janvier 2012; 16 818 973 séquences; 5 891 363 821 résidus)
avec les paramètres standard suivants : type d'échantillon, identification ; alkylation de cystéine,
aucune ; instrument, TripleTOF 5600 ; espèces, aucune restriction ; focus d’ID, modifications
biologiques ; enzyme, trypsine ; effort de recherche, ID approfondie. L’analyse du taux de faux à
l'aide de ProteinPilot a été réalisée sur toutes les recherches. Les peptides identifiés avec > 99 %
de confiance et avec un taux de faux local < 1 % ont été inclus pour une analyse plus
approfondie, et les spectres de fragmentation par MS/MS ont été inspectés manuellement. Des
chromatogrammes d'ions extraits ont été obtenus à l'aide de Peakview 1,1.
DOSAGES IMMUNOLOGIQUES AlphaLISA de NT-proBNP
Nous avons mesuré l’immunoréactivité de NT-proBNP grâce à 6 dosages immunologiques
AlphaLISA avec différentes spécificités d’épitopes (Figure 1A). Tous les anticorps étaient
d’origine monoclonale et ont été achetés auprès de Hy Test (http://www.hytest.fi) à l’exception
de 11D1, qui provenait de My Biosource (MBS311067; http://www.mybiosource.com). Ces
anticorps monoclonaux ont été testés et validés pour leur spécificité par les fabricants et ont
également été utilisés avec succès pour étudier l'immunodétection de NT-proBNP glycosylé
circulant dans le sang humain (14). En outre, ces anticorps monoclonaux ont été testés de
manière intensive pour leur spécificité par Hy Test et My Biosource dans des dosages sandwich
en tant qu’anticorps de capture et de détection pour une utilisation avec des échantillons de
sérum/plasma de patients souffrant d'IC ainsi que pour les analytes NT-proBNP et proBNP non
glycosylés exprimés par recombinaison.
Figue 1. Diagramme schématique illustrant les sites de liaison des anticorps sur les 6 fragments
de NT-proBNP glycosylé et couverture peptidique par SM de NT-proBNP enrichi par
immunoprécipitation à partir de plasma.
(A) Les 6 dosages immunologiques utilisent des anticorps monoclonaux de qualité de diagnostic
pour détecter NT-proBNP1-20, NT-proBNP13-45, NT-proBNP1-45, NT-proBNP28-76, NT-proBNP1376 et NT-proBNP1-76. Les sites protéolytiques N- et C-terminaux détectés par notre analyse par
SM sont représentés avec des lignes verticales rouges. *, paire d’anticorps qui a donné la
concentration de NT-proBNP apparente la plus élevée. (B) Les séquences correspondant aux
peptides identifiés avec une confiance > 99 % sont en gras. Les sites de clivage non tryptiques
sont représentés par des lignes verticales rouges (voir Tableau 2).
Les 6 dosages immunologiques de NT-proBNP sont nommés d'après le premier acide aminé
auquel l'anticorps de capture se lie à sur la molécule de NT-proBNP et le dernier acide aminé
auquel l'anticorps de détection se lie à sur la molécule de NT-proBNP de 1 à 76 acides aminés :
NT-proBNP1-20 (5B61-12 et 13G1213-20) ; NT-proBNP13-45 (18H513-20 et 11D128-45) ; NT-proBNP145 (5B61-12 et 11D128-45) ; NT-proBNP28-76 (11D128-45 et 28F867-76) ; NT-proBNP13-76 (18H513-20 et
28F867-76) ; NT-proBNP1-76 (5B61-12 et 28F867-76). Chaque dosage AlphaLISA de NT-proBNP a
été préparé en utilisant une paire d'anticorps monoclonaux, un anticorps étant biotinylé et se liant
à des billes de donneur revêtues de streptavidine (5B6, 11D1, ou 18H5) et le second anticorps
étant conjugué à des billes d'accepteur (11D1, 13G12, ou 28F8) (15) (16-19). L'analyte NTproBNP a été acheté auprès de PerkinElmer. Les témoins de NT-proBNP sont préparés en
utilisant un pool de plasma collecté auprès de volontaires sains (n = 10) et mélangé avec le
tampon de dosage immunologique High Block selon un rapport de 50 %:50 %. Cela nous a
permis de surmonter les effets de matrice que l'on observe couramment lors de l'élaboration de
dosages immunologiques dans le plasma.
BIOTINYLATION D’ANTICORPS MONOCLONAUX DE NT-proBNP POUR
DES DOSAGES IMMUNOLOGIQUES
De la N-hydroxysuccinimido-ChromaLink-biotine (2 g/l) (9007–105K, Solulink) a été ajoutée
aux anti-NT-proBNP respectifs selon un rapport molaire de 30:1 et incubée pendant 2 h à
température ambiante. Des colonnes de dessalement Zeba Spin (89882 ; Thermo Scientific
Pierce) ont été utilisées pour éliminer la biotine non liée et purifier l’anticorps de NT-proBNP
biotinylé après l’incubation. L’anticorps de NT-proBNP biotinylé a été stocké à 4 °C.
COUPLAGE D’ANTICORPS DE NT-proBNP A DES BILLES D’ACCEPTEUR
AlphaLISA
Une solution de tampon de phosphate (250 µl) a été ajoutée à 50 µl de billes d’accepteur
AlphaLISA (6772003 ; PerkinElmer) et centrifugée à 16 000 g pendant 15 min, et le surnageant
a été éliminé. À la pastille de billes d’accepteur, on a ajouté 0,1 mg d'anticorps de NT-proBNP,
1,25 µl de Tween-20 à 10 %, 25 µg de NaBH3CN, et du PBS (0,13 mol/l, pH 7,4, Gibco® ; Life
Technologies) pour préparer un volume réactionnel final de 200 µl, qui a été incubé pendant 24 h
à 37 °C. Ceci a été suivi par l'ajout de 10 µl de carboxy-méthoxylamine à la réaction, et une
incubation de 1 h à 37 °C. L'anticorps monoclonal de NT-proBNP conjugué a été purifié par
centrifugation à 16 000 g pendant 15 min, le surnageant a été éliminé et la pastille de billes a été
remise en suspension dans 1 ml de 0,1 mol/l de Tris-HCl (pH 8). L'étape de purification a été
répétée trois fois et a été suivie d'une sonication (20 impulsions par seconde). Les billes
conjuguées ont été stockées à 4 °C.
DOSAGES IMMUNOLOGIQUES AlphaLISA DE NT-proBNP DÉVELOPPÉS
EN INTERNE
En résumé, AlphaLISA utilise une paire d'anticorps de NT-proBNP. Un anticorps est biotinylé et
se lie aux billes de donneur revêtues de streptavidine tandis qu'un second anticorps est conjugué
à des billes d'accepteur. En présence de NT-proBNP, les billes se rapprochent les unes des
autres. L'excitation des billes de donneur favorise la libération de molécules d'oxygène singulet,
qui déclenche une cascade de transfert d'énergie vers les billes d'accepteur, ce qui entraîne un pic
fin d'émission de lumière à 615 nm (18).
Les échantillons ont été analysés en triple exemplaire dans des plaques ProxiPlatesTM de 384
puits (PerkinElmer®). La seule exception au protocole du fabricant concernait la réduction du
volume réactionnel total de 50 µl à 10 µl. En résumé, le dosage se composait d’un
échantillon/analyte (1 µl), d’un anticorps biotinylé (25 mmol/l), et d’un mélange de billes
d’accepteur (25 ng/l), et de billes de donneur de streptavidine (80 ng/l). Pour tous les dosages
immunologiques, la concentration des billes d'accepteur finale était de 10 µg/ml, et la
concentration de l'anticorps biotinylé finale était de 1 nmol/l. Le temps d'incubation total était de
1,5 h à température ambiante dans l'obscurité, et les plaques ont été lues sur un lecteur de plaque
EnSpire™.
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE DE DOSAGE POUR LES
DOSAGES AlphaLISA DE NT-proBNP
Afin d’évaluer la pertinence du dosage AlphaLISA pour mesurer le NT-proBNP plasmatique,
nous avons dopé 2 concentrations connues d’analyte NT-proBNP dans un pool de plasma de
contrôle sain. Les deux échantillons dopés et les échantillons non dopés ont été mesurés dans le
même dosage immunologique AlphaLISA. Les pourcentages de récupération des 2 échantillons
de plasma dopés ont été calculés en se référant à un pool de plasma non dopé correspondant dans
un seul AlphaLISA, selon l'équation suivante (20) :
Pourcentage de récupération (%) = {([NT – proBNP]plasma dopé - [NT – proBNP]plasma non dopé)/[NT – proBNP]dopé} x 100
Des échantillons de plasma en triple exemplaire ont été analysés dans un dosage AlphaLISA
unique et 3 dosages AlphaLISA indépendants (20). Nous avons évalué la limite de détection
(LOD) pour les dosages en utilisant 12 blancs (sans NT-proBNP) en trois exemplaires pour 1
seule analyse. La LOD a été déterminée à partir d’une courbe de dose-réponse sigmoïde basée
sur le signal (21) :
LOD de comptage de signal = (moyenne du comptage de signal des blancs) + [3 x (DS du signal des blancs)]
ANALYSE STATISTIQUE
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism 5, version 5.03
(GraphPad Software). Une courbe standard a été générée en traçant les comptes « bruts »
d’AlphaLISA par rapport aux témoins de NT-proBNP en utilisant une équation logistique à 4
paramètres (courbe de dose-réponse sigmoïde à pente variable) et une pondération des données
1/y2 (qui minimise les distances relatives au carré). Avant les analyses statistiques, le test de
normalité omnibus de D'Agostino et Pearson a été réalisé sur les concentrations plasmatiques de
NT-proBNP (variables continues) des 6 fragments à tester pour la distribution normale. Afin de
comparer les valeurs sans distribution normale, un test de paires appariées de Wilcoxon a été
réalisé sur les données de 2 groupes appariés. Les différences entre les 2 groupes ont été
considérées comme statistiquement significatives à P <0,05. Les coefficients de corrélation des
rangs de Spearman ont été calculés pour étudier la relation entre 2 groupes de variables continues
sans distribution normale.
Résultats
Nous avons recruté des patients souffrant d’IC de stade 3 selon la classification NYHA, et les
caractéristiques de ces patients sont présentées dans le Tableau 1.
Tableau 1. Caractéristiques des patients souffrant d’IC
Patients souffrant d’IC (n =
Paramètre
20)
Age, années, moyenne (DS)
73 (10,9)
Sexe, M:F, n
11:09
2
Indice de masse corporelle, kg/m , moyenne
29,9 (6,19)
(DS)
Tous les patients étaient de
Classification NYHA
stade 3
Pression sanguine systolique, mmHg,
124 (3,81)
moyenne (DS)
Pression sanguine diastolique, mmHg,
75 (4,83)
moyenne (DS)
Les peptides de NT-proBNP ont été confirmés dans les fractions d'élution après l’IP des
échantillons de patients souffrant d’IC en utilisant des anticorps spécifiques pour le NT-proBNP
(Tableau 2). Ces peptides couvraient les parties N- et C-terminales de la protéine NT-proBNP
mature prédite (UniProtKB accession P16860). Cependant, plusieurs de ces peptides ont été
identifiés comme étant des peptides semitryptiques, dans lesquels une extrémité du peptide
n'était pas le résultat d'un clivage au niveau d'un site de reconnaissance de la trypsine de
consensus.
Tableau 2. Peptides de NT-proBNP tryptiques et semitryptiques
identifiés après IP à partir de plasma
Positiona
Peptideb
m/z
z Δmasse
1–21
HPLGSPGSASDLETSGLQEQR.N 722,68 3 −0,003
3–21
P.LGSPGSASDLETSGLQEQR.N
966,46 2 −0,004
4–21
L.GSPGSASDLETSGLQEQR.N
909,92 2 −0,005
7–21
P.GSASDLETSGLQEQR.N
789,36 2 −0,004
67–76
K.MVLYTLRAPR
407,23 3
0,001
67–75
K.MVLYTLRAP.R
532,3 2
0,002
67–73
K.MVLYTLR.A
448,25 2
0,001
•
•
a
b
Position des acides aminés dans une protéine NT-proBNP mature.
Les clivages non tryptiques sont en gras ; les clivages ratés sont surlignés.
L'abondance relative de ces peptides trypsiques et semitryptiques de NT-proBNP de chaque
individu a été déterminée en utilisant une quantification relative de l'intensité du
chromatogramme d’ions extraits de chaque forme de peptide. Les ensembles N- et C-terminaux
des peptides ont été normalisés individuellement, fournissant une mesure semi-quantitative de
l'abondance des fragments de clivage N- et C-terminaux de NT-proBNP dans la circulation des
patients souffrant d’IC. Ceci a permis de montrer que les proportions relatives des formes
différemment transformées de NT-proBNP sont essentiellement constantes entre les patients, et
que le NT-proBNP circulant est soumis à un degré élevé de transformation protéolytique à la fois
N- et C-terminale (Figure 2).
Figue. 2. Proportion relative des peptides tryptiques et semitrypiques N- et C-terminaux de NTproBNP purifiés par IP à partir de patients individuels.
(A) Peptides N-terminaux : noir, H1-R21 ; blanc, L3-R21 ; gris, G4-R21 ; rayé, G7-R21. (B)
Peptides C-terminaux : noir, M67-R76 ; blanc, M67-P75.
Nous avons effectué une comparaison (n = 28) entre le dosage de Roche diagnostic et le notre de
NT-proBNP 13-76 développé en interne (corrélation de Spearman de r = 0,69 et P <0,05) (voir
Figure 1 dans le supplément de données qui accompagne la version en ligne de cet article à
http://www.clinchem.org/content/vol59/issue10). La performance de dosage AlphaLISA de NTproBNP est résumée dans le Tableau 3.
Tableau 3. Caractéristiques de performance de nos dosages
immunologiques de NT-proBNP.
Dosage
Récupération, %
Variantion
Variantion
LOD,
immunologique
300 ng/l %
intradosages, interdosages,
ng/l
AlphaLISA
3000 ng/l/,
%
% (ET)
NT-proBNP1–20
101,9 6,55 (0,88)
8,78 (0,56)
90,7
6,69 (0,70)
52,4
7,13 (0,65)
26,4
9,59 (1,03)
168
6,32 (0,88)
147
4,46 (0,59)
45,3
82,6
NT-proBNP13–45
81 9,14 (0,76)
80
NT-proBNP1–45
77,8 7,58 (1,09)
76
NT-proBNP28–76
96,7 7,34 (0,62)
78,8
NT-proBNP13–76
88,1 7,30 (0,69)
121
NT-proBNP1–76
71,5 5,39 (0,75)
70,2
Dans les échantillons de plasma d’IC, des anticorps ciblant le NT-proBNP pleine longueur ainsi
que 5 paires d'anticorps ciblant différentes parties de la molécule ont été utilisés pour mesurer les
concentrations de NT-proBNP. La concentration de NT-proBNP1-20 variait de 2182 à
19 808 ng/l, avec une médiane de 8885 ng/l (IQR, 4166-14 204 ng/l). Les concentrations de NTproBNP1-45 variaient de 91,6 à 2645 ng/l, avec une médiane de 448,3 ng/l (IQR, de 195,2 à
860,3 ng/l). La concentration de NT-proBNP13-45 variait de 165,1 à 14 164 ng/l, avec une
médiane de 2,151 ng/l (IQR, de 840,5 à 3969 ng/l). La concentration de NT-proBNP13-76 variait
de 969,2 à 91 458 ng/l, avec une médiane de 14 705 ng/l (IQR, 5045-28 999 ng/l). La
concentration de NT-proBNP28-76 variait de 140,8 à 2995 ng/l, avec une médiane de 600,5 ng/l
(IQR, de 369,2 à 1339 ng/l). La concentration de NT-proBNP1-76 variait de 399,7 à 16 091 ng/l,
avec une médiane de 4201 ng/l (IQR, 1370-8244 ng/l). La paire d'anticorps reconnaissant le
fragment NT-proBNP13-76 a donné la plus forte concentration par rapport aux paires d'anticorps
reconnaissant les autres parties de la molécule (P <0,05) (Figure 3A). Les corrélations entre NTproBNP13-76 et les 5 fragments sont indiqués sur la Figure 3, B-F.
Figue 3. Comparaison et corrélation des concentrations de NT-proBNP13-76 plasmatique (la
concentration apparente la plus élevée) par rapport à NT-proBNP1-20, NT-proBNP13-45, NTproBNP1-45, NT-proBNP28-76 et NT-proBNP1-76 plasmatiques chez les patients souffrant d’IC (n =
20).
(A) Les 25e, 50e (médian) et 75 percentiles sont indiqués sur les tracés en rectangle et
moustache. *Valeur significativement différente de la concentration de NT-proBNP13-76 à P
<0,05. La corrélation de Spearman a été calculée entre les concentrations de NT-proBNP13-76 et
(B) NT-proBNP1-20 plasmatiques, r de Spearman = 0,890, P <0,0001 ; (C) NT-proBNP13-45, r de
Spearman = 0,859, P <0,0001 ; (D) NT-proBNP1-45, r de Spearman = 0,788, P <0,0001 ; (E) NTproBNP28-76, r de Spearman = 0,908, P <0,0001 ; et (F) NT-proBNP1-76, r de Spearman = 0,946,
P <0,0001.
Discussion
Nous avons employé une combinaison d’analyse par MS et de dosages immunologiques
AlphaLISA pour caractériser les formes circulantes de NT-proBNP dans le plasma de patients
souffrant d’IC. Les 6 dosages immunologiques AlphaLISA développés en interne ont démontré
de bonnes sensibilités analytiques pour la quantification des fragments de NT-proBNP. Nous
avons contrôlé les effets de matrice par la mise en commun de plasmas de contrôle sains (n = 10)
et par dopage avec des concentrations connues de l’analyte NT-proBNP, et nous avons obtenu
des récupérations entre 70,2 % et 121 %. Ces récupérations sont une bonne indication que les
dosages immunologiques de NT-proBNP sont adaptés pour une utilisation avec des échantillons
de plasma. Ces dosages ont ensuite été utilisés pour quantifier et comparer les différents
fragments du NT-proBNP dans le plasma de patients souffrant d'IC et pour identifier la paire
d'anticorps qui a donné la plus forte concentration apparente de NT-proBNP en circulation.
Nos résultats de SM ont identifié plusieurs peptides qui sont des peptides semitryptiques, dans
lesquels une extrémité du peptide n'était pas le résultat d'un clivage au niveau d'un site de
reconnaissance de la trypsine de consensus. Ces peptides semitryptiques étaient probablement
dus au clivage physiologique aux extrémités N et C du NT-proBNP circulant avant l’IP (22).
L'identité de la protéase ou des protéases responsables de ces événements de clivage dans le NTproBNP n'est pas claire, tout comme le fait de savoir si les événements de clivage se produisent
avant ou après le clivage du proBNP en NT-proBNP et BNP. Notre analyse par SM n'a pas
détecté de peptides provenant de BNP, ce qui suggère que les peptides identifiés provenaient de
NT-proBNP plutôt que de proBNP. Cependant, il est possible qu’un peu de proBNP soit présent
dans les échantillons après l’IP. Aucun peptide semitryptique n’a été détecté qui pourrait résulter
d’un clivage interne, ce qui suggère que ces sites de clivage nontryptiques n'étaient pas dus à des
artefacts de transformation, mais représentaient des formes distinctes de NT-proBNP circulant
avec des degrés divers de transformation protéolytique aux extrémités N et C (Figure 1B). En
outre, les données de SM indiquent qu’une fraction importante de NT-proBNP circulant a été
soumise à une troncature au niveau de deux extrémités N et C (Tableau 2, Figures 1 et 2). Ceci
laisse suggérer que des paires d'anticorps pour la mesure de la concentration de NT-proBNP
circulant devraient idéalement ne pas cibler les extrémités N ou C-terminales du peptide. Nous
avons testé si cela était le cas en comparant les concentrations de NT-proBNP apparentes en
utilisant des paires d'anticorps ciblant différents segments de NT-proBNP. La paire d'anticorps
ciblant NT-proBNP13-76 a donné une concentration supérieure à celle ciblant NT-proBNP1-76, et
la paire d'anticorps ciblant NT-proBNP13-45 a donné une concentration supérieure à celle ciblant
NT-proBNP1-45 (Fig. 3). Ces résultats sont cohérents avec la troncature au niveau de l'extrémité
N-terminale de NT-proBNP (Tableau 2, Figure 1), ce qui limite la liaison de l'anticorps
monoclonal 5B6(1-12) à cette partie de la molécule, ce qui conduit à une concentration de NTproBNP apparente réduite. De la même façon, la paire d'anticorps reconnaissant NT-proBNP1-20
a donné une concentration supérieure à celle de NT-proBNP1-76 (Figure 3), en accord avec la
troncature C-terminale (Tableau 2, Figure 1), limitant ainsi la liaison de l'anticorps monoclonal
28F8(67-76). Ces résultats confirment nos données de SM indiquant que la majorité de NT-proBNP
circulant est tronquée au niveau de ses extrémités N et C, et sont également cohérents avec les
descriptions précédentes des multiples formes de NT-proBNP circulant (4, 11).
La glycosylation de la région centrale de NT-proBNP a également été rapportée pour interférer
avec immunodétection (14, 23). La concentration de NT-proBNP apparente en utilisant la paire
d'anticorps ciblant NT-proBNP1-20 était plus élevée que pour l'utilisation de paires d'anticorps
ciblant NT-proBNP1-45, NT-proBNP13-45, ou NT-proBNP28-76 (Fig. 3). Ceci est cohérent avec la
glycosylation dans la partie centrale de NT-proBNP résultant en faible liaison des anticorps à
cette région, ce qui confirme les résultats antérieurs (7, 14, 23). Ensemble, ces données suggèrent
qu'un dosage immunologique idéal pour NT-proBNP ne doit pas cibler les régions N- et Cterminales extrêmes de la molécule de NT-proBNP et doit aussi éviter la région centrale
glycosylée.
Nous avons précédemment validé notre AlphaLISA de NT-proBNP1-76 en utilisant 37
échantillons de plasma qui avaient également été analysés pour les concentrations de NTproBNP en utilisant le dosage de Roche Diagnostic. Une corrélation significative entre notre
dosage et le dosage de Roche (r2 = 0,78 et P <0,001) a été observée (voir Figure 1
supplémentaire en ligne) (15). Le dosage de NT-proBNP actuel de seconde génération de Roche
Diagnostics est basé sur 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes dans les acides
aminés 27-31 et 42-46 de NT-proBNP (fiche de données de Roche Diagnostics, voir
http://www.aacc.org/ publications/cln/2008/July/Pages/newproducts7_0708.aspx). En revanche,
dans cette étude, nous avons découvert que parmi les paires d'anticorps testés, la paire ciblant
NT-proNBP13-76 a donné la concentration apparente la plus élevée dans les échantillons de
plasma prélevés auprès des patients souffrant d'IC. Cependant, nos résultats suggèrent qu’un
dosage immunologique de NT-proBNP idéal ne doit pas utiliser un anticorps ciblant les acides
aminés 67 à 76, du fait de la troncature C-terminale de NT-proBNP (Figures 1 et 2), ce qui réduit
sa concentration apparente (Figure 3). Un anticorps de remplacement visant une section de NTproBNP entre sa région O-glycosylée centrale et son C-terminal tronqué, mais en évitant les
deux régions, serait préférable. Cependant, un tel anticorps n’est actuellement pas disponible. En
outre, des anticorps ciblant NT-proBNP13-76 ont donné une variabilité interindividuelle
relativement élevée. Par conséquent, il sera intéressant de déterminer dans une grande étude
clinique si la détection du fragment NT-proNBP13-76 dans des échantillons de plasma est
préférable aux fragments actuels détectés par les tests de diagnostic commerciaux. Une limitation
de notre étude est que nous avons utilisé une petite cohorte de patients souffrant d'IC de classe
fonctionnelle 3 selon NYHA.
Les récents travaux de Semenov et al. indiquent que les patients souffrant d’IC ont tendance à
avoir un mécanisme de conversion inefficace de proBNP (molécule précurseur) par la furine
convertase en NT-proBNP et BNP lors de la sécrétion des cardiomyocytes dans la circulation
(7). Cependant, notre analyse par SM n'a pas identifié de fragments de proBNP dans la
circulation des patients souffrant d'IC (n = 4), sans doute en raison de l'anticorps que nous avons
choisi pour l'immunoprécipitation. Katrukha et al. ont précédemment démontré que la région
fortement glycosylée de NT-proBNP28-45 plasmatique de patients souffrant d'IC était inaccessible
aux anticorps spécifiques à un site dirigés sur cette région, et ceci a été en outre démontré par
l'élimination enzymatique de molécules d’oligosaccharide O-glycosylées de ces régions qui a
entraîné une augmentation significative (P <0,05) des concentrations de NT-proBNP avant la
déglycosylation (24). Par conséquent, les résultats de notre étude étaient parallèles aux
conclusions précédentes, en ce que les anticorps NT-proBNP28-45 monoclonaux étaient
incapables de se lier aux régions O-glycosylées du NT-proBNP humain. Les corrélations
relativement fortes entre les concentrations de NT-proBNP13-76 plasmatique (région non
glycosylée) avec NT-proBNP13-45 et NT-proBNP28-76 ont suggéré que les concentrations de Oglycosylation (non glycosylées vs glycosylées) dans le NT-proBNP endogène sont
comparativement constantes dans un groupe sélectionné de patients souffrant d’une insuffisance
cardiaque chronique (Figure 3, C et E). Ceci est soutenu par les travaux de Nishikimi et al., qui
ont récemment décrit que les rapports des formes glycosylées et non glycosylées de NT-proBNP
plasmatique sont constants chez tous les patients souffrant d’IC (classes 1-4 selon NYHA ) (25).
La présence de molécules d'oligosaccharides O-liées sur les résidus Ser et Thr dans la région de
NT-proBNP28-45 humain a été décrite dans la littérature pour maintenir la stabilité de NT-proBNP
dans la circulation (26). Par conséquent, les anticorps monoclonaux ciblant les sites non
glycosylés entre NT-proBNP28-45 [c.-à-d NT-proBNP30-35 (motif Glu-Leu-Gln-Val-Glu-Gln)]
sont de nature à exclure les effets de la O-glycosylation lors de la mesure de NT-proBNP
plasmatique. Ceci, combiné à des anticorps monoclonaux ciblant NT-proBNP13-20, est
susceptible de fournir une mesure plus standardisée de NT-proBNP plasmatique pour de futurs
dosages immunologiques « sandwich ». Nos données ont indiqué que, bien qu’un NT-proBNP
immunoréactif fût présent dans le plasma humain en tant que multiples fragments de la molécule
de NT-proBNP pleine longueur, des épitopes spécifiques du peptide semblent être plus
abondants, offrant des cibles idéales pour le développement des tests de diagnostic de nouvelle
génération pour une utilisation clinique.
En résumé, nous avons mis en évidence qu’un dosage immunologique idéal pour détecter NTproBNP dans le plasma ne devrait pas cibler les régions extrêmes N- et C-terminales de NTproBNP, en raison de troncatures protéolytiques endogènes sur ces sites, et ne devrait pas non
plus viser la section O-glycosylée centrale de la protéine. Ces résultats seront importants pour le
développement de la nouvelle génération de dosages immunologiques de NT-proBNP à des fins
de diagnostic. Nos résultats vont ouvrir la voie au développement d'un dosage immunologique de
NT-proBNP de troisième génération, plus standardisé et commercial pour détecter la présence de
l’IC.
Remerciements
Les auteurs remercient Fairuz Jamaluddin pour son aide pour le « zip-tipping » de 4 échantillons
de plasma provenant de patients souffrant d’IC pour une analyse par SM.
Notes
†
Jared Yong Yang Foo, Yunxia Wan et Benjamin L. Schulz ont contribué à parts égales à
ces travaux, et doivent tous être considérés comme auteurs principaux.
9
Abréviations non standard :
IC,
insuffisance cardiaque ;
BNP,
peptide natriurétique de type B ;
NT-proBNP,
proBNP N-terminal ;
NYHA,
New York Heart Association ;
IP,
Immunoprécipitation ;
CL,
chromatographie liquide ;
SM/SM,
spectrométrie de masse en tandem ;
LOD,
limite de détection.
Contributions des auteurs : Tous les auteurs ont confirmé qu'ils ont contribué au contenu
intellectuel de ce document et ont répondu aux 3 exigences suivantes : (a) contributions
significatives à la conception et au format, à l’acquisition de données, ou à l’analyse et
l’interprétation des données ; (b) élaboration ou révision de l'article et de son contenu
intellectuel ; et (c) approbation finale de l'article publié.
Divulgations des auteurs ou potentiels conflits d'intérêts : Lors de la soumission du
manuscrit, les auteurs ont rempli le formulaire de non-divulgation. Divulgations et/ou
potentiels conflits d'intérêts :
Recrutement ou Leadership : Non déclaré.
Consultant ou fonction consultative : Non déclaré.
Actionnariat : Non déclaré.
Honoraires : Non déclaré.
Financement de la recherche : B.L. Schulz, National Health and Medical Research Council
Bourse de projet 631615 et National Health and Medical Research Council Career
Development Fellowship APP1031542 ; C. Punyadeera, Queensland Government Smart
Futures Fellowship Programme (QGSFF), Université du Queensland New Staff Research
Funds (UQNSRSF 601252), Université du Queensland Foundation Research Excellence
Award Scheme, and dons d’anticorps monoclonaux de NT-proBNP de Perkin Elmer (USA).
Témoignage d'expert : Non déclaré.
Brevets : Non déclaré.
Rôle du sponsor : Les organismes de financement n'ont joué aucun rôle dans la conception
de l'étude, le choix des patients inscrits, l'examen et l'interprétation des données, ou la
préparation ou l'approbation du manuscrit
Reçu pour publication le 26 novembre 2012.
Accepté pour publication le 12 juin 2013.
© 2013 The American Association for Clinical Chemistry
Références
1. Dunlay SM, Shah ND, Shi Q, Morlan B, VanHouten H, Long KH, Roger VL. Lifetime
costs of medical care after heart failure diagnosis. Circ Cardiovasc Qual Outcomes
2011;4:68–75.
2. Cheng S, Vasan RS. Advances in the epidemiology of heart failure and left ventricular
remodeling. Circulation 2011;124:e516–9.
3. Collinson PO, Barnes SC, Gaze DC, Galasko G, Lahiri A, Senior R. Analytical
performance of the N terminal pro B type natriuretic peptide (NT-proBNP) assay on the
Elecsys 1010 and 2010 analysers. Eur J Heart Fail 2004;6:365–8.
4. Mair J. Biochemistry of B-type natriuretic peptide: where are we now? Clin Chem Lab
Med 2008;46:1507–14.
5. Melanson SE, Lewandrowski EL. Laboratory testing for B-type natriuretic peptides (BNP
and NT-proBNP): clinical usefulness, utilization, and impact on hospital operations. Am J
Clin Pathol 2005;124(Suppl):S122–8.
6. Dong N, Chen S, Yang J, He L, Liu P, Zheng D, et al. Plasma soluble corin in patients
with heart failure. Circ Heart Fail 2010;3:207–11.
7. Semenov AG, Tamm NN, Seferian KR, Postnikov AB, Karpova NS, Serebryanaya DV, et
al. Processing of pro-B-type natriuretic peptide: furin and corin as candidate convertases.
Clin Chem 2010;56:1166–76.
8. Clerico A, Vittorini S, Passino C. Measurement of the pro-hormone of brain type
natriuretic peptide (proBNP): methodological considerations and pathophysiological
relevance. Clin Chem Lab Med 2011;49:1949–54.
9. Clerico A, Zaninotto M, Prontera C, Giovannini S, Ndreu R, Franzini M, et al. State of the
art of BNP and NT-proBNP immunoassays: the CardioOrmoCheck study. Clin Chim Acta
2012;414C:112–9.
10. Thygesen K, Mair J, Mueller C, Huber K, Weber M, Plebani M, et al. Recommendations
for the use of natriuretic peptides in acute cardiac care: a position statement from the Study
Group on Biomarkers in Cardiology of the ESC Working Group on Acute Cardiac Care. Eur
Heart J 2012;33:2001–6.
11. Ala-Kopsala M, Magga J, Peuhkurinen K, Leipala J, Ruskoaho H, Leppaluoto J,
Vuolteenaho O. Molecular heterogeneity has a major impact on the measurement of
circulating N-terminal fragments of A- and B-type natriuretic peptides. Clin Chem
2004;50:1576–88.
12. Krum H, Jelinek MV, Stewart S, Sindone A, Atherton J. 2011 update to National Heart
Foundation of Australia and Cardiac Society of Australia and New Zealand Guidelines for
the prevention, detection and management of chronic heart failure in Australia, 2006. Med J
Aust 2011;194:405–9.
13. Bailey UM, Jamaluddin MF, Schulz BL. Analysis of congenital disorder of glycosylationId in a yeast model system shows diverse site-specific under-glycosylation of glycoproteins. J
Proteome Res 2012;11:5376–83.
14. Seferian KR, Tamm NN, Semenov AG, Tolstaya AA, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, et
al. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clin Chem
2008;54:866–73
15. Foo JY, Wan Y, Kostner K, Arivalagan A, Atherton J, Cooper-White J, et al. NT-proBNP
levels in saliva and its clinical relevance to heart failure. PLoS One 2012;7:e48452.
16. Mohamed R, Campbell JL, Cooper-White J, Dimeski G, Punyadeera C. The impact of
saliva collection and processing methods on CRP, IgE, and myoglobin immunoassays. Clin
Transl Med 2012;1:19.
17. Pfaffe T, Cooper-White J, Beyerlein P, Kostner K, Punyadeera C. Diagnostic potential of
saliva: current state and future applications. Clin Chem 2011;57:675–87.
18. Punyadeera C, Dimeski G, Kostner K, Beyerlein P, Cooper-White J. One-step
homogeneous C-reactive protein assay for saliva. J Immunol Methods 2011;373:19–25.
19. Topkas E, Keith P, Dimeski G, Cooper-White J, Punyadeera C. Evaluation of saliva
collection devices for the analysis of proteins. Clin Chim Acta 2012;413:1066–70.
20. Jaedicke KM, Taylor JJ, Preshaw PM. Validation and quality control of ELISAs for the
use with human saliva samples. J Immunol Methods 2012;377:62–5.
21. Armbruster DA, Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin
Biochem Rev 2008;29(Suppl 1):S49–52.
22. Bailey UM, Punyadeera C, Cooper-White JJ, Schulz BL. Analysis of the extreme
diversity of salivary alpha-amylase isoforms generated by physiological proteolysis using
liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatography B 2012;911:21–6.
23. Hughes D, Talwar S, Squire IB, Davies JE, Ng LL. An immunoluminometric assay for Nterminal pro-brain natriuretic peptide: development of a test for left ventricular dysfunction.
Clin Sci 1999;96:373–80.
24. Katrukha A, Semenov A, Seferian K, Postnikov A, Koshkina E, Krasnoselsky M, et al.
Glycosylation of NT-proBNP molecules and NT-proBNP immunoassays [Abstract]. Clin
Chem 2007;53(6 Suppl):A23. Voir aussi http://www.hytest.fi/poster-aacc-2007glycosylation-nt-probnp-molecules-and-nt-probnp-immunoassays.
25. Nishikimi T, Ikeda M, Takeda Y, Ishimitsu T, Shibasaki I, Fukuda H, et al. The effect of
glycosylation on plasma N-terminal proBNP-76 levels in patients with heart or renal failure.
Heart 2012;98:152–61.
26. Seferian KR, Tamm NN, Semenov AG, Tolstaya AA, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, et
al. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clin Chem
2008;54:866–73.
“This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The
views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the journal. Reprinted from Clin.Chem, 2013;
v. 59, p. 1523-1531, by permission of AACC. Original copyright © 2013 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When
citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry”
Cet article a été traduit avec la permission de l’AACC. L’AACC n’est pas responsable de la qualité de la traduction. Les opinions
formulées sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement celles de l’AACC ou du journal. Réimprimé de Clin.Chem, 2013;
v. 59, p. 1523-1531, avec la permission de l’AACC. Copyright original©2013 American Association for Clinical Chemistry, Inc.
Lorsque cet article est cité, la publication originale du journal en anglais doit servir de référence.