Annexe 1. Protocole d`extrAction d`Adn génomique à PArtir du sAng

Annexe 1. Protocole d’extraction
d’ADN génomique à partir du sang des
dromadaires
– Ajouter 30 µl de SDS (sodium dodecyl sulfate)
10 %. Vortexer chaque tube juste après l’ajout du
SDS.
1. Hémolyse
3. Digestion et précipitation des protéines
1er lavage
– Ajouter au volume de sang le même volume de
solution de lyse de globule rouge (SLR) Tris 10 mM
pH7,4 et EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid)
10 mM,
– Incubation pendant 10 min dans le bain-marie,
– Centrifuger pendant 10 min à 2 500 tours.min-1 et à
4 °C,
– Jeter le surnageant et garder le culot.
– Ajouter 5 µl protéinase K puis une légère agitation
et incuber pendant 1 min à 37 °C,
– Ajouter 170 µl NaCl (5M) et incuber à 4 °C entre 15
et 60 min,
– Centrifuger pendant 15 min, 3 000 tours.min-1 à
4 °C.
2 lavage
– Ajouter le volume = 2,5 ml de solution de lyse des
globules rouges (SLR) puis vortexer,
– Compléter jusqu’à 5 ml de solution de lyse des
globules rouges (SLR),
– Centrifuger pendant 10 min à 2 500 tours.min-1 et à
4 °C.
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2. Lyse des globules blancs
Pour chaque échantillon
– 600 µl d’eau distillée stérile, NaCl : 5 µl 3M, Tris :
5 µl, EDTA : 5 µl 0,5 M, pH8,
– Vortexer pour faire descendre le culot,
4. Extraction au chloroforme
– Ajouter le même volume de chloroforme que le
surnageant,
– Bien agiter jusqu’à l’obtention de la couleur blanche
puis vortexer,
– Centrifuger pendant 15 min, 3 000 tours.min-1 à la
température ambiante,
– Transférer le surnageant dans un autre tube,
– Ajouter 2,5 fois le volume de l’éthanol absolu,
– Agiter doucement jusqu’à l’obtention de la méduse,
– Récupérer la méduse,
– Mettre la méduse dans 100 ml d’alcool 70 % puis
centrifuger pendant 5 min,
– Ajouter 100 µl de Tris-EDTA à la méduse puis
conserver l’ADN à moins 20 °C.