Extraction d`ADN de champignon (protocole sarcosyl)

Extraction d'ADN de champignon (protocole sarcosyl)
Matériel Biologique : (Mycélium frais ou lyophilisé)
- Obtention du mycélium
- Préparation de l'extraction à partir de mycélium frais
- Préparation de l'extraction à partir de mycélium lyophilisé
Pour Botrytis : mycélium filtré après 1 jour de culture en milieu liquide (NY) - soit frais - soit
lyophilisé
Pour autre champignon : culture en boite de Pétri sur cellophane (2 à 15 jours)puis
lyophilisation du matériel
Protocole :
1- Broyer le mycélium lyophilisé en fine poudre jusqu'à la graduation 1 maximum d'un tube
de 2ml avec un micro-pilon ou pince millipore
2- Ajouter 1ml de tampon Sarcosyl
Bien mélanger (vortexer)
3- Ajouter 1ml de phénol-chloroforme pH8
Mettre dans la glace pendant 1h en vortexant de temps en temps
4- Centrifuger à 13000 rpm pendant 15 min à 4°C
Prélever la phase aqueuse (supérieure)
Si elle est <à100µl ajouter 400µl de tampon Sarcosyl
5- Vortexer (belle émulsion),
Centrifuger 15 min à 13000 rpm à 4°C,
Prélever la phase aqueuse,
Réunir les phases prélevées
6- Centrifuger 60 min à 13000 rpm à 4°C
Prélever le surnageant
7- Ajouter 0.6 vol d'isopropanol
On peut stopper ici à 4°C
Laisser 20 min sur la paillasse
8- Centrifuger 15 min à 13000 rpm à T°ambiante
Jeter le surnageant
Sécher le culot au speed vac (pas trop sinon il ne se resuspend plus)
9- Reprendre le culot dans 400µl d'H2O milliQ stérile à la pipette ou vortex (légèrement)
Ajouter 10µl de RNAse 10mg/ml
Laisser 1h à 37°C au bain-marie
10- Ajouter 400µl de phénol-chloroforme et Vortexer
11- Centrifuger 5 min à 13000 rpm à T°ambiante
Prélever délicatement la phase aqueuse et Ajouter 0.6vol d'isopropanol
On peut stopper ici à 4°C