miniprep maison 1

MINIPREP MAISON 1 REACTIFS & CONSOMMABLES
SOLUTION I :
SOLUTION II :
SOLUTION III :
Tris HCl 25mM
EDTA 10mM
RNase 50µg/mL
NaOH 0,2M
SDS 1%
Acétate de potassium 3M
pH=4,8
Soit
12,5mL Tris HCl 1M pH7,5
10 mL EDTA 0,5M
qsp 500mL eau
Soit
4g NaOH
5g SDS
qsp 500mL eau
Soit
60mL acétate potassium
5M
11,5mL acide acétique
28,5mL eau (qsp 100mL)
Conserver à 4°C
Conserver à RT
Conserver à 4°C
A. RESUSPENSION
1. Prélever 900µL d’une culturede 4 mL overnight et
transvaser dans un tube 1.5mL annoté.
2. Mettre les 3mL restant à 4°C en attendant la
découverte d’un clone positif.
3. Centrifuger 30s 13000g.
4. Eliminer le surnageant à la pipette.
5. Reprendre le culot avec 150µl de solution I
- Le TrisHCl-EDTA est utilisé pour la resuspension,
le but étant de maximiser le nombre de cellules
exposées au tampon de lyse.
- La RNase permettra de digérer l’ARN libéré durant
la lyse.
B. LYSE ALCALINE
6. Ajouter 150µl de solution II et inverser plusieurs
fois pour homogéneiser (ne pas pipetter, ne pas
vortexer).
- Le SDS solubilise les phospholipides et les
protéines composant la membrane.
- Le NaOH dénature les ADN chromosomique,
plasmidique et les protéines.
Remarque :
Si trop visqueux, doubler la quantité de solution II
puis celle de solution III.
Ne pas prolonger la lyse plus de 5min au risque de
dénaturer de manière irréversible l’ADN
plasmidique.
C. NEUTRALISATION de la LYSE
7. Ajouter 200µl de solution III et inverser
vigoureusement pour homogéneiser (ne pas pipetter,
ne pas vortexer).
- La forte concentration en sel induit la formation d’un
précipité KDS qui co-précipite avec les protéines
dénaturées, l’ADN chromosomique et les débris
cellulaires
- L’ADN plasmidique, circulaire, se renature
correctement et reste en solution.
ISOPROPANOL
ETHANOL
TAMPON TE 1X
Soit
40mL Tris 1M pH8
0,1mL EDTA 0,5M
pH8
qsp 50mL eau
Armoire de Sécurité
sous hotte aspirante
Conserver à Tamb
MINIPREP MAISON 2 D. CLARIFICATION du LYSAT
8. Centrifuger 5min à 13000g.
9. Prélever le surnageant en prenant soin de ne pas
aspirer le floculat et le transvaser dans un nouveau
tube 1.5mL annoté.
E. PRECIPITATION de l’ADN PLASMIDIQUE
10. Ajouter 1 mL d’isopropanol et homogénéiser par
inversion douce.
11. Centrifuger 10min à 13000g et éliminer le
surnageant à la pipette.
- Attention à bien orienter les tubes, le culot est
souvent invisible.
- La précipitation à RT limite la co-précipitation des
sels qui pourraient interférer avec les manips
suivantes.
- La centrifugeuse peut être à 4°C pour limiter
l’échauffement de l’échantillon.
F. LAVAGE du CULOT d’ADN PLASMIDIQUE
12. Ajouter 200µL d’éthanol 70%.
13. Centrifuger 2 min à 13000g et jeter le surnageant.
- Cela permet d’eliminer les sels co-précipités et de
remplacer l’isopropanol par l’éthanol plus volatile,
l’ADN est alors plus facile à dissoudre.
G. SECHAGE et RESUSPENSION
14. Sécher le tube 30min à 1h à 37°C.
15. Ajouter 30µL de tampon TE 1X.
- Attention a ne pas sursécher les culots qui
deviendraient difficile à resuspendre.
- L’ADN ne se dissout pas facilement dans les
tampon acide, vérifier alors que le pH>8.