Rapport de stage Cloé RAYNAUD

RAYNAUD Cloé
DUT Génie Biologique, option Analyses Biochimiques et Biologiques
2014/2016
Stage du 18 Avril au 25 Juin 2016
Développement d’une méthode de
purification non dénaturante non
dénaturante de la protéine Fel d 1, en
vue de l’identification de son possible
ligand par GC-MS
Mme Cécile Bienboire-Frosini
IRSEA | QUARTIER SALIGNAN, LE CHENE, 84400 APT
1
RAYNAUD Cloé
DUT Génie Biologique, option Analyses Biochimiques et Biologiques
2014/2016
Stage du 18 Avril au 25 Juin 2016
_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Développement d’une méthode de purification
non dénaturante de la protéine Fel d 1, en vue
de l’identification de son possible ligand par
GC-MS
_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Maître de stage : Dr Cécile Bienboire-Frosini
IRSEA
Département des Mécanismes Physiologiques et Comportementaux de l’Adaptation
Quartier Salignan, Le Chêne, 84400 Apt
2
Remerciements
Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont contribué au succès de mon stage et qui
m’ont aidée lors de la rédaction de ce rapport.
Tout d’abord, je souhaite remercier Messieurs Pageat, De Leyssac et Cozzi pour avoir
accepté ma candidature pour ce stage à l’IRSEA.
Je remercie aussi vivement mon maître de stage Docteur Cécile Bienboire-Frosini, chef
du département Mécanismes Physiologique et Comportementaux de l’Adaptation, pour
son accueil et le partage de son expertise au quotidien. Grâce aussi à sa confiance, j’ai
pu m’accomplir totalement dans les différentes manipulations.
Je souhaite également remercier Camille Chabaud, technicienne de laboratoire du
département Mécanismes Physiologiques et Comportementaux de l’Adaptation, pour
son accueil chaleureux, le temps passé ensemble, sa patience pour m’expliquer certaines
manipulations et tous les conseils donnés durant mon stage.
Enfin je remercie toute l’équipe du département Mécanismes Physiologique et
Comportementaux de l’Adaptation et plus généralement toute l’équipe de l’IRSEA pour
son accueil chaleureux, leur partage de connaissance et les moments passés ensemble.
3
Table des matières
REMERCIEMENTS ............................................................................................................................................ 3
PRESENTATION DE L’ENTREPRISE .................................................................................................. 5
INTRODUCTION ...................................................................................................................................... 7
MATERIEL ET METHODES .................................................................................................................. 9
III.1 PRELEVEMENTS DES ECHANTILLONS DE FEL D 1 ......................................................................................... 9
III.1.1 Anesthésie des animaux ..................................................................................................................... 9
III.1.2 Lavage global du corps (‘Body wash like’ = BWL) ........................................................................... 9
III.1.3 Sacs anaux (SA) ............................................................................................................................... 10
III.2 EXTRACTION DE FEL D 1 DES ECHANTILLONS DE CHAT ............................................................................. 10
III.3 DOSAGE DE FEL D 1 DANS LES ECHANTILLONS PAR LA METHODE ELISA ................................................. 11
III.4 DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PAR LA METHODE AU BCA .................................................................. 12
III.5 ÉLECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE (PAGE) ...................................................................... 13
III.5.1 Le Western Blot (immunotransfert).................................................................................................. 14
III.5.2 La coloration à l’Imperial Protein Stain ......................................................................................... 15
III.6 DEVELOPPEMENT DE L’IMMUNOPURIFICATION ......................................................................................... 16
III.6.1 Première immunopurification .......................................................................................................... 17
III.6.2 Deuxième immunopurification ......................................................................................................... 18
RESULTATS ............................................................................................................................................ 19
IV.1 DOSAGES .................................................................................................................................................. 19
IV.2 ÉLECTROPHORESES SUR GELS DE POLYACRYLAMIDE ................................................................................ 20
IV.3 LES IMMUNOPURIFICATIONS ..................................................................................................................... 22
DISCUSSION ............................................................................................................................................ 26
CONCLUSION ......................................................................................................................................... 28
LISTE DES ANNEXES ............................................................................................................................ 29
BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................................. 41
4
Présentation de l’entreprise
L’Institut de Recherche en Sémiochimie et Ethologie Appliquée (IRSEA) est un
laboratoire de recherche et développement spécialisé dans le domaine de la
communication chimique au sein du monde vivant. Cet institut existe depuis 1995 mais
sous le nom Phérosynthèse jusqu’en 2010, où il devient l’IRSEA.
Cette entreprise est un établissement privé dédié à l’étude et à la compréhension des
mécanismes du comportement des animaux et de l’homme, de leurs interactions et
particulièrement de leur communication chimique afin de développer des méthodes
permettant une amélioration de la gestion des comportements, des interactions et du
bien-être.
L’identification de signaux chimiques intervenant dans la vie des animaux permet de
mettre au point de nouveaux outils thérapeutiques et zootechniques, respectueux de
l’homme, de l’animal et de l’environnement.
L’IRSEA utilise donc la sémiochimie afin d’interagir avec le monde du vivant en
utilisant ses codes, plutôt qu’en cherchant à le plier à nos exigences.
L’entreprise a développé différents produits pour divers animaux afin d’améliorer leur
bien-être et leur communication. Le produit phare de l’institut est Feliway® qui est une
reproduction synthétique de la phéromone faciale F3 et aide les chats à faire face aux
changements de leur environnement et aux situations stressantes en limitant le marquage
urinaire. Dans la même gamme, deux autres produits ont été développés pour les chats :
Feliscratch® qui favorise le comportement de griffade du chat et Felifriend® qui améliore
la cohabitation entre chat.
Dans le même esprit, l’IRSEA a créé des produits visant les chiens et les chevaux avec
respectivement Adaptil® qui, grâce à la réplication synthétique de la Dog Appeasing
Pheromone, diminue les comportements de stress et de peur chez le chien et
Equanimity® qui limite l’anxiété des chevaux lors des transports
5
6
Introduction
Le chat domestique est l’une des causes les plus fréquentes d’allergies chez l’enfant et
l’adulte provoquant notamment des manifestations respiratoires telles que des rhinites
allergiques ou bien de l’asthme bronchique. Ces allergies sont dues à l’hypersensibilité
des personnes à la protéine Fel d 1 produite par les glandes sébacées, salivaires,
lacrymales et anales et qui se propage sur le pelage du chat [1], [2], [3], [4]. Cette
protéine est l’allergène majeur du chat capable d’induire la production d’IgE spécifiques
chez 85 à 95% des patients sensibilisés [5], [6], [7]. Les principales sources de sécrétion
de Fel d 1 sont : la peau, le pelage et les sacs anaux.
Fel d 1 est une glycoprotéine tétramérique d’environ 35-40 kDa qui appartient à la
famille des sécrétoglobines. Ce tétramère est formée de deux hétérodimères noncovalents capable de lier des ions calciums, qui peuvent aider à la stabilisation de la
forme tétramérique [8]. Chaque hétérodimère possède deux chaînes polypeptidiques ; la
chaîne 1 constituée de 70 acides aminés et la chaîne 2 qui est, elle, constituée de 90-92
acides aminés et d’un sucre, le N-glycane. Ces dernières sont reliées par 3 ponts
disulfures et ont respectivement un poids moléculaire de 7 et 10 kDa (sans le N-glycane)
[9].
Le polymorphisme structural de cet allergène a été démontré par plusieurs études [10],
[11], [12], [13]. En particulier, une forme dimérique tronquée (14-16 kDa) est
majoritairement présente dans les sacs anaux alors que la forme dimérique intacte (2022 kDa) est présente en majorité sur la peau et le pelage [14], ainsi que dans la poussière
de maison [15].
La protéine est amphiphile, ce qui veut dire qu’elle possède une partie hydrophile
associé à une partie hydrophobe. Elle est également globulaire et le dimère a une forme
de boomerang avec une cavité majeure hydrophobe capable de lier un ligand et deux
cavités secondaires [16] (cf. Figure 1). Des études in silico ont proposé que les cavités
de Fel d 1 pouvaient interagir avec des ligands de la famille des stéroïdes [3].
7
Cavité
secondaire
Cavité
majeure
Cavité
secondaire
Figure 1 : Représentation in silico de la protéine Fel d 1
(Source : Cécile Bienboire-Frosini, Caractérisation du polymorphisme structural et fonctionnel de
l’allergène majeur du chat, Fel d1, 2009)
Les récentes découvertes laissent supposer que Fel d 1 pourrait être une protéine de
liaison (Pheromone Binding Protein, PBP) [17], en particulier pour une ou des
phéromone(s), et pourrait alors éventuellement avoir une implication dans la
communication chimique. Afin de vérifier cette hypothèse, nous allons chercher à
identifier le ligand endogène porté par Fel d 1 en testant et développant une méthode
d’immunopurification en conditions non dénaturantes, tout en suivant l’intégrité et la
pureté des protéines obtenues par électrophorèse native et dénaturante. Une fois la
protéine native purifiée, le but sera d’extraire son ligand par une extraction
Méthanol/Chloroforme, puis de réaliser son identification par GC-MS1.
Je vous présenterais dans un premier temps les prélèvements réalisés, la caractérisation
biochimiques initiale des prélèvements en termes quantitatifs (ELISA Fel d 1) et
qualitatif (dosage des protéines totales et électrophorèse), et les tests de plusieurs
méthodes d’immunopurification, puis je vous exposerais les résultats des principales
manipulations et je finirais par discuter de ces résultats et des perspectives possibles.
1
Chromatographie Gazeuse – Spectrométrie de Masse
8
Matériel et méthodes
III.1 Prélèvements des échantillons de Fel d 1
Pour la réalisation de la manipulation, nous avons prélevé les échantillons de Fel d 1 sur
quatre femelles entières, toutes venant de la population de chat de l’IRSEA.
Les prélèvements ont été réalisé à deux endroits différents :
o Le flanc et la joue du chat = Lavage globale du corps
o Les sacs anaux
III.1.1 Anesthésie des animaux
Avant de réaliser le prélèvement de Fel d 1, il a été nécessaire d’anesthésier les chats.
Pour cela, la vétérinaire a procédé à une injection intramusculaire, au niveau de la cuisse,
de trois molécules anesthésiques mélangées dans une même seringue. Le dosage par
chat des molécules fut le suivant :
o Butophanol (Dolorex®) : 1 mg  0.1 ml
o Médétomidina (Domitor®) : 160µg  0.2 ml
o Kétamine (Kétamine 1000®) : 10 mg  0.1 ml
L’anesthésie a pris effet au bout d’environ 5-10 min. A la fin des prélèvements, la
vétérinaire a injecté une molécule antagoniste à la Métédomidina pour permettre aux
chats de se réveiller plus rapidement, l’Atipamezole (Antisedan®). La vétérinaire a
injecté un volume inférieur de moitié au Domitor®, soit 0.1 ml.
III.1.2 Lavage global du corps (‘Body wash like’ = BWL)
Pour récupérer les molécules de Fel d 1 à la surface du corps du chat, un flanc a été
humidifié avec 10 ml de solution de lavage (solution d’antiprotéases à base de cocktail
antiprotéases fourni par Sigma et dilué dans l’eau ultrapure selon les recommandations
du fabricant). Puis on a frotté et frictionné toute la surface du flanc avec une compresse
stérile que l’on a préalablement humidifié avec 2 ml de solution de lavage. La zone de
la joue peut également être particulièrement frottée, notamment après l’avoir pressée
pour induire le relargage du contenu des glandes sébacées (en effet, la zone de la joue
en est particulièrement riche). La compresse et les poils récupérés suite à la friction ont
ensuite été collectés dans un pot stérile pour échantillon. Le pot fut ensuite identifié avec
le nom du chat, la date du prélèvement, la nature de l’échantillon, la masse du pot vide.
9
III.1.3 Sacs anaux (SA)
Ce type d’échantillon est récupéré après le lavage global du chat et avoir changé de gants
pour éviter toute contamination des échantillons.
Le contenu de chaque sac anal a été récupéré par une pression manuelle bilatérale des
glandes et collecté dans un tube eppendorf LoBind Protein de 5 ml. Le tube a été
identifié avec le nom du chat, la date du prélèvement, la nature de l’échantillon, la masse
du tube vide.
Pour chaque type de prélèvement, le contenant a ensuite été pesé avec les échantillons
qu’il contenait puis le poids fut noté sur le pot ou le tube.
Figure 2 : Échantillons récupérés
(Source : Photo personnelle)
III.2 Extraction de Fel d 1 des échantillons de chat
Un volume de solution de lavage a été ajouté dans les tubes/pots contenant les
échantillons selon le protocole suivant :
o 6 ml pour 1 g de poils et de compresse récolté
o 5 ml pour 1g de sécrétion de sac anal.
Par exemple pour les prélèvements du chat Écaille (pour les autres chats cf. annexe 1) :
- VBWL = 24,45 ml pour mBWL = 5,49 g
- VSA = 1.02 ml pour mSA = 0.17 g
Ensuite les échantillons ont été longuement vortexés et incubés toute la nuit à
température ambiante sous une légère agitation.
Le jour suivant, le liquide obtenu des échantillons extraits a été transvasé dans des tubes
en volume égaux. Ils ont ensuite été centrifugés à 3000 g pendant 20 minutes à 4°C pour
retirer les poils et les contaminants, puis ils ont été aliquotés dans des microtubes de 2
ml et de nouveau centrifugés à 21 000g pendant 30 min pour ôter les derniers
10
contaminants solides. Le surnageant de chaque tube a été ensuite divisé en au moins un
aliquot de 500 µl et plusieurs aliquots de 20 µl qui sont ensuite conservés à -20°C.
III.3 Dosage de Fel d 1 dans les échantillons par la méthode
ELISA
La technique ELISA2 est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet
de visualiser une interaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite
par l’action sur un substrat d’une enzyme préalablement fixée sur l’anticorps (figure 3).
Le dosage ELISA peut se réaliser de deux manières :
o Compétitif
o Non compétitif (Type Sandwich)
Figure 3 : DAS ELISA ou ELISA Sandwich
(Source : http://www.technobio.fr)
La DAS3 ELISA est un dosage non compétitif, de type sandwich. L’antigène se trouve entre deux
anticorps spécifiques : un de capture et un de détection (dans notre cas, 6F9 et 3E4). Cette méthode
nécessite donc que l’antigène possède deux épitopes différents, permettant la fixation des deux
anticorps distincts.
Le dosage de la concentration en Fel d 1 de nos échantillons s’est réalisé avec un kit
commercial ELISA de Indoor Biotechnologies. Pour notre manipulation nous avons
effectué des dilutions en triplicat pour les échantillons et duplicat pour la gamme étalon
(cf. annexe 2), puis suivi ensuite le protocole du fournisseur (cf. annexe 3).
2
3
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Double Antibody Sandwich
11
Figure 4 : Plaque ELISA pour le dosage de Fel d 1
(Source : Photo Personnelle)
L’image ci-dessus représente le résultat du dosage de Fel d 1 des sacs anaux des femelles. Les blancs
sont réalisés dans les puis A11/12 et B11/12. Les puits de A1 à B10 contiennent la gamme étalon ; Les
échantillons se trouvent dans les puits de C1 à G12.
III.4 Dosage des protéines totales par la méthode au BCA4
La méthode au BCA est basée sur la conversion du Cu 2+ en Cu1+ dans un environnement
alcalin. Un produit de couleur pourpre est formé par la chélation de deux molécules de
BCA avec l’ion cuivreux Cu1+. Ce complexe soluble dans l’eau présente une forte
absorbance à 562 nm. (Figure 5)
Figure 5 : Schéma de principe du dosage au BCA
(Source : IRSEA)
Cette dernière est directement proportionnelle à la quantité de protéine présente dans la
solution et peut-être estimée par comparaison avec une protéine standard telle que
l’albumine bovine sérique (BSA). La formation d’une couleur pourpre est due à la
structure macromoléculaire des protéines, le nombre de liaisons peptidiques et de la
présence de quatre acides aminés (cystine, cystéine, tryptophane et tyrosine) [12].
Pour notre manipulation, nous avons suivi le protocole du fournisseur du kit présenté en
annexe 4.
4
Acide Bicinchoninic
12
Figure 6 : Plaque ELISA pour le dosage des protéines totales
(Source : Photo Personnelle)
L’image ci-dessus représente le résultat du dosage des protéines totales des sacs anaux des
femelles. Les puits A1 et B1 sont les blancs, ceux de C1 à B3 correspondent à la gamme étalon.
Les échantillons sont présents dans les puits C3 à B5.
III.5 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
L’électrophorèse (figure 7) est une technique de séparation et de caractérisation des
molécules. Elle consiste à soumettre un mélange de molécules à un champ électrique ce
qui entraine une migration des molécules chargées.
Pour nos manipulations, nous avons utilisé le gel de polyacrylamide qui permet de
séparer des macromolécules (protéines, ADN, etc.) en fonction de leurs charges, leurs
tailles et leurs encombrements stériques au sein d’un champ électrique constant et le
système X-Cell SureLock Mini-Cell (Invitrogen).
Il existe plusieurs types de conditions pour une électrophorèse sur gel (native,
dénaturante, réductrice etc.).
Figure 7 : Système d’électrophorèse
(Source : Photo personnelle)
13
En conditions dénaturantes on utilise des traitements qui suppriment les liaisons noncovalentes des protéines et leur font perdre leur structure tridimensionnelle ou
conformation initiale, tels que des traitements à haute température et au SDS5. Ce dernier
est un détergent et tensioactif ionique fort, chargé négativement qui permet à la protéine
de prendre une forme déroulée et d’être chargée négativement.
Les conditions non dénaturantes ou natives, permettent la séparation des molécules
dans leur état le plus proche possible de leur état natif. Les étapes préalables permettant
l'obtention de la solution contenant les molécules à séparer, doivent éviter les conditions
dénaturantes citées précédemment.
Dans notre cas, les échantillons (50ng de Fel d 1/puit) ont été analysés sur des gels
NuPAGE® Bis-Tris 4-12% (conditions dénaturantes) et Novex® 4-20% Tris-Glycine
(conditions natives) en suivant les protocoles du fournisseur Thermo Fischer (cf.
annexes 5 et 6).
Pour la révélation des bandes de nos échantillons nous avons utilisé deux méthodes : le
Western blot pour la protéine Fel d 1 (50 ng/puits) et la coloration à l’Imperial Protein
Stain pour les protéines totales (1-2,5 µg/puit)
III.5.1 Le Western Blot (immunotransfert)
Après l’électrophorèse, les bandes de protéines séparées ont été transférées vers une
membrane de nitrocellulose. Les protéines adhèrent à la membrane de la même manière
qu'elles ont été séparées en raison des interactions entre les charges. Les protéines de cet
immunotransfert ont ensuite été liées par liaison à un anticorps spécifique (anticorps
primaire) pour permettre leur identification. L’anticorps primaire est un anticorps
monoclonal de souris de type IgG et est lui-même révélé par un anticorps secondaire
anti-IgG de souris couplée à une enzyme qui transformera un substrat en produit coloré,
permettant la visualisation des bandes protéiques spécifiques.
Ce transfert se fait grâce au module XCell II Blot Module Invitrogen. Les éponges, la
membrane et les papiers filtres ont été imbibé dans du tampon de transfert contenant 35
ml de NuPAGE® Transfert Buffer (20X), 70 ml de méthanol et 595 ml d’eau ultra pure
pour les gels Bis-Tris et 28 ml de Novex® Tris-Glycine Transfert Buffer (25X), 140 ml
de méthanol et 532 ml d’eau ultra pure pour les gels Tris-Glycine. Ensuite nous avons
suivi la mise en place présentée figure 8 puis rempli la chambre d’électrophorèse d’eau
ultrapure et le boîtier contenant la membrane, de tampon de transfert.
5
Sodium Dodecyl Sulphate
14
Figure 8 : Ordre des différents composants pour le Western Blot
(Source : Thermo Fischer)
Les conditions du Western Blot sont les suivantes :
Tampon
Volt (V)
Ampère (mA)
Temps
Conditions Dénaturantes
NuPAGE® Transfer Buffer
(20X)
30
300
1h
Conditions Natives
Novex® Tris Glycine
(25X)
25
300
2h30
Après le transfert, la révélation se fait à l’aide du kit de coloration WesternBreeze
Chromogenic Immunodetection (Invitrogen). Nous avons suivi le protocole du
fournisseur (cf. annexe 7) légèrement modifié en utilisant comme solution de saturation
du BSA 1%, PBS6-Tween 0,05% à la place de la « Blocking solution » fourni par le kit
et comme anticorps primaire, l’anticorps 6F9 dilué au 1/1000e [17]. Nous avons aussi
ajouté 7 ml de Substrat Chromogenic au lieu des 5 ml préconisés pour mieux immerger
la membrane.
III.5.2 La coloration à l’Imperial Protein Stain
L’Imperial Protein Stain (Thermo Fischer) est un réactif coloré à base de Bleu de
Coomassie mais ayant une meilleure sensibilité (jusqu’à 3 ng), permettant la coloration
spécifique des protéines sur gels de polyacrylamide.
Avant de réaliser la coloration, nous avons lavé le gel plusieurs fois dans de l’eau ultra
pure (entre 100 et 200 ml), puis exécuté la coloration en ajoutant 20 ml du réactif.
Cependant les temps de coloration et de décoloration varient en fonction de la sensibilité
recherché.
6
Phosphate Buffer Saline
15
Sensibilité en ng
≤3
3-6
6-12
Temps de coloration
2 heures
1 heure
5-10 minutes
Temps de lavage
Sur la nuit
1-2 heures
3 x 5 minutes
Dans notre cas, nous recherchions une sensibilité inférieure à 3 ng afin de détecter toutes
les possibles bandes protéiques autres que Fel d 1 et d’évaluer correctement le degré de
contamination des échantillons. C’est pourquoi nous avons effectué une coloration sur
2 heures et une décoloration sur la nuit. Toutefois, selon l’intensité des bandes sur le gel
après la décoloration, il était possible de réitérer une coloration de 2 heures suivie par
une décoloration d’1 heure.
III.6 Développement de l’immunopurification
Cette étape est basée sur le principe de la chromatographie d’affinité, la séparation des
molécules va se faire selon leur capacité à se lier à un ligand spécifique fixé sur une
résine (figure 9). Dans notre cas, les colonnes utilisées contiennent des billes d’agarose
couplées à la protéine A que l’on utilise ensuite pour fixer un anticorps spécifique de
Fel d 1, 6F9, dans un premier temps, puis Fel d 1.
Figure 9 : Schéma de principe d'une
chromatographie d'affinité
(Source : http://planet-vie.ens.fr/content/lachromatographie)
16
III.6.1 Première immunopurification
Nous avons réalisé cette immunopurification en utilisant comme tampon de liaison celui
du kit Gentle Ag/Ab Binding & Elution de ThermoScientific qui est à un pH de 8,0.
Cette manipulation s’est déroulée en plusieurs étapes.
Dans un premier temps, on a préparé la colonne NAb Protein A Spin (ThermoScientific)
avec des Ac7 6F9 en ajoutant 2 ml de la solution d’anticorps, préalablement diluée dans
du tampon de liaison (Protein A Binding Buffer, ThermoScientific), dans la colonne
après avoir l’avoir équilibré, avec le même tampon de liaison, et centrifugé 1 min à 1000
g. On a incubé avec retournement pendant 10 minutes, puis centrifugé à nouveau 1 min
à 1000g. Une fois la centrifugation terminée, nous avons récupéré le liquide sorti et lavé
la colonne.
Dans un second temps, on a réalisé l’interaction Ag8 Fel d 1 – Ac 6F9. Pour cela, on a
lavé et équilibré la colonne avec un autre tampon de liaison (Gentle Ag/Ab Binding
Buffer, ThermoScientific), puis ajouté à la colonne l’échantillon à purifier, auparavant
dilué dans du tampon de liaison, de façon à déposer 20 µg de Fel d 1. On a incubé
pendant 1h sous agitation basculante, lavé la colonne et procédé à l’élution douce en
ajoutant cinq fois 2 ml de Gentle Ag/Ab Elution Buffer (ThermoScientific) et en
centrifugeant 1 min à 1000g à chaque fois.
Cette étape nous a permis de récupérer au total 5 fractions de 2 ml de notre échantillon
ainsi que le liquide récupéré après le couplage Ag/Ac et les lavages.
Étant donné la forte concentration ionique du tampon d’élution, nous avons ensuite
réalisé le dessalage des échantillons afin de pouvoir effectuer par la suite une
électrophorèse en conditions dénaturantes pour analyser les fractions obtenues. Pour
cette étape, nous avons utilisé des colonnes de dessalages Zeba Spin Desalting 7 K
MWCO (ThermoScientific) de 10 ml que nous avons équilibré trois fois avec de l’eau
ultrapure. Après cela, nous avons pu réaliser le dessalage des échantillons en ajoutant 2
ml de ces derniers et en centrifugeant trois fois 1 min à 1000g. Il est nécessaire de
récupérer le liquide après chaque centrifugation et pour chaque fraction.
7
8
Anticorps
Antigènes
17
III.6.2 Deuxième immunopurification
Pour cette autre immunopurification, le protocole est le même que précédemment mais
cette fois ci nous avons utilisé comme tampon de liaison du TBS9 pH 7,2 - 7,4 et incubé
une nuit à température ambiante l’Ag Fel d 1 avec l’Ac 6F9 immobilisé sur les billes
d’agarose de la même colonne d’immunopurification utilisée ci-dessus. Pour des raisons
pratiques, des colonnes de dessalage Zeba Spin Desalting 7K MWCO
(ThermoScientific) de 5 ml ont été utilisés dans ce cas.
Pour vérifier la réussite des immunopurifications, nous avons réalisé des électrophorèses
en conditions dénaturantes, puis des révélations par coloration à l’Imperial Protein Stain.
Lors des électrophorèses, nous avons déposé pour chaque gel, 15 µl du marqueur de
taille SeeBlue Plus Pre-Stained (Thermo Fisher) dans les puits 1 et 8. Ensuite nous avons
déposé dans le puit 2 du gel 1, l’échantillon « brut » donc sans immunopurification, du
lavage global du chat Elvira, puis dans les puits 3 à 7, les fractions F1 à F5 récupérées
après l’immunopurification.
Sur le gel 2, nous avons déposé le marqueur de taille et l’échantillon « brut » dans le
même ordre et sous les mêmes volumes. A la place des fractions F1 à F5, nous avons
déposé dans les puits 3 à 7, l’éluat du couplage Ag Fd1 – Ac 6F9, appelé C1, puis les
éluats des quatre lavages réalisés après l’ajout de l’échantillon (L1 à L4) (cf. annexe 8)
Les échantillons ont été déposé sous un volume de 32 µl en suivant les proportions
suivantes :
Échantillon (µl)
24 / 18,2
Tampon LDS Running Buffer (4X) (µl) 8 / 8
Eau ultra-pure (µl)
0 / 5,8
Volume total (µl)
32 / 32
(En bleu, sont représentés les volumes pour l’échantillon de BWL brut)
9
Tris Buffer Saline
18
Résultats
IV.1 Dosages
Les résultats des dosages (cf. figure 10), nous indique que la protéine Fel d 1 est présente
en plus grande concentration dans les sacs anaux (AS) que dans les lavages globaux
(BWL), ce qui correspond à ce qui était attendu.
Ces résultats nous montrent aussi que dans les sacs anaux, il y a une plus grande quantité
de protéines autres que Fel d 1 que dans les lavages globaux.
Dosages
Chats
Elvira
Edelweiss
Ecaille
Perle
AS
19,1
20,8
12,7
/
Fel d1
Concentration (µg/ml)
Ecart-type BWL Ecart-type
± 3,1
12,5
± 0,1
± 3,2
3,2
/
± 1,0
8,2
± 0,2
/
0,5
± 0,04
AS
1099,7
1453,3
1629,8
2260,3
Protéines totales
Concentration (µg/ml)
Ecart-type BWL
Ecart-type
± 18,0
137,5
± 11,3
± 42,9
131,9
/
± 20,6
163
± 4,4
/
77,5
± 3,4
Ration Fd1/Protéines
Totales
Chats
AS
BWL
Elvira
1,7
9,1
Edelweiss
1,4
2,4
Ecaille
0,8
5
Perle
/
0,6
/
< au seuil de détection du kit, calculé en prenant en compte le facteur de
dilution
Figure 10 : Résultats des dosages de Fel d 1 et des protéines totales
(Source : Photo Personnelle)
Suite à ces résultats, nous nous sommes intéressés au ratio entre Fel d 1 et les protéines
totales. Nous avons pu observer un ratio similaire pour les sacs anaux des chats Elvira
et Edelweiss. Toutefois, cette similarité n’était pas le cas avec le chat Ecaille.
Cette disparité de ratio se retrouve aussi au niveau des lavages globaux. En effet, on peut
observer un très grand ratio Fel d 1/Protéines totales pour le chat Elvira mais un ratio
faible pour le chat Perle.
Pour tous les chats, la quantité de Fel d 1 par rapport à celle de protéines totales est plus
importante dans les lavages globaux (hormis Perle pour laquelle la donnée est
manquante pour le ratio dans les sacs anaux)
19
IV.2 Électrophorèses sur gels de polyacrylamide
Les résultats présentés correspondent à l’électrophorèse réalisée en conditions
dénaturantes pour permettre une meilleure visualisation des bandes protéiques.
La figure 11 présente la caractérisation protéique des échantillons dans les lavages
globaux (puits 2 à 5) et les sacs anaux (puits 7 à 10) après une électrophorèse en
conditions dénaturantes et une coloration à l’Impérial Protein Stain (Thermo Fischer).
Les puits 1 et 6 contenaient le marqueur de taille SeeBlue Plus PreStained (Thermo
Fischer). kDa
198
62
49
38
28
18
14
6
3
Figure 11 : Gel d’électrophorèse des échantillons
de sacs anaux et lavages globaux des 4 femelles entières
(Source : Photo Personnelle)
Cette caractérisation nous a permis d’observer des bandes à différents poids moléculaire.
Dans les puits 2 et 4, on peut constater la présence d’une bande diffuse autour de 20 kDa
ce qui correspond à la taille attendue de la forme dimérique intacte de Fel d 1.
Dans les puits 3 on distingue la présence d’une bande autour de 28 kDa ce qui concorde
avec la taille de la forme tétramérique tronquée de Fel d 1.
On retrouve cette bande dans les puits 7, 8, 9 et 10 mais on remarque aussi la présence
d’une bande légèrement inférieure à 14 kDa ce qui coïncide avec la forme dimérique
tronquée de Fel d 1. Cette bande est aussi présente dans le puit 5 ainsi qu’une bande
légèrement inférieure à 28 kDa. Cette dernière correspond à une autre forme
tétramérique tronquée de Fel d 1.
20
Figure 12 : Électrophorèse des échantillons de sacs anaux
et de lavages globaux des 4 femelles entières
(Source : Photo Personnelle)
La figure 12 présente la caractérisation protéique des échantillons dans les lavages
globaux (puits 2 à 5) et les sacs anaux (puits 7 à 10) après une électrophorèse en
conditions natives et un WesternBlot. Les puits 1 et 6 contiennent un échantillon de Fel
d 1 purifié (20 kDa) (ThermoFischer).
Sur ce WesternBlot on peut constater la présence d’une bande de 20 kDa dans les puits
2 et 4 qui correspond à la forme dimérique intacte de Fel d 1. Dans le puit 3 on remarque
une bande diffuse proche de 28 kDa qui coïncide avec le tétramère tronquée de Fel d 1.
Dans les puits 7 à 10 on aperçoit une bande inférieure à 20 kDa qui peut coïncider avec
la taille du dimère tronquée (14 kDa). On observe dans les puits 7,8 et 10, une bande
supérieure à 20 kDa et à la même hauteur que celle du puit 3 qui correspond à la forme
tétramérique tronquée de Fel d 1.
kDa
62
49
38
28
18
14
Figure 13 : WesternBlot des échantillons de sacs anaux et
de lavages globaux des 4 femelles entières
(Source : Photo Personnelle)
21
La figure 13 présente la révélation par WesternBlot de l’électrophorèse en conditions
dénaturantes des échantillons. La contenance des puits et l’ordre est identique à la figure
11.
Ici on peut constater la présence d’une bande diffuse autour de 20 kDa pour les puits 2
à 5 donc la présence de la forme dimérique intacte de Fel d 1 dans les lavages globaux.
On aperçoit aussi une bande diffuse autour de 38 kDa dans les puits 2 à 4, qui coïncide
avec la forme tétramérique intacte de la protéine.
Dans les puits 7 à 10, on voit apparaître une bande autour de 28 kDa qui correspond à
la forme tétramérique tronquée de Fel d 1, ainsi qu’une autre bande autour de 14 kDa
qui concorde avec la forme dimérique tronquée de la glycoprotéine.
Dans le puit 10 on discerne une bande autour de 38 kDa. Cette taille est celle de la forme
tétramérique intacte de la protéine d’intérêt.
IV.3 Les immunopurifications
Les résultats des électrophorèses après immunopurification sont présentés figures 14 et
15.
Sur la figure 14 on peut voir la présence d’une bande dans le puit 2 (BWL brut Elvira)
autour de 20 kDa. Cette taille, qui est identique à celles retrouvées lors de
l’électrophorèse en conditions dénaturantes, correspond à celle de la protéine Fel d 1
présente sous sa forme dimérique intacte sur la peau et le pelage [10]. On remarque aussi
l’absence totale de cette bande dans les puits 3 à 7 qui correspondent aux 5 fractions
récupérées.
kDa
198
62
49
38
28
18
14
6
3
Figure 14 : Gel 1 d’électrophorèse des fractions
récupérés en condition dénaturante après l’immunopurification de l’échantillon du lavage
global du chat Elvira
22
(Source : Photo Personnelle)
Sur le gel présenté à la figure 15, la bande autour de 20 kDa apparaît cette fois dans le
puit 2 mais aussi dans le puit 3. La protéine Fel d 1 est donc présente dans le couplage
Ag/Ac (C1). Par conséquent, cela indique qu’il y a un problème de fixation soit Ac
6F9/Ag Fd1, soit Protéine A/Ac 6F9.
kDa
198
62
49
38
28
18
14
6
3
Figure 15 : Gel 2 d’électrophorèse du couplage Ac/Ag et des lavages en conditions dénaturantes
(Source : Photo Personnelle)
Par la suite, nous avons mesuré la DO10 à 280 nm de l’éluat récupérer après le couplage
Protéine A/ Ac 6F9. La concentration en protéine étant nulle dans l’échantillon, on peut
affirmer que le couplage Protéine A/Ac 6F9 s’est bien réalisé.
Tout au long des immunopurifications, nous avons réalisé des dosages
spectrophotométriques à 280 nm de chaque échantillon récupéré à chaque étape des
immunopurifications afin d’évaluer la présence de protéines (Ac, Fel d 1 ou
contaminants) dans ceux-ci :
10
Densité Optique
23
Echantillon N° Sample
C1 24/05
L1 24/05
L2 24/05
L3 24/05
L4 24/05
F1 24/05
F2 24/05
F3 24/05
F4 24/05
F5 24/05
C1 08/06
L1 08/06
L2 08/06
L3 08/06
F1 08/06
F2 08/06
F3 05/06
F4 08/06
F5 08/06
F'6 08/06
F'7 08/06
F'8 08/06
Concentration
(µg/ml)
0,356
0,485
0,093
0,179
0,042
0,083
0,043
0,067
0,093
0,081
0,034
0,077
0,044
0,091
0,034
0,075
0,043
0,089
0,034
0,069
0,16
0,202
0,056
0,076
0,026
0,043
0,022
0,011
0,034
0,041
0,084
0,082
0,028
0
0,031
0,037
0,032
0,053
0,021
0,022
0,032
0,044
0,045
0,051
DO 280 nm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Tableau 1 : DO et concentration des différents volumes récupéré lors des immunopurifications
(Source : Tableau personnel)
Les résultats (Tableau 1) nous permettent de voir que la concentration protéique la plus
significative se trouve à chaque fois au niveau de l’étape de couplage Ag/Ac (C1) et
aussi au premier lavage (L1) lors de l’immunopurification.
Afin de déterminer la nature des protéines retrouvées dans les échantillons à chaque
étape de l’immunopurification, la réalisation de WesternBlot pour les deux
immunopurifications a été nécessaire pour confirmer l’absence/présence de Fel d 1 dans
les différentes fractions de couplage, lavage et éluat.
24
kDa
198
62
49
38
28
18
14
Figure 16 : WesternBlot de la 1ère immuno-purification
(Source : Photo Personnelle)
Figure 17 : WesternBlot de la 2nd
immunopurification
(Source : Photo Personnelle)
Pour le Western Blot de la 1ère immunopurification présenté figure 16, le puit 1 contient
le marqueur de taille. Du puit 2 à 5, il y a l’échantillon récupéré après le couplage Ag/Ac
et les trois lavages. Du puit 6 à 10, il y a les 5 fractions d’élution.
Sur cette image, on peut constater la présence d’une bande autour de 20 kDa dans les
puits 2 à 5 avec une intensité qui diminue au fur et à mesure. Il y a donc la protéine Fel
d 1 dans le couplage et les lavages. On peut aussi voir une bande très intense autour de
200 kDa dans le puit 2 et qui s’éteint au fur et à mesure des puits pour ensuite disparaître
dans les puits 3 à 5. Cette bande correspond surement à l’anticorps 6F9. Toujours dans
le puit 2, on remarque une bande autour de 40 kDa qui correspond à la forme
tétramérique intacte de la protéine.
Pour le Western Blot de la 2ème immunopurifcation (figure 17), les puits 1 à 4
contiennent le couplage Ag/Ac et les lavages. Les puits 7 à 10 contiennent les 5
fractions. Le marqueur de taille est au puit 6.
Sur ce Blot, on peut toujours voir la bande à 20 kDa et celle à 40 kDa dans le couplage
et les lavages. L’antigène de Fel d 1 ne s’est donc toujours pas lié à l’anticorps sur la
colonne. On remarque cependant, l’absence de la bande autour de 190 kDa et donc
probablement de l’anticorps 6F9.
25
Discussion
La fonction biologique de Fel d 1 et son éventuel rôle dans la communication chimique
des chats n’étant pas encore identifier, ce sujet avait donc pour but de développer une
méthode d’immunopurification non dénaturante afin d’obtenir la protéine pure avec sa
conformation intacte et ainsi permettre l’extraction spécifique et l’identification de son
hypothétique ligand. Ce travail préalable est nécessaire au développement de stratégies
de limitation de la production ou de l’allergénicité de cette molécule.
Les résultats des différents dosages nous confirment la présence de Fel d 1 dans les
échantillons en plus ou moins grandes quantités selon le type d’échantillons. Il a donc
été nécessaire de réaliser des électrophorèses, dans des conditions différentes, pour
déterminer la forme de la protéine présente dans les échantillons. Pour cela nous avons
donc réalisé des électrophorèses en conditions dénaturantes (haute température et SDS)
pour mieux déterminer les différentes formes de Fel d 1, puis, voulant développer une
méthode d’immunopurification non dénaturante, des électrophorèses en conditions
natives, c’est-à-dire sans facteurs dénaturants.
Les résultats nous indiquent qu’il y a, dans les échantillons, différentes formes de la
protéine d’intérêt et que ces formes ne sont pas identiques selon si la protéine se trouve
dans les sacs anaux (tétramères et dimères tronqués) ou bien dans les lavages globaux
(tétramères et dimères intacts) comme l’indiquent les figures 11 et 13. Cependant on
retrouve aussi des formes tronquées dans les lavages globaux ce qui montre bien que les
formes de Fel d 1 ne sont pas établies à chaque échantillon.
La troncation de Fel d 1 dans les sacs anaux est probablement due à la présence de
différentes protéases [14] dans le contenu des sacs anaux qui provoqueraient une
dégradation protéolytique.
Après cette validation de la présence de Fel d 1 dans les échantillons et la caractérisation
de leurs degrés de contamination, la partie sur le développement d’une méthode
d’immunopurification a débuté. Nous avons dans un premier temps réalisé une
immunopurification en suivant le protocole et les tampons du kit ThermoScientific
utilisé, dont le Gentle Ag/Ab Binding Buffer à pH 8,0. Les résultats des électrophorèses,
présentés figures 14 et 15, nous ont démontré l’absence total de Fel d 1 dans les fractions
récupérées après l’élution et une présence de la protéine dans le couplage Ag/Ac. Cette
absence significative de Fel d 1 dans les fractions peut venir de deux problèmes :
- Un mauvais couplage Protéine A/ Ac 6F9
- Un mauvais couplage Ac 6F9/ Ag Fel d 1
Pour vérifier la première hypothèse, nous avons mesuré la DO de l’éluat récupérer après
le couplage Protéine A/Ac. Cette mesure nous a indiqué une concentration nulle, donc
une absence de protéine A dans l’éluat, ce qui signifie un bon couplage.
26
La première hypothèse étant réfutée, nous avons donc réalisé une seconde
immunopurification mais cette fois-ci en changeant le temps d’incubation (une nuit au
lieu d’une heure) lors de l’ajout de la solution d’antigène (contenant l’échantillon) ainsi
que le tampon de liaison pour vérifier le couplage Ac/Ag.
Nous avons fait le choix d’utiliser du tampon TBS car son pH est équivalent (7,2-7,6) à
celui du tampon de liaison de l’ELISA dans lequel l’Ac 6F9 fonctionne bien.
L’incubation a été prolongée sur la nuit pour s’assurer d’atteindre l’équilibre de la
liaison Ag/Ac. Le résultat de cette deuxième immunopurification nous a présenté encore
une fois une absence totale de Fel d 1 dans les fractions et sa présence dans le couplage.
Le dosage spectrophotométrique de chaque fraction récupérée de chaque
immunopurification nous a démontré la présence de protéines dans les couplages Ag/Ac
et dans le premier lavage pour la première immunopurification. Pour connaître la nature
exacte de ces protéines (protéine A, Ac 6F9 ou protéine Fel d 1) nous avons donc réalisé
un Western Blot pour chaque immunopurification. Les résultats (figures 16 et 17) nous
ont clairement indiqué la présence de Fel d 1 dans l’échantillon C1 et les lavages, ainsi
que la présence d’anticorps dans le couplage et les lavages de la première
immunopurification.
Cela confirme donc bien la perte de l’antigène lors de l’étape de fixation Ag/Ac et des
lavages pour chaque immunopurification.
Ayant testé plusieurs conditions d’incubation (dont celles connues pour assurer la liaison
Ac 6F9/Ag Fel d 1 en ELISA), nous faisons l’hypothèse que cette perte est probablement
due au type de support solide utilisé. En effet, les billes d’agarose étant poreuses avec
des trous, la surface d’échange est très grande et la quantité d’Ac 6F9 appliquée n’a pas
permis de la recouvrir suffisamment. En conséquence, à cause du volume de fluide élevé
et de la surface insuffisante de fixation disponible, il est possible que l’antigène de Fel
d 1 n’ait peut-être pas pu rentrer en contact avec les anticorps et ainsi se fixer au support
solide, entraînant alors son élimination immédiatement après l’étape de fixation Ag/Ac
et lors des lavages.
Au vu des résultats obtenus, nous pouvons avoir comme perspective de poursuivre le
développement de cette méthode en changeant le type de de support solide de
l’immunopurification. Notamment, l’utilisation de billes magnétiques semble plus
judicieuse car les volumes de travail et les surfaces d’échanges sont plus petites et
favorise la probabilité de l’interaction Ag/Ac. Il suffit donc ensuite de retenir les billes
grâce à un aimant, de procéder au lavage en séparant les billes de la phase liquide dans
laquelle se trouve le matériel non retenu et ensuite éluer en remettant en suspension les
billes pour relâcher la protéine Fel d 1.
27
Conclusion
Cette étude nous a permis de caractériser des échantillons biologiques contenant Fel d 1
qualitativement et quantitativement. Nous avons pu valider le fait que la protéine est
présente sous différentes formes selon les types d’échantillon étudiés (lavages globaux
ou sacs anaux) et déterminer son ratio par rapport aux protéines totales.
Ce projet nous a aussi permis d’éliminer une méthode d’immunopurification qui n’a pas
donné les résultats escomptés. En effet, lors des différentes immunopurifications, nous
avons perdu la protéine d’intérêt lors des couplages et des lavages, avant même d’avoir
passé le tampon d’élution. Après divers changement (tampon d’élution et temps
d’incubation) et vérification, nous avons conclu que le problème venait certainement du
type de support solide utilisé.
Comme dit précédemment, la suite des recherches concernant le développement d’une
méthode d’immunopurification va d’abord nécessiter d’un changement de support
solide en utilisant des billes magnétiques plutôt qu’un gel contenant des billes d’agarose.
Si cette technique ne permet toujours pas de récupérer la protéine Fel d 1, il faudra peutêtre alors changer de protéine de liaison et utiliser plutôt la protéine G qui a une
meilleure affinité pour les anticorps 6F9 qui sont des anticorps de souris. On peut
également envisager de changer éventuellement d’Ac anti-Fel d 1, bien que l’Ac 6F9
soit connu pour avoir une très forte affinité avec Fel d 1 [17].
A titre personnel, ce stage fût une très bonne expérience du travail de technicienne de
laboratoire en recherche. Cela m’a permis de voir quel était le travail attendu en
recherche, les avantages et inconvénients du métier. Cette expérience m’a ainsi permis
de confirmer mon envie de travailler dans la recherche pour participer aux découvertes
et développement de produits pouvant améliorer la vie des patients humains ou des
animaux.
28
Liste des annexes
Annexe 1 : Résultats des prélèvements et de la remise en solution
p. 30
Annexe 2 : Plan de plaque ELISA Fel d 1
p. 31
Annexe 3 : Protocole ELISA pour le dosage de Fel d 1 (Indoor Biotechnologies) p.3233
Annexe 4 : Protocole de dosage des protéines totales au BCA (ThermoFischer)
36
p.34-
Annexe 5 : Protocole d’électrophorèse NuPAGE Bis-Tris 4-12% (ThermoFischer)
p.37
Annexe 6 : Protocole d’électrophorèse Novex 4-20% Tris-Glycine (ThermoFischer)
p. 38
Annexe 7 : Protocole de révélation des Westerns Blots (ThermoFischer)
p. 39
Annexe 8 : Plan des gels des immunopurifications
p.40
29
Annexe 1 : Résultats des prélèvements et de la remise en solution
Femelles
Nom du
chat
Masse
BWL
(g)
Volume de solution de
lavage (ml)
Masse
SA (g)
Volume de solution de
lavage (ml)
Perle
4,82
24,1
0,4
2,4
Edelweiss 6,13
30,65
0,14
0,84
Elvira
5,42
27,1
0,18
1,08
Ecaille
5,49
24,45
0,17
1,02
30
Annexe 2 : Plan de plaques ELISA Fel d 1
(Source : Photo Personnelle)
31
Annexe 3 : Protocole ELISA pour le dosage de Fel d 1(Indoor
Biotechnologies)
32
33
Annexe 4 : Protocole de dosage des protéines totales au BCA
(Thermo Fisher)
34
35
36
Annexe 5 : Protocole d’électrophorèse NuPAGE Bis-Tris 4-12%
(Thermo Fisher)
37
Annexe 6 : Protocole d’électrophorèse Novex 4-20% Tris-Glycine
(Thermo Fischer)
38
Annexe 7 : Protocole de révélation des Westerns Blots (Thermo
Fischer)
39
Annexe 8 : Plan des gels des immunopurifications
Plan des Gels :
1
2
3
4
5
6
7
8
Gel 1 :
1 : 15 µl MT
2 : 32 µl BWL Elvira
3: 32 µl F1
4: 32 µl F2
5: 32 µl F3
6 : 32 µl F4
7 : 32 µl F5
8: 15 µl MT
9: /
10: /
1: 15µl MT
2 : 32 µl BWL Elvira
3 : 32 µl C1
4 : 32 µl L1
5 : 32 µl L2
6 : 32 µl L3
7 : 32 µl L4
8 : 15 µl MT
9:/
10 : /
Gel 2:
40
Bibliographie
[1] Dabrowski et al., Cat skin as an important source of Fel d 1 allergen, J Allergy Clin
Immunol, n°86, 1990, pp. 462-465.
[2] Charpin et al., Fel d 1 allergen distribution in cat fur and skin, J Allergy Clin
Immunol, n° 88, 1991, pp. 77-82.
[3] Mata et al., Fel d 1 allergen: skin and or saliva ?, Ann Allergy, n°69, 1992, pp.321322.
[4] De Andrade et al., Fel d 1 levels in cat anal glands, Clin Exp Allergy, n°26, 1996,
pp. 178-180.
[5] Ohman et al., Allergens of mammalian origin. III. Properties of a major feline
allergen, J Immunol, n° 113,1974, pp.1668-1677.
[6] Ohman et al., Allergens of mammalian origin. V. Properties of extracts derived
from the domestic cat, Clin Allergy, n°6, 1976, pp.419-428.
[7] van Ree et al., Purified natural and recombinant Fel d 1 and cat albumin in in vitro
diagnostics for cat allergy, J Allergy Clin Immunol, n°104, 1999, pp.1223-1230.
[8] Ligabue-Braun R et al., The calcium goes meow : Effects of ions and glycosylation
on Fel d 1, the major cat allergen, PLos ONE, 2015
[9] Morgenstern et al., Amino acid sequence of Fel d 1, the major allergen of the
domestic cat : protein sequence analysis and cDNA cloning, Proc Natl Acad Sci USA,
n° 88, 1991, pp.9690-9694.
[10] Bienboire-Frosini et al., Distribution of core fragments from the major cat allergen
Fel d 1 is maintained among the main anatomical sites of production, Int Arch Allergy
Immunol, 2009.
[11] Carayol et al., Fel d 1 production in the cat skin varies according to anatomical
sites, Allergy 55¸ pp. 570-573, 2000
[12] Thermo Fisher, Protocol Micro BCA Protein Assay Kit.
[13] Vervloet D et al., Role of desensitization in the treatment of respiratory allergies,
Rev Mal Respire, n°17, 2000, pp. 287-292
41
[14] Bienboire-Frosini., Caractérisation du polymorphisme structural et fonctionnel de
l’allergène majeur du chat, Fel d 1, Thèse, 2009
[15] Bienboire-Frosini et al., Variable content of Fel d 1 variants in house dust and cat
extract may have an impact on allergen measurement, J Investing Allergol Clin
Immunol, n°22, 2012
[16] Kaiser L et al., The crystal structure of the major cat allergen Fel d 1, a member
of the secretoblogin family, J Biol Chem, n° 278, 2003, pp. 37730-37735
[17] Bienboire-Frosini et al., Distribution of core fragments from the major cat allergen
Fel d 1 is maintained among the main anatomical sites of production, J Int Arch of
Allerol and Immunolo, n°152,2010, pp. 197-206.
[18] Chapman MD et al., Monoclonal antibodies to the major feline allergen Fel d I.
II. Singlestep affinity purification of Fel d I. N-terminal sequence analysis, and
development of a sensitive two-site immune assay to assess Fel d I exposure, J
Immunol¸n°140, 1988, pp. 812-818
Sitographie
Magniez, Frédérick. La technique ELISA, 2008, http://www.technobio.fr/article18589062.html, (consulté le 28 Avril 2016)
Johnson, Mary (traduit par Galet Colette), Quantification de protéines, 2015,
http://www.labome.fr/method/Protein-Quantitation.html, (consulté le 10 Mai 2016)
Boucher, Guillaume, Western Blot introduction et optimisation, 2013,
http://docs.abcam.com/pdf/events/western-blot-introduction-et-optimisation.pdf,
(consulté le 15 Mai 2016)
Ladram Ali et Camus Gilles, La chromatographie, 2012,
vie.ens.fr/content/la-chromatographie, (consulté le 20 Mai 2016)
42
http://planet-
Résumé
L’IRSEA a pour but depuis 1995 de trouver et créer des solutions pour améliorer la
cohabitation entre espèces et le bien-être animal en utilisant des sémiochimiques tels
que les phéromones.
La protéine Fel d 1, allergène majeur du chat, est responsable de la deuxième allergie
respiratoire la plus répandue après les acariens. Si la structure de la protéine Fel d 1 est
connue [9], ses propriétés et ses fonctions ne le sont pas encore totalement.
L’objectif de ce stage était de développer une méthode de purification non dénaturante
afin d’identifier le possible ligand de cette protéine. Pour cela nous avons testé différents
protocoles d’immunopurification avec la protéine A et les anticorps monoclonaux
de souris 6F9 avant d’envisager son extraction et son identification par GC-MS11.
Summary
Since 1995 the IRSEA has aimed at finding and creating solutions to improve
cohabitation between species and animal welfare using semiochemicals such as
pheromones.
The protein Fel d 1, the major cat allergen is responsible for the second most common
respiratory allergy after mites. If Fel d 1’s structure is known [9], its properties and
functions are not yet fully.
The objective of this internship was to develop a gentle purification method in order to
identify this protein’s possible ligand. To do so, we have tested differents
immunopurification protocols with protein A and 6F9 mouse monoclonal antibody
before performing its extraction and identification by GC-MS.
11
Chromatographie Gazeuse – Spectrométrie de Masse
43