Petit problème : Deux cystéines sont introduites par mutagénèse

Petit problème :
Deux cystéines sont introduites par mutagénèse dirigée sur la sous-unité γ et sur la sous-unité β de l’ATP synthase
bactérienne. Ces deux cystéines se localisent dans une région de contact entre ces 2 sous-unités. En présence d’un
agent pontant spécifique des cystéines, est-il possible de synthétiser de l’ATP ? Que se passe t’il si l’on ajoute un
agent réducteur ?
Problème 1 (8,5 pts) :
Chez une patiente souffrant d’un affaiblissement musculaire progressif qui la rend inapte à tout effort, on étudie
la chaîne respiratoire mitochondriale, ainsi que la capacité de celle-ci à soutenir une synthèse d’ATP.
Des mitochondries sont isolées à partir d’une biopsie de muscle obtenue sur cette patiente et les activités
enzymatiques caractéristiques de la chaîne respiratoire (regroupant UN ou DEUX complexes) sont dosées. Les
résultats suivants sont obtenus :
Activités enzymatiques (nmol/min/mg protéines mitochondriales) :
NADH-Cytochrome c réductase
Succinate-Cytochrome c réductase
Succinate déshydrogénase
Cytochrome c oxydase
ATP synthase
*=Les différences entre patient et témoin sont considérées comme
Chez la Patiente
0
8
60
1200
2000
non significatives
Chez le Témoin
136
340
90*
950*
1200*
Définir en termes de complexes, les différentes activités enzymatiques dosées dans le tableau (3pts)
Les résultats du tableau précédent vous permettent-ils de localiser l’anomalie au niveau de cette chaîne
respiratoire ? Si oui quelle est cette anomalie ? (1pt)
Dessiner les courbes de consommation d’oxygène en fonction du temps que l’on obtiendrait si ces mêmes
mitochondries étaient incubées en présence des substrats oxydables suivants (de l’ADP est toujours ajouté après
l’introduction des subtrats) :
-Pyruvate (1pt)
-Succinate + Roténone (inhibiteur du complexe I) (0,5pt)
-Ascorbate + TMPD (Donneur artificiel d’électrons au cytochrome c) (1pt)
Dessinez parallèlement les courbes correspondantes obtenues avec des mitochondries normales (1,5pt). Avec quel
type d’inhibiteur de la chaîne respiratoire obtiendrez-vous, avec des mitochondries normales, des courbes
identiques à celles obtenues avec les mitochondries de la patiente ? (0,5pt)
Problème 2 (4 pts):
La figure ci-dessus décrit le transport des électrons chez la bactérie Rhodobacter sphaeroïdes, avec Bchl pour
bactériochlorophylle. A votre avis, est ce que cette bactérie peut synthétiser de l’ATP ? Si oui, comment ? Si
non, pourquoi ? A quoi sert la synthèse de NADH ? Pourquoi cette bactérie illustre t’elle parfaitement la
bioénergétique des êtres vivants ?
Problème 3 (2 pts/ 10 min):
Pour évaluer l’activité de la chaîne respiratoire de mitochondries isolées à partir de cellules de foie de rat, vous
avez à votre disposition : du tampon contenant du phosphate, un oxygraphe, de l’ADP, du NADH et les
mitochondries isolées. Quel tracé représenteriez vous ?
Dessinez le tracé attendu :
Surprise, le tracé obtenu est le suivant :
Concentration
en O2
Mitochondries
NADH
ADP
Temps (min)
On vous informe que les mitochondries utilisées dans cette expérience viennent de cellules génétiquement modifiées
et qu’ainsi les mitochondries de ces cellules sont incapables de produire une protéine X. On vous dit que cette
protéine est spécifique des eucaryotes. D’après le tracé obtenu et les indications ci-dessus, quelle est la fonction
de cette protéine X ? Explicitez votre réponse
Problème 4 (5 pts/20 min):
1-A partir de mitochondries de foie de rat, vous avez isolé un complexe protéique liposoluble qui contient plusieurs
sous-unités. Certaines de ces sous-unités contiennent un ou deux centres REDOX. Vous avez identifié certains de
ces centres et mesurés leur potentiel d’oxydoréduction. Pour l’un de ces centres, appelé centre X, le E0’ mesuré
est de 200mV. En Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) et en Spectrophotométrie, vous obtenez les
signaux suivants : voir 1. A votre avis, de quel centre s’agit-il ?
2-Vous avez aussi isolé une fraction hydrosoluble pour laquelle vous obtenez le signal suivant : voir 2. Qu’il y a-t-il
dans cette fraction ?
Voici les E0’ obtenus pour chacun de ces centres :
Centre A = 215 mV ; Centre B= 50mV ; Centre C= -100 mV ; Fraction soluble= 235 mV.
Le centre A est un hème de type c1 ; les centres B et C appartiennent à la même sous-unité protéique.
De quel complexe protéique s’agit-il ? Comment s’effectue le transfert d’électrons ?
2
Fraction soluble
analysée par
RPE
1
Centre X
analysé par
RPE
4
3
2
1
Valeur de g
Fraction soluble
analysée par
Spectrophotométrie
4
3
2
1
Valeur de g
Centre X analysé par
Spectrophotométrie
350nm
400nm
450nm
350nm
400nm
450nm
Problème 5
1-Des chloroplastes isolés sont mis dans une solution étalonnée à pH 7 pendant 60 secondes. Puis, on ajoute de
l’acide chlorydrique (HCl), de l’ADP et du phosphate radioactif pendant 15 secondes. Enfin, la réaction est stoppée
et la radioactivité du mélange réactionnel est mesurée par une technique qui permet d’exclure la radioactivité du
phosphate libre.
Pourquoi mesure t’on la radioactivité du mélange réactionnel? Justifiez votre réponse.
2-La même expérience est réalisée en remplaçant cette fois ci l’HCl par de la soude (NaOH). Va-t-on, dans ce
cas, mesurer plus ou moins de radioactivité que dans l’expérience 1 ? Justifiez votre réponse.
3-Enfin, dans une ultime expérience, des chloroplastes isolés mis dans une solution à pH 7, sont illuminés pendant
75 secondes puis la réaction est stoppée et la radioactivité mesurée.
Va-t-on mesurer plus ou moins de radioactivité que dans l’expérience 1 ? Justifiez votre réponse
4-Quel concept de bioénergétique est démontré par l’ensemble de ces expériences ?
Problème 6 (4pts):
Le complexe respiratoire bactérien CoCo d’Escherichia coli oxyde du formiate et réduit du nitrate. Calculer
l’énergie libre standard libérée au cours de l’oxydation d’1 mole de formiate et de la réduction d’une mole de
nitrate.
HCOO- CO2+ H+ + 2é
E°’ CO2+H+/HCOO- =-420 mV
E°’ NO3-/NO2- = +400 mV
NO2- + H2O NO3-+ 2H+ + 2é
F=96500 J.mol-1.V-1
R= 8.31 J.mol-1.K-1
T=298K
Calculer l’énergie libre standard consommée lorsque une mole de proton est transloquée du cytoplasme au
périplasme avec ∆pH = 1 ; ∆Ψ = -0,1V.
Le complexe Coco peut il transloquer des protons ? si oui combien ?
Problème 7 :
Pour évaluer l’activité de la chaîne respiratoire de mitochondries isolées, vous avez à votre disposition : du tampon
contenant du phosphate, un oxygraphe, de l’ADP, du NADH et les mitochondries isolées. Vous ne savez pas à
partir de quel tissu elles ont été isolées. Si les mitochondries ont été isolées à partir du foie de rat, quel tracé
représenteriez vous ?
Dessinez le tracé attendu :
Surprise, le tracé obtenu est le suivant :
Concentration
en O2
Mitochondries
NADH
ADP
Temps (min)
Vous en déduisez qu’il ne s’agit pas de mitochondries isolées à partir du foie de rat mais d’un autre tissu, lequel à
votre avis ? Explicitez votre réponse dans le cadre ci-dessous :