I+Oc Z-‐Y+/I+O+Z+Y+ I+Oc Z+Y+/I+O+Z+Y+ +plus I+Oc Z+Y+/I+O+Z-‐Y

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N° étudiant :
UM2-Fac des Sciences-L2- Biologie Moléculaire: (HLBI307) .CC2 - 10 décembre 2014-Durée : 1 h
L’expression écrite sera scientifique et concise Barême prévisionnel : exercice 1: 4 points ; exercice 2: 6 points ; exercice 3: 4 points ; exercice 4: 6 points Exercice 1 Les génomes de 100 bactéries d’un clone de bactéries E. coli sont séquencés. On dénombre 4500 mutations pour 100 génomes. Si l’on considère que ces mutations sont apparues lors de la dernière division et qu’on néglige l’action de la réparation post réplicative, quel est alors le taux d’erreur de l’ADN polymérase III ? Cette ADN polymérase vous paraît-­‐ elle fonctionnelle ? (taille du génome de E.coli : 4,5×106 pb). Les calculs très simples sont réalisables sans machine. 4500 mutations pour 100 bactéries → 45 mutations par bactéries. Taille génome E. coli : 4,5 106 pb. Le génome de chaque bactérie résulte de la synthèse de 4,5 106 nucléotides en utilisant un des brins parental comme modèle. Donc 45 mutations pour 4,5 106 nucléotides incorporés par la polymérase→ 1 mutation pour 4,5 106/45= 1,0 105 nucléotides La fréquence d’erreur de l’ADN polymérase munie de son activité d’édition est normalement de 1 pour 109 nucléotides. Donc cette polymérase n’est pas fonctionnelle ; elle est dépourvue de l’activité d’édition Exercice 2 La régulation de l’expression de l’opéron lactose a été étudiée à l’aide de souches bactériennes comportant deux exemplaires de la région lac (diploïdes partiels). Comment sera exprimée la b-­‐
galactosidase (produit du gène lac Z) ainsi que la b-­‐galactoside perméase (produit du gène Y) en l’absence ou en présence d’inducteur dans les différentes souches dont le génotype est mentionné. (NB les signes -­‐
,+, c, s du génotype ne sont pas mis en indice pour plus de clarté) Complétez le tableau ci-­‐dessous en précisant le niveau d’expression par -­‐ (signe moins) ou par + (signe plus) b-­‐galactosidase b-­‐galactoside perméase Absence d’inducteur -­‐moins Présence d’inducteur +plus Absence d’inducteur +plus Présence d’inducteur I+Oc Z+Y+/I+O+Z+Y+ +plus I+Oc Z+Y+/I+O+Z-­‐Y-­‐ +plus I+O+Z+Y+/I-­‐O+Z-­‐Y+ -­‐moins +plus +plus +plus +plus +plus +plus +plus -­‐moins +plus Is O+Z-­‐Y+/I+O+Z+Y-­‐ -­‐moins -­‐moins -­‐moins Génotype I+Oc Z-­‐Y+/I+O+Z+Y+ +plus -­‐moins NB I+ est dominant sur I-­‐ ; lac oc est cis dominant ; Is : mutation lac I « super-­‐represseur » Exercice 3 La protéine thrBS régule l’expression de plusieurs opérons en réponse à la présence ou à l’absence de l’acide aminé thréonine dans le milieu. Ainsi, lorsqu’on mesure l’expression de l’opéron TSV dans une souche bactérienne sauvage et dans une souche mutante on observe le résultat suivant: .. Expression de l’opéron TSV Souche sauvage Souche mutante thrBS-­‐ + thréonine Expression faible Expression forte -­‐ thréonine Expression forte Expression forte a -­‐ Proposez 1 mécanisme de régulation permettant d’expliquer ces observations pour l’opéron TSV Un mécanisme de Régulation Négative explique les observations . La synthèse de l’ARNm de l’opéron est contrôlée par un répresseur qui bloque la transcription, la présence du répresseur sur l’ADN dépend du taux de thréonine dans la cellule. En effet : pour la souche sauvage l’expression de l’opéron est faible en présence de thréonine, elle est forte en son absence. Pour la souche mutante pour la protéine thr BS , l’expression de l’opéron est forte en présence et en absence de thréonine . Comme dans ce cas, la protéine thr BS n’est plus présente ou elle est non fonctionnelle, on peut déduire qu’elle est un répresseur qui ne peut plus interagir avec l’opérateur, en présence de thréonine, pour bloquer la transcription (permettant l’accès de l’ARN polymérase au promoteur et donc la transcription). A l’état sauvage, la protéine thr BS inhibe la transcription en présence de thréonine, inversement en absence de thréonine cette protéine n’exerce plus d’inhibition sur l’opéron TSV (NB dans le cadre de l’exo on ne peut pas affirmer si la thréonine se lie directement au répresseur fixé sur l’ADN et est un co-­‐répresseur (comme pour l’opéron Trp) ou bien si c’est un intermédiaire de la chaine métabolique induit par la thréonine De même comme on n’a pas d’indication plus précise il semble qu’on ne puisse dire si c’est un opéron dont les produits des gènes interviennent dans une voie de synthèse ou une voie de dégradation ) On utilise la technique de protection contre la nucléase (footprint DNase assay) avec une matrice d’ADN, correspondant aux séquences régulatrices (promoteur et opérateur) de l’opéron TSV. La matrice ADN spécifique de l’opéron TSV marquée au 32P est incubée, ou non, soit avec l’ARN polymérase, soit avec la protéine ThrBS puis traitée par une endonucléase. On sépare ensuite par électrophorèse dénaturante les fragments d’ADN obtenus et on révèle le résultat par autoradiographie. Le résultat est schématisé dans la figure ci-­‐dessous (Schéma 1) : Opéron TSV b -­‐ Que déduisez-­‐vous de l’ensemble de ces expériences ? Expliquez votre raisonnement en une ou deux phrases Remarque : les mécanismes de régulation génique par la thréonine et la protéine ThrBS ont pu être modifiés pour les besoins de l’exercice. La technique de foot-­‐print suivie d’une électrophorèse dénaturante et d’une autoradiographie révèle les empreintes de l’ARN polymérase et de la protéine thr BS au niveau des séquences régulatrices de l’opéron TSV( c’est à dire promoteur et opérateur) : schéma 1, on voit que l’empreinte de la protéine thr BS recouvre partiellement celle de l’ARN polymérase. Ainsi, lorsque la thréonine est présente, la protéine thr BS se fixe au niveau des séquences régulatrices de l’opéron (opérateur) et empêche physiquement l’accès de l’ARN polymérase au promoteur afin d’initier la transcription. En absence de thréonine, comme l’expression est forte, la thr BS n’est pas fixée à l’opéron et l’ARN polymérase peut débuter la transcription spécifique. Aussi, on comprend que, dans la souche mutante si le répresseur thr BS est muté et perd son affinité pour l’opérateur, l’ARN pol peut transcrire fortement les gènes de l’opéron en permanence . On confirme l’hypothèse émise en a : cette protéine thrBS, est un répresseur ,quand elle est mutée elle ne peut plus interagir avec l’opérateur permettant l’accès de l’ARN pol au promoteur et donc une transcription forte . (Rappel : In vitro, lorsque le complexe ADN promoteur –ARN polymérase est crée, la protéine protège l’ADN de la dégradation par une nucléase, de même la protéine thr BS en interaction avec l’opérateur empêche l’accès de la nucléase à l’ADN ). Exercice 4 Dans une expérience de transcription in vitro, on utilise comme ADN matrice une portion du génome d’Escherichia coli avec promoteur(s). Par ailleurs, on dispose de l’ARN polymérase core-­‐enzyme, du facteur sigma 70 et d’une protéine H. Toutes ces protéines (ou sous-­‐unités) sont purifiées. Cet ADN matrice est incubé dans des conditions ioniques convenables en présence de NTP, dont du UTP radioactif et d’une ou de plusieurs protéines mentionnées ci-­‐dessus. Après 20 minutes d’incubation, la radioactivité TCA précipitable (associée aux ARNs synthétisés) est mesurée pour toutes les conditions testées (expériences de A à D). Les résultats sont les suivants, ils sont exprimés en coup par minute (cpm) ( les cpm sont proportionnels aux désintégrations par minute): A) + core enzyme seul 150 B) + core enzyme + sigma 70 18 150 C) + core enzyme + protéine H 160 D) + core enzyme + sigma 70 + protéine H 298 920 a -­‐ Comparez les résultats des expériences A) et B). Comment expliquez-­‐vous les 150 cpm de l’expérience A ? En A la quantité de radioactivité est très faible, donc très peu d’ARN ont été synthétisés. En B la quantité de radioactivité est 1000 fois plus importante : on a donc produit une quantité importante d’ARN. En A la quantité d’ARN synthétisée est très faible car l’ARN polymérase est dépourvue du facteur sigma, seule une faible transcription abortive non spécifique est observée. En B En présence de sigma l’ARN polymérase reste liée au niveau du promoteur et une transcription abondante et spécifique est initiée b -­‐ Quel pourrait être le rôle de la protéine H ? Justifier complètement votre (vos) déduction(s) sans omettre de dire sur quels résultats expérimentaux vous vous appuyez. La protéine H n’est pas un facteur sigma. En effet dans l’expérience C, l’ajout de cette protéine, au core enzyme, ne permet pas une transcription abondante et spécifique à partir du promoteur : on a le même niveau de transcription que dans l’expérience A. Si on compare l’expérience B et l’expérience D, on observe qu’en présence du facteur sigma, la transcription est beaucoup plus abondante lorsqu’on rajoute le facteur H (18 fois). Ce facteur agit donc comme un activateur de la transcription Puis , dans un autre type d’expérience, cet ADN matrice double brin a été dénaturé, les deux chaînes de l’ADN ont été séparées (chaine S et chaine R) et chacune a été déposée sur un filtre (filtre S, filtre R) en vue d’une hybridation avec les produits radioactifs synthétisés dans l’expérience D. Les expériences d’hybridation, de lavage ont été conduites dans les mêmes conditions expérimentales pour les deux filtres. La radioactivité est retenue seulement, de façon significative sur le filtre R. c -­‐ Quelle information déduisez vous de cette dernière expérience? La radioctivité est retenue sur le filtre R : donc les ARNs radioactifs, synthétisés dans l’expérience D, se sont hybridés uniquement avec le brin d’ADN immobilisé sur ce filtre R. Ces ARNs ont donc la séquence complémentaire du brin R. Ce brin R ( chaine R) a servi de matrice pour la synthèse des ARNs et Le brin S ( chaine S) est le brin codant. Fichier avec quelques commentaires des corrections à suivre.