SOD - PNMVS

Les analyses virologiques
pour le diagnostic et la prise
en charge thérapeutique de
l’infection au VHC
Donald Murphy, PhD
Laboratoire de santé publique du Québec
PNMVS, Montréal, 15 octobre 2013
Plan de la présentation
Introduction au virus
Tests virologiques pour le diagnostic
 Détection des anticorps contre le VHC
 Détection du virus (test ARN qualitatif)
Tests virologiques pour la prise en charge thérapeutique
 Génotypage
 Mesure de la charge virale (test ARN quantitatif)
 Détermination génotypique de la résistance aux
inhibiteurs de la protéase
2
Virus de l’hépatite C
Identifié à la fin des années 1980
Se réplique dans le cytoplasme des
hépatocytes
Demi-vie 2,7 heures; production virale de
1010 à 1012 virions / jour
Virus à transmission hématogène
Appartient à la famille Flaviviridae, genre
hépacivirus
3
Arbre phylogénétique de membres de
la famille Flaviviridae (hélicase)
Kapoor A et al. mBio 2013;
doi:10.1128/mBio.00216-13
4
Arbres phylogénétiques de la région de
l’hélicase des hépacivirus et pegivirus
Kapoor A et al. mBio 2013;
doi:10.1128/mBio.00216-13
5
Prévalence du VHC et évolution de la maladie
3% de la population mondiale
170 millions de personnes
0,7% de la population du Canada
240,000 personnes, 50,000 au Québec
Risque de chronicité (variable)
75-80% chez l’adulte
Risque de cirrhose
 jusqu’à 10% dans 20 ans, 20% dans 30 ans
Mortalité et incidence du carcinome hépatocellulaire
relié à la cirrhose
1 – 4% / année
6
Organisation génomique du VHC
Moradpour et al., 2007
7
Tests virologiques pour le diagnostic
Détection des anticorps anti-VHC
Détection du virus – test de détection
qualitative de l’ARN du VHC
8
Antigènes utilisés dans les tests de
détection d’anticorps anti-VHC
C E1
E2
NS2
NS3
5’
NS4
A
NS5
B
A
B
3’
Génération
1e
2e
SOD
c100-3
SOD
c22-3
SOD
c200
SOD
c22-3
SOD
c200
3e
SOD
9
NS5
Caractéristiques des tests de dépistages
10
Génération Introduction
Caractéristiques
Première
NS4
Mai 1990
• Réduction de 80% dans l’incidence d’hépatite
post-transfusionnelle non-A, non-B
 délai d’apparition des anticorps dans
l’infection aiguë
 absence d’une réponse anti-VHC décelable
Deuxième
NS4
C, NS3
Mars 1992
• Plus sensible que les essais de 1e génération
 anticorps contre C et NS3 apparaissent
plus tôt dans la période fenêtre
 détection des patients anti-NS4 (c100-3 et
5-1-1) négatifs
Troisième
NS4
C, NS3
NS5
Juin 1996
• Plus sensible que les essais de 2e génération
sur des panels de séroconversion
 en raison d’une plus grande sensibilité à
NS3 et non à NS5
Comparaison des antigènes utilisés dans
les tests de détection des anti-VHC
Trousse
AxSym 3.0 (MEIA)
(1-150)
Architect (CMIA)
(1-150)
ADVIA Centaur (CIA)
c22p
(10-53)
Elecsys (ECL) (peptide +
C
protéines recombinantes)
(peptide)
VITROS Ortho (CIA)
Ortho ELISA (EIA)
c22-3
(2-120)
Monolisa (EIA) (3 protéines
recombinantes E.coli)
11
Core
C
E1
E2
P7
NS2
NS3
NS4
HCr43
c33c
c100-3
(1192-1457) (1569-1931)
c200
(1192-1931)
HCr43
c33c
(1192-1457)
NS5
(2054-2995)
NS4
(peptide)
c200
(1192-1931)
NS3
NS5
(2054-2995)
c100-3
(1569-1931)
c200
(1192-1931)
NS3
(Ag recomb)
NS5
NS4
NS5
(2054-2995)
Antigènes utilisés dans le test
d’immunoblot CHIRON RIBA HCV*
C E1
E2
NS2
NS3
5’
NS4
A
NS5
B
A
B
3’
Génération
SOD
1e
SOD
SOD
c22-3
2e
SOD
c33c
SOD
c22-p
SOD
5-1-1-p
3e
c33c
SOD
c100-3
5-1-1
c100-3
5-1-1
c100p
SOD
* En mars 2013, Ortho Clinical Diagnostics annonce l’abandon de
la fabrication de la trousse RIBA HCV 3.0 SIA par Novartis Diagnostics
12
NS5
Tests immunoblots sur bandelettes
INNO-LIA HCV Score*
Innogenetics
* Utilisé par le Laboratoire national
de microbiologie, ASPC
13
Chiron RIBA HCV 3.0 SIA†
†
Ce test n’est plus disponible
Algorithme provincial de diagnostic de
l’infection par le virus de l’hépatite C
Épreuve de détection des anticorps (ex. hôpital)
Rapport final
Absence
d’anticorps VHC
Non réactif
Réactif
s/co < X
s/co ≥ X
S/co = signal/cut-off :
X = 12
X = 15
X = 11
X = 10
14
AxSym
Vitros ECI
Advia Centaur
Architect
Soumettre au
LSPQ pour
confirmation
Résultat réactif
émettre final
Algorithme provincial de diagnostic de
l’infection par le virus de l’hépatite C (suite)
Épreuve de dépistage des anticorps
Hôpital
Anti-VHC réactif (s/co < X)
LSPQ
Duplex EIA1/EIA2
HR/HR
Présence
d’anticorps VHC
Positif
Autres profils
Indéterminé
NR/NR
Négatif
EIA1 : OrthoTM HCV 3.0 ELISA Test System with Enhanced SAVe
EIA2 : Monolisa® anti-HCV PLUS Version 2 (Bio-Rad)
HR : haut réactif = s/co ≥ 4.0; NR : non réactif = s/co < 1.0
15
Absence
d’anticorps VHC
Signification d’un résultat anti-VHC positif
• Indique une exposition au VHC dans le passé
• « La présence d’anticorps anti-VHC ne permet pas de
distinguer les porteurs cliniques des patients guéris. La
recherche de l’ARN du VHC par un test RT-PCR qualitatif
est recommandée pour déterminer s’il y a présence d’une
virémie. »
 En 2011, les représentants des laboratoires impliqués
dans les épreuves spécialisées pour le VHC à
recommandé l’ajout de ce commentaire au rapport
anti-VHC positif
16
Signification d’un résultat anti-VHC
« indéterminé » (LSPQ)
• Résultat non concluant, il n’est ni positif ni négatif
• Commentaire ajouté sur le rapport du LSPQ
 « Le résultat de la recherche des anticorps
anti-VHC étant indéterminé, une recherche de
l’ARN du VHC par un test RT-PCR qualitatif
est recommandée pour déterminer s’il y a
présence d’une virémie. »
17
Changement au processus de confirmation
à compter du 5 janvier 2011 (LSPQ)
• La confirmation des anti-HCV ne sera plus effectuée
chez les patients connus positifs sur 2 sérums
antérieurs, le commentaire suivant apparaîtra aux
rapports :
Nos dossiers indiquent que ce patient est connu positif à
une épreuve de confirmation des anticorps VHC sur au
moins deux sérums antérieurs. Il est donc jugé inutile de
répéter une épreuve de confirmation. Le diagnostic de
l’infection active doit être établi par une détection de
l’ARN du VHC à l’aide d’une épreuve qualitative.
18
Détection qualitative de l’ARN
génomique du VHC*
Résultats
Positif
 présence d’ARN VHC
ARN génomique
Négatif
 absence d’ARN VHC
(au seuil de détection)
* L’épreuve qualitative est le seul test de détection de
l’ARN du VHC approuvé au Canada pour le diagnostic de
l’infection active.
19
Détection qualitative de l’ ARN
génomique du VHC
Trois sites désignés (déc. 2012)
Montréal
CHUM – Hôpital Saint-Luc
CUSM – Hôpital Royal Victoria
Québec
CHU de Québec – Hôtel-Dieu de Québec
20
Détection qualitative de l’ARN VHC
Trousses utilisées au Québec
Trousses de Roche (RT-PCR classique)
 COBAS Amplicor HCV 2.0 Test
 COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HCV 2.0
Test (CHUM seulement)
Cible génomique : région 5 prime non codante
(5’NCR)
Limite de détection 50 UI/ml
 Limite établie par la détection d’au moins 95%
des échantillons ayant un taux d’ARN à 50 UI/ml
21
Calcul de la limite de détection
Amplicor HCV Test, version 2.0
Détecté
UI/ml*
Nombre
testé
Nombre
%
150
125
100
75
50
25
15
12
11
12
117
108
107
11
12
11
12
117
108
96
8
100
100
100
100
100
89,7
72,7
* Standard international de l’OMS (96/790) dilué dans du plasma
22
Détection qualitative de l’ ARN
génomique du VHC
Anti-VHC
Réactif/Positif
Indéterminé
ARN qualitatif*
ARN qualitatif*
Positif
Négatif
Positif
Répété l’ARN qualitatif
dans 4 - 6 mois
* Bien libeller la demande d’analyse; voir lettre circulaire
23
Négatif
Tests virologiques pour la prise en
charge thérapeutique
Génotypage
Mesure de la charge virale – test de
détection quantitative de l’ARN du VHC
Détermination génotypique de la résistance
aux antiviraux
24
Arbre phylogénétique du VHC
Génome complet
NS5B
QC69
QC69
HC-J8
HCV-Tr
HC-J6
b
NZL1
a
a
7
3
d
03-18
ED43
?
AJ851228
g
a
HCV-BK
HC-G9
H77
k
a
g
6
h
1
JK046
a
c
5
b
?
a
HC-G9
VN004
VN405
k
2
b
H77
h
c
AJ851228
BEBE1
EUH1480
0.1
25
JK046
7
3
GX004
HCV-BK
b
4
a
JK049
6
e
e
k
EUHK2
a
c
0.1
NZL1
GX004
b
VAT96
k
5
EUHK2
d
a
HCV-Tr
2
4
1
a
a
BEBE1
c
k
JK049
03-18
ED43
b
CS101300
CS101285
EUH1480
VN405
HC-J8
HC-J6
k
VAT96
VN004
Virus de l’hépatite C
Classification de l’ARN viral en génotypes
Génotype
Sous-type
1
a-l
2
a-r
3
a-k
4
a-v
5
a
6
a-w
7 (provisoire)
a
 Génome recombinant (ex. RF_2k/1b)
26
Exemple d’un génome recombinant
Génome parental 1 (ex. 1b)
5’
C
E1
E2
P
7
NS2
NS3
NS
4A
NS4B
NS5A
NS5B
3’
NS5B
3’
Génome parental 2 (ex. 2k)
5’
C
E1
E2
P
7
NS2
NS3
NS
4A
NS4B
NS5A
Génome recombinant (ex. 2k/1b)
5’
27
C
E1
E2
P
7
NS2
NS3
NS
4A
NS4B
NS5A
NS5B
3’
Recombinants naturel du VHC
Point de
Recombinant Recombinaison Souche
(nucléotides*)
Référence
St-Pétersbourg,
Kalinina et al. 2002
Russie
Ho Chi Minh
Noppornpanth et
D3
City, Vietnam
al., 2006
SE-03Manille,
Kageyama et al.,
07-1689
Philippines
2006
2k/1b
NS2 (-235)
2i/6p
NS2-NS3
(-15 à 21)
2b/1b
NS3 (36-37)
2/5
NS3 (12 à 32)
R1
France
(sud-ouest)
Legrand-Abravanel.
et al., 2007
2b/6w
NS3 (9)
D177
Taïwan
Lee et al., 2010
1b/1a
NS5B
PE22
Lima, Pérou
Colina et al., 2004
* Par rapport à NS3
28
Géographie
N687
Génotype décrit par le LSPQ
Génotype
1j,1k
2m
2r
3i
4q
6q, 6r, 6s
7*
Origine
Haïti
Vietnam
Haïti
Continent Indien
Rwanda/Burundi
Cambodge
République démocratique
du Congo
*Séquence génomique complète déterminée au LSPQ en 2007
29
Rôle du génotype dans le traitement
Génotype 1
 Peg-interféron alfa + ribavirine + inhibiteur de
protéase
Autres génotypes (2 à 6)
 Peg-interféron alfa + ribavirine
 Génotypes 2 et 3 – 24 semaines (Tx classique)
 Génotypes 4, 5, 6 – 48 semaines (Tx classique)
30
Génotypage effectué par séquençage et
inférence phylogénétique (LSPQ)
5’
NCR
C
E1
E2
P
7
NS2
NS3
NS
4A
NS4B
NS5A
NS5B
196 pb
424 pb
340 pb
3e
2e
1e
- Premier choix région NS5B (génotype/soustype; 97%)
- Deuxième choix région C/E1 (génotype/soustype; 0,5%)
- Troisième choix région 5’NC (génotype; 2,5%)
•
Charge virale < 10 000 UI/mL
Murphy DG et al., 2007. J. Clin. Microbiol. 45 (4): 1102-1112.
31
NCR
3’
Arbre phylogénétique du VHC
Séquences de la région NS5B
6h-VN004
6
6g-JK046
6d-VN235
6e-VN711
BM116151
6e-VN540
6b-Th580
6a-EUHK2
BM116100
BM115860
BM116155
BM116144
1a-HCV1
BM116068
a
1
BM116059
b
c
1c-HCG9
BM115929
2b-HCJ8
2a-HCJ6
2k-VAT96
2c-BEBE1
5a-EUH1480
2
5
4
3
0.05
32
BM116002
BM115644
1b-HCVBK
109484C+4r
BM109484
4r-FrSD120
4k-B14
4d-SD006
4c-GB358
4a-ED43
3b-HCVTr
3k-JK049
BM116165
BM116158
BM116062
3a-NZL1
Arbre phylogénétique du VHC
Séquences de la région NS5B
a
Génotype 1
1a-HCV1
1a-QC198
1k-QC328
1k-QC82
1j-QC329
1j-QC2
k
j
l
c
i
d
b
f
h
g
e
0.02
33
BM116059
1l-M5186N
1l-QC390
1l-CM1427
1c-QC165
1c-HCG9
1i-QC77
1i-FR16
1d-QC167
1d-NL29
1b-QC250
1b-HCVBK
1f-FR2
1h-QC94
1h-CM1521
1g-QC71
1g-2152
1e-QC248
1e-CAM1078
3a
E
A-2006
F
A-2003
G
3a-NZl1
I
J
K
L
M
N
O
1a
P
Q
1a-HCV1
S
1
1b
0.1
34
B-2004
B-2006
T
U
V
W
X
Y
1b-HCVBK
H
R
Z
D-2003
C-2002
Exemple de
comparaison de
souches à partir de
la région NS5B
Génotypage du VHC (LSPQ)
Effectué à l’aide d’une technique maison développée
au LSPQ
Limite de détection : entre 12 et 100 UI/ml
Le requérant doit indiquer sur le formulaire d’analyse
du LSPQ que la personne est connue positive pour
l’ARN du VHC
Le génotypage n’est effectué qu’une seule fois sauf
s’il y possibilité de réinfection – ceci doit être spécifié
sur le formulaire d’analyse du LSPQ pour que le test
de génotypage soit refaite
35
Génotypage du VHC
Échantillons et bénéficiaires
2000
1800
1600
Nombre
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
07/08
08/09
09/10
Échantillons
36
10/11
11/12
Bénéficiaires
12/13
Distribution annuelle des génotypes du VHC
70
Pourcentage
60
07/08
50
08/09
40
09/10
10/11
30
11/12
12/13
20
10
0
1
37
2
3
4
Génotype
5
6
Proportions relatives du génotype 1a et 1b
100
Pourcentage
80
60
40
20
0
1a
07/08
38
08/09
1b
09/10
10/11
11/12
12/13
Détection quantitative (mesure de la
charge virale) de l’ARN du VHC
3 sites désignés (déc. 2012)*
Montréal
CHUM - Hôpital Saint-Luc
CUSM – Hôpital Royal Victoria
Québec
CHU de Québec – CHUL
* Analyse auparavant effectuée au LSPQ
39
Détection quantitative de l’ARN VHC
Trousse utilisée au Québec
Trousse Abbott RealTime HCV (RT-PCR temps
réel)
 Cible génomique : région 5 prime non codante
(5’NCR)
 Linéarité 12 – 100 000 000 UI/ml
 Limite de détection de 12 UI/ml (95% des
échantillons ayant un taux d’ARN à 12 UI/ml)
 Volume minimal d’échantillon requis 1 ml
(idéalement 2 ml en cas de reprise)
40
Détection quantitative de l’ARN VHC
Résultats possibles
Résultat
Interprétation
Non détecté
ARN du VHC non détecte
< 12 UI/ml, détecté
ARN du VHC détecté, mais est
en dessous de la limite
inférieure de quantification
12 à 100 million UI/ml ARN du VHC détecté à la
mesure indiquée
> 100 million UI/ml
41
ARN du VHC détecté, mais est
au dessus de la limite supérieur
de quantification
Détection quantitative de l’ARN VHC
Le test de détection quantitative est dorénavant
utilisé à toutes les étapes de la prise en charge
thérapeutique (la détection qualitative ne sera plus
utilisée en suivi thérapeutique)
Veuillez faire parvenir vos demandes à un des trois
établissements désignés selon vos corridors de
service
Toute demande de charge virale devra être
accompagnée du contexte clinique (i.e.
prétraitement, 4e semaine de thérapie, etc.)
42
Exemples de cédules recommandée des
mesures de charge virale du VHC
Génotype
1 (pt naïf)
1 (pt naïf)
1 (pt naïf,
cirrhose)
1 (pt naïf)
1 (pt naïf)
1 (pt naïf,
cirrhose)
2, 3
4, 5, 6
Co-infection
VIH (1 à 6)
4
8
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
S/O
X
X
X
X
X
X
X
S/O
X
X
X
X
S/O
X
F
X
X
X
X
X
S/O
X
F
X
X
X
X
X
ARN VHC
Peg-INF + RIB
+ BOC
Peg-INF + RIB
+ BOC
Indétectable
S8 à S24
Détectable S8,
indétectable
S24
Indétectable
S24
Indétectable
S4 et S12
Détectable S4
ou/et S12
Peg-INF + RIB
+ BOC
Peg-INF + RIB
+ TÉL
Peg-INF + RIB
+ TÉL
Peg-INF + RIB
+ TÉL
Peg-INF + RIB
(classique)
Peg-INF + RIB
(classique)
Peg-INF + RIB
(classique)
F, facultative; S/O, sans objet
43
0
Semaine
12 24 28 36 48 52 72
Type de Tx
F
X
X
X
X
Charge virale du VHC – Échantillons analysés
3500
3000
Nombre
2500
2000
1500
1000
500
0
07/08
08/09
09/10
Échantillons
44
10/11
11/12
Bénéficiaires
12/13
Distribution des mesures de charge virale
Abbott RealTime HCV (UI/ml)
50
Pourcentage
40
30
20
10
0
45
10/11
11/12
12/13
Détermination génotypique de la
résistance aux inhibiteurs de protéases
But : évaluer l’émergence de mutations sur le
génome virale associées à la résistance à
l’inhibiteur de protéase (IP) chez des sujets nonrépondeurs
Analyse disponible au LSPQ après entente
Très peu de demande à ce jour
Limite de détection : environ 1000 UI/ml
 Cible : domaine de la protéase de NS3
46
Détermination de la résistance
exemples de cas
ID
47
Sexe
Âge
Origine
ethnique
NR1
Homme
Caucasien
47
NR2
Homme
58
NR3
Homme
Caucasien
55
Asiatique
Génotype
VHC
Fibrose
Tx antérieur
Réponse Tx
antérieur
1a
Cirrhose
(F4)
Peg IFNα
+ RBV
Répondeur
nul
1b + 6a
Cirrhose
(F4)
Peg IFNα
+ RBV
Répondeur
nul
1a
Fibrose
(F2-F3)
Peg IFNα
+ RBV
Répondeur
nul
Taux d’ARN VHC dans les premières
semaines de traitement
NR2 (1b+6a)
7
ARN VHC Log UI/mL
ARN VHC Log UI/mL
NR1 (1a)
6
5
4
3
2
1
0
8
11
Semaines de traitement
14
7
6
5
4
3
2
1
0
4
8
12
Semaines de traitement
ARN VHC Log UI/mL
NR3 (1a, VIH +)
7
6
5
4
3
2
1
0
48
4
8
12
Semaines de traitement
16
Charge virale déterminée
à l’aide de la trousse
Abbott RealTime HCV
16
Résumé sur l’utilisation des épreuves de
laboratoires pour le VHC
Détection des anti-VHC
- anti-VHC
Sérologie
Positive / Indéterminée
Détection de l’ARN VHC
ARN VHC qualitatif
Positif
Prise en charge
traitement envisagé
Prise en charge
traitement imminent
en cours ou terminée
Prise en charge
échec au traitement
49
Génotypage
Mesure de la charge virale
Au besoin
Résistance aux antiviraux
Merci de votre attention
Remerciements
Personnel du LSPQ
 Secteur Sérodiagnostic et virologie
 Secteur Biologie moléculaire
 Direction
Personnel du réseau
 Médecin œuvrant dans le domaine
 Technologistes de laboratoire
 Infirmière et pharmacienne
50