Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30

F. Rossi et al.
Recherche in vitro sur la toxicologie des nanoparticules
au Joint Research Center.
European Commission, Joint Research Centre
Institute for Health and Consumer Protection
ECVAM and BMS1 Units
Ispra (VA) Italy
E. Sabbioni, J. Ponti, R. Del Torchio,
M. Farina, S. Fortaner, B. Munaro,
T. Sasaki1 and F. Rossi1
Résumé
Depuis quelques années, la toxicité des nanoparticules est sujette à de nombreuses études
qui montrent que les schémas habituels de toxicité observés à l’échelle macroscopique ne sont
plus applicables. En particulier, la distribution de taille des nanoparticules, leur facteur de forme
ainsi que leurs propriétés de surface semblent avoir une importance particulière dans les mécanismes d’interaction avec les cellules. Le travail présenté porte sur l’évaluation des mécanismes
d’interaction de nanoparticules de Cobalt avec les fibroblastes de souris Balb/ 3T3. Tout d’abord
la caractérisation des nanoparticules est faite (analyse chimique, morphologie) avant et après
interaction avec le milieu de culture. Les résultats montrent que l’agglomération des nanoparticules
est inférieure dans le milieu de culture à celle observée dans l’eau. La dissolution partielle des
nanoparticules conduit à utiliser 2 marquages différents pour le Co en solution (57Co) et les
nanoparticules (60Co). Ceci permet de différentier la distribution du Co en cours de test. Ensuite
l’interaction avec les cellules montre que les nanoparticules pénètrent la membrane des cellules et
se retrouvent préférentiellement dans le noyau, au contraire du Co dissout. Finalement, les résultats montrent que la toxicité des nanoparticules est nettement supérieure à celle du Co en solution,
ce qui confirme la nécessité de poursuivre les recherches en ce domaine.
Nanoparticules / Toxicologie / Caractérisation
INTRODUCTION
! Les nanotechnologies et la
nanoscience représentent un déve-
loppement clé des secteurs des matériaux innovants et des nouvelles
productions. Les propriétés nouvelles attachées aux nanomatériaux ont
déjà trouvé des applications commerciales. Par exemple les nanoparticules
sont utilisées dans les cosmétiques
(crèmes solaires), le textile, les céramiques, les industries chimiques et
pharmaceutiques (administration des
médicaments). Les nanoparticules
peuvent aussi être produites involon-
Correspondance : François Rossi
JRC IHCP - Via E. Fermi 1 - TP 203 - 21020 ISPRA (VA) Italie
Médecine Nucléaire -
Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1
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Recherche in vitro sur la toxicologie des nanoparticules au JRC
tairement par des activités humaines
comme la combustion à haute température, l’abrasion mécanique ou
d’autres procédés industriels [1].
Les nanoparticules existent aussi dans
la nature et nous vivons entourés de
nanoparticules. Pour donner un
exemple : une pièce normale peut
contenir de 10 000 à 20 000 particules par cm3 tandis que ces chiffres
peuvent atteindre 50 000 nano-particules par cm3 dans un bois et 100 000
dans les rues des villes (Borm, 2002).
A présent, les nanoparticules produites industriellement sont marginales
par rapport à celles produites et
relarguées de manière involontaire
par exemple via les processus de
combustion. Cependant, des niveaux
élevés de production et d’utilisation
industrielles de nanoparticules sont
attendus dans les prochaines années.
L’emploi des nanomatériaux devenant de plus en plus étendu, le nombre de cas dans lesquels l’exposition
devient possible augmentera.
En dépit du fait que l’exposition professionnelle et publique aux
nanomatériaux augmente de manière
spectaculaire, l’information sur son
impact sur la santé humaine est gravement absente. L’exposition humaine aux nanoparticules peut survenir par inhalation, par ingestion
orale, par absorption à travers la peau
ou par injection. De nombreuses
preuves témoignent de la pénétration
et du dépôt dans l’organisme des
particules de taille supérieure au
nanomètre via le système respiratoire.
L’introduction par ingestion est un
mécanisme très plausible. La pénétration à travers la peau est moins évidente ; des études récentes suggèrent
par exemple que le dioxyde de titane
pénètre très peu la peau saine et que
sa pénétration peut seulement intervenir à la suite de mouvement mécanique de la peau plutôt que par un
transport par diffusion [2]. Après la
pénétration, la distribution des particules dans l’organisme dépend fortement des propriétés de surface des
nanoparticules (hydrophobicité,
charge de surface, réactivité chimique,
solubilité). On suppose que les
nanoparticules insolubles dans l’eau
16
sont potentiellement plus dangereuses que celles solubles [3].
La taille et la forme des particules
semblent aussi très importantes. La
surface active augmentant au fur et à
mesure que la taille de la particule
décroît, la toxicité et les effets potentiels sur la santé peuvent augmenter.
De plus, il semble qu’au dessous
d’une taille critique la translocation
des nanoparticules dans certaines
parties de l’organisme est réduite.
Une grande quantité de résultats
scientifiques ont été rassemblés par
la US-EPA [4] et un récent réseau
AIRNET subventionné par les programmes européens [5] indique que
les particules atmosphériques de
taille inférieure à 150 nm, dues aux
combustions, peuvent représenter un
danger plus élevé que les plus grosses particules. Une excellente revue
de l’état de l’art sur la toxicité des
nanoparticules a été publiée par Hoet
et al. [3] et résume les résultats exprimés ci-dessus. Elle insiste notamment
sur le fait que, en dehors des macro-
phages, les mécanismes d’interaction
cellule-particule et l’effet de la fixation des particules sur la santé n’ont
pas été étudiés en détail.
Le Joint Research Center (JRC) a récemment entrepris une recherche in
vitro sur la nanotoxi-cologie basée,
pour les études de validation et pour
des raisons légales, sur une stratégie
multidisciplinaire impliquant l’emploi de méthodes alternatives n’utilisant pas l’animal (cultures de cellules) en combinaison avec des techniques analytiques et biochimiques.
La Figure 1 souligne l’approche
scientifique de la recherche in vitro
sur la toxicologie des nanoparticules.
Cet article présente les résultats préliminaires sur la fixation cellulaire, la
répartition intracellulaire et la
cytotoxicité induite par les nanoparticules (Conano) et les ions Co2+ solubles (Cosol) dans les fibroblastes immortalisés de souris (lignée cellulaire
Balb/3T3).
Modèles cellulaires utilisés au
ECVAM
Toxicocinétique
(fixation, distribution
intracellulaire, liaison
aux biomolécules)
Toxicité de base et
mesure des effets au
niveau moléculaire
Méthodes analytiques
avancées
Potentiel
génotoxique et
carcinologique
Techniques de culture
cellulaire et de
biologie moléculaire
- Figure 1 Recherche sur la toxicologie des nanoparticules In vitro au JRC.
In vitro nanotoxicology research at the JRC
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Nanoparticules de cobalt (Co nano)
et caractérisation
!Les particules de Conano métalliques
(50-150nm) ont été fournies par le
Laboratoire des Biomatériaux du Dé-
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partement des Neurosciences de
l’Université de Modène et de Reggio
Emilie en Italie. Elles ont été préparées par la combustion d’aérosols de
solutions alcooliques de métal simple et de mélange métal-métalloorganiques avec l’oxygène ou l’air dans
une chambre de réaction à une température comprise entre 1200 et
2000°C.
Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1
F. Rossi et al.
La composition en éléments des impuretés et la morphologie du Conano
ont été caractérisées. Les éléments
considérés comme impuretés ont été
déterminés par spectrométrie de
masse utilisant comme source d’ions
un plasma inductif couplé (ICPMS) et
par spectrométrie d’absorption atomique utilisant un four graphite (GFAAS)
après minéralisation de 10 mg de particules par l’acide nitrique dans un
four à micro-ondes.
La microscopie électronique à balayage (SEM LEO 435VP) a été utilisée pour détecter et visualiser la présence des particules de Conano et étudier leur morphologie dans différentes solutions aqueuses et milieux de
culture, ainsi que leur localisation
dans les cellules.
Radiomarquage du Co nano
et du Co sol
!Les nanoparticules de Conano (5 mg)
ont été irradiées pendant 24 heures
dans un flux de neutrons thermiques
de 2x1014 neutrons.cm-2.s-1 dans un
réacteur nucléaire HFR (NRG, Petten,
Hollande).
La radioactivité spécifique obtenue
en 60Co était de 22,2 MBq.mg-1.
Les ions Co2+ ont été marqués avec
du cobalt 57 (Amersham Biosciences,
Milan, Italie). La radioactivité spécifique obtenue était supérieure à 155,4
MBq.µg-1.
La radioactivité du 57Co et celle du
Co ont été mesurées avec un compteur gamma automatique (Wallac
1480, Suède) équipé d’un cristal d’iodure de sodium (NaI) de 3x3,5 pouces en utilisant les pics de 1173 et
1332 keV pour le 60Co et ceux de 122
et 136 keV pour le 57Co. Les mesures
de 60Co et 57Co ont été interprétées
chaque fois en termes de concentration exogène par comparaison avec
des solutions de référence de 60Co et
57
Co d’activités spécifiques connues.
60
Cultures de cellules
!Les cellules Balb/3T3 CL A31-1-1 ont
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été cultivées dans un milieu Dulbecco
(Dulbecco Modified Eagle Medium
low glucose (DMEM)) enrichi en sérum fétal (10% Fœtal Clone Serum III
(FCS III, Celbio, Milan, Italie))
Estimation de la toxicité
! Des fractions aliquotes de 1mL de
DMEM ont été incubées pendant 3h
et 72h avec une solution 100µM de
60
Conano. Les particules ont été ensuite
centrifugées à 9000g pendant 15 min
et le 60Co compté dans le surnageant.
!Les cellules ont été placées dans
des boîtes à culture de 60mm de diamètre (200 cellules/boîte, 6 boîtes par
détermination). Après 24h, le milieu
a été remplacé par une solution 1µM
ou 100µM de Conano ou Cosol et les
cellules ont été incubées pendant 4h.
Après traitement les boîtes ont été
remplies avec du DMEM et 7 jours
plus tard les cultures ont été fixées
avec du méthanol absolu et colorées
avec une solution de Giemsa à 10%.
La capacité à former des colonies a
été déterminée par le rapport du nombre de colonies contenant plus de 50
cellules dans les cultures traitées au
nombre de ces mêmes colonies dans
les cultures contrôles non traitées.
Fixation et répartition
intracellulaire
RÉSULTATS
Les procédures de maintenance et de
culture des cellules ont été préalablement décrites dans [6].
Dissolution du 60Co nano
dans le milieu DMEM
!Les cultures confluentes croissant
dans les boîtes de Pétri de 20x90mm
ont été exposées à des solutions 1
et 100µM de 60Co ou de 57Co dans du
milieu de culture.
Après 4h, les cellules adhérentes ont
été lavées 3 fois avec une solution
saline de phosphate (PBS), détachées
avec une solution de trypsine-EDTA,
les cellules viables comptées et le
60
Co et le 57Co mesurés dans le compteur γ. Par la suite, les cellules ont été
remises en suspension dans un tampon contenant du cacodylate (10mM)
du sucrose (0.25M) et du chlorure
de magnésium MgCl2 (1mM ). Après
homogénéisation avec un PotterElvehejm les cellules ont été mises
au sommet d’un tube contenant un
gradient de Percoll (Amersham
Bioscience, Milan, Italie) et le 60Conano
"libre" sédimenté par centrifugation
à 50g pendant 2 min. Les cellules ont
été récupérées, traitées par ultra-sons
et centrifugées à 105 000g pendant 90
min dans une ultracentrifugeuse
(Beckman, Palo Alto, CA) pour séparer le culot et les fractions
surnageantes. La fixation du 60Co et
du 57Co ont été estimées dans les cellules et dans les fractions obtenues à
105 000g par comptage γ.
Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2006 - vol.30 - n°1
Caractérisation du Co nano
!La concentration en 21 impuretés
contenues dans le Conano initial (Ag,
As, Bi, Cd, Cu, Hf, Mn, Mo, Nb, Pb, Pt,
Ru, Sc, Si, Sr,Ti,V, Zn, Zr) (résultats non
montrés) a été jugée négligeable pour
induire un effet toxique détectable.
A la concentration la plus élevée de
Conano testée (100µM), les impuretés
ajoutées avec les nanoparticules dans
le milieu de culture ont été estimées
à environ 2x10-12 (Nb) à 3x10-7M(As).
Ces résultats tendent à exclure de
possibles artéfacts dus à la contamination par ces éléments sur la réponse biologique.
La microscopie électronique à baFigures 2 et 3
layage (Figures
3) a montré que
des agrégats de Conano présents dans
l’eau diminuaient dans le milieu de
culture.
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Recherche in vitro sur la toxicologie des nanoparticules au JRC
- Figure 2 Microscopie électronique à balayage des agrégats de Conano et spectre de rayons X en dispersion.
SEM micrograph of Conano aggregates and EDAX spectrum
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- Figure 3 Image de microscopie électronique à balayage de Conano dans le milieu DMEM et spectre de rayons X en dispersion.
SEM picture of Conano in DMEM and EDAX spectrum
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Recherche in vitro sur la toxicologie des nanoparticules au JRC
Dissolution du 60Co nano dans le
DMEM
!Le Tableau I rapporte les résultats
concernant la dissolution d’une solution 100µM de Conano , 4 et 72 h
après incubation dans un milieu de
culture. Ces résultats suggèrent une
génération progressive d’ions Co2+
dans le milieu, allant de 9.7% à 48.2%
du Conano , respectivement 4 et 72h
après l’exposition.
- Ta bleau I Dissolution du Conano dans le milieu de culture en fonction du temps
Timed dissolution of Conano in culture medium
Fixation et répartition
intracellulaire
!Les cellules Balb/3T3 ont fixé le Co,
après une exposition de 4h, à des
concentrations équimolaires aussi
bien pour le Cosol que le Conano. Cependant, d’un point de vue quantita-
tif, des différences de trois ordres de
grandeur ont été observées entre les
deux formes, la concentration cellulaire du Co étant de l’ordre du
femtogramme par cellule pour le Cosol
et du picogramme par cellule pour
Tableau II
le Conano (T
II).
- Ta bleau II Fixation du Co provenant du Conano et du Cosol par les cellules Balb/3T3 après 4h
d’exposition
Uptake of Co from Conano and Cosol by Balb/3T3 cells after 4h of exposure
Des différences significatives ont été
également observées dans la répartition intracellulaire correspondante
des deux espèces de cobalt entre les
culots (organites cellulaires) et le
surnageant (cytosol). Plus de 80% du
cobalt provenant du Conano ont été
retrouvés dans le culot tandis que la
valeur correspondante du Co provenant du Cosol était inférieure à 65%
Tableau III
(T
III).
- Ta bleau III Répartition intracellulaire du Co provenant du Conano et du Cosol par les cellules
Balb/3T3 après 4h d’exposition
Intracellular repartition of Co from Conano and Cosol by Balb/3T3 cells
after 4h of exposure
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Médecine Nucléaire -
Les Figures 4 et 5 représentent la
morphologie des cellules Balb/3T3
non exposées et exposées au Conano ,
déterminée par microscopie électronique à balayage. La figure 5 montre
une interaction du Conano avec des cellules suggérant un processus d’endocytose.
Cytotoxicité
!Après 4h d’exposition à une solution 1µM de Cosol ou de Conano, aucun
effet cytotoxique significatif n’a été
observé. Cependant, à une concentration 100µM une inhibition de la capacité à former des colonies est apparue pour le Conano tandis que la valeur correspondante pour le Cosol était
Tableau IV
de 25% (T
IV).
CONCLUSIONS
!Les résultats de ce présent travail
doivent être perçus comme le point
de départ du nouveau projet de recherche "In vitro NAnoparticles
FiTOXicology (INATOX)" du JRC (F
gure 1
1). Le but est de contribuer à
l’évaluation des effets nocifs potentiels sur la santé qui peuvent voir le
jour avec l’exposition à des
nanoparticules fabriquées, par une
information sur les mécanismes dérivée des systèmes in vitro, ceci de
manière à affiner, réduire et remplacer la toxicologie animale par des
méthodes alternatives [7] pour satisfaire aux exigences éthiques, politiques, financières et réglementaires.
Les méthodes de recherche décrites
ici confirment le grand potentiel des
méthodes in vitro pour tester la toxicité, lorsqu’elles sont utilisées en
combinaison avec des techniques
analytiques, physiques et biochimiques avancées. En particulier, l’utilisation de la spectrométrie de masse
couplée à un plasma (ICPMS) et de la
microscopie électronique à balayage
(SEM) propose des conclusions intéressantes sur la pureté chimique du
Conano qui est suffisante pour exclure
tout artéfact concernant la réponse
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cytotoxique. De plus, l’analyse par
microscopie électronique à balayage
indique une tendance des
nanoparticules à se désagréger dans
Figure 3
le milieu de culture (Figure
3) en
accord avec la découverte de leur
Tadissolution dans le même milieu (T
bleau II). Cet aspect est particulièrement intéressant parce que la génération de Co2+ à partir du Conano dans
le milieu complique par la suite l’interprétation de l’effet cytotoxique
Tableau IV
observé du Conano (T
IV).Pour
cela les études in vitro des
nanoparticules métalliques doivent
être effectuées en parallèle à celles
des ions métalliques correspondants.
Les différences évidentes observées
pour la fixation, la répartition intra-
cellulaire et la toxicité du Conano dans
les cellules Balb/3T3 comparées aux
mêmes effets du Cosol imposent de
comprendre si la toxicité du Conano
est réellement due ou non aux ions
Co2+ générés par la dissolution des
Tableaux II et III
nanoparticules (T
III).
La constatation de l’entrée du Conano
dans les cellules et de son association avec les organites cellulaires est
d’un intérêt toxicologique tout particulier. La question importante qui se
pose est reliée aux effets potentiels
d’une possible persistance des
nanoparticules dans les compartiments cellulaires. Ceci nécessite une
connaissance de leur solubilité dans
l’environnement cellulaire au cours
du temps, parce qu’elles pourraient
représenter à long terme une voie
d’élimination pour les matériaux exogènes étrangers.
Ce sont seulement quelques questions qui apparaissent à la suite de
cette étude préliminaire qui semble
indiquer cependant que les résultats
de la recherche sur la toxicologie des
nanoparticules est plus compliquée
que ce que l’on pensait au préalable.
De toute façon, la compréhension des
mécanismes de toxicité nécessite des
initiatives pour une recherche
multidisciplinaire active sur l’étude
de l’impact des nanoparticules sur la
santé humaine.
- Figure 4 Image de microscopie électronique à balayage de cellules Balb/3T3 non exposées
SEM pictures of unexposed Balb/3T3 cells
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Recherche in vitro sur la toxicologie des nanoparticules au JRC
- Ta bleau IV Cytotoxicité induite après 4h d’exposition des cellules Balb/3T3 au Conano et au Cosol
Cytotoxicity induced by 4h of exposure of Balb/3T3 cells to Conano and Cosol
- Figure 5 Image de microscopie électronique à balayage de cellules Balb/3T3 exposées à une solution 100µM de Conano
SEM pictures of Balb/3T3 cells exposed to 100µM Conano
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In vitro toxicology research on metallic nanoparticles
Since several years, the toxicity of nanoparticles is the subject of intense research which
demonstrate that the toxicity mechanisms observed at the macroscopic scale are not valid anymore
sin some cases at the nanoscale. In particular, the size distribution of nanoparticles, their shape
and their surface properties seem to have a particular importance in their interaction with cells.
The present work investigates the mechanisms of interaction of Co nanoparticles with mouse
fibroblast Balb 3T3. First the characterization of the nanoparticles is done (chemical analysis,
morphology) before and after interaction with the medium. Results show that the clustering of
nanoparticles is less pronounced in the medium than in pure water. Partial dissolution of
nanoparticles and the corresponding effect between doluble and insoluble fraction of the
nanoparticles was investigated using 2 radio isotopes for Co in solution (57Co) and Co nanoparticles
(60Co). This allows the differentiation of the accumulation of Co and puts in evidence a major
concentration of Co nanoparticles in the nuclei of the cells, to the contrary of Co in solution.
Finally our results show that the toxicity of Co nanoparticles is higher than soluble Co, which
indicates the need for further research in this field.
Nanoparticles / Cell toxicology / Nanoparticles characterisation
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