The Importance of Drug Metabolism in Drug Development and

Pharmaceutical Chemistry
Bernd Clement, Pharmazeutisches Institut
Die Bedeutung der Biotransformation in der
Arzneistoffentwicklung und Therapie
Viele Verbindungen, die mit hoher Affinität an ein Zielmolekül binden, werden durch High-Throughput Screening-Verfahren (HTS) und andere Methoden der Arzneistoffentwicklung identifiziert. Es ist mittlerweile aber
auch klar erkannt worden, dass ein erfolgreicher Arzneistoffkandidat nicht nur Wirkstärke und Selektivität,
sondern auch ein geeignetes pharmakokinetisches Profil einschließlich der Biotransformation (Arzneistoffmetabolismus) aufweisen muss. Von daher sind gute metabolische Eigenschaften ein Ziel der Arzneistoffentwicklung. In meiner Gruppe werden Enzyme untersucht, die in den Metabolismus von Arzneistoffen und Arzneistoffkandidaten eingreifen. Insbesondere wurden Enzyme identifiziert, die N-hydroxylierte Strukturen reduzieren. Diese Enzymsysteme sind sowohl an der Reduktion von genotoxischen N-hydroxylierten Verbindungen als
auch an der Aktivierung von Amidoximprodrugs beteiligt. Dieses Prodrug-Prinzip „Amidoxime an Stelle von
Amidinen“ wurde neu entwickelt und ist mittlerweile auf zahlreiche Arzneistoffkandidaten übertragen worden.
The Importance of Drug Metabolism in Drug
Development and Therapy
Many active compounds binding with high affinity to a target are identified by high-throughput screening and
other methods of drug design. However, it is now clearly recognized that a successful drug candidate requires
not only potency and selectivity, but also a suitable pharmacokinetic profile including metabolism. Thus, highly
favorable metabolic properties are one goal of drug development. In my group enzymes are studied which are
involved in the metabolism of drugs and new drug candidates. In particular new enzymes systems have been
identified which are capable of reducing N-hydroxylated structures. These systems are involved in the reduction
of genotoxic N-hydroxylated compounds and also in the activation of amidoximes used as prodrugs of
amidines. This prodrug principle was newly developed and has been applied to several drug candidates.
Arzneistoffmetabolisierende Enzyme
Drug Metabolizing Enzymes
Arzneistoffmetabolismus hat biochemische, pharmakologische
und toxikologische Aspekte (Bild 1). Arzneistoffe werden durch
fremdstoff(xenobiotika)-metabolisierende Enzyme, hauptsächlich das Cytochrom P450 Enzymsystem, welches aus verschiedenen Isoenzymen besteht (Multigenfamilie, Tabelle 1), umgesetzt.
Drug metabolism has biochemical, pharmacological and
toxicological aspects (Figure 1). Drugs are transformed by
foreign-compound (xenobiotic) metabolizing enzymes, in particular the cytochrome P450 enzyme system, consisting of several isoenzymes (multigene family, Table 1).
Polymorphic enzymes (CYP2D6, CYP2C19) have been identified and their participation in the metabolism of a drug or a drug
candidate has to be realized. Pharmacokinetic interactions were
the reason that many drugs were withdrawn from the market
during recent years (f. ex. mibefradil, terfenadin). In vitro studies
with isoenzyme selective substrates (marker-substrates, see
Table1) or inhibitors have to be conducted during an early phase
of drug development in order to see if interactions are feasible.
The induction potential of many drugs is well known and should
also be checked for drug candidates.
Polymorphe Enzyme (CYP2D6, CYP2C19) sind identifiziert und
ihre Beteiligung am Metabolismus von Arzneistoffen und Entwicklungsverbindungen ist erkannt worden. Pharmakokinetische
Interaktionen waren der Grund dafür, dass viele Arzneistoffe in
den letzten Jahren vom Markt zurückgezogen werden mussten
(z.B. Miberfradil, Terfenadin). In vitro Studien mit isoenzymspezifischen Substraten (Markeraktivitäten, s. Tabelle 1) und
Inhibitoren sind bereits in einer frühen Phase der Arzneistoffentwicklung durchzuführen, um solche Interaktionen voraussehen
zu können. Das Induktionspotential einer Reihe von Arznei-
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Pharmaceutical Chemistry
Bild 1 / Figure 1
Nahezu alle Arzneistoffe werden in einem als Biotransformation oder Arzneistoffmetabolismus bezeichneten Prozess in Metabolite umgewandelt, die meistens inaktiv
sind. In einigen Fällen entstehen allerdings toxische Verbindungen oder aktive
Metaboliten. Die Biotransformation kann für die Entwicklung von prodrugs ausgenutzt
werden. Die am Arzneistoffmetabolismus beteiligten Enzyme können polymorph und
auch Ursache für pharmakokinetische Interaktionen sein.
Reductive Drug Metabolism
The counterparts of the many reactions of
oxidative drug metabolism are obviously reactions
of reduction and some of them must be viewed as
metabolic cycles. Whereas it is generally accepted
that oxidations of carbon atoms are favored the
situation of nitrogen containing functional groups
might be different. In order to examine the importance of metabolic cycles and in particular of reductions of Nhydroxylated compounds, the reversible metabolism at the
amidine, guanidine and amidinohydrazone nitrogen atoms of
Nearly all drugs are transformed in a process known as biotransformation or drug
metabolism to metabolites which are usually inactive. However, in certain cases toxic
or active metabolites are formed. Biotransformation can be used for the development
of prodrugs. Enzymes involved in drug metabolism may be polymorphic and can be
also the reason for pharmacokinetic interactions.
stoffen ist bekannt und sollte ebenfalls im Rahmen der Entwicklung neuer Verbindungen überprüft werden.
In meinem Labor sind verschiedene P450 Isoenzyme, die am
Metabolismus von Arzneistoffen
und neuen Verbindungen beteiligt
sind, durch eine Bank von
menschlichen Lebermikrosomen,
Markeraktivitäten und rekombinanten menschlichen P450 Enzymen
erkannt worden. Hepatozytenkulturen (Schwein, Mensch) wurden
ebenfalls für das Studium des
Phase 2 Metabolismus in vitro entwickelt. Die Anzahl der lebenden
Zellen der kultivierten Hepatozyten
wurde während der Kultivierung
durch die Freisetzung von
Lactatdehydrogenase in den Überstand und die Albuminsynthese
der Zellen überprüft. Die metabolische
Kompetenz
der
Hepatozytenkultur wurde durch die
In my laboratory, P450 isoenzymes involved in the
metabolism of drugs and drug candidates are
identified using a set of human liver microsomes,
marker substrates, and recombinant human P450
enzymes. Pig and human hepatocyte culture
systems were also developed for phase 2 biotransformation studies in vitro. The viability of the
cultured hepatocytes was characterized during
cultivation by lactate dehydrogenase release into
the supernatant and albumin synthesis of the cells.
The metabolic activity of the hepatocyte cultures
was measured by 7-ethoxycoumarin (ECOD) and
7-ethoxy-resorufin O-deethylation (EROD). The
viability and metabolic activity of these pig
hepatocytes were preserved for several days by
culturing the cells in a monolayer culture system.
With these systems we were able to identify several new metabolic pathways.
Tabelle 1 / Table 1
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Pharmazeutische Chemie
7-Ethoxycumarin (ECOD) - und 7-Ethoxy-resorufin-O-deethylierung (EROD) bestimmt. Die Lebensfähigkeit und die metabolische Kompetenz der Schweinehepatozyten wurde durch Kultivierung der Zellen in einer Monolayerkultur für mehrere Tage
erhalten. Mit diesem System waren wir in der Lage, verschiedene neue metabolische Wege zu identifizieren.
various drugs and model compounds was investigated. Many of
these N-oxygenated metabolites are very easily reduced back to
the starting materials. A comparison of the kinetic data for the
N-hydroxylation and reduction suggests that the reduction
should predominate in vivo. This could be verified by in vivo
studies. The enzymatic basis of N-oxidative processes is very
well understood whereas reductions have been less extensively
investigated. We purified an enzyme system from pig and
human liver consisting of cytochrome b5, its reductase, and a
P450 enzyme which is involved in the reduction of the
N-hydroxylated products. Similar activities were found in all
species studied so far. Furthermore, comparable reductive
reactions could also be demonstrated with microsomal fractions
from organs other than liver. Also mitochondria are highly
capable of performing the reductions of these N-hydroxylated
compounds.
Reduktiver Arzneistoffmetabolismus
Der Gegenspieler von vielen oxidativen Arzneistoffmetabolisierungen ist die Reduktion. Oxidation und Reduktion
können in vielen Fällen als metabolische Zyklen auftreten. Es
wird allgemeinen angenommen, dass Oxidationen am Kohlenstoff gegenüber der Reduktion überwiegen, die Situation für
stickstoffhaltige funktionelle Gruppen könnte jedoch eine andere
sein. Um die Bedeutung von solchen metabolischen Zyklen und
insbesondere die Reduktion von N-hydroxylierten Verbindungen
zu studieren, wurde der reversible Metabolismus von Amidin-,
Guanidin- und Amidinohydrazonstickstoffen innerhalb verschiedener Arzneistoffe und Modellverbindungen untersucht. Die eigenen Studien ergaben, dass diese N-oxygenierten Metaboliten
sehr leicht zu den Ausgangsverbindungen rückreduziert werden.
Ein Vergleich der kinetischen Daten der N-Hydroxylierung mit
denen der Reduktion lassen eine Bevorzugung der Reduktion in
vivo vermuten. Dies konnte durch in vivo Studien bestätigt
werden. Im allgemeinen sind die enzymatischen Grundlagen
von N-oxidativen Prozessen sehr gut verstanden. Auf der anderen Seite sind Reduktionen weniger intensiv untersucht worden.
Ein Enzymsystem, bestehend aus Cytochrom b5, der zugehörigen Reduktase und einem P450 Enzym, wurde von uns
aus Schweineleber und humaner Leber gereinigt. Dieses System ist an der Reduktion von N-hydroxylierten Verbindungen beteiligt. Ähnliche Aktivitäten konnten in allen Spezies, die bisher
untersucht worden sind, nachgewiesen werden. Darüberhinaus
wurden vergleichbare reduktive Aktivitäten auch in Mikrosomen
von anderen Organen nachgewiesen. Mitochondrien zeigten
ebenfalls
hohe
Reduktionsraten
von
N-hydroxylierten Verbindungen.
Toxicological Aspects of Drug Metabolism
In most cases inactive metabolites are formed during biotransformation. However, certain structures can also be transformed
into reactive metabolites such as electrophiles and radicals
during a process known as toxification. Responsible functional
groups should be identified and not be included in new chemical
entities. The accepted concept of the metabolic activation of
arylamides, arylamines, and aminoazoheterocycles involves the
N-hydroxylation of the amine and amide function. In the case of
primary arylamines, hydroxylamines are formed, which can be
metabolized by conjugation reactions to various esters which
can be unstable and decompose to arylnitrenium ions forming
DNA adducts. The possibility of reduction of hydroxylamines and
similar N-hydroxylated metabolites back to the starting non-toxic
nitrogen containing functional groups, the easiest way of
detoxification for an organism, has been neglected. Enzyme
systems are studied in my laboratory which are capable of
catalyzing such reductive reactions.
Development of Prodrugs
Toxikologische Aspekte des Arzneistoffmetabolismus
Prodrugs are defined as therapeutic agents which are inactive
but are transformed into active metabolites by biotransformation.
A number of successful drugs are on the market in which oral
absorption and pharmacokinetics have been improved through
the design of prodrugs. Amidines and guanidines are functional
groups, which are very often incorporated into active molecules
because the cations formed after protonation are necessary for
interactions with the negatively charged carboxylates of target
molecules. Very often, benzamidines are imitating the guanidine
functional group of arginine. So amidines (Scheme 1) can be
found in various drug candidates such as thrombin inhibitors,
glycoprotein IIb/IIIa receptor antagonists, and factor Xa
inhibitors, and in older drugs such as compounds with trypano-
In den meisten Fällen werden durch Biotransformation inaktive
Metaboliten gebildet. Jedoch können bestimmte Strukturen auch
in reaktive Metabolite wie Elektrophile und Radikale, ein Vorgang der als Toxifizierung bezeichnet wird, umgewandelt
werden. Die davon betroffenen funktionellen Gruppen sollten
identifiziert und nicht Bestandteil neuer Arzneistoffkandidaten
sein. Das akzeptierte Konzept der metabolischen Toxifizierung
von Arylamiden, Arylaminen und Aminostickstoffheterozyklen
beinhaltet die N-Hydroxylierung der Amin und Amidfunktion. Im
Falle von primären Arylaminen werden Hydroxylamine gebildet,
die durch Konjugationsreaktionen zu verschiedenen Estern
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Pharmaceutical Chemistry
cidal and leishmanicidal activities and with effects against
pneumonia cause by pneumocystis carinii (pentamidine).
umgewandelt werden. Diese Ester können instabil sein und zu
Arylnitreniumionen mit der Fähigkeit zur Bildung von DNA-Addukten zerfallen. Die Möglichkeit der Rückreduktion von Hydroxylaminen und ähnlichen N-hydroxylierten Metaboliten zu den
ursprünglichen stickstoffhaltigen funktionellen Gruppen ist der einfachste Weg
zur Detoxifizierung, den Organismen aufweisen. Dieser Gesichtspunkt ist bisher
vernachlässigt worden. In meiner Gruppe
werden Enzymsysteme studiert, die in der
Lage sind, solche reduktiven Reaktionen
zu katalysieren.
Entwicklung von Prodrugs
Prodrugs stellen therapeutische Verbindungen dar, die pharmakologisch inaktiv
sind, aber durch Biotransformation in aktive
Metaboliten umgewandet werden. Es sind
eine Reihe von erfolgreichen Arzneistoffen
zugelassen worden, bei denen die orale
Absorption und die pharmakokinetischen
Eigenschaften durch die Entwicklung von
Prodrugs entscheidend verbessert worden
sind.
Schema 1 / Scheme 1
Amidines like guanidines are protonated at the double bonded
nitrogen atom and thus form a highly mesomerically stabilized
cation. They are the strongest known organic bases, protonated
under physiological conditions, very hydrophilic, usually not absorbed from the gastrointestinal tract, and thus not orally
available. The N-hydroxylated derivatives (amidoximes, N-hydroxyguanidines) are less basic because of the introduction of
the oxygen atom. They are not protonated under physiological
conditions and should lead to sufficient oral absorption and
therefore to improved bioavailability.
Amidine und Guanidine stellen funktionelle Gruppen dar, die
sehr häufig in aktive Verbindungen eingebaut worden sind, da
die durch Protonierung gebildeten Kationen für Wechselwirkungen mit negativ geladenen Carboxylatgruppen der Zielmoleküle
notwendig sind. Sehr häufig imitieren Benzamidine die Guanidingruppe des Arginins. Von daher finden sich sehr viele Amidine in verschiedenen Arzneistoffkandidaten wie z.B. Thrombininhibitoren, Glykoprotein IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten und Faktor
Xa-Inhibitoren, aber auch in alten Arzneistoffen wie Verbindungen mit trypanociden und leishmaniciden Aktivitäten (Pentamidin) und mit Wirkungen gegen Lungenentzündungen, die durch
Pneumocystis Carinii hervorgerufen werden (Schema 1).
Because of these properties and the intensive reduction of
benzamidoximes (see above), the prodrug principle benzamidoximes instead of benzamidines (Scheme 2) was developed in my laboratory for pentamidine.
Guanidine und Amidine werden am doppelt gebundenen Stickstoff protoniert, bilden dadurch hoch mesomeriestabilisierte Kationen und stellen die stärksten organischen Basen dar. Sie sind
somit auch unter physiologischen Bedingungen protoniert und
sehr hydrophil. Aufgrund dieser Eigenschaften werden sie
meistens aus dem Gastrointestinaltrakt nicht absorbiert und sind
nicht oral verfügbar. Die N-hydroxylierten Derivate (Amidoxime,
N-Hydroxyamidine) sind aufgrund der Einführung des Sauerstoffatoms weniger basisch. Sie sind unter physiologischen
Bedingungen nicht protoniert und sollten von daher zu einer
ausreichenden oralen Verfügbarkeit und somit zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit führen. Wegen dieser Eigenschaften
Furthermore, the principle has been applied to drug candidates
like sibrafiban and the prodrug of melagatran ximelagatran both
in phase III clinical trials. Sibrafiban, a gp IIb/IIIa receptor antagonist shows a good oral availability in these trials, with low
intersubject variability of pharmacokinetic parameters and no
signs of toxicity. The same properties were detected for
ximelagatran, the first oral direct thrombin inhibitor. Sibrafiban
and ximelagatran are both double prodrugs (monoamidoximes
and ester functionality), where in the active principles the
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Pharmazeutische Chemie
und der umfangreichen Reduktion von
Benzamidoximen (siehe oben) wurde
das Prodrug-Prinzip „Amidoxime anstelle von Amidinen“ (Schema 2) in
meinem Labor für Pentamidin entwickelt.
Dieses Prodrugprinzip wurde auf
zahlreiche Arzneistoffkandidaten wie
Sibrafiban und Ximelagatran, beide in
Phase III der klinischen Studien, übertragen. Sibrafiban, ein Glykoprotein
IIIb/IIIa Rezeptorantagonist, wies in
diesen Studien eine sehr gute orale
Verfügbarkeit mit einer geringen
individuellen Variabilität der pharmakokinetischen Parameter und keine Zeichen von Toxizität auf. Die gleichen Eigenschaften wurden auch für
Schema 2 / Scheme 2
Ximelagatran, dem ersten oralen
direkten Thrombininhibitor, nachgewiesen. Sibrafiban und Ximelagatran
sind beide doppelte Prodrugs (Monoamidoxime und Estergruppierungen), bei denen in den Wirkformen die Amidinfunktion durch ein N-Hydroxyamidin (Amidoxim) und die
Carbonsäure durch eine Estergruppierung ersetzt worden sind.
amidine functional groups are replaced by N-hydroxyamidines
and the carboxyclic acids by ester functionalities.
Nitric Oxide Donors, NO-Synthases
Nitric oxide synthases (NOSs), expressed as inducible (iNOS),
endothelial (eNOS), and neuronal (nNOS, bNOS) isoenzymes,
oxidize L-arginine in two steps via N-hydroxy-L-arginine to nitric
oxide (NO) and the urea derivative L-citrulline. The second step
is reported to be also catalyzed by P450 enzymes. The discovery of new (NO) liberating compounds and structure-activity
relationships are desirable both for the development of new
drugs and to advance our understanding of the metabolism
catalyzed by NOSs and P450s.
Stickstoffmonoxid-Donatoren, NO-Synthasen
Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOSs), die als induzierbare
(iNOS), endotheliale (eNOS) und neuronale (nNOS, bNOS)
Isoenzyme zur Expression kommen, oxidieren L-Arginin in zwei
Schritten über N-Hydroxy-L-arginin zu Stickstoffmonoxid (NO)
und dem Harnstoffderivat L-Citrullin. Es ist darüber berichtet
worden, das der zweite Schritt auch durch P450-Enzyme
katalysiert werden kann. Die Entdeckung von neuen NOfreisetzenden Verbindungen und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ist sowohl für die Entwicklung von neuen Arzneistoffen als
auch zur Verbesserung des Verständnisses der durch NO-Synthasen und P450-Enzymen katalysierten Reaktionen äußerst
wünschenswert.
In my group several N-hydroxyguanidines, azides and hydrazines were tested for their capability to release NO by cytochrome P450 enzymes. Non-physiological N-hydroxyguanidines
are capable of producing NO in the presence of microsomal
enzymes like P450. However, in vivo the reduction of these Nhydroxyguanidines is the predominant reaction (see above).
Inhibitors of NO synthases are also developed which might be
beneficial for the treatment of several diseases.
In meiner Gruppe sind viele N-Hydroxyguanidine, Amidoxime,
Azide und Hydrazine hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Freisetzung
von NO, katalysiert durch P450-Enzyme, untersucht worden.
Nichtphysiologische N-Hydroxyguanidine und Amidoxime sind
in der Lage in Gegenwart von mikrosomalen Enzymen wie P450
NO freizusetzen. Allerdings ist in vivo die Reduktion (siehe
oben) dieser N-hydroxylierten Verbindungen die weitaus dominierende Reaktion.
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Pharmaceutical Chemistry
Darüberhinaus werden zur Zeit auch Inhibitoren von NO-Synthasen entwickelt, die zur Behandlung verschiedener Krankheitsbilder von grossem Vorteil sein könnten.
Literaturangaben / References
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of N-hydroxylated amidines (amidoximes): Synthesis, in vitro
formation by pig hepatocytes, and mutagenicity testing, Chem.
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Ansprechpartner / Contact
Prof. Dr. Bernd Clement
Pharmazeutisches Institut
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
Gutenbergstr. 76
D-24118 Kiel (Germany)
Tel: 0431-880-1126
Fax: 0431-880-1352
E-Mail: [email protected]
URL: www.pharmazie.uni-kiel.de
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