BIOKATALYSE - AKTIVITÄTSMESSUNGEN VON ENZYMEN

BIOKATALYSE - AKTIVITÄTSMESSUNGEN VON ENZYMEN
(Measurement of Enzymatic Activity)
Enzyme sind die Katalysatoren der belebten Natur. Die allermeisten von ihnen sind Proteine.
Allerdings gibt es inzwischen einige Beispiele für RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität –
man spricht dann von Ribozymen. Viele Enzyme enthalten sog. prosthetische Gruppen, die
nicht Aminosäuren sind (Coenzyme) und die oft am katalytischen Zentrum des Enzymmoleküls
lokalisiert sind. Coenzyme sind häufig eher Cosubstrate, die (wie beispielsweise das NAD in
Redoxreaktionen) zyklische Reaktionen durchlaufen.
Enzyme können als globuläre, lösliche Moleküle in allen Bereichen der Zelle, z. B. im
Cytoplasma oder in der Matrix von Organellen auftreten. Andere sind Bestandteile von
Enzymkomplexen, wie z. B. im Multienzymkomplex der Fettsäuresynthese. Manche
Enzymkomplexe sind in Membranen integriert – wie etwa die großen Komplexe in der
Atmungskette der inneren Mitochondrienmembran oder die Photosynthesekomplexe der
Thylakoidmembran, die aus mehr als 30 individuellen Proteinuntereinheiten bestehen können.
Enzyme gehorchen in ihrer Funktion den Gesetzen der Thermodynamik. Sie beschleunigen die
Gleichgewichtseinstellung von Reaktionen, die ohne einem Katalysator nur sehr langsam
ablaufen würden. Die Kinetik einer Reaktion wird optimiert, in dem der reaktive
Übergangszustand durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie begünstigt wird. Es wird also
die Gleichgewichtseinstellung beschleunigt, das Gleichgewicht bleibt jedoch unverändert. Ein
Beispiel: Die Spaltung von Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff ist
thermodynamisch sehr begünstigt, denn die freie Enthalpie beträgt –96 kJ/mol. Die Reaktion
läuft aber aufgrund der hohen Aktivierungsenergie von 76 kJ/mol nur sehr langsam mit einer
Geschwindigkeitskonstante k<10-5 mol/l(1 x s) ab (siehe unten). Mit kolloidalem Platin als
Katalysator sinkt sie auf 50 kJ/mol und k stiegt auf 10– 2. Das Enzym Katalase senkt die
Aktivierungsenergie auf 23 kJ/mol und erhöht k so auf 106 .
Im Gegensatz zu chemischen Katalysatoren haben Enzyme in der Regel eine außerordentlich
hohe Substratspezifität, die es möglich macht, die vielen nebeneinander auflaufenden
Stoffwechselwege subtil zu regulieren. Eine hohe Stereospezifität in der Reaktion findet man
beispielsweise beim auch ökonomisch bedeutenden sog. pflanzlichen Sekundärstoffwechsel.
Enzyme können irreversibel gehemmt werden. Von Bedeutung für biologische
Regulationsvorgänge sind aber reversible Hemmungen bzw. Induktionen. Unterschieden wird
ein isosterischer Effekt, bei dem es zur kompetitiven Hemmung kommt, d. h. Hemmstoff und
Substrat konkurrieren um das katalytische Zentrum, und ein allosterischer Effekt, der zur einer
nichtkompetitiven Hemmung führt.
Nach ihren Substrat- und Reaktionsspezifitäten werden die Enzyme mit EC-Nummern
(,,enzyme commission‘‘) in sechs Großgruppen (1. Oxidoreduktasen, 2. Transferasen, 3.
Hydrolasen, 4. Lyasen, 5. Isomerasen, 6. Ligasen) mit weiteren Untergruppen klassifiziert.
Modelle der Enzymkatalyse
In die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion gehen die Konzentrationen der beteiligten
Partner ein, denn die Konzentration der Intermediate darf ja bei einem längeren
Stoffwechselweg nie zu klein werden. Alle weiteren Faktoren, die die Geschwindigkeit der
Reaktion beeinflussen, stecken in der Geschwindigkeitskonstante, also primär in den
Eigenschaften des Enzyms. Die Funktion eines Enzyms als Katalysator zu verstehen, ist für die
biochemische Betrachtung des Zellgeschehens eine wesentliche Voraussetzung. Ein
vereinfachtes, aber schlüssiges Bild von der Enzymkatalyse kann man sich relativ leicht anhand
von einschränkenden Annahmen machen.
Das Spezielle an der Katalyse mit Hilfe von Enzymen ist, daß sie über Zwischenstufen, EnzymSubstrat-Komplexe, abläuft. Nach dem Schema freies Substrat S → gebundenes Substrat →
Produkt P betrachtet man die Gesamtreaktion als Folgereaktion, die aus zwei Teilreaktionen
besteht.
Das Postulat von Enzym-Substrat-Komplexen beruht auf der reversiblen Bildung dieses
Komplexes aus den Komponenten,
Enzym + Substrat ↔ Enzym-Substrat-Komplex
E
+
S
=
ES
Die Anwendung Massenwirkungsgesetzes ergibt die Beziehung:
[E] x [S]
[ES]
=
KS
Nach dem Grundpostulat der „Zwischenstoffkatalyse“ kann sich die eigentliche enzymatische
Reaktion nur aus dem Komplex heraus abspielen. In einer praktisch vollständig ablaufenden
Reaktion, d. h. vorausgesetzt, daß die Reaktion exergonisch ist und das Gleichgewicht sehr weit
rechts liegt, wie dies häufig der Fall ist, wird gleichzeitig der Katalysator regeneriert.
MICHAELIS und MENTEN haben angenommen, daß diese Reaktion
geschwindigkeitsbestimmend ist, d.h. wesentlich langsamer verläuft als die Bildung des EnzymSubstrat-Komplexes. Dann ist die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion, die man direkt messen
kann, der Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes (ES) proportional, und man kann die
Reaktionsgeschwindigkeit als Maß für die ES-Konzentration ansehen.
Aus der Gleichung läßt sich nun folgendes entnehmen: Wenn man von einer gegebenen Menge
Enzym ausgeht und die Substratkonzentration nach und nach erhöht, so wird immer mehr
Enzym in den Komplex ES übergeführt, die Reaktionsgeschwindigkeit steigt, bis schließlich
praktisch alles Enzym als ES vorliegt, das Enzym also gesättigt ist; dann besitzt die
Reaktionsgeschwindigkeit ihre maximale Größe. Der Verlauf dieser Kurve ist in Abbildung XII,
1 wiedergegeben.
Vmax
V1/2 max
KM
[S]
Abb. XII, 1: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (bei
konstanter Enzymkonzentration). Die graphische Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung
zeigt einen Bereich für geringe Substrat-Konzentrationen, in dem eine fast lineare Abhängigkeit
zwischen Substrat-Konzentration und Geschwindigkeit herrscht. Es folgt ein Bereich, bei dem
eine Erhöhung der Konzentration des Substrats nur mehr geringe Zunahmen an
Reaktionsgeschwindigkeit mit sich bringt. Zuletzt zeigt der Kurvenverlauf, daß eine Sättigung
erreicht wird.
Die Sättigungskonzentration ist von Enzym zu Enzym und für ein Enzym von Substrat zu
Substrat verschieden. Sie läßt sich – im Gegensatz zur Maximalgeschwindigkeit – aus der
Kurve schlecht ablesen. Man bekommt aber gut definierte Verhältnisse, wenn man die
halbmaximale Geschwindigkeit als Bezugspunkt wählt. Dann muß die Hälfte des insgesamt
vorhandenen Enzyms als ES, die andere Hälfte als E vorliegen, denn die
Reaktionsgeschwindigkeit soll der ES-Konzentration proportional sein. In der oben
angegebenen Gleichung heben sich für diesen Fall die Größen E und ES heraus und es bleibt
die Beziehung
[S]halbmaximale Geschwindigkeit = KM
Dies heißt: Die Substratkonzentration, bei der die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit
erreicht ist, ist gleich der Dissoziationskonstanten des Enzym-Substrat-Komplexes. Man nennt
sie nach dem Begründer der Theorie die ,,Michaelis-Menten-Konstante‘‘, der KM-Wert. Sie hat
die Dimension einer Substratkonzentration (in mol/l); bei dieser Konzentration ist das Enzym
zur Hälfte mit Substrat gesättigt.
Eine hohe Michaelis-Menten-Konstante (KM-Wert) bedeutet also, daß eine hohe
Substratkonzentration nötig ist, um Halbsättigung zu erzielen, d. h. das Enzym hat zu dem
betreffenden Substrat keine hohe Affinität. Ein kleiner KM-Wert zeigt eine hohe Affinität des
Enzyms zu seinem Substrat an. Dieses wird bevorzugt binden und meist auch umgesetzt. – Die
Michaelis-Menten-Konstanten bewegen sich meist zwischen 10-2 bis 10-5 mol/l.
Ein wichtiger Parameter zur Charakterisierung eines Enzyms ist folglich sein KM-Wert für ein
bestimmtes Substrat. Dies ist diejenige Substratkonzentration [S], bei der die halbmaximale
Reaktionsgeschwindigkeit V erreicht ist. Es gilt für diesen Zusammenhang die sog. MichaelisMenten-Gleichung:
V = Vmax [S]/(KM + [S]),
wobei Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit beschreibt.
Die Enzymaktivität ist natürlich von verschiedenen Bedingungen abhängig (Temperatur, pHWert, Ionenkonzentration) und jedes Enzym hat hierfür seine charakteristischen Optima. Die
klassische Einheit (engl.: unit, U) der Enzymaktivität beschreibt den Umsatz von 1 µmol
Substrat pro Minute.
Alkoholdehydrogenase (ADH)
Eine große Zahl von Alkoholdehydrogenasen (ADH) ist aus verschiedenen Organismen isoliert
worden. Sie katalysieren allgemein die Reaktion:
R-CH2OH + NAD+ ↔ R-CHO + NADH + H+
Quantitative measurement of Drosophila alcohol dehydrogenase (ADH)
1. Thaw protein extracts from last week (A, B, C, D, E, F) and keep on ice.
2. Add 450 ul of ADH Assay Buffer to each of 6 plastic cuvettes
3. Add 50 ul from sample A to the first cuvette, mix, wait 1 minute for the mixture to reach room
temperature, and then place it in the spectrophotometer. Blank the Spec., then record the O.D.
reading every 10 seconds for 2 minutes. Be sure to write down the numbers as soon as they
appear on the Spec.
4. Repeat the above step for samples B, C, D, E, F
5. Make 1 graph of O.D. vs. time with 6 lines - one for each sample
6. Calculate ADH activity for each sample in units of:
change in O.D. per minute / protein concentration,
where protein concentration for each sample is estimated from last week’s lab.
Make a table with these results.
Note:
Sample A is from ADH-null flies (should have no ADH activity = negative control)
Sample B is from wild-type flies (positive control)
Samples C-F have various forms of ADH, it is your job to compare their activities.
Qualitative assay for β-galactosidase activity in Drosophila
β-galactosidase (Bgal) is an enzyme from bacteria that is not normally present in Drosophila.
However, it can be introduced into Drosophila by genetic engineering and is a useful Reporter
Gene. This is because its activity can be detected by a simple color change in the presence of the
appropriate substrate.
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; colorless) ↔ o-nitrophenol (yellow)
1. Begin with 6 tubes (B1, B2, B3, B4, B5, B6). Each tube contains1 knocked-out fly.
2. Add 40 ul Buffer A and thoroughly grind the fly.
3. Place 25 ul of Bgal Assay Buffer in each of 6 0.5 ul microcentrifuge tubes.
4. Add 25 ul sample to each tube
5. Incubate at least 1 hour at room temp. Record which samples are positive for Bgal (yellow)
and which are negative (colorless).
Note:
Sample B1 is a wild-type fly (should have no Bgal activity = negative control)
Sample B2 is from a Bgal transgenic fly (positive control)
Samples B3-B6 are unknown. You must determine if the are Bgal+ or BgalBgal Assay Buffer
200 mM sodium phosphate
2 mM MgCl2
100 mM 2-mecaptoethanol
1.33 mg/ml ONPG
Buffer A
0.1 M tris-HCl
1mM EDTA
7mM 2-mercaptoethanol
ADH Assay Buffer
Buffer A containing:
0.1 M isopropanol
1.4 mM NAD+