CHLAMYDIA TRACHOMATIS and NEISSERIA GONORRHOEAE

Transcription

(bioMérieux ref. 39210 / Gen-Probe Cat. No. 3905)
CHLAMYDIA TRACHOMATIS und NEISSERIA GONORRHOEAE
(bioMérieux Best.Nr. 39210 / Gen-Probe Kat. Nr. 3905)
CHLAMYDIA TRACHOMATIS et NEISSERIA GONORRHOEAE
(bioMérieux réf. 39210 / Gen-Probe Cat. No. 3905)
CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA GONORRHOEAE
CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE
(bioMérieux cod. 39210 / Gen-Probe Cat. N. 3905)
English
For screening of Chlamydia trachomatis and/or Neisseria gonorrhoeae in Endocervical and Male
Urethral Specimens
INTENDED USE
The GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and NEISSERIA
GONORRHOEAE is a DNA probe test that utilizes nucleic acid hybridization technology to screen
for the presence of Chlamydia trachomatis and/or Neisseria gonorrhoeae from endocervical and
male urethral swab specimens collected with the GEN-PROBE PACE Specimen Collection Kits.
Follow-up testing in individual C. trachomatis and N. gonorrhoeae assays is needed to identify the
organism(s) present in PACE 2C-positive specimens.
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
Chlamydiae are nonmotile, Gram-negative, obligate intracellular bacteria that rely on the ATP
produced by the host cell for replication. Chlamydial infections have been known for many years.
However, appreciation of the pathogenicity of Chlamydia trachomatis has increased over time (23,
25). C. trachomatis is responsible for approximately 50-80% of the cases of nongonococcal
urethritis (9, 10).
The Chlamydia trachomatis species is comprised of fifteen serovars that are responsible for the
following diseases in humans: trachoma, inclusion conjunctivitis, lymphogranuloma venereum, and
other sexually transmitted diseases. The serovars D through K are the major cause of genital
chlamydial infections in men and women (26). Clinical signs produced by Chlamydia trachomatis in
humans include nongonococcal urethritis, epididymitis, proctitis, cervicitis, and acute salpingitis (9,
24, 27). In addition to the sexual transmission of chlamydial infections, newborn children are
significantly at risk for inclusion conjunctivitis and chlamydial pneumonia from infected mothers (1,
7, 28).
Several methods have been used to detect the presence of Chlamydia trachomatis in infected
tissue. These include direct Giemsa staining of infected tissue and evaluation by light microscopy
and cell culture of specimens followed by visualization of inclusion bodies by iodine, fluorescein, or
conjugated antibody staining (5, 19, 26, 31). More recently, rapid methods have been developed
using antigen detection and nucleic acid hybridization (13, 14).
Gonorrhea is a very commonly reported bacterial infection in the United States, with nearly 392,200
cases reported in 1993 (4). This sexually transmitted disease usually results in anterior urethritis
accompanied by a purulent exudate in men. In women, the disease is most often found in the cervix,
but the vagina and uterus also may be infected. While severe complications and sterility can occur
in untreated individuals, asymptomatic infections are frequently diagnosed. Gonorrhea infections
also may be diagnosed from other mucous membranes including the conjunctiva, anus, and
oropharynx (17).
1
Neisseria gonorrhoeae is the causative agent of gonorrhea. N. gonorrhoeae is a Gram-negative,
oxidase-positive diplococcus that has stringent growth requirements (8, 12, 29). Presumptive
diagnosis of gonorrhea is based on recovery of the organism from culture, morphological
examination using gram stain, and determination of the presence of cytochrome oxidase (8, 12).
Confirmatory procedures for the definitive diagnosis of gonorrhea infections include fluorescent
antibody staining, carbohydrate degradation, agglutination, sugar fermentation, and nucleic acid
hybridization tests (6, 11, 16, 18, 22, 30). More recently, nucleic acid hybridization has been used
to diagnose gonorrhea infections directly from patient samples (21).
GONORRHOEAE uses nucleic acid hybridization technology (15) to detect Chlamydia trachomatis
and/or Neisseria gonorrhoeae directly from endocervical and male urethral swab specimens. The
assay does not distinguish between the two organisms, but indicates if one or both are present in
a specimen.
PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
Nucleic acid hybridization tests are based on the ability of complementary nucleic acid strands to
specifically align and associate to form stable double-stranded complexes (15). The GEN-PROBE
PACE 2C System uses single-stranded DNA probes with chemiluminescent labels that are
complementary to the ribosomal RNA of the target organisms. After the ribosomal RNA is released
from the organisms, the labeled DNA probes combine with the ribosomal RNA of the target
organisms to form stable DNA:RNA hybrids. The labeled DNA:RNA hybrids are separated from the
non-hybridized probes and are measured in the GEN-PROBE LEADER luminometer. The test
results are calculated as the difference between the response of the specimen and the mean
response of the Negative Reference.
REAGENTS
GONORRHOEAE
PACE 2 Hybridization Buffer (Buffered solution) (HB) containing < 20% detergent.
PACE 2C Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Probe Reagent (P) Lyophilized,
labeled non-infectious DNA probe (< 500 ng/vial).
PACE 2 Selection Reagent (Buffered solution) (S) containing < 8% detergent.
PACE 2 STD Separation Reagent (SR) Solid phase (1.25 mg/mL) in a solution containing
0.02% sodium azide as a preservative.
PACE 2 STD Negative Reference (NR) Non-infectious nucleic acid in a buffered solution
containing < 5% detergent.
PACE 2 Chlamydia trachomatis Positive Control (PCT) Non-infectious C. trachomatis nucleic
acid in a buffered solution containing < 5% detergent.
PACE 2 Neisseria gonorrhoeae Positive Control (PGC) Non-infectious N. gonorrhoeae nucleic
acid in a buffered solution containing < 5% detergent.
PACE 2 STD Wash Solution (Buffered solution) (W) containing < 2% detergent.
Sealing Cards One package.
GEN-PROBE DETECTION REAGENT KIT (Provided Separately)
Detection Reagent I (RI) 0.1% Hydrogen peroxide in 0.001N nitric acid.
Detection Reagent II (RII) 1N Sodium hydroxide.
2
WARNINGS AND PRECAUTIONS
A.
For in vitro diagnostic use.
This test system has been evaluated using endocervical and male urethral swab specimens
only. Performance with other specimen types has not been assessed.
C.
Separation Reagent MUST NOT freeze. The performance of the assay will be affected by use
of improperly stored Separation Reagent. If the reagent has been frozen, the particles in the
suspension may clump, resulting in a granular appearance that will not evenly disperse after
thorough mixing. Visible clumps of Separation Reagent may adhere to the walls of the
container. If this occurs, contact your Gen-Probe distributor.
D.
Clean laboratory ware must be used to prepare reagents. Disposable polystyrene containers
are strongly recommended.
E.
Use routine laboratory precautions. Do not pipette by mouth. Do not eat, drink or smoke in
designated work areas. Wear disposable gloves and laboratory coats when handling
specimens and kit reagents. Wash hands thoroughly after handling specimens and kit
reagents.
F.
Specimens may be infectious. Use universal precautions (3). Proper handling and disposal
methods should be established by the laboratory director. Only personnel adequately trained
in handling infectious materials should be permitted to perform this type of diagnostic
procedure.
1.
2.
Thoroughly clean and disinfect all work surfaces.
Autoclave any contaminated equipment or materials that have come in contact with the
samples before discarding.
G.
Separation Reagent contains sodium azide which may react with lead or copper plumbing to
form potentially explosive metal azides. Upon disposal of this reagent, always dilute the
material with a large volume of water to prevent azide buildup in the plumbing.
H.
Avoid contact of Detection Reagents I and II with skin, eyes and mucous membranes.
WARNING: CORROSIVE PRODUCT. Wash with water if contact with these reagents occurs.
If spills of these reagents occur, dilute with water before wiping dry.
I.
Do NOT interchange, mix or combine reagents from kits with different lot numbers except for
STD wash solution.
STORAGE AND HANDLING REQUIREMENTS
PACE 2C Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Probe Reagent and PACE 2 Separation
Reagent must be stored at 2° to 8°C.
The PACE 2C Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Probe Reagent is stable for 3 weeks
after reconstitution when stored at 2° to 8°C.
The prepared Separation Suspension is stable for 6 hours after preparation when stored at 20° to
25°C.
Other reagents contained in the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS
and NEISSERIA GONORRHOEAE are to be stored at 2° to 25°C and are stable until the date
stamped on the container.
DO NOT FREEZE THE REAGENTS CONTAINED IN THIS KIT.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
GONORRHOEAE is designed to screen for the presence of Chlamydia trachomatis and/or
3
English
B.
Neisseria gonorrhoeae in endocervical and male urethral specimens collected using the GENPROBE PACE SPECIMEN COLLECTION KITS.
Only swabs contained in the PACE SPECIMEN COLLECTION KITS can be used to collect patient
specimens. The swabs collected from patients MUST BE transported to the laboratory in the GENPROBE transport medium.
A.
Collect swab samples as follows:
1.
Cervical swab specimens
a.
b.
c.
d.
e.
f.
2.
Remove excess mucus from the cervical os and surrounding mucosa using one
of the swabs provided in the cervical collection kit and discard the swab.
Insert the second swab from the collection kit into the endocervical canal.
Rotate the swab for 10 to 30 seconds in the endo-cervical canal to ensure
adequate sampling.
Withdraw the swab carefully; avoid any contact with the vaginal mucosa.
Fully insert the swab into the GEN-PROBE transport tube.
Break the swab shaft at the scoreline to fit the tube; use care to avoid splashing
of contents. Cap the tube tightly.
Urethral swab specimens
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Patient should not have urinated for at least 1 hour prior to sample collection.
Insert the swab from the urethral/conjunctival collection kit 2 to 4 cm into the
urethra using a rotating motion to facilitate insertion.
Once inserted, rotate the swab gently using sufficient pressure to ensure the swab
comes into contact with all urethral surfaces. Allow the swab to remain inserted for
2 to 3 seconds.
Withdraw the swab.
Fully insert the swab into the GEN-PROBE transport tube.
Break the swab shaft at the scoreline to fit the tube; use care to avoid splashing
of contents. Cap the tube tightly.
B.
Transport the tubes to the laboratory at 2° to 25°C and store at 2° to 25°C until tested.
Samples should be assayed with the GEN-PROBE PACE 2C System within 7 days. If longer
storage is necessary, process the specimen as described in SAMPLE PREPARATION and
freeze at -20° to -70°C for up to 90 days after collection.
C.
During routine analysis, bloody specimens have not proven to interfere with assay
performance. However, grossly bloody specimens (greater than 80 µL whole blood in 1 mL
transport medium) may interfere with performance.
D.
Specimens which require shipping should be transported to the laboratory in compliance with
regulations covering transportation of etiological agents. Store and test as described (see B
above).
MATERIALS PROVIDED
GONORRHOEAE
(bioMérieux ref. 39210/Gen-Probe Cat.No. 3905)
100 Tests
2 x 6 mL
PACE 2 Hybridization Buffer (HB)
PACE 2C Chlamydia trachomatis/
Neisseria gonorrhoeae Probe Reagent (P)
2 x 6 mL
when reconstituted
4
1 x 100 mL
1 x 9 mL
1 x 7 mL
1 x 3 mL
1 x 3 mL
3 x 200 mL
1 package
120 tubes/box
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
Vortex Mixer
Covered water bath (60° ± 1°C)
Micropipettes (100 µL)
Pipettes capable of delivering 1-25 mL
Absorbent paper
MATERIALS AVAILABLE FROM YOUR GEN-PROBE DISTRIBUTOR
GEN-PROBE PACE Specimen Collection Kit
Urethral/Conjunctival:
(bioMérieux ref. 39309 / Gen-Probe Cat. No. 3275) (50 each)
Cervical:
(bioMérieux ref. 39301 / Gen-Probe Cat. No. 3300) (50 each)
GEN-PROBE Detection Reagent Kit
(bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 1791 (1200 tests)
GEN-PROBE LEADER 50i luminometer
(bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 3100i)
GEN-PROBE Magnetic Separation Unit
GEN-PROBE FAST Express Reagent Kit
TEST PROCEDURE
A.
SAMPLE PREPARATION
1.
2.
3.
4.
B.
Allow the specimens to reach room temperature prior to processing.
Vortex each GEN-PROBE transport tube for at least 5 seconds.
Express all liquid from the swab by pressing the swab against the wall of the tube.
Discard the swab.
Prior to testing, vortex the transport tube for at least 5 seconds to ensure homogeneity.
REAGENT PREPARATION
1.
Allow all reagents EXCEPT the Probe Reagent and Separation Reagent to reach room
temperature prior to using. Probe Reagent and Separation Reagent must be maintained
at 2° to 8°C until used.
2.
Probe Reagent
Remove PACE 2 Hybridization Buffer from the kit and vortex for 10 seconds. Warm
PACE 2 Hybridization Buffer by swirling the vial in a water bath at 60° ± 1°C for 3 to 4
minutes. Vortex again for 10 seconds to ensure a homogeneous solution. Pipette
5
English
PACE 2 Selection Reagent (S)
PACE 2 STD Separation Reagent (SR)
PACE 2 STD Negative Reference (NR)
PACE 2 Chlamydia trachomatis
Positive Control (PCT)
PACE 2 Neisseria gonorrhoeae
Positive Control (PGC)
PACE 2 STD Wash Solution (W)
Sealing Cards
GEN-PROBE Disposable Polystyrene
Reaction Tubes (12 x 75 mm)
6.0 mL of PACE 2 Hybridization Buffer into lyophilized PACE 2C Chlamydia
trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Probe Reagent (PACE 2C Probe Reagent). Allow
the reagent to stand at room temperature for 2 minutes and then vortex for 10 seconds
prior to use. Visually inspect to ensure that the reagent is completely rehydrated and
homogeneous. Record on the label the date reconstituted. The reconstituted PACE 2C
Probe Reagent is stable for 3 weeks when stored at 2° to 8°C or until the date stamped
on the reagent container, whichever comes first. If the reconstituted PACE 2C Probe
Reagent has been refrigerated, vortex for 10 seconds then warm it by swirling the vial
in a water bath at 60° ± 1°C for 2 minutes. Prior to use, vortex again for 10 seconds to
ensure homogeneity. It may be necessary to repeat this procedure if the reconstituted
PACE 2C Probe Reagent is not homogeneous.
3.
Separation Suspension
Determine the number of tests to be performed. Calculate the volumes of Selection
Reagent and Separation Reagent as follows:
Volume of
Selection Reagent (mL) = number of tests + 2 extra tests
(with Eppendorf repeating pipettor)
= number of tests + 10 extra tests
(with bottle top dispenser)
Volume of
Separation Reagent (mL)
= Volume of Selection Reagent (mL)
20
Pour the required volume of Selection Reagent into a clean dry container. Mix the
Separation Reagent, add the required volume to the Selection Reagent, and mix well.
Prepared Separation Suspension is stored at room temperature and is stable for 6
hours.
Separation Suspension Preparation
(Example)
8 tests + 2 = 10 tests
C.
Number
of Tests
Selection
Reagent
8+2
18 + 2
48 + 2
98 + 2
10
20
50
100
mL
mL
mL
mL
Separation
Reagent
0.5
1.0
2.5
5.0
mL
mL
mL
mL
HYBRIDIZATION
1.
2.
3.
4.
Label tubes with sample identification numbers. Include three tubes for the Negative
Reference, one for the C. trachomatis Positive Control, and one for the N. gonorrhoeae
Positive Control. Label near the tops of the tubes only. The reference and controls must
be run with each batch of specimens.
Insert the tubes into the tube rack portion of the GEN-PROBE Magnetic Separation Unit.
Set aside the base portion of the separation unit for later use.
Vortex each specimen for 5 seconds.
Pipette 100 µL of each of the controls and specimens to the bottom of the respective
tubes.
6
5.
D.
EQUIPMENT PREPARATION
1.
E.
SEPARATION
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
F.
Prepare the GEN-PROBE LEADER luminometer for operation. Make sure there is
sufficient volume of Detection Reagents I and II to complete the tests.
Remove the tube rack from the water bath and remove the Sealing Cards.
Pipette 1 mL of the well-mixed, prepared Separation Suspension into each tube.
Cover the tubes with Sealing Cards and vigorously shake the tube rack 3 to 5 times to
mix. A foam head should be present in each tube.
Immediately place the tube rack in a water bath at 60° ± 1°C and incubate for 10
minutes.
Remove the tube rack from the water bath. Remove the Sealing Cards and place the
tube rack on the base of the Magnetic Separation Unit for 5 minutes at room
temperature.
Holding the tube rack and base of the GEN-PROBE Magnetic Separation Unit together,
decant the supernatants. Before turning tubes upright, shake the unit 2 to 3 times and
then blot tubes 3 times for 5 seconds each on absorbent paper.
DO NOT REMOVE THE TUBE RACK FROM THE GEN-PROBE MAGNETIC
SEPARATION BASE. Fill each tube to the rim with Wash Solution. See PROCEDURAL
NOTES regarding Wash Solution addition.
Allow the tubes to remain on the magnetic separation base for 20 minutes at room
temperature.
Holding the tube rack and base together, decant supernatants. Before turning tubes
upright, shake the unit 2 to 3 times. DO NOT BLOT. Approximately 50-100 µL of Wash
Solution should remain in each tube.
Separate the tube rack from the base and shake the tube rack to resuspend the pellets.
DETECTION
1.
2.
Select the appropriate protocol from the LEADER luminometer software.
Using a damp tissue or damp paper towel, wipe each tube to ensure that no residue is
present on the outside of the tube. Ensure that the pellets are resuspended and insert
the tubes in the LEADER luminometer according to the prompts provided by the
instrument software.
Read the tubes in the following order:
Negative Reference, 3 tubes
C. trachomatis Positive Control, 1 tube
N. gonorrhoeae Positive Control, 1 tube
Specimen tubes
3.
When the analysis is complete, remove the tube(s) from the LEADER luminometer.
PROCEDURAL NOTES
A.
PACE 2 HYBRIDIZATION BUFFER: Heating and swirling of the PACE 2 Hybridization Buffer
and reconstituted PACE 2C Probe Reagent at 60° ± 1°C is imperative to prevent gel formation
and ensure a homogeneous solution.
7
English
6.
7.
8.
Pipette 100 µL of the PACE 2C Probe Reagent to the BOTTOM of each tube, taking
care not to touch the top or sides of the tube.
Cover the tubes with Sealing Cards ensuring that each tube is sealed.
Shake the rack 3 to 5 times to mix.
Incubate the tubes in a water bath at 60° ± 1°C for 1 hour. DO NOT place the magnetic
separation unit base in the water bath.
B.
SPECIMENS: Occasionally a specimen may be too viscous to pipet. Be sure that specimens
are at room temperature and vortex to liquify. The GEN-PROBE FAST Express reagent may
be used to simplify specimen preparation. For information, call Gen-Probe Technical Service.
C.
PIPETTING: For convenience, repeating pipettors or dispensers may be used for addition of
PACE 2C Probe Reagent, Separation Suspension, and Wash Solution. Pipettors with
disposable tips are recommended for pipetting specimens, references, and controls to avoid
sample carry-over and cross-contamination. Care should be taken to pipette PACE 2C Probe
Reagent to the BOTTOM of tubes without inserting the pipette tip into the tubes or touching
the tip to the rim of each tube. When adding the reagents, angle the solutions toward the front
sides of the tubes, not straight to the bottoms, to avoid splashback.
D.
BLOTTING: Discard absorbent paper after each blotting to avoid contamination. DO NOT
BLOT AFTER THE WASH STEP.
E.
TEMPERATURE: The hybridization and separation reactions are temperature dependent.
Therefore, it is imperative that the water bath and reaction tubes be equilibrated uniformly
during these steps. A covered water bath capable of maintaining 60° ± 1°C should be used.
F.
WASHING: Forceful addition of the Wash Solution is required. The Wash Solution should
be forcefully injected into each tube. Angle the Wash Solution towards the front sides of the
tubes, not straight to the bottoms, to avoid splashback. Appearance of a 1 cm foam head on
the reaction tubes will signal forceful enough addition of Wash Solution. After adding Wash
Solution to all tubes in the rack, care should be taken to go back and “top off” each tube so
no foam remains. Failure to deliver Wash Solution in the specified manner may result in
spurious results.
G.
WASH BOTTLE AND CAP ASSEMBLY: This is an optional method for delivering Wash
Solution. Each laboratory should validate that this assembly yields assay performance
equivalent to that of the current method of Wash Solution addition. Prior to using a new wash
bottle and cap assembly, pour Wash Solution into the bottle. Screw cap onto bottle. Discard
the first 5 ml by squirting through the cap.
H.
As in any reagent system, excess powder on some gloves may cause contamination of
opened reagents or reaction tubes. Gen-Probe recommends that customers experiencing
difficulty with the test avoid using this type of laboratory glove. Using powderless gloves (no
talcum powder) will avoid this difficulty.
I.
DETECTION: Tubes should be read in the LEADER luminometer within 60 minutes of
decanting the Wash Solution. Tubes should be maintained at 20° to 25°C prior to reading.
RESULTS
A. CALCULATION OF RESULTS
The results of the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and
NEISSERIA GONORRHOEAE are calculated based on the difference between the response in
Relative Light Units (RLU) of the specimen and the mean of the Negative Reference.
8
Mean of the Negative Reference = Sum of the three Negative Reference replicates divided by 3.
Example:
English
Mean of the Negative Reference =
(65 RLU + 71 RLU + 80 RLU) = 72 RLU
3
Assigned Cut-off = 300 RLU
Calculated Cut-off = 300 RLU + 72 RLU = 372 RLU
Specimen Response = 900 RLU
Positive
The LEADER luminometer prints the specimen response and compares this response to the
calculated assay cut-off. A positive or negative interpretation as compared to this cut-off is printed.
See the Operator’s Manual for detailed protocols.
B.
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and
NEISSERIA GONORRHOEAE should be interpreted in conjunction with other laboratory and
clinical data available to the clinician.
POSITIVE - The difference is greater than or equal to 300 RLU plus the mean of the Negative
Reference.
NEGATIVE - The difference is less than 300 RLU plus the mean of the Negative Reference.
A positive result should be reported that Chlamydia trachomatis rRNA and/or Neisseria gonorrhoeae
rRNA is present in the specimen tested. Follow-up testing in individual C. trachomatis and N.
gonorrhoeae assays is needed to identify the organism(s). If, after follow-up testing in individual C.
trachomatis and N. gonorrhoeae assays, the sample is negative, report result as inconclusive and
request another sample.
A negative result should be reported that Chlamydia trachomatis rRNA and Neisseria gonorrhoeae
rRNA were not detected in the specimen tested.
C.
QUALITY CONTROL AND ACCEPTABILITY OF RESULTS
NOTE: The Negative Reference and Positive Control provided, control the PACE 2C assay only.
They do not control for the lysis of the target organism(s) in the specimen transport medium.
Negative Reference:
The Negative Reference provides a measure of the assay background and is used to calculate the
run cut-off. The expected values of the Negative Reference were validated using 69 runs (3
replicates/run) at five locations throughout the United States.
The response of each Negative Reference should be less than 200 RLU. All Negative Reference
values should fall within 30% of the mean response for the Negative Reference (i.e., the Coefficient
of Variance should be less than 30%). If one value falls outside these ranges, it may be deleted from
the calculations by following the instructions in the LEADER luminometer Operator’s Manual. If two
values fall outside these ranges, the test should be repeated. If this is a frequent occurrence, reevaluate the technique used and call GEN-PROBE Technical Service if the problem persists.
Positive Controls:
The expected values for each of the Positive Controls were validated using 69 different runs at five
locations throughout the United States.
9
The difference in the response of each of the Positive Controls and the mean response of the
Negative Reference should be > 600 RLU and < 3,200 RLU or the run is invalid. If the Positive
Control values repeatedly fall out of specification, contact Gen-Probe Technical Service. Results
from the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and NEISSERIA
GONORRHOEAE should be interpreted in conjunction with other laboratory and clinical data
available to the clinician.
If the Positive Controls or Negative Reference values are not in the required ranges, the test results
are invalid and must not be reported.
Each laboratory under its normal operating conditions should establish its own mean and range for
the Negative Reference and Positive Controls and maintain records according to Standard
Laboratory Quality Control practices (2, 20).
Sample Processing Cell Controls:
To test the effectiveness of sample processing, positive and negative cell controls may be run in
conjunction with the specimens. For example, C. trachomatis ATCC VR878 and N. gonorrhoeae
ATCC 19424 may be used as the positive cell controls and N. mucosa ATCC 19696 may be used
as the negative cell control. For the Neisseria isolates, use actively growing cultures to prepare
suspensions of approximately 3 x 108 CFU/mL in sterile saline. Inoculate 10 µL of each cell
suspension into a transport tube from a GEN-PROBE PACE Specimen Collection Kit (endocervical
or urethral/conjunctival) and vortex. For the Chlamydia isolates, use stocks harvested from cell
culture and titered to be approximately 3 x 108 IFU/mL. Transfer 10 µL of each stock to a transport
tube from a GEN-PROBE PACE Specimen Collection Kit (endocervical or urethral/conjunctival) and
vortex. Process the controls in the same manner as the patient specimens, beginning with Step C1
of the test procedure. The positive cell controls should produce positive test results and the negative
cell controls should produce negative test results.
LIMITATIONS
This method has been tested using endocervical and male urethral swab specimens only.
Performance with other specimens has not been assessed.
During routine analysis, bloody specimens have not proven to interfere with assay performance.
However, grossly bloody specimens (greater than 80 µL whole blood in 1 mL transport media) may
interfere with performance.
The PACE 2C assay has been evaluated for interference by gynecological lubricants and
spermicides. The data indicate that in normal usage no interference will be observed. For additional
information on particular products, call Gen-Probe Technical Service.
Other endogenous substances that may be present in patient samples may interfere with the assay.
All Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae identification methods can yield false positive
results. In those circumstances where diagnosis could lead to adverse psychosocial impacts,
additional testing methods are recommended. Culture is the only recommended procedure for
diagnosing chlamydial and gonorrheal infection in medicolegal cases.
As in any disease state, the positive predictive value of this assay will decrease as the prevalence
decreases in the population. Reliable results are dependent on adequate specimen collection.
Because the transport system used for this assay does not permit microscopic assessment of
specimen adequacy, training of clinicians in proper specimen collection techniques is necessary.
See the SAMPLE COLLECTION AND STORAGE section of this insert for instructions.
Therapeutic failure or success cannot be determined as nucleic acid may persist following
appropriate antimicrobial therapy.
Results from the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and
10
NEISSERIA GONORRHOEAE should be interpreted in conjunction with other laboratory and
clinical data available to the clinician.
If a positive PACE 2C result contradicts other clinical or patient information or if the patient belongs
to a category cited in the 1993 CDC C. trachomatis guidelines (CDC, MMWR, Vol. 42, No. RR-12,
1993), verification of the result may be warranted.
Because the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and NEISSERIA
GONORRHOEAE is a screening assay designed to detect the presence of C. trachomatis and/or
N. gonorrhoeae, and because of the possibility of dual infection, follow-up testing of PACE 2Cpositives in individual C. trachomatis and N. gonorrhoeae assays is needed.
EXPECTED VALUES
DISTRIBUTION OF CLINICAL RESULTS
Using the results obtained for the specimens tested in the clinical trial for PACE 2C, a distribution
of sample RLU values above and below the assay cut-off was generated. The data are presented
below after resolution of discrepant specimens. The numbers of false positive (FP) and false
negative (FN) results for each RLU category are given below the figure.
1400
1,349
Male Asymptomatic
1200
Male Symptomatic
1000
Female Symptomatic
# of Samples
Female Asymptomatic
800
600
481
NEGATIVES
400
POSITIVES
200
90
10
14
20
d
10
,0
01
an
10
to
01
01
10
11
up
00
,0
00
20
to
10
to
1
50
2
29
00
0
to
50
0
40
1
30
1
20
13
10
30
9
40
to
30
to
to
1
10
18
0
0
20
0
10
TO
FP
FN
32
1
77
0
8
7
11
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
A. WITHIN-RUN PRECISION
The within-run precision of the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS
and NEISSERIA GONORRHOEAE was calculated by assaying four concentrations of C.
trachomatis inclusion forming units (IFU) and N. gonorrhoeae cells using five replicates in a single
11
English
A negative test does not exclude the possibility that the numbers of C. trachomatis and/or N.
gonorrhoeae organisms may be below the level of detection of the assay. A second swab can be
collected and cultured to identify those patients infected with low levels of organism(s). As well, test
results may be affected by improper specimen collection, technical error, specimen mix-up or
concurrent antibiotic therapy.
assay; one negative sample was also run.
Sample
A
Number of Replicates
Mean Response (RLU)
Standard Deviation (RLU)
Coefficient of Variance
5
9,530
210
2.2%
B
C
D
E
5
2,075
143
6.9%
5
1,041
42
4.0%
5
767
52
6.8%
5
49
2
n/a
B.
BETWEEN-RUN PRECISION
Between-run precision was calculated by assaying the same four concentrations of C. trachomatis
IFU and N. gonorrhoeae cells and one negative sample using the average of five replicates
determined in three consecutive runs.
Sample
A
B
C
D
E
3
Mean Response (RLU)
10,147
917
9.0%
3
2,259
240
10.6%
3
968
66
6.8%
3
690
74
10.7%
3
51
4
n/a
C.
POSITIVE CONTROL PRECISION
Precision data for the C. trachomatis and N. gonorrhoeae Positive Controls were determined in
PACE 2C assays performed at five locations throughout the United States. One replicate of each
Positive Control was assayed in each PACE 2C run.
Sample
Mean Response (RLU)
D.
C. trachomatis
Positive Control
69
1,837
329
5.6%
N. gonorrhoeae
Positive Control
69
2,165
425
5.1%
ANALYTICAL SENSITIVITY
The analytical sensitivity (limits of detection) of the GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA
TRACHOMATIS and NEISSERIA GONORRHOEAE was determined by directly comparing dilutions
of freshly grown C. trachomatis and N. gonorrhoeae in cell culture and in the PACE 2C assay. The
sensitivities for the 15 C. trachomatis serovars at the assay cut-off of 300 RLU plus the mean of the
Negative Reference ranged from 24-2,232 inclusion-forming units (IFU)/assay (0.1 mL inoculated
transport medium); the average was 966 IFU/assay. The sensitivity of N. gonorrhoeae was
determined to be approximately 650 colony-forming units (CFU)/assay (0.1 mL inoculated transport
medium).
E.
ANALYTICAL SPECIFICITY
A total of 80 culture isolates were evaluated using the PACE 2C assay. These isolates included 20
organisms that may be isolated from the urogenital tract and 30 additional organisms that represent
a phylogenetic cross-section of organisms. Culture isolates of C. trachomatis (15 serovars), N.
gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, and 12 species of Neisseriaceae were
also tested. Only the C. trachomatis and N. gonorrhoeae samples produced a positive result in the
GEN-PROBE PACE 2C System for CHLAMYDIA TRACHOMATIS and NEISSERIA
GONORRHOEAE.
12
F.
RECOVERY
G.
CLINICAL TRIAL RESULTS
GONORRHOEAE was compared to standard culture methods for C. trachomatis and N.
gonorrhoeae using 1,266 endocervical specimens and 849 male urethral specimens. Specimens
were evaluated at a total of five clinical sites using a 300 net RLU cut-off. Clinical data are presented
below, both before and after resolution of discrepant specimens.
1.
PERFORMANCE SUMMARY: BEFORE DISCREPANT RESOLUTION
PACE 2C
Culture
Pos
Pos
Pos
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensitivity /
Specificity
(%)
74
9
6
219
92.5/96.1
48
8
3
313
94.1/97.5
71
6
8
221
89.9/97.4
12
4
1
263
92.3/98.5
371
17
11
208
97.1/92.4
Asymptomatic
(6.6% / 5.4%;
4 sites)
26
11
2
203
92.9/94.9
Combined
(10.1% / 41.3%;
4 sites)
397
28
13
411
96.8/93.6
Population
(%CT/%NG prevalence; # sites)
Female
Symptomatic
High Prevalence
(13.6% / 16.2%;
2 sites)
Low prevalence
(8.9% / 7.0%;
2 sites)
Female
Asymptomatic
High Prevalence
(12.1% / 17.0%;
2 sites)
Low Prevalence
(3.2% / 1.8%;
2 sites)
Male
Symptomatic
(11.5% / 55.7%;
4 sites)
13
English
Ribosomal RNA isolated from C. psittaci, Ureaplasma urealyticum, and Neisseria meningitidis was
added at a concentration of 0.1 µg/assay to samples containing different concentrations of C.
trachomatis and/or N. gonorrhoeae ribosomal RNA. These additions did not interfere with the
recovery of C. trachomatis or N. gonorrhoeae rRNA using the PACE 2C assay.
2.
PERFORMANCE SUMMARY: AFTER DISCREPANT RESOLUTION
Discrepant samples for C. trachomatis were resolved by re-culture and DFA. Cell culture was
not repeated for N. gonorrhoeae discrepant samples.
PACE 2C
Culture
Pos
Pos
Sensitivity/
Specificity
(%)
95%
Confidence
Intervals
Sensitivity/
Specificity (%)
86.7-97.9 /
94.7-99.1
86.5-100.0 /
95.6-99.1
Pos
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Population
Female Symptomatic
High Prevalence 77
6
6
219
92.8/97.3
Low Prevalence 49
7
3
313
94.2 / 97.8
Female Asymptomatic
High Prevalence 71
6
8
221
89.9 / 97.4
Low Prevalence 13
3
1
263
92.9 / 98.9
Male
Symptomatic
373
15
11
208
97.1 / 93.3
Asymptomatic
28
9
2
203
93.3 / 95.8
Combined
401
24
13
411
96.9 / 94.5
81.0-94.9 /
94.7-99.1
71.4-100.0 /
97.4-100.0
95.3-98.7 /
89.7-96.0
83.3-100.0 /
92.5-98.1
94.9-98.3 /
92.0-96.3
Of the 55 total PACE 2C-positive, culture-negative samples, 15 were negative when tested in
the individual PACE 2 assays for C. trachomatis and N. gonorrhoeae. As well, although it
could not be included in the discrepant resolution protocol described above, a research
amplification assay was used to test a number of the apparent PACE 2C false positives. Of
40 PACE 2C-positive, culture-negative probe samples tested in amplification, 26
demonstrated the presence of C. trachomatis nucleic acid and 11 N. gonorrhoeae nucleic
acid. These data indicate that a majority of samples classified in the above table as PACE 2C
false positives were, in fact, true positives that were missed by cell culture. The samples
remained classified as false positives because the amplification assay used was a research
assay.
3.
PERFORMANCE SUMMARY: INDIVIDUAL ORGANISMS
The ability of PACE 2C to detect C. trachomatis and N. gonorrhoeae individually was
determined by analyzing the resolved PACE 2C vs. culture results of positive samples
separately for each of the two target organisms. In order to simplify the analysis, dual positive
samples were included in both the C. trachomatis and N. gonorrhoeae data. Therefore, the
total number of positive samples in the table below is increased by 59 over the number in the
other clinical data tables.
14
PACE 2C
Negative
109
79
12
12
132
350
6
1
15
English
C. trachomatis Culture Positive
Female
Male
N. gonorrhoeae Culture Positive
Female
Male
Positive
16
Zum Screening auf Chlamydia trachomatis und/oder Neisseria gonorrhoeae in endozervikalen
Abstrichen und urethralen Proben von Männern.
VERWENDUNGSZWECK
Das GEN-PROBE PACE 2C System für CHLAMYDIA TRACHOMATIS und NEISSERIA
GONORRHOEAE ist ein DNA Sondentest, der nach dem Prinzip der Nukleinsäurehybridisierung
arbeitet. Mit diesem Test können endozervikale Abstriche und urethrale Proben von Männern, die
mit dem GEN-PROBE PACE Probenentnahmekit abgenommen wurden, auf die Anwesenheit von
Chlamydia trachomatis und/oder Neisseria gonorrhoeae gescreent werden. Bei PACE 2C-positiven
Proben müssen weitere Tests, in denen C. trachomatis und N. gonorrhoeae separat nachgewiesen
werden, angeschlossen werden.
ZUSAMMENFASSUNG UND TESTERKLÄRUNG
Chlamydien sind unbewegliche, gramnegative, obligat intrazelluläre Bakterien, die für ihre
Vermehrung das von der Wirtszelle produzierte ATP verwerten. Chlamydien-Infektionen sind seit
vielen Jahren bekannt. Mit der Zeit hat jedoch die pathogene Bedeutung von Chlamydia
trachomatis zugenommen (23, 25). C. trachomatis ist für ca. 50-80% aller nicht-gonorrhoischen
Urethritiden verantwortlich (9, 10).
Die Spezies Chlamydia trachomatis umfaßt 15 Serotypen, die folgende Erkrankungen beim
Menschen verursachen: Trachom, Einschlußkonjunktivitis, Lymphogranuloma venereum und
andere sexuell übertragbare Krankheiten. Die Serogruppen D bis K sind die Hauptverursacher
genitaler Chlamydien-Infektionen bei Männern und Frauen (26). Zu den klinischen
Erscheinungsbildern, die durch Chlamydia trachomatis beim Menschen hervorgerufen werden,
gehören die nicht-gonorrhoische Urethritis, Epididymitis, Proctitis, Zervizitis und akute Salpingitis (9,
24, 27). Neben der sexuellen Übertragung von Chlamydien-Infektionen haben Neugeborene von
infizierten Müttern ein hohes Risiko, an Einschlußkonjunktivitis oder Chlamydien-Pneumoniae zu
erkranken (1, 7, 28).
Zum Nachweis von Chlamydia trachomatis aus infiziertem Gewebe wurden mehrere Methoden
angewendet. Diese umfassen die direkte Giemsa Färbung von infiziertem Gewebe und deren
lichtmikroskopische Evaluierung sowie die Zellkultur mit anschließender Visualisierung der
Einschlußkörperchen durch Jod, Fluoreszein oder konjugierte Antikörper-Färbung (5, 19, 26, 31). In
jüngster Zeit wurden Schnellverfahren entwickelt, die mit dem Antigennachweis und der
Nukleinsäurehybridisierung arbeiten (13, 14).
Die Gonorrhoe ist eine sehr verbreitete Bakterieninfektion in den Vereinigten Staaten; 1993 wurden
fast 392.200 Fälle registriert (4). Diese sexuell übertragbare Erkrankung manifestiert sich beim
Mann im allgemeinen durch eine Urethritis anterior mit eitrigem Ausfluß. Bei der Frau ist am
17
Deutsch
CHLAMYDIA TRACHOMATIS und NEISSERIA GONORRHOEAE
häufigsten die Zervix betroffen, aber auch Vagina und Uterus können infiziert werden. Häufig
verlaufen die Infektionen asymptomatisch. Unbehandelt kann es zu schweren Komplikationen und
Sterilität kommen. Gonorrhoe-Infektionen können auch aus anderen Schleimhautmembranen,
insbesondere der Bindehaut, Anus und Oropharynx diagnostiziert werden (17).
Neisseria gonorrhoeae ist der Erreger der Gonorrhoe. N. gonorrhoeae ist ein gramnegativer,
oxidasepositiver Diplococcus mit besonders strengen Wachstumsansprüchen (8, 12, 29). Die
präsumptive Diagnostik einer Gonorrhoe basiert auf der kulturellen Anzucht des Erregers, der
morphologischen Untersuchung nach Gramfärbung und dem Nachweis von Cytochromoxidase
(8, 12). Zur Bestätigung einer Gonorrhoe gehören außerdem der Nachweis fluoreszierender
Antikörper, Kohlenhydratabbau, Agglutinationstests, Zuckerfermentationstests und die
Nukleinsäurehybridisierung (6, 11, 16, 18, 22, 30). In jüngster Zeit wurden
Nukleinsäurehybridisierungstests zur direkten Diagnostik einer Gonorrhoe-Infektion aus
Patientenproben verwendet (21).
GONORRHOEAE arbeitet nach dem Prinzip der Nukleinsäurehybridisierung (15) und weist
Chlamydia trachomatis und/oder Neisseria gonorrhoeae direkt aus Endozervikalabstrichen und
urethralen Proben von Männern nach. Der Test differenziert nicht zwischen den beiden
Organismen, er zeigt jedoch an, ob eine oder beide Organismen in der Probe vorhanden sind.
PRINZIP
Die Nukleinsäure-Hybridisierungstests basieren auf der Fähigkeit komplementärer
Nukleinsäuresequenzen sich spezifisch zu hybridisieren und stabile Doppelstrangkomplexe zu
bilden (15). Das GEN-PROBE PACE 2C System enthält eine einzelsträngige DNA Sonde, an die
ein Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist. Diese Sonde ist der rRNA der Zielsequenz
komplementär. Nachdem die rRNA des Zielorganismus freigesetzt ist, verbindet sich die Sonde mit
dieser und bildet einen stabilen DNA-RNA Komplex. Ein Selektionsreagenz baut den
Chemilumineszenzmarker der ungebundenen Sonde ab, während der Marker der gebundenen
Sonde intakt bleibt. Das GEN-PROBE LEADER luminometer mißt das von den DNA-RNA-Hybriden
abgegebene Lichtsignal. Das Testergebnis wird aus der Differenz zwischen dem Meßsignal der
Probe und dem Mittelwert der Meßsignale der negativen Referenz berechnet.
REAGENZIEN
GEN-PROBE PACE
GONORRHOEAE
2C
System
für
CHLAMYDIA TRACHOMATIS
und
NEISSERIA
PACE 2 Hybridisierungspuffer (Pufferlösung mit) (HB) < 20% Detergenz.
PACE 2C Sondenreagenz für Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (P)
Lyophilisierte, markierte, nicht infektiöse DNA-Sonde (< 500 ng/Fläschchen).
PACE 2 Selektionsreagenz (Pufferlösung mit) (S) < 8% Detergenz.
PACE 2 STD Trennreagenz (SR) Festphase (1,25 mg/ml) in einer Lösung mit 0,02%
Natriumazid als Konservierungsmittel.
PACE 2 STD Negative Referenz (NR) Nicht infektiöse Nukleinsäure in einer Pufferlösung mit
< 5% Detergenz.
PACE 2 Chlamydia trachomatis positive Kontrolle (PCT) Nicht infektiöse C. trachomatis
Nukleinsäure in einer Pufferlösung mit < 5% Detergenz.
PACE 2 Neisseria gonorrhoeae positive Kontrolle (PGC) Nicht infektiöse N. gonorrhoeae
Nukleinsäure in einer Pufferlösung mit < 5% Detergenz.
PACE 2 STD Waschlösung (Pufferlösung mit) (W) < 2% Detergenz.
18
Abdeckfolien (Selbstklebefolien). 1 Packung.
GEN-PROBE DETEKTIONSREAGENZIEN-KIT (separat geliefert)
Detektionsreagenz I (RI) 0,1% Wasserstoffperoxid in 0,001N Salpetersäure.
Detektionsreagenz II (RII) 1N Natriumhydroxyd.
VORSICHTSMASSNAHMEN
A.
Nur für die in vitro Diagnostik verwenden.
Dieser Test wurde nur für endozervikale Abstriche und urethrale Proben von Männern
validiert. Die Performance wurde nicht für andere Probentypen evaluiert.
C.
Das Trennreagenz DARF NICHT eingefroren werden. Die Testperformance wird durch eine
unsachgemäße Aufbewahrung dieses Reagenzes beeinträchtigt. Beim Einfrieren dieses
Reagenzes können Bestandteile der Suspension ausflocken. Diese Artefakte lösen sich auch
durch kräftiges Schütteln nicht auf, und es kann somit zu einer sichtbaren Adhäsion
granulöser Partikel an der Behälterwand des Trennreagenzes kommen. Bitte wenden Sie sich
in diesem Fall an unseren Kundendienst.
D.
Verwenden Sie für die Vorbereitung der Reagenzien sauberes Labormaterial. Wir empfehlen
besonders die Verwendung von Einweg-Polystyrenbehältern.
E.
Beachten Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen. Nicht mit dem Mund pipettieren. In
gekennzeichneten Arbeitsbereichen sollte nicht gegessen, getrunken oder geraucht werden.
Verwenden Sie während der Handhabung der Proben und Reagenzien des Kits
Einweghandschuhe und Laborkittel. Waschen Sie nach dem Arbeiten mit den Proben und den
Reagenzien des Kits sorgfältig die Hände.
F.
Proben sind als potentiell infektiös anzusehen. Beachten Sie die üblichen
Vorsichtsmaßnahmen (3). Vom Laborleiter sind genaue Vorschriften für die Handhabung und
die Entsorgung zu erstellen. Die Durchführung dieser Art von Diagnostik sollte Laborpersonal
vorbehalten sein, das im Hinblick auf den Umgang mit infektiösen Materialien geschult ist.
1.
2.
Alle Arbeitsflächen sorgfältig reinigen und desinfizieren.
Alle kontaminierten Materialien, die in Kontakt mit den Proben gekommen sind, müssen
vor der Entsorgung autoklaviert werden.
G.
Das Trennreagenz enthält Natriumazid, das mit Blei- oder Kupferrohren zu explosiven
Metallaziden reagieren kann. Beim Ableiten in die Kanalisation sollten die Reagenzien mit
reichlich Wasser verdünnt werden.
H.
Vermeiden Sie jeden Kontakt der Detektionsreagenzien I und II mit der Haut, den Augen oder
den Schleimhäuten. ACHTUNG: ÄTZENDE REAGENZIEN. Bei eventuellem Kontakt sofort
mit Wasser spülen. Beim Verschütten eines dieser Reagenzien, die Flüssigkeit vor dem
Aufwischen mit Wasser verdünnen.
I.
Bis auf die STD Waschlösung sollten die Reagenzien aus Kits unterschiedlicher Chargen
NICHT ausgetauscht oder gemischt werden.
LAGERUNG
Das PACE 2C Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Sondenreagenz und PACE 2
Trennreagenz müssen bei 2° bis 8°C gelagert werden.
Das PACE 2C Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Sondenreagenz ist nach der
Auflösung bei 2° bis 8°C 3 Wochen haltbar.
Die vorbereitete Trennlösung ist 6 Stunden bei Raumtemperatur (20° bis 25°C) stabil.
Die übrigen Reagenzien des GEN-PROBE PACE 2C Systems für CHLAMYDIA TRACHOMATIS
und NEISSERIA GONORRHOEAE müssen bei 2° bis 25°C gelagert werden und sind bis zu dem
auf der Packung angegebenen Verfallsdatum haltbar.
19
Deutsch
B.
DIE REAGENZIEN DIESES KITS DÜRFEN NICHT EINGEFROREN WERDEN.
PROBENGEWINNUNG UND -VORBEREITUNG
GONORRHOEAE dient zum Screening auf Chlamydia trachomatis und/oder Neisseria
gonorrhoeae in endozervikalen Proben und urethralen Abstrichen vom Mann, die mit dem GENPROBE PACE PROBENENTNAHMEKIT abgenommen wurden.
Für die Probenentnahme dürfen nur die im PACE PROBENENTNAHME-KIT enthaltenen
Abstrichtupfer verwendet werden. Die Proben MÜSSEN im GEN-PROBE Transportmedium ins
Labor gebracht werden.
A.
Nehmen Sie die Proben folgendermaßen ab:
1.
Endozervikale Abstriche
a.
b.
c.
d.
e.
f.
2.
Überschüssigen Schleim vom Gebärmuttermund und der umgebenen Mucosa mit
einem der Abstrichtupfer des Probenentnahmekits für Zervixabstriche entfernen.
Tupfer verwerfen.
Den zweiten Tupfer des Probenentnahmekits in den Zervixkanal einführen.
Den Tupfer 10 bis 30 sec im Zervixkanal drehen, um eine angemessene
Probenmenge zu erhalten.
Den Tupfer vorsichtig herausziehen, dabei jeden Kontakt mit der Vaginalmucosa
vermeiden.
Den Tupfer ganz in das GEN-PROBE Transportröhrchen einführen.
Den überstehenden Teil des Schaftes an der Markierung abbrechen; arbeiten Sie
vorsichtig, um Spritzer zu vermeiden. Das Röhrchen anschließend dicht
verschließen.
Urethrale Abstriche
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Die Patienten dürfen mindestens 1 Stunde vor der Probenabnahme keinen Harn
lassen.
Den Abstrichtupfer (des GEN-PROBE Probenentnahmekits für Harnröhre / Auge)
2 bis 4 cm in die Harnröhre einführen; den Tupfer dabei vorsichtig drehen, um das
Einführen zu erleichtern.
Den eingeführten Tupfer vorsichtig und mit ausreichendem Druck 2 bis 3 sec
drehen, um Kontakt mit der ganzen urethralen Oberfläche zu ermöglichen.
Den Abstrichtupfer entfernen.
Den Tupfer ganz in das GEN-PROBE Transportröhrchen einführen.
Den überstehenden Teil des Schaftes an der Markierung abbrechen; arbeiten Sie
vorsichtig, um Spritzer zu vermeiden. Das Röhrchen anschließend dicht
verschließen.
B.
Transportieren Sie die Röhrchen bei 2° - 25°C ins Labor und lagern Sie sie bis zur Testung
bei 2° - 25°C. Die Proben sollten innerhalb von 7 Tagen nach der Probenentnahme mit dem
GEN-PROBE PACE 2C System getestet werden. Zur längeren Aufbewahrung behandeln Sie
die Proben wie im Abschnitt TESTDURCHFÜHRUNG beschrieben und frieren Sie sie für
max. 90 Tage nach der Probensammlung bei -20° bis -70°C ein.
C.
Bei Routineuntersuchungen haben blutige Abstriche die Testperformance nicht beeinflußt.
Stark bluthaltige Proben (mehr als 80 µl Gesamtblut in 1 ml Transportmedium) können jedoch
die Testperformance beeinflussen.
D.
Für den Transport der Proben sind die gültigen Bestimmungen zu beachten.
20
PACKUNGSBESTANDTEILE
GEN-PROBE PACE 2C System für CHLAMYDIA TRACHOMATIS
GONORRHOEAE
PACE 2 Hybridisierungspuffer (HB)
PACE 2C Chlamydia trachomatis/
Neisseria gonorrhoeae Sondenreagenz (P)
NEISSERIA
100 Tests
2 x 6 ml
2 x 6 ml
(wenn aufgelöst)
1 x 100 ml
1 x 9 ml
1 x 7 ml
1 x 3 ml
1 x 3 ml
3 x 200 ml
1 Packung
120 Röhrchen pro Packung
ERFORDERLICHES LABORMATERIAL (NICHT IM Kit entHALTEN)
Vortex
Wasserbad mit Abdeckung (60° ± 1°C)
Mikropipetten (100 µl)
Pipetten für 1 bis 25 ml
Saugfähiges Papier
ZUSÄTZLICH LIEFERBARE REAGENZIEN UND MATERIALIEN
GEN-PROBE PACE Probenentnahmekit
Abstrichbestecke für Harnröhre / Auge:
(50 Bestecke)
Zervixabstriche:
(50 Bestecke)
(bioMérieux Best.Nr. 39301 /Gen-Probe Kat. Nr. 3300)
GEN-PROBE Detektionsreagenzien-Kit
(1200 Tests)
GEN-PROBE luminometer LEADER 50i
(bioMérieux Best.Nr. 39400 / Gen-Probe Kat. Nr. 3100i)
GEN-PROBE Magnettrenneinheit
GEN-PROBE FAST EXPRESS Reagenz
TESTDURCHFÜHRUNG
A.
PROBENVORBEREITUNG
1.
2.
3.
4.
Die Proben vor der Testung auf Raumtemperatur temperieren.
Jedes GEN-PROBE Transportröhrchen mindestens 5 sec vortexen.
Drücken Sie den Tupfer fest an der Röhrchenwand aus, und verwerfen Sie danach den
Tupfer.
Vortexen Sie das Transportröhrchen vor Testbeginn erneut mindestens 5 sec, um die
21
Deutsch
PACE 2 Selektionsreagenz (S)
PACE 2 STD Trennreagenz (SR)
PACE 2 STD Negative Referenz (N)
Positive Kontrolle (PCT)
Positive Kontrolle (PGC)
PACE 2 STD Waschlösung (W)
Abdeckfolien
GEN-PROBE Polystyren-Einwegröhrchen (12 x 75 mm)
und
Homogenität der Probe zu gewährleisten.
B.
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
1.
Alle Reagenzien MIT AUSNAHME des Sondenreagenzes und Trennreagenzes vor
Gebrauch auf Raumtemperatur temperieren. Das Sondenreagenz und die Trennlösung
müssen bis zum Gebrauch bei 2° bis 8°C gelagert werden.
2.
Sondenreagenz
Nehmen Sie den PACE 2 Hybridisierungspuffer aus der Packung und vortexen Sie
diesen 10 sec. Erwärmen Sie den Puffer anschließend für 3 bis 4 min unter vorsichtigem
Schwenken im Wasserbad bei 60° ± 1°C. Vortexen Sie erneut 10 sec, um eine
homogene Lösung zu erhalten. Pipettieren Sie 6 ml des PACE 2 Hybridisierungspuffers
in das lyophilisierte PACE 2C Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae
Sondenreagenz (PACE 2C Sondenreagenz). Das Reagenz 2 min bei Raumtemperatur
stehen lassen und vor Gebrauch 10 sec vortexen. Überprüfen Sie visuell, daß das
PACE 2C Sondenreagenz vollständig gelöst und homogen ist. Notieren Sie auf dem
Etikett das Datum der Auflösung. Das aufgelöste PACE 2C Sondenreagenz ist innerhalb
des angegebenen Verfallsdatums 3 Wochen bei 2° - 8°C haltbar.
Wenn das aufgelöste PACE 2C Sondenreagenz gekühlt wurde, vortexen Sie es 10 sec.
Das Fläschchen anschließend zum Erwärmen für 2 min unter vorsichtigem Schwenken
in ein Wasserbad bei 60° ± 1°C halten. Vor Gebrauch erneut 10 sec vortexen, um die
Homogenität des Reagenzes zu gewährleisten. Wiederholen Sie diesen Vorgang
gegebenenfalls, wenn das PACE 2C Sondenreagenz nicht vollständig homogen ist.
3.
Trennlösung
Bestimmen Sie die Anzahl der durchzuführenden Tests. Berechnen Sie das Volumen
der Selektions- und Trennreagenzien folgendermaßen:
Volumen des
Selektionsreagenzes (ml). = Anzahl der Tests + 2 zusätzliche Tests
(mit der Eppendorf-Multipette)
= Anzahl der Tests + 10 zusätzliche Tests
(mit einem Flaschendispenser)
Volumen des
Trennreagenzes (ml)
= Volumen des Selektionsreagenzes (ml)
20
Gießen Sie das erforderliche Volumen an Selektionsreagenz in ein sauberes, trockenes
Gefäß. Mischen Sie das Trennreagenz und geben Sie das erforderliche Volumen zum
Selektionsreagenz. Gut mischen. Die vorbereitete Trennlösung wird bei
Raumtemperatur gelagert und ist 6 Stunden stabil.
Vorbereitung der Trennlösung
(Beispiel)
8 Tests + 2 = 10 Tests
Anzahl
Tests
8+2
18 + 2
48 + 2
98 + 2
Selektionsreagenz
10 ml
20 ml
50 ml
100 ml
22
Trennreagenz
0,5 ml
1,0 ml
2,5 ml
5,0 ml
C.
HYBRIDISIERUNG
1.
2.
3.
4.
6.
7.
8.
D.
VORBEREITUNG DES LABORMATERIALS
1.
E.
TRENNUNG
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
F.
Bereiten Sie das GEN-PROBE LEADER luminometer vor. Vergewissern Sie sich, daß
für die Durchführung des Tests ausreichend Detektionsreagenz I und II vorhanden ist.
Nehmen Sie den Ständer aus dem Wasserbad und entfernen die Selbstklebefolien.
1 ml der vorbereiteten, gut homogenisierten Trennlösung in jedes Röhrchen pipettieren.
Die Röhrchen mit Selbstklebefolie abdecken und den Ständer zum Mischen 3 bis 5 Mal
kräftig schütteln. Dabei sollte es in jedem Röhrchen zu einer Schaumbildung kommen.
Die Röhrchen sofort ins Wasserbad bei 60° ± 1°C stellen und 10 min inkubieren.
Nehmen Sie den Ständer aus dem Wasserbad und entfernen Sie die Selbstklebefolien.
Stellen Sie den Röhrchenständer für 5 min bei Raumtemperatur auf das Unterteil der
Magnettrenneinheit.
Oberteil und Unterteil der Magnettrenneinheit zusammenhalten und die Überstände
dekantieren. Die Röhrchen kopfüber halten, 2 bis 3 Mal abschütteln und die restlichen
Tropfen 3 Mal 5 sec auf saugfähigem Papier abtropfen lassen.
DEN RÖHRCHENSTÄNDER AUF DEM UNTERTEIL DER MAGNETTRENNEINHEIT
STEHEN LASSEN. Füllen Sie jedes Röhrchen bis zum Rand mit Waschlösung (siehe
Abschnitt ANMERKUNGEN bzgl. Waschlösung).
Die Röhrchen 20 min bei Raumtemperatur auf der Magnettrenneinheit stehen lassen.
Oberteil und Unterteil der Magnettrenneinheit zusammenhalten und die Überstände
dekantieren. Die Röhrchen kopfüber halten und 2 bis 3 Mal abschütteln. DIE
RÖHRCHEN NICHT AUF PAPIER ABTROPFEN LASSEN. Es sollten ca. 50 bis 100 µl
Waschlösung in jedem Röhrchen verbleiben.
Nehmen Sie den Röhrchenständer von der Magnettrenneinheit und schütteln Sie den
Röhrchenständer, um die Sedimente zu resuspendieren.
DETEKTION
1.
Wählen Sie auf dem luminometer LEADER das geeignete Protokoll.
23
Deutsch
5.
Beschriften Sie die Röhrchen mit der Probennummer. Bereiten Sie außerdem 3
Röhrchen für die negative Referenz, 1 Röhrchen für die C. trachomatis positive
Kontrolle und eines für die N. gonorrhoeae positive Kontrolle vor. Die Röhrchen sollten
nur oben beschriftet werden. Die negative Referenz und die Kontrollen müssen in jeder
Testserie mitgeführt werden.
Stellen Sie die Röhrchen in den Ständer der GEN-PROBE Magnettrenneinheit. Den
Magnetständer für einen späteren Gebrauch zur Seite stellen.
Vortexen Sie jede Probe 5 sec.
Pipettieren Sie 100 µl von jeder Kontrolle bzw. Probe auf den Boden des jeweiligen
Röhrchens.
100 µl des PACE 2C Sondenreagenzes auf den BODEN jedes Röhrchens pipettieren.
Bitte achten Sie darauf, daß der obere Rand und die Wände der Röhrchen nicht berührt
werden.
Die Röhrchen mit Selbstklebefolie abdecken. Vergewissern Sie sich, daß jedes
Röhrchen gut abgedeckt ist.
Den Ständer zum Mischen 3 bis 5 Mal schütteln.
Inkubieren Sie die Röhrchen für 1 Stunde im Wasserbad bei 60° ± 1°C. Stellen Sie das
Unterteil der Magnettrenneinheit NICHT in das Wasserbad.
2.
Um statische Aufladung zu vermeiden, sollte jedes Röhrchen vor der Messung mit
einem feuchten Tuch bzw. Papier abgewischt werden. Vergewissern Sie sich, daß die
Sedimente gut suspendiert sind und stellen Sie die Röhrchen gemäß der Anleitung in
das LEADER luminometer.
Messen Sie die Röhrchen in folgender Reihenfolge:
negative Referenz, 3 Röhrchen
C. trachomatis positive Kontrolle, 1 Röhrchen
N. gonorrhoeae positive Kontrolle, 1 Röhrchen
Probenröhrchen
3.
Nehmen Sie die Röhrchen nach abgeschlossener Messung aus dem LEADER
luminometer.
ANMERKUNGEN
A.
PACE 2 HYBRIDISIERUNGSPUFFER: Der PACE 2 Hybridisierungspuffer und das aufgelöste
PACE 2C Sondenreagenz müssen unbedingt unter vorsichtigem Schwenken auf 60° ± 1°C
erhitzt werden, um die Bildung eines Präzipitats zu vermeiden und die Homogenität der
Lösung zu gewährleisten.
B.
PROBEN: Manche Proben sind für die Entnahme mit der Pipette zu viskos. Achten Sie darauf,
daß die Proben auf Raumtemperatur temperiert sind und vortexen Sie sie zur Verflüssigung.
Um die Probenvorbereitung zu erleichtern, kann das GEN-PROBE FAST EXPRESS Reagenz
verwendet werden. Weitere Informationen erhalten Sie von unserem Kundendienst.
C.
PIPETTIEREN: Für die Zugabe des PACE 2C Sondenreagenzes, der Trennlösung und der
Waschlösung können der Einfachheit halber Multipetten oder Dispenser verwendet werden.
Für die Proben, Referenzen und Kontrollen empfiehlt sich die Verwendung von Pipetten mit
Einwegspitzen, um Verschleppungen der Proben und Kreuzkontaminationen auszuschließen.
Achten Sie darauf, daß das PACE 2C Sondenreagenz auf den BODEN der Röhrchen
pipettiert wird, ohne die Pipettenspitze in die Röhrchen einzuführen und ohne die Ränder zu
berühren. Halten Sie die Pipette bei der Zugabe der Reagenzien angewinkelt gegen die
vordere Röhrchenwand und nicht auf den Boden, um Spritzer zu vermeiden.
D.
ABTROPFEN DER RÖHRCHEN: Verwerfen Sie den Zellstoff nach jedem Abtropfvorgang, um
Kontaminationen zu vermeiden. DIE RÖHRCHEN NACH DEM WASCHSCHRITT NICHT
ABTROPFEN LASSEN.
E.
TEMPERATUR: Die Hybridisierung und die Trennung sind temperaturabhängige Reaktionen.
Achten Sie deshalb unbedingt darauf, daß das Wasserbad und die Reaktionsröhrchen
während dieser Schritte eine konstante Temperatur aufweisen. Arbeiten Sie mit einem
abgedeckten Wasserbad, bei dem eine Temperatur von 60° ± 1°C aufrecht erhalten werden
kann.
F.
WASCHEN: Die Waschlösung sollte sehr kräftig in jedes Röhrchen pipettiert werden.
Halten Sie die Pipette angewinkelt gegen die vordere Röhrchenwand und nicht auf den
Boden, um Spritzer zu vermeiden. Wenn die Waschlösung kräftig genug pipettiert wurde,
kommt es zu einer 1 cm hohen Schaumbildung. Füllen Sie anschließend nochmals jedes
Röhrchen vorsichtig bis zum Überlaufen mit der Waschlösung, so daß kein Schaum im
Röhrchen bleibt. Wenn dieser Waschschritt nicht korrekt ausgeführt wird, kann es zu falschen
Ergebnissen kommen.
G.
AUTOMATISCHES WASCHEN: Alternativ kann mit Waschflaschen gearbeitet werden. Die
Performance dieses Waschverfahrens muß durch das Labor im Vergleich zur konventionellen
Methode validiert werden. Geben Sie Waschlösung in die Flasche bevor Sie mit einer neuen
24
Waschflasche arbeiten. Verschließen Sie die Flasche. Die ersten 5 ml durch den Verschluß
spritzen und verwerfen.
H.
Wie bei jeder Testmethode kann es durch gepuderte Handschuhe zu einer Kontamination
offener Reagenzien oder Reaktionsröhrchen kommen. Gen-Probe empfiehlt deshalb den
Gebrauch von ungepuderten Handschuhen.
I.
DETEKTION: Die Röhrchen müssen innerhalb einer Stunde nach dem Dekantieren der
Waschlösung im LEADER luminometer abgelesen werden. Die Röhrchen sollten bis zur
Messung bei 20° - 25°C gelagert werden.
Die Ergebnisse des GEN-PROBE PACE 2C Systems für CHLAMYDIA TRACHOMATIS und
NEISSERIA GONORRHOEAE berechnen sich aus der Differenz zwischen den Meßsignalen der
Probe (RLU = Relative Light Units) und dem Mittelwert der negativen Referenz.
Mittelwert der negativen Referenz = Summe der drei negativen Referenzen dividiert durch 3.
Beispiel:
Mittelwert der negativen Referenz =
(65 RLU + 71 RLU + 80 RLU) = 72 RLU
3
festgelegter cut-off = 300 RLU
berechneter cut-off = 300 RLU + 72 RLU = 372 RLU
Meßwert der Probe = 900 RLU
positiv
Das LEADER luminometer druckt den Meßwert der Probe aus und vergleicht diesen mit dem
berechneten cut-off des Tests. Die Interpretation (positiv oder negativ) erfolgt im Vergleich zu
diesem cut-off und wird durch das LEADER luminometer ausgedruckt. Weitere Informationen
bezüglich des Meßverfahrens finden Sie im Handbuch des luminometers LEADER.
B.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
NEISSERIA GONORRHOEAE sollten in Zusammenhang mit anderen Testergebnissen und
klinischen Daten interpretiert werden.
POSITIV - Die Differenz ist gleich oder größer als 300 RLU plus Mittelwert der negativen Referenz.
NEGATIV - Die Differenz ist kleiner als 300 RLU plus Mittelwert der negativen Referenz.
Ein positives Ergebnis zeigt das Vorhandensein von Chlamydia trachomatis rRNA und/oder
Neisseria gonorrhoeae rRNA in der getesteten Probe an. Zur Identifizierung der jeweiligen
Organismen sind zusätzliche Einzeltests für C. trachomatis und N. gonorrhoeae erforderlich. Wenn
diese Einzeltests negativ ausfallen, handelt es sich um ein zweifelhaftes Ergebnis. Fordern Sie in
diesem Fall eine weitere Probe an.
Ein negatives Ergebnis zeigt die Abwesenheit von Chlamydia trachomatis rRNA und Neisseria
gonorrhoeae rRNA in der getesteten Probe an.
C.
QUALITÄTSKONTROLLE UND VALIDIERUNG DER ERGEBNISSE
HINWEIS: Die in der Packung enthaltene negative Referenz und die positive Kontrolle sind nur für
die Kontrolle des PACE 2C Tests bestimmt. Sie ermöglichen keine Kontrolle der Lyse der
Zielorganismen im Probentransportmedium.
25
Deutsch
ERGEBNISSE
A.
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Negative Referenz:
Die negative Referenz dient zur Hintergrundmessung des Tests und zur Berechnung des cut-offs
der Testserie. Die Sollwerte der negativen Referenz wurden in 69 Testserien (3-fach
Bestimmungen/Testserie) in 5 Laboratorien in den Vereinigten Staaten ermittelt.
Die Ergebnisse aller negativen Referenz-Bestimmungen müssen unter 200 RLU liegen. Alle
negativen Referenzwerte sollten sich in einem Bereich von 30% um den Mittelwert der negativen
Referenzen bewegen (Variationskoeffizient < 30%).
Liegt ein Wert nicht in diesem Bereich, kann der entsprechende Wert aus der Berechnung
genommen werden. Folgen Sie in diesem Fall den Anweisungen im Handbuch des luminometers
LEADER.
Wenn zwei Werte nicht in diesem Bereich liegen, muß der Test wiederholt werden. Ist dies öfters
der Fall, überprüfen Sie die angewandte Technik und wenden Sie sich an unseren Kundendienst.
Positive Kontrolle:
Die Sollwerte jeder positiven Kontrolle wurden in 69 verschiedenen Testserien in 5 Laboratorien in
den Vereinigten Staaten ermittelt.
Die Differenz zwischen dem Meßwert jeder positiven Kontrolle und dem Mittelwert der negativen
Referenz muß > als 600 RLU und < 3.200 RLU sein. Andernfalls ist der Test ungültig. Liegt der Wert
der positiven Kontrolle wiederholt außerhalb des Sollbereichs, wenden Sie sich an unseren
Kundendienst. Die Ergebnisse des GEN-PROBE PACE 2C Systems für CHLAMYDIA
TRACHOMATIS und NEISSERIA GONORRHOEAE sollten in Zusammenhang mit anderen
Testergebnissen und klinischen Daten interpretiert werden.
Wenn die Werte der positiven Kontrollen oder der negativen Referenz nicht im angegebenen
Sollbereich liegen, ist der Test ungültig und die Ergebnisse können nicht protokolliert werden.
Jedes Labor sollte unter normalen Arbeitsbedingungen seine eigenen Mittelwerte und Bereiche für
die negative Referenz und die positiven Kontrollen festlegen und diese im Rahmen der
Standardvorschriften für die Laborqualitätskontrolle aufbewahren (2, 20).
Zellkontrolle der Probenvorbereitung:
Um die Effizienz der Probenvorbereitung zu testen, können positive und negative Zellkontrollen
parallel zu den Proben getestet werden. Als positive Zellkontrolle können C. trachomatis ATCC
VR878 und N. gonorrhoeae ATCC 19424 verwendet werden, während der Stamm N. mucosa ATCC
19696 als negative Kontrolle dienen kann. Für die Neisseria Stämme verwenden Sie aktiv
wachsende Kulturen und bereiten Sie Suspensionen mit ca. 3 x 108 KBE/ml in steriler
physiologischer Kochsalzlösung vor. Überimpfen Sie 10 µl jeder Zellsuspension in ein
Transportröhrchen des GEN-PROBE PACE Probenentnahmekits (für endozervikale Abstriche oder
Abstriche für Harnröhre / Auge) und vortexen Sie dieses. Für die Chlamydia-Stämme verwenden
Sie die aus den Zellkulturen gewonnenen Elementarkörperchen und bereiten Sie eine titrierte
Lösung mit ca. 3 x 108 EK/ml vor. Transferieren Sie 10 µl jeder Suspension in ein Transportröhrchen
des GEN-PROBE PACE Probenentnahmekits (für endozervikale Abstriche oder Abstriche für
Harnröhre / Auge) und vortexen Sie dieses. Behandeln Sie die Kontrollen wie die Proben, und
beginnen Sie mit Punkt C1 der Testdurchführung. Die positiven Zellkontrollen sollten positive
Testergebnisse und die negativen Zellkontrollen negative Testergebnisse liefern.
LIMITIERUNGEN
Dieses Verfahren wurde nur für endozervikale Abstriche und urethrale Proben von Männern
getestet. Die Performance wurde nicht für andere Proben validiert.
26
Bei Routineuntersuchungen haben blutige Abstriche die Testperformance nicht beeinflußt. Stark
bluthaltige Proben (mehr als 80 µ Gesamtblut in 1 ml Transportmedium) können jedoch zu
Interferenzen führen.
Bei normalem Gebrauch wurden beim PACE 2C Test keine Interferenzen durch gynäkologische
Gleitmittel und Spermizide festgestellt. Für weitere Informationen bezüglich anderer Produkte
wenden Sie sich bitte an unseren Kundendienst.
Andere, eventuell in den Patientenproben vorhandene, endogene Substanzen können mit dem Test
interferieren.
Wie bei jeder Erkrankung nimmt der positive Vorhersagewert dieses Tests ab, wenn die Prävalenz
in der Bevölkerung sinkt. Die Zuverlässigkeit des Testergebnisses hängt von einer sachgemäßen
Probengewinnung ab. Da das für diesen Test eingesetzte Transportsystem keine mikroskopische
Beurteilung einer korrekten Probengewinnung erlaubt, sollte die Probengewinnung von
entsprechend geschultem Personal vorgenommen werden, siehe Empfehlungen in den Abschnitten
PROBENGEWINNUNG und LAGERUNG dieser Arbeitsanleitung.
Das Ergebnis dieses Tests gibt keine Hinweise auf eventuelle Therapieerfolge bzw. -mißerfolge, da
Nukleinsäuren auch nach einer geeigneten Antibiotikatherapie persistieren können.
NEISSERIA GONORRHOEAE sollten in Zusammenhang mit anderen Testergebnissen und
klinischen Daten interpretiert werden
Ein negatives Testergebnis schließt nicht aus, daß die Probe C. trachomatis und/oder N.
gonorrhoeae Organismen unterhalb der Nachweisgrenze dieses Tests enthält. In diesem Fall kann
zur Bestätigung des Testergebnisses ein zweiter Abstrich abgenommen und kultiviert werden.
Desweiteren können die Testergebnisse durch unsaubere Probenentnahme, technische Fehler,
Verwechslungen bei den Proben oder durch eine bereits begonnene Antibiotikatherapie beeinflußt
werden. Für den Fall, daß ein positives PACE 2C Testergebnis den klinischen Daten oder anderen
Informationen durch den Patienten widerspricht, oder der Patient zu einer der Kategorien gehört,
die in den Richtlinien des CDC für C. trachomatis von 1993 aufgeführt sind (CDC, MMWR, Vol. 42,
No. RR-12, 1993), kann eine Überprüfung des Testergebnisses gerechtfertigt sein.
Da das GEN-PROBE PACE 2C System für
GONORRHOEAE ein Screening Test für C.
Doppelinfektionen vorliegen können, müssen
angeschlossen werden, in denen C. trachomatis
CHLAMYDIA TRACHOMATIS und NEISSERIA
trachomatis und/oder N. gonorrhoeae ist und
bei PACE 2C-positiven Proben weitere Tests
und N. gonorrhoeae einzeln identifiziert werden.
27
Deutsch
Jede Nachweismethode für Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae kann falsch positive
Resultate ergeben. Für den Fall, daß das Testergebnis negative psychosoziale Auswirkungen hat,
empfiehlt es sich, das Ergebnis durch zusätzliche Verfahren zu bestätigen. In
gerichtsmedizinischen Fällen ist die Kultur die einzig empfohlene Methode für die Diagnostik von
Chlamydien und Gonorrhoeae-Infektionen.
NORMALWERTE
VERTEILUNG DER KLINISCHEN ERGEBNISSE
Anhand der Ergebnisse, die bei der klinischen Erprobung des PACE 2C Tests ermittelt wurden,
wurde eine Verteilung der RLU-Probenmeßwerte ober- und unterhalb des cut-off des Tests erstellt.
Die Daten nach Auflösung der diskrepanten Ergebnisse sind in folgender Abbildung dargestellt. Die
Anzahl der falsch positiven (FP) und falsch negativen (FN) Ergebnisse für jede RLU Kategorie sind
unter der Abbildung angegeben.
FP
FN
13
10
10
2
14
11
8
7
11
PERFORMANCE
A.
INTRA-ASSAY PRÄZISION
Zur Berechnung der Intra-Assay Präzision des GEN-PROBE PACE 2C Systems für CHLAMYDIA
TRACHOMATIS und NEISSERIA GONORRHOEAE wurden 4 Konzentrationen von C. trachomatis
Einschlußkörperchen (EK) und N. gonorrhoeae Zellen 5-fach in einer Testserie getestet. Außerdem
wurde eine negative Probe getestet.
Probe
A
B
C
D
E
Anzahl Tests
5
Mittelwert (RLU)
9.530
Standardabweichung (RLU) 210
Variationskoeffizient
2,2%
5
2.075
143
6,9%
5
1.041
42
4,0%
5
767
52
6,8%
5
49
2
n/a
B.
INTER-ASSAY PRÄZISION
Die Inter-Assay Präzision wurde mit den gleichen 4 Konzentrationen von C.trachomatis EK und N.
gonorrhoeae Zellen sowie einer negativen Probe berechnet und zwar anhand des Mittelwertes der
5-fach Bestimmungen, die in drei aufeinanderfolgenden Serien durchgeführt wurden.
Probe
A
B
C
D
E
Anzahl Tests
3
Mittelwert (RLU)
10.147
Standardabweichung (RLU) 917
9,0%
3
2.259
240
10,6%
3
968
66
6,8%
3
690
74
10,7%
3
51
4
n/a
28
C.
PRÄZISION DER POSITIVEN KONTROLLE
Die Präzision der C. trachomatis und N. gonorrhoeae positiven Kontrolle wurde mit PACE 2C Tests,
die in fünf verschiedenen Orten in den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden, ermittelt. Jede
positive Kontrolle wurde einfach in jeder PACE 2C Testserie getestet.
Probe
C. trachomatis
positive Kontrolle
D.
69
1.837
329
5,6%
69
2.165
425
5,1%
ANALYTISCHE SENSITIVITÄT
Für die Berechnung der analytischen Sensitivität (Nachweisgrenze) des GEN-PROBE PACE 2C
Systems für CHLAMYDIA TRACHOMATIS und NEISSERIA GONORRHOEAE wurden
Verdünnungen frisch gewachsener C. trachomatis und N. gonorrhoeae vergleichend in der
Zellkultur und im PACE 2C Test bestimmt. Bei einem cut-off von 300 RLU + dem Mittelwert der
negativen Referenz betrug die Sensitivität der 15 C. trachomatis Serotypen 24 - 2.232
Einschlußkörperchen (EK) / Test (0,1 ml beimpftes Transportmedium); der Durchschnittswert betrug
966 EK/Test. Die Sensitivität für N. gonorrhoeae betrug ca. 650 Kolonie-bildende Einheiten
(KBE)/Tests (0,1 ml beimpftes Transportmedium).
E.
ANALYTISCHE SPEZIFITÄT
Insgesamt wurden 80 Kulturisolate mit dem PACE 2C Test getestet. Diese Stämme umfaßten 20 im
Urogenitaltrakt vorkommende Organismen und 30 weitere Stämme, die einen phylogenetischen
Querschnitt der Bakterien bildeten. Kulturisolate von C. trachomatis (15 Serotypen), N.
gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae und 12 Neisseriaceae Spezies wurden
ebenfalls getestet. Nur C. trachomatis- und N. gonorrhoeae-Proben reagierten mit dem GENPROBE PACE 2C System für CHLAMYDIA TRACHOMATIS und NEISSERIA GONORRHOEAE
positiv.
F.
WIEDERFINDUNG
Von C. psittaci, Ureaplasma urealyticum und Neisseria meningitidis isolierte, ribosomale RNA
wurde in einer Konzentration von 0,1 µg/Test Proben zugesetzt, die verschiedene Konzentrationen
von C. trachomatis und/oder N. gonorrhoeae rRNA enthielten. Diese Zugaben zeigten bei der
Wiederfindung von C. trachomatis oder N. gonorrhoeae rRNA mit dem PACE 2C Test keine
Interferenzen.
29
Deutsch
Anzahl Tests
Mittelwert (RLU)
Standardabweichung (RLU)
N. gonorrhoeae
positive Kontrolle
G.
ERGEBNISSE KLINISCHER TESTREIHEN
GONORRHOEAE wurde mit Standard-Kulturverfahren für C. trachomatis und N. gonorrhoeae
verglichen. Hierfür wurden 1.266 endozervikale Abstriche und 849 urethrale Proben von Männern
getestet. Die Proben wurden in 5 verschiedenen Laboratorien bei einem cut-off von 300 RLU
getestet. Die klinischen Daten vor und nach Auflösung diskrepanter Proben sind in folgender
Tabelle angegeben.
1.
PERFORMANCE ZUSAMMENFASSUNG: VOR DER AUFLÖSUNG DISKREPANTER
ERGEBNISSE
PACE 2C
Kultur
Pos
Pos
Pos
Neg
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensitivität /
Spezifität (%)
Population
(%CT/%NG Prävalenz; Anzahl Labors)
weiblich
symptomatisch
hohe Prävalenz
(13,6% / 16,2%;
2 Labors)
74
9
6
219
92,5/96,1
48
8
3
313
94,1/97,5
71
6
8
221
89,9/97,4
12
4
1
263
92,3/98,5
371
17
11
208
97,1/92,4
asymptomatisch
(6,6% / 5,4%;
4 Labors)
26
11
2
203
92,9/94,9
zusammengefaßt
(10,1% / 41,3%;
4 Labors)
397
28
13
411
96,8/93,6
Niedrige
Prävalenz
(8,9% / 7,0%;
2 Labors)
weiblich
asymptomatisch
Hohe Prävalenz
(12,1% / 17,0%;
2 Labors)
Niedrige Prävalenz
(3,2% / 1,8%;
2 Labors)
männlich
symptomatisch
(11,5% / 55,7%;
4 Labors)
30
2.
PERFORMANCE ZUSAMMENFASSUNG: NACH AUFLÖSUNG DISKREPANTER
ERGEBNISSE
Die diskrepanten Ergebnisse für C. trachomatis wurden durch erneute Kultur und DFA
aufgelöst. Die Zellkulturen wurden für N. gonorrhoeae diskrepante Proben nicht wiederholt.
PACE 2C
Kultur
Pos
Pos
Pos
Neg
niedrige
49
7
Prävalenz
weiblich asymptomatisch
hohe Prävalenz 71
6
niedrige
Prävalenz
männlich
symptomatisch
95%
Vertrauensbereiche
Sensitivität/
Spezifität (%)
86,7-97,9 /
94,7-99,1
86,5-100,0 /
95,6-99,1
Neg
Pos
Neg
Neg
6
219
92,8/97,3
3
313
94,2 / 97,8
8
221
89,9 / 97,4
13
3
1
263
92,9 / 98,9
373
15
11
208
97,1 / 93,3
asymptomatisch 28
9
2
203
93,3 / 95,8
zusammengefaßt
24
13
411
96,9 / 94,5
401
81,0-94,9 /
94,7-99,1
71,4-100,0 /
97,4-100,0
95,3-98,7 /
89,7-96,0
83,3-100,0 /
92,5-98,1
94,9-98,3 /
92,0-96,3
Von den insgesamt 55 PACE 2C-positiven, Kultur-negativen Proben reagierten 15 in den
PACE 2 Einzeltests für C. trachomatis und N. gonorrhoeae negativ. Ein Nachweistest mittels
Amplifikation wurde ebenfalls durchgeführt, um einige anscheinend PACE 2C falsch-positiven
Ergebnisse zu überprüfen, wenngleich dieser Test nicht in oben genanntes Protokoll nach
Auflösung der diskrepanten Ergebnisse aufgenommen werden konnte. Von den 40 PACE 2Cpositiven, Kultur-negativen, durch Amplifikation überprüften Proben, wurde bei 26 C.
trachomatis Nukleinsäure und bei 11 N. gonorrhoeae Nukleinsäure nachgewiesen. Dies zeigt,
daß es sich bei der Mehrzahl der oben aufgeführten PACE 2C falsch-positiven Ergebnisse in
Wirklichkeit um echt positive Proben handelte, die in der Kultur nicht nachgewiesen wurden.
Diese Proben wurden weiterhin als falsch-positiv eingestuft, da es sich bei dem
Amplifikationstest um einen in der Forschung befindlichen Test handelte.
3.
PERFORMANCE ZUSAMMENFASSUNG FÜR EINZEL-ORGANISMEN
Das PACE 2C System wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit C. trachomatis und N. gonorrhoeae
einzeln nachzuweisen getestet. Hierfür wurden, nach Auflösung der Diskrepanzen, die PACE
2C- und Kultur-Ergebnisse positiver Proben separat jeweils für beide Zielorganismen
verglichen. Zur Vereinfachung wurden Proben, die für beide Organismen positiv reagierten,
sowohl in die C. trachomatis und die N. gonorrhoeae Daten aufgenommen. Demzufolge
erhöht sich die Gesamtzahl positiver Proben in der folgenden Tabelle um 59 im Vergleich zu
den Tabellen mit den klinischen Daten.
31
Deutsch
Population
weiblich symptomatisch
hohe Prävalenz 77
6
Sensitivität/
Spezifität (%)
PACE 2C
C. trachomatis Kultur-positiv
weiblich
männlich
N. gonorrhoeae Kultur-positiv
weiblich
männlich
Positiv
Negativ
109
79
12
12
132
350
6
1
32
CHLAMYDIA TRACHOMATIS ET NEISSERIA GONORRHOEAE
Pour la détection de Chlamydia trachomatis et/ou de Neisseria gonorrhoeae dans les échantillons
urétraux chez l’homme et dans les échantillons endocervicaux.
Il faut ensuite pratiquer des tests supplémentaires afin de détecter individuellement C. trachomatis
et N. gonorrhoeae dans les échantillons positifs avec le test PACE 2C.
INTRODUCTION
Les Chlamydiae sont des bactéries intracellulaires immobiles, à Gram négatif, utilisant l’ATP produit
par la cellule hôte pour leur réplication. Les infections à Chlamydiae sont connues depuis
longtemps. Cependant, la pathogénicité de Chlamydia trachomatis a pu être évaluée de façon plus
précise au cours du temps (23, 25). Chlamydia trachomatis est responsable d’environ 50 à 80% des
cas d’urétrites non gonococciques (9, 10).
Chlamydia trachomatis comprend 15 sérovars responsables des maladies suivantes: trachomes,
conjonctivites à inclusions, lymphogranulomes vénériens et autres maladies sexuellement
transmissibles. Les sérovars D à K sont le plus fréquemment à l’origine des infections génitales à
Chlamydiae tant chez l’homme que chez la femme (26). Les urétrites non gonococciques, les
épididymites, les proctites, les cervicites et les salpingites aiguës font partie des manifestations
pathologiques liées à Chlamydia trachomatis (9, 24, 27). Outre la transmission par voie sexuelle,
les nouveau-nés de mères infectées peuvent également développer des infections à Chlamydiae
comme des pneumonies ou des conjonctivites à inclusions (1, 7, 28).
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter la présence de Chlamydia trachomatis dans les
tissus infectés. Elles comprennent l’observation des tissus infectés au microscope optique après
coloration directe de Giemsa, et la culture cellulaire suivie de la visualisation des inclusions
intracellulaires par l’iode, la fluorescéine, ou par des anticorps conjugués à un marqueur (5, 19, 26,
31). Plus récemment, des méthodes rapides utilisant la détection d’antigènes et l’hybridation
d’acides nucléiques ont été développées (13, 14).
La gonococcie est l’infection bactérienne la plus fréquemment rencontrée aux Etats-Unis, avec près
de 392.200 cas rapportés en 1993 (4). Cette maladie sexuellement transmissible (MST) se
manifeste généralement par une urétrite antérieure, accompagnée d’exsudat purulent chez
l’homme. Chez la femme, c’est généralement le col de l’utérus qui est atteint, mais le vagin et
33
Français
UTILISATION
Le test GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS et NEISSERIA
GONORRHOEAE est un test utilisant une sonde ADN et la technique d’hybridation d’acides
nucléiques pour détecter la présence de Chlamydia trachomatis et/ou de Neisseria gonorrhoeae
dans les échantillons urétraux chez l’homme et dans les échantillons endocervicaux. Les
prélèvements doivent être réalisés avec le COFFRET DE PRELEVEMENT PACE GEN-PROBE.
l’utérus peuvent également être infectés. Les infections sont souvent asymptomatiques. Or, si elles
ne sont pas traitées, elles peuvent entraîner des complications graves, voire la stérilité. Les
infections gonococciques peuvent également être diagnostiquées à partir d’autres muqueuses, en
particulier la conjonctive, l’anus et l’oropharynx (17).
Neisseria gonorrhoeae est l’agent responsable des gonococcies; c’est un diplocoque à Gram
négatif, oxydase positif, dont la croissance requiert des conditions strictes (8, 12, 29). Le diagnostic
présomptif est basé sur l’isolement du microorganisme par culture, l’examen microscopique après
coloration de Gram, et la présence de la cytochrome oxydase (8, 12). La révélation par anticorps
fluorescents, l’étude de la dégradation des hydrates de carbone et de la fermentation des sucres,
et les tests d’agglutination permettent de confirmer le diagnostic d’une infection gonococcique (6,
11, 16, 18, 22, 30). Plus récemment, la technique d’hybridation des acides nucléiques a été utilisée
pour le diagnostic des infections gonococciques directement à partir des échantillons cliniques (21).
GONORRHOEAE utilise la technique d’hybridation des acides nucléiques (15) pour identifier
Chlamydia trachomatis et/ou Neisseria gonorrhoeae directement à partir d’un prélèvement urétral
chez l’homme ou d’un prélèvement endocervical. Le test ne permet pas de différencier les deux
microorganismes, mais indique si l’échantillon contient l’un d’entre eux, ou les deux.
PRINCIPE
Les tests par hybridation d’acides nucléiques sont basés sur la capacité de brins complémentaires
d’acides nucléiques à s’apparier de manière spécifique pour former des complexes bicaténaires
stables (15). Le système GEN-PROBE PACE 2C utilise des sondes monocaténaires d’ADN
conjuguées à un marqueur chimiluminescent, complémentaires de l’ARN ribosomal (ARNr) des
organismes cibles. Lorsque l’ARNr des organismes cibles est libéré, les sondes ADN marquées
s’hybrident avec celui-ci pour former des complexes ADN-ARN stables. Les sondes hybridées sont
ensuite séparées des sondes non hybridées. Le luminomètre GEN-PROBE LEADER permet de
mesurer le signal lumineux émis par les hybrides ADN-ARN. Le résultat du test est la différence
entre la réponse des échantillons et la réponse moyenne des références négatives.
REACTIFS
Test GEN-PROBE
GONORRHOEAE
PACE
2C
POUR
CHLAMYDIA
TRACHOMATIS
et
NEISSERIA
Tampon d’Hybridation PACE 2 (Solution tampon) (HB) contenant < 20% de détergent.
Réactif Sonde PACE 2C pour Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae (P) Sonde
ADN marquée, lyophilisée (< 500 ng/flacon).
Réactif de Sélection PACE 2 (Solution tampon) (S) contenant < 8% de détergent.
Réactif de Séparation MST PACE 2 (SR) phase solide (1,25 mg/ml) dans une solution
contenant 0,02% d’azide de sodium (conservateur).
Référence Négative MST PACE 2 (NR) Acide nucléique non infectieux dans une solution
tampon contenant < 5% de détergent.
Contrôle Positif pour Chlamydia trachomatis (PCT) Acide nucléique non infectieux de C.
trachomatis dans une solution tampon contenant < 5% de détergent.
Contrôle Positif pour Neisseria gonorrhoeae (PGC) Acide nucléique non infectieux de N.
gonorrhoeae dans une solution tampon contenant < 5% de détergent.
Solution de Lavage MST PACE 2 (solution tampon) (W) contenant < 2% de détergent.
Cartes d’étanchéité (feuilles autocollantes) un paquet.
34
COFFRET DE REACTIFS DE DETECTION GEN-PROBE (fourni séparément)
Réactif de Détection I (RI) 0,1% d’eau oxygénée dans une solution d’acide nitrique 0,001 N
Réactif de Détection II (RII) hydroxyde de sodium 1N.
PRECAUTIONS D’UTILISATION
A.
Pour diagnostic in vitro uniquement.
Ce test a été évalué uniquement pour des échantillons urétraux chez l’homme et des
échantillons endocervicaux. Les performances du test avec d’autres types d’échantillons n’ont
pas été étudiées.
C.
Le Réactif de Séparation NE DOIT PAS être congelé. La performance du test peut être
affectée par une mauvaise conservation de ce réactif. Si ce réactif a été congelé, les
particules en suspension peuvent floculer. L’aspect granuleux persiste même après agitation
de la solution. Les granules du Réactif de Séparation peuvent adhérer aux parois du flacon.
Si cela se produit, contacter votre distributeur Gen-Probe.
D.
Du matériel de laboratoire propre doit être utilisé pour la préparation des réactifs. Il est
fortement conseillé d’utiliser des récipients en polystyrène.
E.
Prendre les précautions habituelles. Ne pas pipetter avec la bouche. Ne pas manger, boire ou
fumer dans la zone de travail. Porter des gants jetables et des blouses lors de la manipulation
des échantillons et des réactifs. Se laver soigneusement les mains après la manipulation des
échantillons et des réactifs.
F.
Certains échantillons peuvent être infectieux. Prendre les précautions (3) nécessaires à la
réalisation de toute technique de biologie moléculaire. Des procédures précises de
manipulation et d’élimination des déchets devront être établies par le directeur du laboratoire.
Seules les personnes formées à la manipulation de matériel infectieux seront autorisées à
effectuer ce type de test de diagnostic.
1.
2.
Nettoyer minutieusement et désinfecter toutes les surfaces de travail.
Autoclaver tout matériel susceptible d’être contaminé avant de le jeter.
G.
Le Réactif de Séparation contient de l’azide de sodium susceptible de former, par réaction
avec le plomb ou le cuivre des canalisations, des azides métalliques explosifs. Lors de
l’évacuation de ces réactifs, prendre soin de toujours rincer abondamment à l’eau pour éviter
la formation d’azide dans la plomberie.
H.
Eviter tout contact des Réactifs de Détection l et ll avec la peau, les yeux et les muqueuses.
ATTENTION: PRODUIT CORROSIF. En cas de contact, rincer à l’eau. Si ces réactifs sont
renversés, les diluer avec de l’eau avant d’essuyer.
I.
Ne pas interchanger ou mélanger des réactifs provenant de coffrets de lots différents, sauf en
ce qui concerne la solution de lavage MST.
CONSERVATION
Le Réactif Sonde PACE 2C et le Réactif de Séparation PACE 2 doivent être conservés à 2° - 8°C.
Le Réactif Sonde PACE 2C est stable pendant 3 semaines après reconstitution quand il est
conservé à 2° - 8°C.
La Solution de Séparation reconstituée reste stable pendant 6 heures à température ambiante
quand elle est conservée à 20° - 25°C.
35
Français
B.
Tous les autres réactifs contenus dans le coffret PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS et
NEISSERIA GONORRHOEAE se conservent entre 2° et 25°C et restent stables jusqu’à la date de
péremption indiquée.
NE PAS CONGELER LES REACTIFS CONTENUS DANS CE COFFRET.
PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS
GONORRHOEAE est conçu pour détecter la présence de C. trachomatis et/ou de N. gonorrhoeae
dans les échantillons urétraux chez l’homme et dans les échantillons endocervicaux prélevés à
l’aide du COFFRET DE PRELEVEMENT PACE GEN-PROBE.
Seuls les écouvillons contenus dans le COFFRET DE PRELEVEMENT PACE doivent être utilisés
pour les prélèvements. Les échantillons doivent être transportés au laboratoire dans le milieu de
transport GEN-PROBE.
A.
Prélever les échantillons comme suit:
1.
Echantillons endocervicaux prélevés par écouvillonnage
a.
b.
c.
d.
e.
f.
2.
Prendre l’un des deux écouvillons fournis et retirer l’excès de mucus tout autour
du col; le jeter.
Insérer le second écouvillon dans le canal endo-cervical.
Effectuer des rotations pendant 10 à 30 secondes pour assurer un bon
prélèvement.
Retirer doucement l’écouvillon ; éviter tout contact avec la muqueuse vaginale.
Placer l’écouvillon dans le tube de transport GEN PROBE.
Casser l’écouvillon au niveau du repère et fermer le tube hermétiquement.
Echantillons urétraux prélevés par écouvillonnage chez l’homme
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Les patients doivent ne pas avoir uriné dans l’heure précédant le prélèvement.
Faire pénétrer l’écouvillon dans l’urètre sur 2 à 4 cm, tourner doucement pour
faciliter la pénétration.
Une fois l’écouvillon introduit, effectuer des rotations douces pendant 2 à 3
secondes, avec une pression suffisante pour être en contact avec toute la surface
de la muqueuse.
Retirer l’écouvillon.
Le placer dans le tube de transport GEN-PROBE.
Casser l’écouvillon au niveau du repère afin de pouvoir fermer hermétiquement
le tube.
B.
Transporter les tubes au laboratoire en les maintenant entre 2° et 25°C et les conserver à
cette température jusqu'à ce qu'ils soient analysés. Les échantillons doivent être testés
dans les 7 jours suivant le prélèvement avec le test GEN-PROBE PACE 2C. Si une
conservation plus longue est nécessaire, traiter les prélèvements selon les instructions du
paragraphe PREPARATION DES ECHANTILLONS et les congeler entre -20°C et -70°C
pendant 90 jours maximum après recueil.
C.
En routine, il n’a pas été établi que les échantillons contenant du sang interféraient sur les
performances du test. Il est cependant possible qu’un échantillon à forte concentration
sanguine (supérieure à 80 µ l de sang total dans 1 ml de milieu de transport) soit une source
d’interférence.
D.
L’acheminement des échantillons doit être réalisé conformément à la réglementation en
vigueur. Conserver et tester les échantillons comme décrit (voir le paragraphe B, ci-dessus).
36
MATERIEL FOURNI
Test GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS
GONORRHOEAE
100 tests
Tampon d’Hybridation PACE 2 (HB)
2 x 6 ml
Réactif Sonde PACE 2C
Chlamydia trachomatis / Neisseria gonorrhoeae (P)
2 x 6 ml
(après reconstitution)
Réactif de Sélection PACE 2 (S)
1 x 100 ml
Réactif de Séparation MST PACE 2 (SR)
1 x 9 ml
Référence Négative MST PACE 2 (NR)
1 x 7 ml
Contrôle Positif PACE 2 Chlamydia trachomatis (PCT)
1 x 3 ml
Contrôle Positif PACE 2 Neisseria gonorrhoeae (PGC)
1 x 3 ml
Solution de Lavage MST PACE 2 (W)
3 x 200 ml
Cartes d’étanchéité (feuilles auto-collantes)
1 paquet
Tubes réactionnels GEN-PROBE à usage unique
en polystyrène (12 x 75 mm)
120 tubes/boîte
et
NEISSERIA
MATERIEL DISPONIBLE CHEZ VOTRE DISTRIBUTEUR GEN-PROBE
Coffrets de prélèvement GEN-PROBE PACE
Urétral/Conjonctival:
(bioMérieux réf. 39309 / Gen-Probe Cat. No. 3275) (50 par boîte)
Cervical:
(bioMérieux réf. 39301 / Gen-Probe Cat. No. 3300) (50 par boîte)
Coffret de Réactifs de Détection GEN-PROBE (1200 tests)
Portoir magnétique
Luminomètre GEN-PROBE LEADER 50i
(bioMérieux réf. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 3100i)
Coffret de réactifs GEN-PROBE FAST EXPRESS
MODE OPERATOIRE
A.
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
1.
2.
3.
4.
Laisser les prélèvements revenir à température ambiante avant de commencer
l’analyse.
Agiter chaque tube de transport GEN-PROBE à l’aide d’un Vortex pendant au moins 5
secondes.
Exprimer tout le liquide de l’écouvillon en le pressant contre la paroi du tube. Jeter
l’écouvillon.
Avant de commencer le test, agiter à nouveau le tube de transport à l’aide d’un Vortex
pendant au moins 5 secondes pour assurer l’homogénéité de l’échantillon.
37
Français
MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI
Vortex
Bain-marie couvert (60° ± 1°C)
Micropipettes (100 µl)
Pipettes capables de distribuer de 1 à 25 ml
Papier absorbant
B.
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
1.
Laisser tous les réactifs revenir à température ambiante avant utilisation A
L’EXCEPTION du Réactif Sonde et du Réactif de Séparation. Le Réactif Sonde et le
Réactif de Séparation doivent être conservés à 2° - 8°C jusqu’à leur utilisation.
2.
Réactif Sonde
Agiter le Tampon d’Hybridation PACE 2 pendant 10 secondes à l’aide d’un Vortex puis
le placer dans un bain-marie à 60° ± 1°C en l’agitant doucement pendant 3-4 minutes.
L’homogénéiser en l’agitant à l’aide d’un Vortex pendant 10 secondes. A l’aide d’une
pipette, distribuer 6 ml du Tampon d’Hybridation dans le Réactif Sonde PACE 2C C.
TRACHOMATIS et N. GONORRHOEAE lyophilisé (Réactif Sonde PACE 2C). Laisser
reposer pendant 2 minutes à température ambiante puis agiter à l’aide d’un Vortex
pendant 10 secondes avant l’utilisation. S’assurer visuellement que le réactif est
complètement réhydraté et homogène. Noter sur l’étiquette la date de reconstitution. Le
Réactif Sonde PACE 2C ainsi reconstitué est stable pendant 3 semaines quand il est
conservé à 2° - 8°C, dans la limite de la date de péremption. Si le Réactif Sonde
reconstitué a été réfrigéré, l’agiter à l’aide d’un Vortex pendant 10 secondes et le
réchauffer ensuite en plongeant le flacon dans un bain-marie à 60° ± 1°C pendant 2
minutes, tout en l’agitant doucement. Avant utilisation, l’agiter pendant 10 secondes à
l’aide d’un Vortex pour s’assurer de son homogénéité. Il peut être nécessaire de répéter
cette opération si le réactif reconstitué n’est pas parfaitement homogène.
3.
Solution de Séparation
Déterminer le nombre de tests à effectuer. Calculer le volume des réactifs de Sélection
et de Séparation comme suit:
Volume de Réactif de Sélection (ml) = Nombre de tests + 2 tests supplémentaires
(avec une pipette répétitive Eppendorf)
= Nombre de tests + 10 tests supplémentaires
(avec un distributeur automatique)
Volume du Réactif de Séparation (ml)
= Volume de Réactif de Sélection (ml)
20
Verser la quantité requise de Réactif de Sélection dans un récipient sec et propre. Agiter
le Réactif de Séparation et ajouter le volume requis du Réactif de Séparation au Réactif
de Sélection; agiter à nouveau. Cette Solution de Séparation préparée se conserve à
température ambiante et reste stable pendant 6 heures.
Préparation de la Solution de Séparation
(Exemple)
Nombre
de tests
8
18
48
98
+
+
+
+
2
2
2
2
Réactif
de Sélection
10
20
50
100
ml
ml
ml
ml
38
Réactif
de Séparation
0,5
1,0
2,5
5,0
ml
ml
ml
ml
C.
HYBRIDATION
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
D.
PRÉPARATION DU MATÉRIEL
SÉPARATION
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
F.
Préparer le luminomètre GEN-PROBE LEADER. S’assurer qu’il y ait suffisamment de
Réactifs de Détection I et II pour pratiquer les tests.
Retirer le portoir du bain-marie et retirer les feuilles auto-collantes.
Distribuer 1 ml de la Solution de Séparation bien homogénéisée dans chaque tube.
Couvrir les tubes avec les feuilles autocollantes et secouer vigoureusement le portoir 3
à 5 fois pour mélanger.
Placer immédiatement les tubes dans un bain-marie à 60° ± 1°C et les incuber pendant
10 minutes.
Retirer le portoir du bain-marie. Décoller les feuilles auto-collantes. Placer le portoir de
tubes sur le support magnétique pendant 5 minutes à température ambiante.
En maintenant le portoir sur le support magnétique GEN-PROBE, décanter le
surnageant en retournant le portoir. Secouer 2 ou 3 fois puis égoutter les tubes 3 fois
pendant 5 secondes sur du papier absorbant avant de reposer le portoir.
SANS RETIRER LE PORTOIR DU SUPPORT MAGNETIQUE GEN-PROBE, remplir
complètement chaque tube avec la Solution de Lavage. (Voir le paragraphe
REMARQUES pour tout ce qui concerne la Solution de Lavage).
Laisser les tubes sur le support magnétique pendant 20 minutes à température
ambiante.
En maintenant le portoir sur le support magnétique, décanter le surnageant par
retournement. Avant de retourner les tubes, agiter 2 à 3 fois. NE PAS EGOUTTER. Il
doit rester environ 50 à 100 µl de Solution de Lavage dans chaque tube.
Retirer le portoir du support magnétique et le secouer pour remettre les culots en
suspension.
DETECTION
1.
Sélectionner le protocole approprié sur le luminomètre LEADER.
39
Français
1.
E.
Identifier les tubes en indiquant le numéro de l’échantillon correspondant. Ajouter 3
tubes pour la Référence Négative, un tube pour le Contrôle Positif C. trachomatis, et un
tube pour le Contrôle Positif N. gonorrhoeae. Ecrire sur le haut du tube uniquement. La
référence et les contrôles doivent être testés avec chaque série d’échantillons.
Placer les tubes sur le portoir magnétique GEN-PROBE. Mettre de côté le support
magnétique pour une utilisation ultérieure.
Agiter chaque échantillon à l’aide d’un Vortex pendant 5 secondes.
Distribuer 100 µl de chaque contrôle et 100 µl de chaque échantillon au fond de leurs
tubes respectifs.
Distribuer 100 µl de Réactif Sonde PACE 2C AU FOND de chaque tube, en prenant soin
de ne pas toucher le sommet ou la paroi du tube.
Couvrir les tubes avec les feuilles auto-collantes et s’assurer que chaque tube est bien
fermé.
Secouer le portoir 3 à 5 fois pour mélanger.
Incuber les tubes dans un bain-marie à 60° ± 1°C pendant une heure. NE PAS mettre
le support du portoir magnétique dans le bain-marie.
2.
Afin de retirer tout résidu de la surface des tubes, les essuyer avec du papier absorbant
humide. Vérifier que les culots soient bien en suspension et insérer les tubes dans le
luminomètre conformément aux instructions affichées par l’appareil.
Lire les tubes dans l’ordre suivant:
Référence négative, 3 tubes
Contrôle positif C. trachomatis, 1 tube
Contrôle positif N. gonorrhoeae, 1 tube
Tubes contenant les échantillons cliniques
3.
Lorsque l’analyse est terminée, retirer les tubes du lecteur.
REMARQUES
A.
TAMPON D’HYBRIDATION PACE 2: Le chauffage à 60° ± 1°C du Tampon d’Hybridation
PACE 2 et du Réactif Sonde PACE 2C reconstitué est impératif pour éviter la formation d’un
précipité et s’assurer de l’homogénéité de la solution.
B.
ECHANTILLONS: Certains échantillons sont parfois trop visqueux pour être pipettés.
S’assurer qu’ils sont bien à température ambiante et les agiter à l’aide d’un Vortex pour les
fluidifier. Le Réactif GEN-PROBE FAST EXPRESS peut être utilisé pour faciliter la
préparation des échantillons. Contacter votre distributeur GEN-PROBE pour information.
C.
UTILISATION DES PIPETTES: Par commodité, les mêmes pipettes ou distributeurs peuvent
être utilisés pour l’addition du Réactif Sonde PACE 2C, de la Solution de Séparation et de la
Solution de Lavage. Il est recommandé d’utiliser des pipettes avec pointes jetables pour
prélever les échantillons et les contrôles, afin d’éviter toute contamination entre tubes.
Prendre soin de déposer le Réactif Sonde PACE 2C AU FOND des tubes, sans rentrer
l’embout trop profondément et en évitant de lui faire toucher le bord du tube. Afin d’éviter les
projections, distribuer les réactifs vers la paroi des tubes et non pas vers le fond des tubes.
D.
EGOUTTAGE DES TUBES: Changer le papier absorbant après chaque égouttage pour éviter
toute contamination. NE PAS EGOUTTER APRES L’ETAPE DE LAVAGE.
E.
TEMPERATURE: Les réactions d’hybridation et de séparation sont des réactions thermodépendantes. Par conséquent, il est indispensable que le bain-marie et les tubes restent à
température constante durant ces étapes. Un bain-marie couvert capable de maintenir une
température de 60° ± 1°C devra être utilisé.
F.
LAVAGE: La Solution de Lavage doit être distribuée énergiquement dans chaque tube.
Orienter la pipette vers la paroi du tube et non pas vers le fond, afin d’éviter les projections.
De la mousse doit apparaître sur une hauteur de 1 cm quand la Solution de Lavage a été
distribuée assez énergiquement. Remplir ensuite les tubes avec la Solution de Lavage afin
qu’il ne reste pas de mousse. Les résultats peuvent être faussés si l’étape de lavage n’a pas
été correctement effectuée.
G.
FLACON AVEC DISTRIBUTEUR AUTOMATIQUE: Cette méthode de distribution de la
Solution de Lavage est optionnelle. Chaque laboratoire devra valider l’efficacité de ce
dispositif par rapport à la méthode en vigueur pour l’addition de la Solution de Lavage. Avant
d’utiliser un distributeur, transférer la Solution de Lavage dans le flacon. Visser le bouchon.
Eliminer les 5 premiers millilitres distribués.
H.
Comme dans toute méthode utilisant des réactifs, l’excès de poudre sur les gants peut
entraîner la contamination des réactifs ou des tubes réactionnels ouverts. GEN-PROBE
recommande que les clients ayant rencontré des difficultés avec le test évitent d’utiliser ce
type de gants. L’utilisation de gants non talqués est recommandée.
40
I.
DETECTION: Les tubes devront être lus à l’aide du luminomètre LEADER dans les 60
minutes qui suivent la décantation de la Solution de Lavage. Les tubes devront être conservés
entre 20° et 25°C avant la lecture.
RESULTATS
A.
CALCUL DES RÉSULTATS:
Les résultats du test GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS et NEISSERIA
GONORRHOEAE sont calculés comme la différence en RLU (Relative Light Units) entre la réponse
des échantillons et la moyenne des 3 tubes de Référence Négative.
Moyenne des références négatives = somme des 3 Références Négatives, divisée par 3.
Exemple:
Moyenne des références négatives =
(65 RLU + 71 RLU + 80 RLU) = 72 RLU
3
Seuil déterminé = 300 RLU
Seuil calculé = 300 RLU + 72 RLU = 372 RLU
B.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
GONORRHOEAE doivent être interprétés en tenant compte des autres données du laboratoire et
être corrélés avec les données cliniques.
POSITIF - La différence est supérieure ou égale au seuil de 300 RLU augmenté de la moyenne des
trois Références Négatives.
NÉGATIF - La différence est inférieure au seuil de 300 RLU augmenté de la moyenne des trois
Références Négatives.
Un résultat positif indique la présence d’ARNr de Chlamydia trachomatis et/ou d’ARNr de Neisseria
gonorrhoeae dans l’échantillon testé. Il faut ensuite pratiquer des tests supplémentaires afin
d’identifier individuellement C. trachomatis et N. gonorrhoeae.
Si les tests individuels sont négatifs, le résultat est équivoque et un autre prélèvement doit être
effectué.
Un résultat négatif indique que ni l’ARNr de Chlamydia trachomatis ni l’ARNr de Neisseria
gonorrhoeae n’ont été détectés dans l’échantillon.
C.
CONTROLE DE QUALITÉ ET ACCEPTABILITÉ DES RÉSULTATS
NOTE: Les Références Négatives et le Contrôle Positif fournis permettent de contrôler uniquement
le test PACE 2C. Ils ne permettent pas de contrôler la lyse du microorganisme cible dans le milieu
de transport du prélèvement.
Référence Négative:
La Référence Négative permet de mesurer le bruit de fond du test et est utilisée pour calculer le
seuil de positivité de la série. Les valeurs attendues de la Référence Négative ont été calculées en
réalisant 69 séries de tests (3 essais/série) sur cinq sites différents à travers les Etats-Unis.
41
Français
Valeur de lecture d’un échantillon = 900 RLU POSITIF
Le luminomètre LEADER imprime la valeur de lecture de l’échantillon et la compare à un seuil
déterminé. L’interprétation de la positivité ou de la négativité s’effectue par rapport à ce seuil et est
imprimée par le luminomètre. Consulter le manuel d’utilisation du luminomètre LEADER pour plus
d’information sur le protocole de lecture.
La réponse de chaque Référence Négative doit être inférieure à 200 RLU. Toutes les valeurs des
Références Négatives doivent être comprises dans un intervalle de 30% autour de la valeur
moyenne des Références Négatives (le coéfficient de variation doit être inférieur à 30%). Si une
valeur n’est pas comprise dans cet intervalle, elle peut être éliminée des calculs; suivre alors les
indications du manuel d’utilisation du luminomètre LEADER. Si deux valeurs sont en-dehors de cet
intervalle, le test devra être répété. Si le problème se répète fréquemment, revoir la technique
utilisée et contacter votre distributeur Gen-Probe.
Contrôle Positif:
Les valeurs attendues de chaque Contrôle Positif ont été calculées en réalisant 69 séries de tests
sur cinq sites différents à travers les Etats-Unis.
Pour que la série soit valide, la différence entre la réponse de chaque Contrôle Positif et la réponse
moyenne des Références Négatives doit être supérieure à 600 RLU et inférieure à 3.200 RLU. Si
la valeur du Contrôle Positif ne satisfait pas à ces conditions, et ce de manière répétée, contacter
votre distributeur Gen-Probe. Les résultats du test GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA
TRACHOMATIS et NEISSERIA GONORRHOEAE doivent être interprétés en tenant compte des
autres données du laboratoire et corrélés avec les données cliniques.
Si les valeurs des Contrôles Positifs et de la Référence Négative ne sont pas conformes aux valeurs
attendues, les résultats du test ne sont pas valides et ne doivent pas être rendus.
Chaque laboratoire doit, en conditions de routine, déterminer ses propres valeurs et ses intervalles
pour la Référence Négative et le Contrôle Positif, et les archiver conformément aux bonnes
pratiques de laboratoire (2, 20).
Contrôles de traitement des échantillons:
Pour tester l’efficacité du traitement de l’échantillon, des contrôles cellulaire positifs et négatifs
peuvent être soumis au test en parallèle avec les échantillons. Les souches C. trachomatis ATCC
VR878 et N. gonorrhoeae ATCC 19424 peuvent être utilisés comme contrôles positifs et la souche
N. mucosa ATCC 19696 comme contrôle négatif.
Pour les souches de Neisseria, utiliser des cultures en croissance et préparer des suspensions
d’environ 3 x 108 UFC/ml dans du sérum physiologique stérile. Transférer 10 µl de chaque
suspension cellulaire dans un tube de transport du COFFRET DE PRELEVEMENT PACE GENPROBE (endocervical ou urétral/conjonctival) et agiter à l’aide d’un Vortex.
Pour les souches de Chlamydia, utiliser les corps élémentaire récoltés à partir de cultures
cellulaires et préparer une solution titrée à environ 3 x 108 UFI/ml. Transférer 10 µl de chaque
suspension dans un tube de transport du COFFRET DE PRELEVEMENT PACE GEN-PROBE
(endocervical ou urétral/conjonctival) et agiter à l’aide d’un Vortex. Traiter les contrôles de la même
facon que les prélèvements, en commençant par l’étape C1 du mode opératoire. Les contrôles
cellulaires positifs doivent donner des résultats positifs et les contrôles cellulaires négatifs des
résultats négatifs.
LIMITES DU TEST
Cette méthode a été testée uniquement pour les prélèvements urétraux chez l’homme et les
prélèvements endocervicaux. Ses performances n’ont pas été évaluées pour d’autres types
d’échantillons.
En routine, il n’a pas été établi que les échantillons contenant du sang interféraient sur les performances
du
test.
Cependant
un
échantillon
à
très
forte
concentration
sanguine
(supérieure à 80 µl de sang total dans 1 ml de milieu de transport) peut être une source d’interférence.
42
Aucune interférence causée par les lubrifiants gynécologiques et les spermicides n’a été observée
avec le test PACE 2C, lorsque ces produits sont utilisés normalement. Pour des informations sur
des produits particuliers, contacter votre distributeur Gen-Probe.
D’autres substances endogènes peuvent être présentes dans les échantillons des patients et
interférer avec le test.
Toutes les méthodes d’identification de Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae sont
susceptibles de donner des résultats faussement positifs. Dans les cas où les résultats de l’analyse
sont susceptibles d’avoir un impact psycho-social négatif, il est recommandé de confirmer le
résultat à l’aide d’une autre méthode. La culture est la seule méthode préconisée pour poser le
diagnostic d’une infection à Chlamydiae ou pour les applications médico-légales.
Comme pour toute autre maladie, la valeur prédictive positive de ce test diminue en même temps
que la prévalence de la maladie dans la population. La fiabilité des résultats dépend de la qualité
du prélèvement. Le système de transport utilisé pour ce test ne permettant pas de vérifier par
l’observation au microscope du prélèvement si celui-ci a été correctement effectué, il est nécessaire
de former le personnel aux techniques de prélèvement. Voir les recommandations indiquées dans
les paragraphes PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS et CONSERVATION de cette notice.
GONORRHOEAE doivent être interprétés en tenant compte des autres données du laboratoire et
être corrélés avec les données cliniques.
Un test négatif n’exclut pas la possibilité d’une infection car le nombre de C. trachomatis et/ou N.
gonorrhoeae peut être inférieur au seuil de détection du test. Un deuxième échantillon peut être
prélevé par écouvillonnage et cultivé pour confirmation du résultat. Les résultats du test peuvent
également être affectés par un mauvais prélèvement, une erreur technique, une inversion des
échantillons ou un traitement antibiotique en cours.
Si un résultat PACE 2C-positif est en contradiction avec d’autres données cliniques ou informations
fournies par le patient, ou si le patient appartient à une catégorie citée dans les directives de 1993
du CDC concernant C. trachomatis (CDC, MMWR, Vol. 42, No. RR-12, 1993), il peut être justifié de
vérifier le résultat.
GONORRHOEAE est un test de dépistage de C. trachomatis et/ou N. gonorrhoeae. L’infection
pouvant être double, Il est nécessaire de pratiquer des tests supplémentaires sur les échantillons
PACE 2C positifs afin de détecter individuellement la présence de C. trachomatis et N.
gonorrhoeae.
43
Français
Le résultat du test ne donne pas d’indication sur le succès ou l’échec d’une thérapie car la présence
d’acides nucléiques peut persister même après une thérapie anti-microbienne appropriée.
VALEURS ATTENDUES
DISTRIBUTION DES RESULTATS CLINIQUES
A partir des résultats obtenus lors des essais cliniques du test PACE 2C, la distribution des valeurs
de lecture des échantillons (valeurs indiquées en RLU) par rapport à la valeur seuil du test a été
établie. Les données après résolution des résultats discordants, figurent ci-dessous. Le nombre de
faux-positifs (FP) et de faux-négatifs (FN) correspondants est indiqué en-dessous du tableau.
FP
FN
13
10
10
2
14
11
8
7
11
PERFORMANCES
A.
PRECISION INTRA-ESSAI
La précision intra-essai du test PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS et NEISSERIA
GONORRHOEAE a été établie en testant quatre concentrations de C. trachomatis (mesurée en
UFI:Unité Formant Inclusion) et de N. gonorrhoeae, 5 fois dans une même série. Un échantillon
négatif a également été testé.
Echantillon
Nombre d’essais
Réponse moyenne (RLU)
Ecart-type (RLU)
Coefficient de variation
B.
A
B
C
D
E
5
9.530
210
2,2%
5
2.075
143
6,9%
5
1.041
42
4,0%
5
767
52
6,8%
5
49
2
n/d
PRECISION INTER-ESSAI
La précision inter-essai a été établie en testant les quatre mêmes concentrations de C. trachomatis
(nombre d’ UFI) et de N. gonorrhoeae, et un échantillon négatif au cours de trois séries
consécutives.
Echantillon
A
B
C
D
E
Nombre d’essais
3
Réponse moyenne (RLU) 10.147
Ecart-type (RLU)
917
9,0%
3
2.259
240
10,6%
3
968
66
6,8%
3
690
74
10,7%
3
51
4
n/d
44
C.
PRECISION DU CONTROLE POSITIF
La précision pour les contrôles positifs de C.trachomatis et N. gonorrhoeae a été déterminée à partir
de tests PACE 2C effectués sur cinq sites différents aux Etats-Unis. Chaque contrôle positif a été
testé une fois dans chaque série.
Echantillon
Nombre d’essais
Réponse moyenne (RLU)
Ecart-type (RLU)
D.
Contrôle positif
C. trachomatis
69
1.837
329
5,6%
Contrôle négatif
N. gonorrhoeae
69
2.165
425
5,1%
SENSIBILITE ANALYTIQUE
La sensibilité analytique (seuil de détection) du test GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA
TRACHOMATIS et NEISSERIA GONORRHOEAE a été déterminée en comparant les résultats de
la culture et du test PACE 2C sur des dilutions de C. trachomatis et N. gonorrhoeae provenant de
cultures fraîches.
E.
SPECIFICITE ANALYTIQUE
Quatre vingt cultures ont été analysées avec le test PACE 2C. Ces souches comprenaient 20
microorganismes susceptibles d’être isolés du tractus urogénital et 30 autres microorganismes
représentant une intersection phylogénétique. Des souches de C. trachomatis (15 sérovars), N.
gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, et de 12 espèces de Neisseriaceae ont
également été testées. Seuls C. trachomatis et N. gonorrhoeae ont donné des résultats positifs
avec le système GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS et NEISSERIA
GONORRHOEAE.
F.
TEST DE SURCHARGE
Une quantité de 0,1 µg/test d’ARN ribosomal isolé de C. psittaci, Ureaplasma urealyticum, et
Neisseria meningitidis a été ajouté à des échantillons contenant différentes concentrations d’ARNr
de C. trachomatis et/ou de N. gonorrhoeae. Aucune interférence sur la détection de C. trachomatis
ou de N. gonorrhoeae avec le test GEN-PROBE PACE 2C POUR CHLAMYDIA TRACHOMATIS et
NEISSERIA GONORRHOEAE n’a été observée.
45
Français
Le seuil de positivité étant de 300 RLU plus la moyenne des Références Négatives, une sensibilité
de 24 à 2.232 inclusion UFI/test (0.1 ml de milieu de transport innoculé) a été déterminée pour les
15 sérovars de C. trachomatis, c’est-à-dire une moyenne de 966 UFI/test. Pour N. gonorrhoeae,
une sensibilité d’environ 650 UFC (Unité Formant Colonie)/test (0,1 ml de milieu de transport
innoculé) a été déterminée.
G.
RESULTATS DE L’ESSAI CLINIQUE
GONORRHOEAE a été comparé aux méthodes traditionnelles de culture sur 1.266 échantillons
endocervicaux et 849 échantillons urétraux masculins. Ces essais ont été réalisés sur cinq sites
cliniques, en utilisant un seuil net de 300 RLU. Les données cliniques obtenues avant et après
résolution des discordances, sont présentées ci-dessous:
1.
RESUME DES PERFORMANCES AVANT ANALYSE DES DISCORDANCES
PACE 2C
Culture
Pos
Pos
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensibilité/
Spécificité
%
9
6
219
92,5/96,1
8
3
313
94,1/97,5
6
8
4
1
263
92,3/98,5
17
11
208
97,1/92,4
11
2
203
92,9/94,9
28
13
411
96,8/93,6
Pos
Neg
Population
(%CT / %NG prévalence; Nb de sites)
Femmes avec symptômes
Forte prévalence
74
(13,6%/16,2%; 2 sites)
Faible prévalence
(8,9%/7,0%; 2 sites)
48
Femmes asymptomatiques
Forte prévalence
71
(12,1%/17,0%; 2 sites)
Faible prévalence
(3,2%/1,8%; 2 sites)
12
Hommes
Avec symptômes
371
(11,5%/ 55,7%; 4 sites)
asymptomatiques
(6,6%/5,4%; 4 sites)
26
Total
397
(10,1%/41,3%; 4 sites)
46
221
89,9/97,4
2.
RESUME DES PERFORMANCES APRES ANALYSE DES DISCORDANCES
Les résultats discordants pour C. trachomatis ont été résolus par immunofluorescence directe
après remise en culture. Les échantillons discordants pour N. gonorrhoeae n’ont pas été
remis en culture.
Intervalle de
confiance à
95%
Sensibilité/
Spécificité %
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensibilité/
Spécificité
%
Femmes avec symptômes
Forte
prévalence
77
6
6
219
92,8/97,3
86,7-97,9 /
94,7-99,1
Faible
prévalence
3
313
94,2 / 97,8
86,5-100,0 /
95,6-99,1
Femmes asymptomatiques
Forte
prévalence
71
6
8
221
89,9 / 97,4
81,0-94,9 /
94,7-99,1
Faible
prévalence
13
3
1
263
92,9 / 98,9
71,4-100,0 /
97,4-100,0
Hommes
Avec
symptômes
373
15
11
208
97,1 / 93,3
95,3-98,7 /
89,7-96,0
Asymptomatiques
28
9
2
203
93,3 / 95,8
Total
401
24
13
411
96,9 / 94,5
83,3-100,0 /
92,5-98,1
94,9-98,3 /
92,0-96,3
PACE 2C
Culture
Pos
Pos
Pos
Neg
Population
49
7
3.
RESUME DES PERFORMANCES: MICROORGANISMES INDIVIDUELS
La capacité du PACE 2C à détecter individuellement C. trachomatis et N. gonorrhoeae a été
étudiée en comparant les résultats du test PACE 2C après résolution des discordances et la
47
Français
Sur les 55 échantillons PACE 2C-positifs, culture-négatifs, 15 se sont révélés négatifs après
avoir été soumis à des tests individuels PACE 2 pour C. trachomatis et N. gonorrhoeae. Un
test de recherche par amplification a également été utilisé pour tester certains échantillons
PACE 2C - faux positifs, bien que ce test ne figure pas dans le protocole de résolution des
discordances décrit ci-dessus. 26 des 40 échantillons PACE 2C-positifs, culture-négatifs,
testés par amplification, contenaient de l’ARNr de C. trachomatis et 11 d’entre eux
contenaient de l’ARNr de N. gonorrhoeae. Ceci prouve que la majorité des faux positifs
étaient en fait de vrais positifs n’ayant pas été mis en évidence par la culture. Les échantillons
ont été tout de même classés comme faux positifs, le test d’amplification utilisé étant un test
de recherche.
culture pour des échantillons positifs, et ceci pour chacun des deux microorganismes cibles.
Pour simplifier, les échantillons double-positifs ont été inclus à la fois dans les données de C.
trachomatis et de N. gonorrhoeae. Par conséquent, le nombre total d’échantillons positifs du
tableau ci-dessous est augmenté de 59 par rapport aux tableaux des données cliniques.
Positifs
C. trachomatis Positifs en Culture
Femmes
Hommes
N. gonorrhoeae Positifs en Culture
Femmes
Hommes
PACE 2C
Négatifs
109
79
12
12
132
350
6
1
48
CHLAMYDIA TRACHOMATIS Y NEISSERIA GONORRHOEAE
Para la detección de Chlamydia trachomatis y/o de Neisseria gonorrhoeae en muestras uretrales
en el varón y en muestras endocervicales.
UTILIZACION
El test GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA
GONORRHOEAE es un test con sonda de ADN basado en la técnica de hibridación de ácidos
nucleicos para detectar la presencia de Chlamydia trachomatis y/o de Neisseria gonorrhoeae en
muestras uretrales masculinas y en muestras endocervicales tomadas con los escobillones de los
equipos de toma de muestras PACE de GEN-PROBE.
A continuación se deben realizar tests suplementarios con el fin de detectar individualmente C.
trachomatis y N. gonorrhoeae en las muestras que han resultado positivas con el test PACE 2C.
Chlamydia trachomatis incluye 15 serovariedades responsables de las siguientes enfermedades:
tracomas, conjuntivitis con inclusiones, linfogranulomas venéreos y otras enfermedades de
transmisión sexual. Las serovariedades D a K son la causa más frecuente de infecciones genitales
por Clamidias, tanto en el varón como en la mujer: (26). Las uretritis no gonocócicas, las
epididimitis, las proctitis, las cervicitis y las salpingitis agudas forman parte de lossignos clínicos
producidos porChlamydia trachomatis (9, 24, 27). Además de las infecciones de transmisión
sexual, los recién nacidos de madres infectadas pueden también desarrollar enfermedades
causadas por Clamidia, tal como neumonías o conjuntivitis con inclusiones (1, 7, 28).
Varios métodos han sido utilizados para detectar la presencia de Chlamydia trachomatis en los
tejidos infectados. Incluyen la observación de los tejidos infectados a través de microscopio óptico
después de la tinción directa con Giemsa, y el cultivo celular, seguido de la visualización de las
inclusiones intracelulares mediante yodo o fluoresceína o mediante anticuerpos conjugados con un
marcador (5, 19, 26, 31). En fecha más reciente han sido desarrollados métodos rápidos que
utilizan la detección de antígenos y la hibridación de ácidos nucleicos.
La gonococia es la infección bacteriana que se encuentra más frecuentemente en Estados Unidos,
con más de 392.200 casos registrados en 1993 (4). Esta enfermedad de transmisión sexual (ETS)
se manifiesta en general por una uretritis previa, acompañada de exudado purulento en el varón.
En la mujer se afecta generalmente el cuello del útero, pero también pueden infectarse la vagina y
49
Español
INTRODUCCION
Las Clamidias son bacterias intracelulares inmóviles, Gram negativas, que utilizan el ATP producido
por la célula huésped para replicarse. Las infecciones producidas por Clamidia son conocidas
desde hace mucho tiempo. Sin embargo, la apreciación de la patogenicidad de Chlamydia
trachomatis se ha incrementado con el tiempo (23, 25). Chlamydia trachomatis es responsable de
aproximadamente 50 a 80% de los casos de uretritis no gonocócicas (9, 10).
el útero. Las infecciones son a menudo asintomáticas, de modo que si no son tratadas pueden
provocar complicaciones graves e incluso esterilidad. Las infecciones gonocócicas pueden ser
también diagnosticadas a partir de otras mucosas, en particular la conjuntiva, el ano y la región
orofaríngea (17).
Neisseria gonorrhoeae es el agente responsable de las gonococias; se trata de un diplococo Gram
negativo y oxidasa positivo, cuyo crecimiento exige condiciones estrictas (8, 12, 29). El diagnóstico
presuntivo se basa en el aislamiento del microorganismo por cultivo, el examen microscópico tras
tinción de Gram y la presencia de la citocromooxidasa (8, 12). Las técnicas confirmatorias de
diagnóstico definitivo de infecciones gonocócicas son el revelado con anticuerpos fluorescentes,
estudio de degradación de hidratos de carbono y la fermentación de azúcares y tests de
aglutinación (6, 11, 16, 18, 22, 30). Más recientemente, para el diagnóstico de las infecciones
gonocócicas se ha utilizado la técnica de hibridación de los ácidos nucleicos directamente sobre
muestras de pacientes (21).
GONORRHOEAE utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos (15) para identificar
Chlamydia trachomatis y/o Neisseria gonorrhoeae directamente a partir de una muestra uretral en
el varón o de una muestra endocervical. El test no permite diferenciar ambos microorganismos,
pero indica si la muestra contiene uno de ellos o ambos.
PRINCIPIO
Los tests por hibridación de ácidos nucleicos se basan en la capacidad de las cadenas
complementarias de los ácidos nucleicos para aparearse de manera específica, constituyendo
complejos bicatenarios estables (15). El sistema GEN-PROBE PACE 2C utiliza sondas
monocatenarias de ADN conjugadas con un marcador quimioluminiscente, complementario del
ARN ribosómico (ARNr) de los organismos diana. Cuando el ARNr de los organismos diana es
liberado, las sondas ADN marcadas se combinan con éste para formar complejos ADN-ARN
estables. Las sondas hibridadas son a continuación separadas de las sondas no hibridadas. El
luminómetro GEN-PROBE LEADER permite medir la señal luminosa emitida por los híbridos ADNARN. El resultado del test es la diferencia entre la respuesta de las muestras y la respuesta media
de las referencias negativas.
REACTIVOS
Test GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA GONORRHOEAE
Tampón de Hibridación PACE 2 (Solución tampón) (HB) que contiene < 20% de detergente.
Reactivo Sonda PACE 2C para Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae (P) Sonda
ADN marcada, liofilizada (< 500 ng/frasco).
Reactivo de Selección PACE 2 (Solución tampón) (S) que contiene < 8% de detergente.
Reactivo de Separación ETS PACE 2 (SR) fase sólida (1,25 mg/ml) en una solución que
contiene 0,02% de azida sódica (conservante).
Referencia Negativa ETS PACE 2 (NR) Acido nucleico no infeccioso en una solución tampón
que contiene < 5% de detergente.
Control Positivo para Chlamydia trachomatis (PCT) Acido nucleico no infeccioso de C.
trachomatis en una solución tampón que contiene < 5% de detergente.
Control Positivo para Neisseria gonorrhoeae (PGC) Acido nucleico no infeccioso de N.
gonorrhoeae en una solución tampón que contiene < 5% de detergente.
Solución de Lavado ETS PACE 2 (solución tampón) (W) que contiene < 2% de detergente.
Hojas autoadhesivas. un paquete.
50
KIT DE REACTIVOS DE DETECCION GEN-PROBE (suministrado por separado)
Reactivo de Detección I (RI) 0,1% de agua oxigenada en una solución de ácido nítrico 0,001
N
Reactivo de Detección II (RII) hidróxido sódico 1N.
PRECAUCIONES DE EMPLEO
A.
Sólo para diagnóstico in vitro.
Este test ha sido evaluado exclusivamente para muestras uretrales en el varón y para
muestras endocervicales. Los rendimientos del test con otro tipo de muestras no han sido
estudiados.
C.
El Reactivo de Separación NO DEBE congelarse. El rendimiento del test puede ser afectado
por una mala conservación del reactivo. Si este reactivo ha sido refrigerado, las partículas en
suspensión pueden precipitar, adquiriendo un aspecto granuloso, el cual persiste después de
agitar. Los gránulos del Reactivo de Separación pueden adherirse a las paredes del frasco.
Si esto se produce,contactar con su distribuidor Gen-Probe.
D.
En la preparación de los reactivos debe emplearse material de laboratorio limpio. Se
aconseja enfáticamente utilizar recipientes de poliestireno.
E.
Adoptar las precauciones habituales. No pipetear con la boca. No comer, beber o fumar en
la zona de trabajo. Llevar guantes desechables y ropa protectora durante la manipulación de
las muestras y de los reactivos. Lavarse cuidadosamente las manos después de manipular
las muestras y los reactivos.
F.
Algunas muestras pueden ser infecciosas. Adoptar las precauciones necesarias para la
realización de cualquier técnica de biología molecular. El responsable del laboratorio debe
establecer procedimientos precisos de manipulación y eliminación de desechos. Unicamente
las personas que han sido capacitadas para manipular material infeccioso están autorizadas
para efectuar este tipo de test de diagnóstico.
1.
2.
Limpiar cuidadosamente y desinfectar todas las superficies de trabajo.
Autoclavar todo el material que puede estar contaminado antes de eliminarlo.
G.
El Reactivo de Separación contiene azida sódica susceptible de formar, por reacción con el
plomo o el cobre de las tuberías, azidas metálicas explosivas. En el momento de eliminar
estos reactivos, tener cuidado de enjuagar siempre con agua abundante para evitar la
formación de azida en las cañerias.
H.
Evitar todo contacto de los Reactivos de Detección con la piel, los ojos y las mucosas.
Evitar el contacto de lis Agentes de Detección l y ll con la piel, los ojos y las membranas
mucosas. ATENCION: PRODUCTO CORROSIVO. Lavar con agua si se produce cualquier
contacto con esos reactivos. Si se producen salpicaduras de estos reactivos, diluir con agua
antes de secar.
I.
No intercambiar o mezclar reactivos provenientes de kits de lotes diferentes, excepto si se
trata de la solución de lavado ETS.
CONSERVACION
El Reactivo Sonda PACE 2C y el Reactivo de Separación PACE 2 deben ser conservados a
2° - 8°C.
El Reactivo Sonda PACE 2C es estable durante 3 semanas después de la reconstitución cuando
se le conserva a 2° - 8°C.
La Solución de Separación reconstituida se mantiene estable durante 6 horas a temperatura
51
Español
B.
ambiente cuando es conservada a 20° - 25°C.
Todos los otros reactivos contenidos en el kit PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y
NEISSERIA GONORRHOEAE se conservan entre 2° y 25°C y se mantienen estables hasta la
fecha de caducidad indicada.
NO CONGELAR LOS REACTIVOS CONTENIDOS EN ESTE KIT.
OBTENCION Y PREPARACION DE LAS MUESTRAS
GONORRHOEAE ha sido diseñado para detectar la presencia de C. trachomatis y/o de N.
gonorrhoeae en las muestras uretrales en el varón y en las muestras endocervicales obtenidas con
el KIT DE TOMA DE MUESTRAS PACE GEN-PROBE.
Deben utilizarse sólo las torundas contenidos en el KIT DE TOMA DE MUESTRAS PACE para
obtener las muestras. Las muestras deben ser transportadas al laboratorio en el medio de
transporte GEN-PROBE.
A.
Realizar la toma de muestras como sigue:
1.
Muestras endocervicales
a.
Tomar uno de las dos torundas suministradas y retirar el exceso de mucus en
torno al cuello; desecharlo.
b.
Insertar la segunda torunda en el canal endocervical.
c.
Efectuar rotaciones durante 10 a 30 segundos para garantizar una buena toma de
muestras.
d.
Retirar suavemente la torunda; evitar su contacto con la mucosa vaginal.
e.
Colocar la torunda en el tubo de transporte GEN PROBE.
f.
Quebrar la torunda en el nivel marcado y cerrar el tubo herméticamente.
2.
Muestras uretrales
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Los pacientes no deben miccionar en la hora anterior a la toma de muestras.
Introducir la torunda en la uretra 2 a 4 cm; girar suavemente para facilitar la
introducción.
Una vez que la torunda ha sido introducida, realizar rotaciones suaves durante 2
a 3 segundos, con una presión suficiente para entrar en contacto con toda la
superficie de la mucosa.
Retirar la torunda.
Colocarla en el tubo de transporte GEN-PROBE.
Romper la torunda a nivel de la marca con el fin de poder cerrar herméticamente
el tubo.
B.
Transportar los tubos al laboratorio manteniéndolos entre 2° y 25°C y conservarlos a esta
temperatura hasta que sean analizados. Las muestras deben ser estudiadas en los 7 días
que siguen a la toma de muestras con el test GEN-PROBE PACE 2C. Si se necesita un
almacenamiento más prolongado, procesar el espécimen como se describe en
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA y congelarlo a temperaturas entre -20°C y -70°C hasta por
90 días después de la recolección.
C.
Durante el análisis de rutina, no ha quedado establecido que las muestras que contienen
sangre interfieran en los resultados del test. Sin embargo, es posible que una muestra con
una elevada concentración de sangre (superior a 80 µl de sangre total en 1 ml de medio de
transporte) constituya una fuente de interferencias.
D.
El envío de las muestras debe ser realizado conforme a la reglamentación vigente. Conservar
y probar las muestras como se describe (ver B anterior).
52
MATERIAL SUMINISTRADO
Test GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA GONORRHOEAE
100 tests
Tampón de Hibridación PACE 2 (HB)
2 x 6 ml
Reactivo Sonda PACE 2C
2 x 6 ml
(tras reconstitución)
Reactivo de Selección PACE 2 (S)
1 x 100 ml
Reactivo de Separación ETS PACE 2 (SR)
1 x 9 ml
Referencia Negativa ETS PACE 2 (NR)
1 x 7 ml
Control Positivo PACE 2
Chlamydia trachomatis (PCT)
1 x 3 ml
Control Positivo PACE 2
Neisseria gonorrhoeae (PGC)
1 x 3 ml
Solución de Lavado ETS PACE 2 (W)
3 x 200 ml
Hojas autoadhesivas
1 paquete
Tubos de reacción GEN-PROBE
desechables de poliestireno (12 x 75 mm)
120 tubos/caja
MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO
Vortex
Baño maría cubierto (60° ± 1°C)
Micropipetas (100 µl)
Pipetas capaces de distribuir 1 a 25 ml
Papel absorbente
TECNICA
A.
PREPARACION DE LAS MUESTRAS
1.
2.
3.
4.
Llevar las muestras a la temperatura ambiente antes de comenzar el análisis.
Agitar cada tubo de transporte GEN-PROBE mediante un Vortex durante por lo menos
5 segundos.
Exprimir todo el líquido de la torunda presionándolo contra la pared del tubo. Desechar
la torunda.
Antes de comenzar el test, agitar nuevamente el tubo de transporte mediante un Vortex
durante al menos 5 segundos para garantizar la homogeneidad de la muestra.
53
Español
MATERIAL DISPONIBLE EN SU DISTRIBUIDOR GEN-PROBE
Kits de toma de muestras GEN-PROBE PACE
Uretral/conjuntival:
(bioMérieux ref. 39309 / Gen-Probe Cat. No. 3275) (50 por caja)
Cervical:
(bioMérieux ref. 39301 / Gen-Probe Cat. No. 3300) (50 por caja)
Kit de Reactivos de Detección GEN-PROBE (1200 tests)
Portatubos magnético
Luminómetro GEN-PROBE LEADER 50i
Kit de reactivos GEN-PROBE FAST EXPRESS
B.
PREPARACION DE LOS REACTIVOS
1.
Llevar todos los reactivos a la temperatura ambiente antes de utilizarlos, CON
EXCEPCION del Reactivo Sonda y del Reactivo de Separación. El Reactivo Sonda y el
Reactivo de Separación deben ser conservados a 2 - 8°C hasta el momento de
utilizarlos.
2.
Reactivo Sonda
Agitar el Tampón de Hibridación PACE 2 durante 10 segundos mediante un Vortex y
después colocarlo al baño maría a 60° ± 1°C agitándolo suavemente durante 3-4
minutos. Homogeneizarlo agitando con un Vortex durante 10 segundos. Mediante una
pipeta, distribuir 6 ml del Tampón de Hibridación en el Reactivo Sonda PACE 2C C.
TRACHOMATIS y N. GONORRHOEAE liofilizado (Reactivo Sonda PACE 2C). Dejar
reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente y después agitar con un Vortex
durante 10 segundos antes de utilizarlo. Verificar visualmente que el reactivo se
encuentra completamente rehidratado y homogéneo. Anotar sobre la etiqueta la fecha
de reconstitución. El Reactivo Sonda PACE 2C así reconstituido es estable durante 3
semanas cuando se le conserva a 2 - 8°C, dentro de la fecha de caducidad. Si el
Reactivo Sonda reconstituido ha sido refrigerado, agitarlo mediante un Vortex durante
10 segundos y calentarlo a continuación sumergiendo el frasco en un baño maría a 60°
± 1°C durante 2 minutos, agitando al mismo tiempo suavemente. Antes de utilizarlo,
agitarlo 10 segundos mediante un Vortex para garantizar su homogeneidad. Puede ser
necesario repetir esta operación si el reactivo reconstituido no está perfectamente
homogéneo.
3.
Solución de Separación
Determinar el número de tests por realizar. Calcular el volumen de los reactivos de
Selección y de Separación como sigue:
Volumen de Reactivo de Selección (ml)
= Número de tests + 2 tests extra
(con una pipeta de repetición Eppendorf)
= Número de tests + 10 tests extra
(con un distribuidor automático)
Volumen del Reactivo de Separación (ml)
= Volumen del Reactivo de Selección (ml)
20
Introducir la cantidad necesaria de Reactivo de Selección en un recipiente limpio y
seco. Agitar el Reactivo de Separación y añadir el volumen necesario del Reactivo de
Separación al Reactivo de Selección; agitar nuevamente. Esta Solución de Separación
preparada se conserva a temperatura ambiente y se mantiene estable durante 6 horas.
Preparación de la Solución de Separación
(Ejemplo)
Número
de tests
8
18
48
98
+
+
+
+
2
2
2
2
Reactivo de
Selección
10
20
50
100
ml
ml
ml
ml
54
Reactivo de
Separación
0,5
1,0
2,5
5,0
ml
ml
ml
ml
C.
HIBRIDACION
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
D.
PREPARACION DEL MATERIAL
1.
E.
Identificar los tubos indicando el número de la muestra correspondiente. Añadir 3 tubos
para la Referencia Negativa, un tubo para el Control Positivo C. trachomatis, y un tubo
para el Control Positivo N. gonorrhoeae. Escribir sólo en la parte superior del tubo. La
referencia y los controles deben ser estudiados con cada serie de muestras.
Colocar los tubos en el portatubos del rack magnético GEN-PROBE. Dejar de lado el
soporte magnético para una utilización ulterior.
Agitar cada muestra mediante un Vortex durante 5 segundos.
Distribuir 100 µl de cada control y 100 µl de cada muestra en el fondo de sus tubos
respectivos.
Distribuir 100 µl de Reactivo Sonda PACE 2C EN EL FONDO de cada tubo, cuidando
de no tocar la parte superior o la pared del tubo.
Cubrir los tubos con hojas autoadhesivas y verificar que cada tubo se encuentre bien
cerrado.
Sacudir el portatubos 3 a 5 veces para mezclar bien.
Incubar los tubos en un baño maría a 60° ± 1°C durante una hora. NO poner el soporte
del portatubos en el baño maría.
Preparar el luminómetro GEN-PROBE LEADER. Verificar que hay suficiente Reactivo
de Detección I y II para realizar los tests.
SEPARACION
1.
2.
3.
1.
2.
Seleccionar el protocolo apropiado en el luminómetro LEADER.
Con el fin de retirar todo residuo de la superficie de los tubos, secarlos con papel
absorbente húmedo. Verificar que los precipitados se encuentren efectivamente en
55
Español
F.
Retirar el portatubos del baño maría y retirar las hojas autoadhesivas.
Distribuir 1 ml de Solución de Separación bien homogeneizada en cada tubo.
Cubrir los tubos con las hojas autoadhesivas y sacudir el portatubos 3 a 5 veces para
mezclarlo bien.
4.
Colocar de inmediato los tubos en un baño maría a 60° ± 1°C e incubarlos durante 10
minutos.
5.
Retirar el portatubos del baño maría. Despegar las hojas autoadhesivas. Colocar el
portatubos en el soporte magnético durante 5 minutos a temperatura ambiente.
6.
Manteniendo el portatubos en el soporte magnético GEN-PROBE, decantar el
sobrenadante invirtiendo el portatubos. Sacudir 2 ó 3 veces y después secar los tubos
3 veces en papel absorbente antes de volver a posar el portatubos
7.
SIN RETIRAR EL PORTATUBOS DEL SOPORTE MAGNETICO GEN-PROBE, llenar
por completo cada tubo con la Solución de Lavado. (Ver el párrafo OBSERVACIONES
para todo lo que se refiere a la solución de Lavado).
8.
Dejar los tubos en el soporte magnético durante 20 minutos a temperatura ambiente.
9.
Manteniendo el portatubos en el soporte magnético, decantar el sobrenadante
invirtiendo el portatubos. NO SECAR. Deben quedar aproximadamente 50 a 100 µl de
Solución de Lavado en el fondo de los tubos.
10. Retirar el portatubos del soporte magnético y sacudirlo para volver a poner el sedimento
en suspensión.
DETECCION
suspensión e insertar los tubos en el luminómetro, conforme a las instrucciones que se
visualizan en el aparato.
Leer los tubos en el orden siguiente:
Referencia negativa, 3 tubos
Control positivo C. trachomatis, 1 tubo
Control positivo N. gonorrhoeae, 1 tubo
Tubos que contienen las muestras clínicas
3.
Cuando el análisis ha terminado, retirar los tubos del lector.
OBSERVACIONES
A.
TAMPON DE HIBRIDACION PACE 2: El calentamiento a 60° ± 1°C del Tampón de
Hibridación PACE 2 y del Reactivo Sonda PACE 2C reconstituido es imperativo para evitar la
formación de un precipitado y garantizar la homogeneidad de la solución.
B.
MUESTRAS: Algunas muestras son a veces demasiado viscosas para ser pipeteadas.
Verificar que se encuentren efectivamente a temperatura ambiente y agitarlas mediante un
Vortex para fluidifícarlas. El Reactivo: GEN-PROBE FAST EXPRESS puede ser utilizado para
facilitar la preparación de las muestras. Contactar con su distribuidor GEN-PROBE para
mayor información.
C.
UTILIZACION DE LAS PIPETAS: Por comodidad, pueden utilizarse las mismas pipetas o
distribuidores para añadir el Reactivo Sonda PACE 2C, la Solución de Separación y la
Solución de Lavado. Se recomienda utilizar pipetas con puntas desechables para obtener
una muestra y los controles, con el fin de evitar cualquier contaminación entre tubos. Cuidar
de depositar el Reactivo Sonda PACE 2C AL FONDO de los tubos, sin hacer penetrar
demasiado la punta y evitando que toque el borde del tubo. Con el fin de evitar salpicaduras,
distribuir los reactivos hacia la pared de los tubos y no hacia el fondo de los tubos.
D.
SECADO DE LOS TUBOS: Cambiar el papel absorbente después de cada secado para evitar
cualquier contaminación. NO SECAR DESPUES DE LA ETAPA DE LAVADO.
E.
TEMPERATURA: Las reacciones de hibridación y de separación son reacciones
termodependientes. En consecuencia es indispensable que el baño maría y los tubos se
mantengan a una temperatura constante durante estas etapas. Deberá utilizarse un baño
maría cubierto, capaz de mantener una temperatura de 60° ± 1°C.
F.
LAVADO: La Solución de Lavado debe ser distribuida enérgicamente en cada tubo.
Orientar la pipeta hacia la pared del tubo y no hacia el fondo, para evitar salpicaduras. Debe
aparecer espuma en una altura de 1 cm cuando la Solución de Lavado ha sido distribuida con
suficiente energía. Llenar a continuación los tubos con la Solución de Lavado para que no
quede espuma. Los resultados pueden ser falseados si la etapa de lavado no ha sido hecha
correctamente.
G.
FRASCO CON DISTRIBUIDOR AUTOMATICO: Este método de distribución de la Solución
de Lavado es optativo. Cada laboratorio deberá validar la eficacia de este dispositivo en
relación al método vigente para añadir la Solución de Lavado. Antes de utilizar un distribuidor,
transferir la Solución de Lavado al frasco. Atornillar el tapón. Eliminar los primeros 5 mililitros
distribuidos.
H.
Como en cualquier método que utilice reactivos, el exceso de polvo en los guantes puede
contaminar los reactivos o los tubos de reacción abiertos. GEN-PROBE recomienda que los
clientes que hayan tenido dificultades con el test eviten utilizar este tipo de guantes. Se
recomienda utilizar guantes sin talco.
56
I.
DETECCION: Los tubos deberán leerse mediante el luminómetro LEADER en los 60
segundos que siguen a la decantación de la Solución de Lavado. Los tubos deben ser
conservados: entre 20° y 25°C antes de la lectura.
RESULTADOS
A.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Los resultados del test GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA
GONORRHOEAE son calculados como la diferencia en RLU (Relative Light Units = Unidades
Relativas de Luz) entre la respuesta de las muestras y la media de los 3 tubos de Referencia
Negativa.
Media de las referencias negativas = suma de las 3 Referencias Negativas, dividida por 3.
Ejemplo:
Media de las referencias negativas =
(65 RLU + 71 RLU + 80 RLU) = 72 RLU
3
Umbral determinado = 300 RLU
Umbral calculado = 300 RLU + 72 RLU = 372 RLU
Valor de una muestra = 900 RLU Positivo
El luminómetro LEADER imprime el valor de lectura de la muestra y lo compara con un umbral
determinado. La interpretación de la positividad o de la negatividad se efectúa en relación a este
umbral y es impresa por el luminómetro. Para mayor información sobre el protocolo de lectura,
consultar el manual de utilización del luminómetro LEADER.
B.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
POSITIVO - La diferencia es superior o igual al umbral de 300 RLU mas la media de las tres
Referencias Negativas.
NEGATIVO - La diferencia es inferior al umbral de 300 RLU mas la media de las tres Referencias
Negativas.
Un resultado positivo indica la presencia del ARNr de Chlamydia trachomatis y/o del ARNr de
Neisseria gonorrhoeae en la muestra estudiada. A continuación hay que realizar tests
suplementarios con el fin de identificar individualmente C. trachomatis y N. gonorrhoeae.
Si los tests individuales son negativos, el resultado es dudoso y debe realizarse una nueva toma
de muestras.
Un resultado negativo indica que no se ha detectado en la muestra el ARNr de Chlamydia
trachomatis ni el ARNr de Neisseria gonorrhoeae.
C.
CONTROL DE CALIDAD Y ACEPTABILIDAD DE LOS RESULTADOS
NOTA: Las Referencias Negativas y el Control Positivo suministrados permiten controlar sólo el
test PACE 2C. No permiten controlar la lisis del microorganismo diana en el medio de transporte
de la muestra.
57
Español
GONORRHOEAE deben ser interpretados tomando en cuenta otros datos de laboratorio y deben
ser correlacionados con los datos clínicos.
Referencia Negativa:
La Referencia Negativa permite medir el ruido de fondo del test y es utilizada para calcular el
umbral de positividad de la serie. Los valores esperados de la Referencia Negativa han sido
calculados realizando 69 series de tests (3 ensayos/serie) en cinco sitios diferentes de Estados
Unidos.
La respuesta de cada Referencia Negativa debe ser inferior a 200 RLU. Todos los valores de las
Referencias Negativas deben encontrarse en un intervalo de 30% en torno al valor medio de las
Referencias Negativas (p.e. el coeficiente de variación debe ser menor al 30%). Si un valor no se
encuentra dentro de este intervalo, puede ser eliminado de los cálculos. Seguir en este caso las
indicaciones del manual de empleo del luminómetro LEADER. Si dos valores se encuentran por
fuera de este intervalo, el test deberá repetirse. Si el problema se repite con frecuencia, revisar la
técnica utilizada y contactar con el distribuidor Gen-Probe.
Control Positivo:
Los valores esperados de cada Control Positivo han sido calculados realizando 69 series de tests
en cinco sitios diferentes de Estados Unidos.
Para que la serie sea válida, la diferencia entre la respuesta de cada Control Positivo y la respuesta
media de las Referencias Negativas debe ser superior o igual a 600 RLU e inferior a 3.200 RLU.
Si el valor del Control Positivo no satisface estas condiciones y esto de manera repetida, contactar
con el distribuidor Gen-Probe. Los resultados del test GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA
TRACHOMATIS y NEISSERIA GONORRHOEAE deben ser interpretados tomando en cuenta otros
datos de laboratorio y correlacionarlos con los datos clínicos.
Si los valores del Control Positivo y de la Referencia Negativa no están conformes con los valores
esperados, los resultados del test no son válidos y no deben ser entregados.
Cada laboratorio debe determinar sus propios valores y sus intervalos, en condiciones de rutina,
para la Referencia Negativa y para el Control Positivo, y archivarlos conforme a las buenas
prácticas de laboratorio (2, 20).
Controles de tratamiento de las muestras:
Para estudiar la eficacia del tratamiento de la muestra deben ser sometidos al test controles
celulares positivos y negativos, paralelamente con las muestras. Las cepas C. trachomatis ATCC
VR878 y N. gonorrhoeae ATCC 19424 pueden ser utilizadas como controles positivos y la cepa N.
mucosa ATCC 19696, como control negativo.
Para las cepas de Neisseria utilizar cultivo en crecimiento y preparar suspensiones de
aproximadamente 3 x 108 UFC/ml en suero fisiológico estéril. Transferir 10 µl de cada suspensión
en un tubo de transporte del KIT DE TOMA DE MUESTRAS PACE GEN-PROBE (endocervical o
uretral/conjuntival) y agitar mediante un Vortex.
Para las cepas Clamidias, utilizar los cuerpos elementales tomados a partir de cultivos celulares y
preparar una solución titulada en aproximadamente 3 x 108 UFI/ml. Transferir 10 µl de cada
suspensión al tubo de transporte del KIT DE TOMA DE MUESTRAS PACE GEN-PROBE
(endocervical o uretral/conjuntival) y agitar con un Vortex. Tratar los controles de la misma forma
que las muestras, comenzando por la etapa C1 de la técnica. Los controles celulares positivos
deben dar resultados positivos y los controles celulares negativos, resultados negativos.
LIMITES DEL TEST
Este método ha sido analizado exclusivamente en las muestras uretrales para el varón y en las
muestras endocervicales. Sus resultados no han sido evaluados en otro tipo de muestras.
58
De modo rutinario no ha quedado establecido que las muestras que contienen sangre interfieran
en los resultados del test. Sin embargo, una muestra con una concentración de sangre muy alta
(superior a 80 µl de sangre total en 1 ml de medio de transporte) puede constituir una fuente de
interferencia.
No se ha observado ninguna interferencia provocada por lubricantes ginecológicos y los
espermicidas con el test PACE 2C cuando estos productos son utilizados de forma normal. Para
información sobre productos en particular, contactar con el distribuidor Gen-Probe.
Otras sustancias endógenas pueden encontrarse presentes en las muestras de los pacientes e
interferir con el test.
Todos los métodos de identificación de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae son
susceptibles de dar resultados falsos positivos. En caso que los resultados del análisis puedan
tener un impacto psicosocial negativo, se recomienda confirmar el resultado con otro método. El
cultivo es el único método recomendado par el diagnóstico de Clamidiasis e infecciones
gonocócicas en casos médico-legales.
Como en el caso de cualquier otra enfermedad, el valor predictivo positivo de este test disminuye
al mismo tiempo que la prevalencia de la enfermedad en la población. La fiabilidad de los
resultados depende de la calidad de la toma de muestra. Dado que el sistema de transporte
utilizado para este test no permite verificar por observación en microscopio si la muestra ha sido
efectuada correctamente, se debe formar al personal en las técnicas de toma de muestras. Ver las
recomendaciones indicadas en los párrafos OBTENCION Y CONSERVACION DE LAS
MUESTRAS en esta nota.
El resultado del test no da indicación sobre el éxito y el fracaso de un tratamiento por cuanto la
presencia de ácidos nucleicos puede persistir incluso después de un tratamiento antimicrobiano
apropiado.
Un test negativo no excluye la posibilidad de una infección, por cuanto el número de C. trachomatis
y/o N. gonorrhoeae puede ser inferior al umbral de detección del test. Puede tomarse una segunda
muestra con torunda y cultivarse para confirmar el resultado. Los resultados del test pueden
además quedar afectados por una toma de muestra inadecuada, por un error técnico, por una
inversión de las muestras o por un tratamiento de antibióticos en curso.
Si un resultado PACE 2C-positivo se contradice con otros datos clínicos o con informaciones
suministradas por el paciente, o si el paciente se encuentra en una de las categorías mencionadas
en las directivas de 1993 del CDC relativas a C. trachomatis (CDC, MMWR, Vol. 42, No. RR-12,
1993), puede justificarse verificar el resultado.
GONORRHOEAE es un test de detección de C. trachomatis y/o N. gonorrhoeae. La infección
puede ser doble. Es necesario realizar tests suplementarios en las muestras PACE 2C positivas
con el fin de detectar la presencia de C. trachomatis y N. gonorrhoeae.
59
Español
GONORRHOEAE deben ser interpretados tomando en cuenta los otros datos de laboratorio y
deben correlacionarse con los datos clínicos.
VALORES ESPERADOS
DISTRIBUCION DE LOS RESULTADOS CLINICOS
A partir de los resultados obtenidos durante los ensayos clínicos del test PACE 2C, ha sido
establecida la distribución de los valores de lectura de las muestras (valores indicados en RLU) en
relación al valor umbral del test. Los datos, después de resolver los resultados discordantes,
aparecen a continuación. El número de falsos positivos (FP) y de falsos negativos (FN)
correspondientes es indicado en la parte inferior del cuadro.
FP
FN 10
13
10
2
14
11
8
7
11
RENDIMIENTOS
A.
PRECISION INTRA-ENSAYO
La precisión intra-ensayo del test PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA
GONORRHOEAE ha sido establecida estudiando cuatro concentraciones de C. trachomatis
(medidas en UFI: Inclusion Forming Units = Unidad que Forma Inclusión) y de N. gonorrhoeae, 5
veces en una misma serie. También ha sido estudiada una muestra negativa.
Muestra
Número de ensayos
Respuesta media (RLU)
Desviación típica (RLU)
Coeficiente de variación
B.
A
B
C
D
E
5
9.530
210
2,2%
5
2.075
143
6,9%
5
1.041
42
4,0%
5
767
52
6,8%
5
49
2
n/a
PRECISION INTER-ENSAYOS
La precisión inter-ensayos ha sido establecida estudiando las mismas cuatro concentraciones de
C. trachomatis (número de UFI) y de N. gonorrhoeae, y una muestra negativa durante tres series
consecutivas.
Muestra
Número de ensayos
Desviación típica (RLU)
A
B
C
D
E
3
10.147
917
9,0%
3
2.259
240
10,6%
3
968
66
6,8%
3
690
74
10,7%
3
51
4
N/A
60
C.
PRECISION DEL CONTROL POSITIVO
La precisión para los controles positivos de C. trachomatis y N. gonorrhoeae ha sido determinada
a partir de tests PACE 2C realizados en cinco sitios diferentes de Estados Unidos. Cada control
positivo ha sido estudiado una vez en cada serie.
Muestra
C. trachomatis
Control Positivo
Número de ensayos
Desviación tipo (RLU)
D.
69
1.837
329
5,6%
N. gonorrhoeae
Control negativo
69
2.165
425
5,1%
SENSIBILIDAD ANALITICA
La sensibilidad analítica (limite de detección) del test GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA
TRACHOMATIS y NEISSERIA GONORRHOEAE ha sido determinada comparando los resultados
del cultivo y del test PACE 2C en diluciones de C. trachomatis y N. gonorrhoeae que provienen de
cultivos frescos.
Siendo el umbral de positividad 300 RLU más la media de las Referencias Negativas, una
sensibilidad de 24 a 2.232 inclusiones UFI/test (0,1 ml de medio de transporte inoculado) ha sido
determinada para las 15 serovariedades de C. trachomatis, es decir, una media de 966 UFI/test.
Para N. gonorrhoeae, ha sido determinada una sensibilidad de aproximadamente 650 CFU
(Colony-Forming Units = Unidades que Forman Colonia)/test (0,1 ml de medio de transporte
inoculado).
E.
ESPECIFICIDAD ANALITICA
F.
TEST DE SOBRECARGA
Una cantidad de 0,1 µg/test de ARN ribosómico aislado de C. psittaci, Ureaplasma urealyticum, y
Neisseria meningitidis ha sido añadido a muestras que contienen diferentes concentraciones del
ARNr de C. trachomatis y/o de N. gonorrhoeae. No se ha observado ninguna interferencia en la
detección de C. trachomatis o de N. gonorrhoeae con el test GEN-PROBE PACE 2C PARA
CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA GONORRHOEAE.
61
Español
Ochenta cultivos han sido analizados con el test PACE 2C. Estas cepas incluyen 20
microorganismos susceptibles de ser aislados en el tracto urogenital y otros 30 microorganismos
que representan una intersección filogenética. Cepas de C. trachomatis (15 serovariedades), N.
gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, y 12 especies de Neisseriaceas han sido
también estudiadas. Unicamente C. trachomatis y N. gonorrhoeae han dado resultados positivos
con el sistema GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS y NEISSERIA
GONORRHOEAE.
G.
RESULTADOS DEL ENSAYO CLINICO
GONORRHOEAE ha sido comparado con los métodos tradicionales de cultivo en 1.266 muestras
endocervicales y en 849 muestras uretrales masculinas. Estos ensayos fueron realizados en cinco
sitios clínicos, utilizando un umbral neto de 300 RLU. Los datos clínicos obtenidos antes y después
de resolución de las discordancias son presentados a continuación:
1.
RESUMEN DE LOS
DISCORDANCIAS
RENDIMIENTOS
ANTES
DEL
ANALISIS
DE
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensibilidad/
Especificidad
%
9
6
219
92,5/96,1
48
8
3
313
94,1/97,5
Mujeres asintomáticas
Alta prevalencia
71
(12,1%/17,0%; 2 sitios)
6
8
221
89,9/97,4
4
1
263
92,3/98,5
17
11
208
97,1/92,4
11
2
203
92,9/94,9
28
13
411
96,8/93,6
PACE 2C
Cultivo
Pos
Pos
Pos
Neg
Población
(%CT / %NG prevalencia; N° de sitios)
Mujeres con síntomas
Alta prevalencia
74
(13,6%/16,2%; 2 sitios)
Baja prevalencia
(8,9%/7,0%; 2 sitios)
Baja prevalencia
(3,2%/1,8%; 2 sitios)
12
Varones
con síntomas
371
(11,5%/ 55,7%; 4 sitios)
asintomáticos
(6,6%/5,4%; 4 sitios)
26
Total
397
(10,1%/41,3%; 4 sitios)
62
LAS
2.
RESUMEN DE LOS RENDIMIENTOS DESPUES DEL ANALISIS DE LAS
DISCORDANCIAS
Los resultados discordantes para C. trachomatis fueron resueltos mediante
inmunofluorescencia directa, tras la puesta en cultivo. Las muestras discordantes para N.
gonorrhoeae no fueron puestos nuevamente en cultivo.
PACE 2C
Cultivo
Población
Pos
Pos
Pos
Neg
Sensibilidad/
Especificidad
%
Intervalo de
confianza a 95%
Sensibilidad/
Especificidad %
86,7-97,9 /
94,7-99,1
86,5-100,0 /
95,6-99,1
Neg
Neg
Mujeres con síntomas
Alta prevalencia 77
6
6
219
92,8/97,3
Baja prevalencia 49
7
3
313
94,2 / 97,8
Mujeres asintomáticas
Alta prevalencia 71
6
8
221
89,9 / 97,4
Baja prevalencia 13
3
1
263
92,9 / 98,9
Varones
Con síntomas
373
15
11
208
97,1 / 93,3
Asintomáticos
28
9
2
203
93,3 / 95,8
Total
401
24
13
411
96,9 / 94,5
81,0-94,9 /
94,7-99,1
71,4-100,0 /
97,4-100,0
95,3-98,7 /
89,7-96,0
83,3-100,0 /
92,5-98,1
94,9-98,3 /
92,0-96,3
De 55 muestras PACE 2C-positivas y cultivo negativas, 15 se demostraron negativas
después de ser sometidas a tests individuales PACE 2 para C. trachomatis y N. gonorrhoeae.
Fue además utilizado un test de investigación por amplificación para estudiar algunas
muestras PACE 2C falsas positivas, a pesar de que este test no aparece en el protocolo de
resolución de las discordancias descrito antes. De 40 muestras PACE 2C positivas, cultivo
negativo fueron analizadas con test de amplificación, en 26 se demostró la presencia de
ácido nucleico de C. trachomatis y en 11 la presencia de ácido nucleico de N. gonorrhoeae.
Esto prueba que la mayoría de los falsos positivos eran en realidad verdaderos positivos que
no habían sido puestos en evidencia por el cultivo. Las muestras fueron clasificadas de todos
modos como falsos positivos dado que el test de amplificación utilizado era un test de
investigación.
3.
RESUMEN DE LOS RENDIMIENTOS: MICROORGANISMOS INDIVIDUALES
La capacidad del PACE 2C para detectar individualmente C. trachomatis y N. gonorrhoeae
ha sido estudiada comparando los resultados del test PACE 2C después de resolver las
discordancias y el cultivo de cada muestra positiva; esto, para los dos microorganismos
diana. Para simplificar, las muestras doble positivas fueron incluidas tanto en los datos de C.
trachomatis y de N. gonorrhoeae. En consecuencia, el número total de muestras positivas del
cuadro que sigue se aumenta 59 veces en relación a los cuadros de los datos clínicos.
63
Español
Neg
Pos
PACE 2C
Positivos
Negativos
C. trachomatis cultivo positivo
Mujeres
Varones
N. gonorrhoeae cultivo positivo
Mujeres
Varones
109
79
12
12
132
350
6
1
64
CHLAMYDIA TRACHOMATIS E NEISSERIA GONORRHOEAE
Per la ricerca di Chlamydia trachomatis e/o di Neisseria gonorrhoeae in campioni uretrali
(nell’uomo) e in campioni endocervicali nella donna.
MODALITÀ DI IMPIEGO
Il test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE è un
test che impiega una sonda a DNA e la tecnica di ibridazione degli acidi nucleici per rilevare la
presenza di Chlamydia trachomatis e/o di Neisseria gonorrhoeae in campioni uretrali (nell’uomo) e
in campioni endocervicali nella donna. I prelievi devono essere eseguiti con il KIT DI PRELIEVO
PACE GEN-PROBE.
Occorre altresì condurre test supplementari per rilevare singolarmente C. trachomatis e N.
gonorrhoeae nei campioni positivi con il test PACE 2C.
INTRODUZIONE
Le Chlamydiae sono batteri intracellulari immobili, Gram-negativi, che si riproducono utilizzando
l’ATP prodotto dalla cellula ospite. Le infezioni da Chlamydia sono note da molto tempo. Tuttavia,
solo col tempo è stato possibile valutarne la patogenicità in maniera più precisa (23, 25). La
Chlamydia trachomatis è responsabile di circa il 50-80% delle uretriti non gonococciche (U.N.G.) (9,
10).
Per l’accertamento diagnostico della Chlamydia trachomatis nei tessuti infetti sono state utilizzate
diverse tecniche. Si va dall’osservazione dei tessuti infetti al microscopio ottico dopo colorazione
diretta di Giemsa alla coltura cellulare seguita dalla visualizzazione delle inclusioni intracellulari
mediante iodio, fluoresceina o tramite anticorpi associati ad un marker (5, 19, 26, 31).
Recentemente, però, sono state sviluppate metodiche rapide per la ricerca di antigeni e
all’ibridazione degli acidi nucleici (13, 14).
L’infezione da gonococco costituisce l’infezione batterica riscontrata con maggiore frequenza negli
Stati Uniti. Nel 1993 (4), i casi registrati in questo paese sono stati oltre 392.200. Questa malattia
a trasmissione sessuale (MTS) insorge nell’uomo, in genere, come uretrite accompagnata da
essudato purulento. Nella donna, l’infezione si localizza in genere nel collo dell’utero, ma possono
essere infettati anche la vagina e l’utero. Le infezioni spesso risultano asintomatiche. Se le infezioni
65
Italiano
La specie Chlamydia trachomatis comprende 15 sierotipi patogeni correlati a quadri clinici
differenziati: tracoma, congiuntivite da inclusi, linfogranuloma venereo e altre MTS. I sierotipi da D
a K sono la causa più frequente di infezioni genitali da Chlamydia nell’uomo e nella donna (26). Altre
manifestazioni patologiche come l’uretrite non gonococcica, l’epididimite, la proctite, la cervicite e
la salpingite acuta sono legate alla Chlamydia trachomatis (9, 24, 27). Alcune infezioni da
Chlamydia, come la polmonite interstiziale o la congiuntivite da inclusi (1, 7, 28) rientrano a pieno
titolo non soltanto fra le MTS, ma anche fra le infezioni connatali.
non vengono curate possono condurre a gravi complicazioni e portare addirittura alla sterilità. Le
infezioni da gonococco possono essere diagnosticate anche a partire da altre mucose, in
particolare la congiuntiva, l’ano e l’orofaringe (17).
Neisseria gonorrhoeae è l’agente responsabile delle infezioni da gonococco; si tratta di un
diplococco Gram-negativo, ossidasi-positivo, la cui crescita richiede specifiche condizioni (8, 12,
29). La diagnosi presuntiva si basa sull’isolamento del microrganismo mediante coltura, esame
microscopico previa colorazione di Gram e presenza della citocromo ossidasi (8, 12). La rilevazione
tramite anticorpi fluorescenti, lo studio della degradazione degli idrati di carbonio e della
fermentazione degli zuccheri ed i test di agglutinazione permettono di confermare la diagnosi di una
infezione da gonococco (6, 11, 16, 18, 22, 30). Più recentemente, è stata impiegata la tecnica di
ibridazione degli acidi nucleici per la diagnosi delle infezioni gonococciche a partire direttamente dai
campioni clinici (21).
Il test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS E NEISSERIA GONORRHOEAE si
avvale della tecnica dell’ibridazione degli acidi nucleici (15) per rilevare direttamente la presenza di
Chlamydia trachomatis e/o di Neisseria gonorrhoeae a partire da un prelievo uretrale nell’uomo o
da un prelievo endocervicale. Il test non consente la differenziazione fra i due microrganismi, ma
indica se il campione ne contiene uno od entrambi.
princIpio operativo
I test di ibridazione degli acidi nucleici sfruttano la capacità dei filamenti complementari di acidi
nucleici di accoppiarsi in maniera specifica per formare composti stabili a doppia catena (15). Il
sistema GEN-PROBE PACE 2C impiega delle sonde a DNA a catena singola - associate ad un
marker chemioluminescente - complementare all’RNA ribosomiale (rRNA) degli organismi
bersaglio. Una volta liberato l’rRNA degli organismi bersaglio, la sonda si combina con le sue
sequenze omologhe formando un complesso DNA-RNA stabile. Successivamente, le sonde
ibridate vengono separate da quelle non ibridate. Il luminometro GEN-PROBE LEADER permette
di misurare il segnale luminoso emesso dagli ibridi DNA-RNA. Il risultato si evince dalla differenza
tra il valore misurato per il campione e la media dei valori misurati per le referenze negative.
REAGENTI
Test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE
Tampone di Ibridazione PACE 2 (Soluzione tampone) (HB) contenente < 20% di detergente.
Reagente Sonda PACE 2C Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae (P) Sonda DNA
marcata, liofilizzata (< 500 mg/flacone).
Reagente di Selezione PACE 2 (Soluzione tampone) (S) contenente < 8% di detergente.
Reagente di Separazione MST PACE 2 (SR) fase solida (1,25 mg/ml) in una soluzione
contenente 0,02% di sodio azide (conservante).
Referenze Negative MST PACE 2 (NR) Acido nucleico non infettante in una soluzione
tampone contenente < 5% di detergente.
Controllo Positivo Chlamydia trachomatis (PCT) Acido nucleico non infettante di C.
trachomatis in una soluzione tampone contenente < 5% di detergente.
Controllo Positivo Neisseria gonorrhoeae (PGC) Acido nucleico non infettante di N.
gonorrhoeae in una soluzione tampone contenente < 5% di detergente.
Soluzione di Lavaggio MST PACE 2 (Soluzione tampone) (W) contenente < 2% di detergente.
Sigilli (fogli autoadesivi). 1 pacchetto.
66
KIT REAGENTI DI RILEVAZIONE GEN-PROBE (forniti a parte)
Reagente di Rilevazione I (RI) 0,1% di acqua ossigenata in una soluzione di acido nitrico 0,001
N.
Reagente di Rilevazione Il (RII) idrossido di sodio 1N.
PRECAUZIONI D’USO
A.
Il test è riservato esclusivamente ad un uso diagnostico in vitro.
B.
Questo test è stato valutato unicamente su campioni endocervicali nella donna, uretrali
(nell’uomo). Le performance del test su altri tipi di campioni non sono state valutate.
C.
Il Reagente di Separazione NON DEVE essere congelato. Una cattiva conservazione di
questo reagente può compromettere le performance del test. La congelazione del reagente
provoca flocculazione delle particelle in sospensione. L’aspetto granuloso permane anche
dopo agitazione della soluzione. I granuli del Reagente di Separazione possono aderire alle
pareti della provetta. In tal caso, contattare il distributore Gen-Probe.
D.
Per la preparazione dei reagenti, usare materiale di laboratorio disinfettato. Si raccomanda di
utilizzare recipienti in polistirolo.
E.
Adottare le normali precauzioni. Non pipettare con la bocca. Evitare di mangiare, bere o
fumare. Durante le manipolazioni, indossare guanti monouso e camici. Lavarsi
accuratamente le mani dopo aver manipolato i campioni e i reagenti.
F.
Alcuni prodotti possono essere infettanti. Adottare le precauzioni necessarie per la
realizzazione di qualsiasi tecnica di biologia molecolare. È compito del direttore di laboratorio
stabilire procedure specifiche per la manipolazione e lo smaltimento di tali prodotti. Questo
tipo di procedure diagnostiche dovrà essere eseguito esclusivamente da persone esperte
nella manipolazione di materiale infettante.
1.
2.
Detergere accuratamente e disinfettare tutte le superfici di lavoro.
Autoclavare tutto il materiale contaminato prima di gettarlo.
Il Reagente di Separazione contiene sodio azide, una sostanza che può reagire con il piombo
o il rame delle tubature e formare composti esplosivi. Durante lo smaltimento di tali reagenti,
ricordarsi di utilizzare sempre acqua in abbondanza per evitare la formazione di tali composti
all’interno delle tubature.
H.
Evitare qualsiasi contatto della cute, degli occhi o delle mucose con i Reagenti di Rivelazione
l e ll. ATTENZIONE: PRODOTTO CORROSIVO. In caso di contatto, lavare con acqua. Se si
verificassero versamenti, diluirli con acqua prima di asciugare.
I.
Fare attenzione a non scambiare né mescolare casualmente reagenti provenienti da kit
diversi, con l’eccezione della soluzione di lavaggio MST.
CONSERVAZIONE
Il Reagente Sonda PACE 2C e il Reagente di Separazione PACE 2 devono essere conservati a
temperature comprese tra 2° - 8°C.
Dopo ricostituzione il Reagente Sonda PACE 2C conservato a temperatura compresa tra 2° e 8°C,
rimane stabile per 3 settimane.
La Soluzione di Separazione ricostituita rimane stabile per 6 ore a temperatura ambiente
(20° - 25°C).
67
Italiano
G.
Tutti gli altri reagenti contenuti nel kit PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE si conservano ad una temperatura compresa fra 2° e 25°C e rimangono stabili
fino alla data di scadenza.
NON CONGELARE I REAGENTI CONTENUTI IN QUESTO KIT.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il test GEN-PROBE PACE 2C PER CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE
rileva la presenza di C. trachomatis e/o di N. gonorrhoeae in campioni uretrali (nell’uomo) e in
campioni endocervicali nella donna prelevati tramite il KIT DI PRELIEVO PACE GEN-PROBE.
Per i prelievi utilizzare esclusivamente i tamponi contenuti nel KIT PACE. Trasportare i campioni in
laboratorio utilizzando il terreno di trasporto GEN-PROBE.
A.
Per il prelievo dei campioni procedere come segue:
1.
Campioni endocervicali prelevati tramite tampone
a.
b.
c.
d.
e.
f.
2.
Pulire il collo dell’utero con uno dei due tamponi forniti e gettarlo.
Introdurre il secondo tampone all’interno del canale endocervicale.
Per consentire il prelievo cellulare, ruotare per 10 - 30 secondi.
Estrarre delicatamente il tampone ed evitare qualsiasi contatto con la mucosa
vaginale.
Riporre il tampone nella provetta da trasferimento GEN-PROBE.
Rompere il tampone a livello della tacca e chiudere ermeticamente la provetta.
Campioni uretrali (nell’uomo) prelevati mediante tampone
a.
b.
c.
d.
e.
f.
L’ultima minzione del paziente deve risalire ad almeno un’ora prima del prelievo.
Introdurre il tampone all’interno del canale uretrale per 2 - 4 cm ruotando
delicatamente per facilitarne la penetrazione.
Una volta introdotto il tampone, ruotare delicatamente per 2 - 3 secondi,
esercitando una pressione sufficiente a toccare tutta la superficie dell’uretra.
Estrarre il tampone.
Riporre il tampone nella provetta da trasferimento GEN-PROBE.
Rompere il tampone a livello della tacca e chiudere ermeticamente la provetta.
B.
Trasportare le provette in laboratorio mantenendole ad una temperatura compresa tra 2 e
25 °C e conservarle alla stessa temperatura fino all'analisi dei campioni. I campioni devono
essere analizzati entro 7 giorni dal prelievo con il kit GEN-PROBE PACE 2C. Qualora sia
necessaria una conservazione più lunga, trattare il campione come descritto nel paragrafo
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI e congelarlo a una temperatura compresa tra -20 e -70 °C
fino a 90 giorni dopo il suo prelievo.
C.
Non è stato stabilito se, in genere, la presenza di sangue nei campioni possa influire sulle
performance del test. È possibile, tuttavia, che una forte concentrazione di sangue in un
campione (superiore a 80 µl di sangue totale in 1 ml di terreno di trasporto) possa
pregiudicare l’attendibilità del test.
D.
La manipolazione dei campioni deve essere effettuata conformemente alle normative vigenti.
Conservare e analizzare i campioni come descritto (vedere il paragrafo B, sopra indicato).
68
MATERIALE COMPRESO NEL KIT
Test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE
100 test
Tampone di Ibridazione PACE 2 (HB)
2 x 6 ml
Reagente Sonda PACE 2C
Chlamydia trachomatis / Neisseria gonorrhoeae (P) 2 x 6 ml
(dopo ricostituzione)
Reagente di Selezione PACE 2 (S)
1 x 100 ml
Reagente di Separazione MST PACE 2 (SR)
1 x 9 ml
Referenza Negativa MST PACE 2 (NR)
1 x 7 ml
Controllo Positivo PACE 2
Chlamydia trachomatis (PCT)
1 x 3 ml
Controllo Positivo PACE 2
Neisseria gonorrhoeae (PGC)
1 x 3 ml
Soluzione di Lavaggio MST PACE 2 (W)
3 x 200 ml
Sigilli (fogli autoadesivi)
1 pacchetto
Provette di reazione GEN-PROBE monouso
in polistirolo (12 x 75 mm)
(Conf. da 120)
MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO NEL KIT
Vortex
Bagnomaria coperto (60° ± 1°C)
Micropipette (100 µl)
Pipette con erogazione da 1 a 25 ml
Fogli assorbenti
PROCEDIMENTO
A.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
1.
2.
3.
4.
Portare i campioni a temperatura ambiente prima di sottoporli al test.
Agitare con un Vortex ogni provetta di trasporto GEN-PROBE per almeno 5 secondi.
Eliminare il liquido in eccesso sul tampone premendolo contro le pareti della provetta.
Gettare il tampone.
Prima di cominciare il test, agitare con un Vortex nuovamente la provetta di trasporto
per almeno 5 secondi per garantire così l’omogeneità del campione.
69
Italiano
MATERIALE DISPONIBILE PRESSO IL VOSTRO DISTRIBUTORE GEN-PROBE
Kit di prelievo GEN-PROBE PACE
Uretrale/conjiuntivale:
(bioMérieux cod. 39309 / Gen-Probe Cat. N. 3275) (Conf. da 50)
Cervicale:
(bioMérieux cod. 39301 / Gen-Probe Cat. N. 3300) (Conf. da 50))
Kit di Reagenti di Rilevazione GEN-PROBE (1200 test)
Portaprovette magnetico
Luminometro GEN-PROBE LEADER 50i
(bioMérieux cod. 39400 / Gen-Probe Cat. N. 3100i)
Kit di reagenti GEN-PROBE FAST EXPRESS
B.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
1.
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell’uso FATTA ECCEZIONE per
il Reagente Sonda e per il Reagente di Separazione. Il Reagente Sonda e il Reagente
di Separazione devono essere conservati a una temperatura compresa tra 2° e 8°C fino
al momento del loro impiego.
2.
Reagente Sonda
Agitare con un Vortex il tampone di Ibridazione per 10 secondi e riporlo nel bagnomaria
a una temperatura di 60° ± 1°C mescolando delicatamente per 3-4 minuti. Agitare con
un Vortex per 10 secondi per ottenere una perfetta omogeneizzazione. Con l’aiuto di
una pipetta, far defluire 6 ml del tampone di Ibridazione nel Reagente Sonda PACE 2C
C. TRACHOMATIS e N. GONORRHOEAE liofilizzato (Reagente Sonda PACE 2C).
Lasciare riposare 2 minuti a temperatura ambiente, poi agitare con un Vortex per 10
secondi prima dell’uso. Accertarsi visivamente che il reagente sia completamente
reidratato e omogeneizzato. Annotare sull’etichetta la data di ricostituzione. Se
conservato ad una temperatura compresa fra 2° e 8°C il Reagente Sonda PACE 2C così
ricostituito rimane stabile per 3 settimane (entro i limiti della data di scadenza).Qualora
il reagente ricostituito sia stato refrigerato, agitarlo con un Vortex per 10 secondi,
riscaldarlo immergendo il flacone a bagnomaria ad una temperatura di 60° ± 1°C e
mescolare delicatamente per 2 minuti. Prima dell’uso, omogeneizzarlo agitandolo con
un Vortex per 10 secondi. Qualora il reagente non sia perfettamente omogeneo, ripetere
l’operazione.
3.
Soluzione di Separazione
Stabilire il numero di test da effettuare. Per calcolare il volume dei reagenti di Selezione
e di Separazione, attenersi alle seguenti istruzioni:
Volume di Reagente di Selezione (ml) Numero di test + 2 test supplementari
(con micropipetta a volume fisso Eppendorf)
= Numero di test + 10 test supplementari
(con erogazione automatica)
Volume del Reagente di Separazione (ml)
= Volume di Reagente di Separazione (ml)
20
Versare la quantità necessaria di Reagente di Selezione in un recipiente asciutto e
pulito. Agitare il Reagente di Separazione e aggiungere la quantità necessaria al
Reagente di Selezione; agitare nuovamente. Questa Soluzione di Separazione
ricostituita si conserva a temperatura ambiente e rimane stabile per 6 ore.
Preparazione della Soluzione di Separazione
(Esempio)
8 test + 2 test = 10 test
Numero
di test
8
18
48
98
C.
+
+
+
+
2
2
2
2
Reagente
di Selezione
10
20
50
100
ml
ml
ml
ml
IBRIDAZIONE
70
Reagente
di Separazione
0,5
1,0
2,5
5,0
ml
ml
ml
ml
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
D.
PREPARAZIONE DEL MATERIALE
1.
E.
Identificare le provette indicando il numero del campione corrispondente. Aggiungere 3
provette per le Referenze Negative e una provetta per il Controllo Positivo C.
trachomatis e una provetta per il Controllo Positivo N. gonorrhoeae. Scrivere
esclusivamente sulla parte superiore della provetta. Le referenze ed i controlli devono
essere testati con ogni serie di campioni.
Inserire le provette nel portaprovette magnetico GEN-PROBE. Riporre il supporto
magnetico per il successivo impiego.
Agitare con un Vortex ciascun campione per 5 secondi.
Dispensare 100 µl di ogni campione/controllo sul fondo della rispettiva provetta.
Depositare 100 µl di Reagente Sonda PACE 2C SUL FONDO di ciascuna provetta,
facendo attenzione a non toccare né il bordo né le pareti della provetta.
Coprire le provette con i sigilli e assicurarsi che siano ben chiuse.
Agitare il portaprovette (da 3 a 5 volte) per mescolare.
Incubare le provette nel bagnomaria ad una temperatura di 60° ± 1°C per un’ora. NON
mettere il supporto del portaprovette magnetico nel bagnomaria.
Preparare il luminometro LEADER GEN-PROBE. Assicurarsi che la quantità di
Reagenti di Rilevazione I e II sia sufficiente per effettuare i test.
SEPARAZIONE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
71
Italiano
10.
Togliere il portaprovette dal bagnomaria e rimuovere i sigilli.
Inserire in ogni provetta 1 ml di Soluzione di Separazione ben omogeneizzata.
Coprire le provette e mescolare agitando vigorosamente il portaprovette (da 3 a 5 volte).
Incubare le provette nel bagnomaria ad una temperatura di 60° ± 1°C per 10 minuti.
Togliere il portaprovette dal bagnomaria. Rimuovere i sigilli. Riporre il portaprovette sul
supporto magnetico per 5 minuti a temperatura ambiente.
Mantenendo il portaprovette sul supporto magnetico GEN-PROBE, lasciar decantare le
parti in sospensione capovolgendo il portaprovette. Agitare il portaprovette, poi
sgocciolare per 5 secondi le provette su fogli assorbenti prima di riporre il portaprovette
(ripetere 3 volte).
SENZA RIMUOVERE IL PORTAPROVETTE DAL SUPPORTO MAGNETICO GENPROBE, riempire ogni provetta con Soluzione di Lavaggio fino al limite superiore
(Vedere il paragrafo OSSERVAZIONI).
Lasciare le provette sul supporto magnetico per 20 minuti a temperatura ambiente.
Capovolgendo il portaprovette sul supporto magnetico, far decantare le particelle in
sospensione prima di rigirare i tubi, agitare 2 o 3 volte. NON SGOCCIOLARE LE
PROVETTE SU FOGLI ASSORBENTI. Sul fondo delle provette devono rimanere da 50
a 100 µl circa di Soluzione di Lavaggio.
Staccare il portaprovette dal supporto magnetico e agitarlo per riportare il fondo in
sospensione.
F.
LETTURA
1.
2.
Selezionare il protocollo giusto sul luminometro LEADER.
Per eliminare completamente i residui dalla superficie delle provette, asciugarle
utilizzando un foglio assorbente inumidito. Verificare che i fondi siano in sospensione e
inserire le provette nel luminometro LEADER attenendosi alla targhetta istruzioni.
Procedere alla lettura delle provette nel seguente ordine:
Referenze negative, 3 provette
Controllo positivo C. trachomatis, 1 provetta
Controllo positivo N. gonorrhoeae, 1 provetta
Provette che contengono i campioni clinici
3.
Una volta terminata l’analisi, estrarre le provette dal lettore.
OSSERVAZIONI
A.
TAMPONE DI IBRIDAZIONE PACE 2:: Per evitare la formazione di precipitato e garantire
l’omogeneità della soluzione è fondamentale riscaldare a 60° ±1°C il Tampone di Ibridazione
PACE 2 e il Reagente Sonda ricostituito PACE 2C.
B.
CAMPIONI: Alcuni campioni possono presentare un grado di viscosità tale da impedire il
prelevamento con le pipette. Accertarsi che i campioni siano a temperatura ambiente e, se
necessario, fluidificarli agitandoli con un Vortex. È possibile utilizzare il reagente GENPROBE FAST EXPRESS per agevolare la preparazione dei campioni. Contattare il vostro
distributore GEN-PROBE per informazioni.
C.
USO DELLE PIPETTE: Per maggiore comodità, è possibile usare le stesse pipette o
distributori per aggiungere il Reagente Sonda, la Soluzione di Separazione o la Soluzione di
Lavaggio. Per il prelievo dei campioni o dei controlli, si consiglia l’uso di pipette con puntale
monouso per evitare contaminazioni tra provette. Assicurarsi che il Reagente Sonda PACE
2C si depositi SUL FONDO delle provette, senza inserire il puntale all’interno delle provette e
senza toccarne i bordi. Per evitare fuoriuscite, orientare i reagenti in direzione della parete
delle provette e non verso il fondo delle stesse.
D.
SGOCCIOLATURA DELLE PROVETTE: Cambiare il foglio assorbente dopo ogni
sgocciolatura per evitare contaminazioni. NON SGOCCIOLARE DOPO LA FASE DI
LAVAGGIO.
E.
TEMPERATURA: Le reazioni di ibridazione e di separazione sono reazioni temperaturadipendenti. Di conseguenza, è indispensabile che il bagnomaria e le provette rimangano a
temperatura costante durante queste fasi. Utilizzare un bagnomaria coperto in grado di
mantenere una temperatura di 60° ± 1°C.
F.
LAVAGGIO: Dispensare energicamente la Soluzione di Lavaggio in ciascuna provetta.
Orientare la pipetta verso la parete della provetta e non verso il fondo, per evitare fuoriuscite.
Se la Soluzione di Lavaggio è stata iniettata con sufficiente energia, si formerà una schiuma
di 1 cm di altezza. Riempire quindi ciascuna provetta con la Soluzione di Lavaggio finché la
schiuma non scompare. Una fase di Lavaggio non corretta potrebbe compromettere i risultati
del test.
G.
FLACONE CON EROGATORE AUTOMATICO: Si tratta di un metodo opzionale per
dispensare la Soluzione di Lavaggio. Spetterà ai singoli laboratori convalidare tale metodo
sulla base delle tecniche in uso. Prima di usare l’erogatore, trasferire la Soluzione di Lavaggio
nel flacone. Avvitare il coperchio. Iniziare l’erogazione ed eliminare i primi 5 millilitri.
H.
Come in tutti i metodi in cui vengono impiegati reagenti, l’eccesso di polvere sui guanti può
causare la loro contaminazione e quella delle provette di reazione aperte. GEN-PROBE
72
raccomanda di evitare l’uso di questo tipo di guanti da laboratorio agli addetti che possano
incontrare difficoltà durante il test. Si consiglia di usare guanti senza talco.
I.
LETTURA: leggere le provette nel luminometro LEADER entro un’ora dal lavaggio. Prima
della lettura, conservare le provette ad una temperatura tra 20° e 25°C.
RISULTATI
A.
CALCOLO DEI RISULTATI
I risultati del test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE si ottengono come differenza in RLU (Relative Light Units) tra il valore di lettura
dei campioni e la media delle tre referenze negative.
Media delle referenze negative = somma delle referenze negative, divisa per 3.
Esempio:
Media delle referenze negative =
(65 RLU + 71 RLU + 80 RLU) = 72 RLU
3
Limite determinato = 300 RLU
Limite calcolato = 300 RLU + 72 RLU = 372 RLU
Valore di lettura di un campione = 900 RLU POSITIVO
Il luminometro LEADER stampa il valore di lettura del campione e lo confronta con il valore di soglia
del test. La positività o la negatività sono valutate in rapporto a tale soglia e vengono stampate dal
luminometro LEADER. Consultare il manuale d’uso del luminometro LEADER per ulteriori
informazioni sul protocollo di lettura.
B.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
GONORRHOEAE devono essere interpretati considerando altri dati del laboratorio e correlati ai dati
clinici.
CONTROLLO POSITIVO - La differenza tra il valore di lettura del controllo positivo e il valore medio
delle referenze negative deve essere superiore o uguale a 300 RLU.
CONTROLLO NEGATIVO - La differenza tra il valore di lettura del controllo negativo e il valore
medio delle referenze negative deve essere inferiore a 300 RLU.
Se i singoli test sono negativi, il risultato è equivoco e deve essere eseguito un altro prelievo.
Un risultato negativo indica l’assenza di rRNA di Chlamydia trachomatis o di rRNA di Neisseria
gonorrhoeae nel campione.
C.
CONTROLLO DI QUALITÀ E ACCETTABILITÀ DEI RISULTATI
NOTA: Le referenze negative e il Controllo Positivo forniti consentono l’esclusivo controllo del test
PACE 2C. Non consentono di controllare la lisi del microrganismo target nel terreno di trasporto del
campione.
73
Italiano
Un risultato positivo indica la presenza di rRNA di Chlamydia trachomatis e/o di Neisseria
gonorrhoeae nel campione testato. Successivamente, occorrerà condurre test supplementari per
rilevare singolarmente C. trachomatis e N. gonorrhoeae.
Referenze negative:
Le referenze negative consentono di misurare il rumore di fondo del test e vengono impiegato per
calcolare il limite di positività della serie. I valori attesi delle referenze negative sono stati calcolati
eseguendo 69 serie di test (3 test/serie) su cinque laboratori diversi negli Stati Uniti.
Il valore di lettura per ogniuna delle referenze negative deve essere inferiore a 200 RLU. Tutti i valori
delle referenze negative devono essere compresi in un intervallo del 30% attorno al valore medio
delle referenze negative (la deviazione standard deve essere inferiore al 30%). Qualora una delle
referenze negative risultasse inferiore a tale intervallo, è possibile escluderne il valore dal calcolo;
seguire quindi le indicazioni riportate nel manuale d’uso del luminometro LEADER. Qualora si
dovessero rilevare due valori inferiori a tale intervallo, ripetere il test. Se il problema persiste,
rivedere la tecnica utilizzata e contattare il distributore Gen-Probe.
Controllo Positivo:
I valori attesi di ogni Controllo Positivo sono stati calcolati conducendo 69 serie di test su cinque siti
diversi negli Stati Uniti.
Per conseguire la validità della serie, la differenza tra il valore di lettura di ogni Controllo Positivo e
il valore medio delle referenze negative deve essere superiore a 600 RLU e inferiore a 3.200 RLU.
Qualora il valore del Controllo Positivo risulti più volte inferiore a tale valore, contattare il distributore
Gen-Probe. I risultati del test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE devono essere interpretati considerando altri dati del laboratorio e correlati ai dati
clinici.
Qualora i valori del Controllo Positivo e delle referenze negative non rientrassero nell’intervallo
richiesto, i risultati del test non devono essere convalidati.
Ogni laboratorio deve sistematicamente determinare i propri valori ed intervalli per le referenze
negative e il Controllo Positivo ed archiviarli conformemente alle buone pratiche di laboratorio (2, 20).
Controlli di trattamento dei campioni:
Per testare l’efficacia del trattamento del campione, alcuni controlli cellulari positivi e negativi
possono essere sottoposti al test in parallelo con i campioni. I ceppi C. trachomatis ATCC VR878 e
N. gonorrhoeae ATCC 19424 possono essere usati come controlli positivi e il ceppo N. mucosa
ATCC 19696 come controllo negativo.
Per i ceppi di Neisseria, usare colture in accrescimento e preparare sospensioni di circa 3 X 108
CFU/ml in siero fisiologico sterile. Dispensare 10 µl di ogni sospensione cellulare in una provetta di
trasporto del KIT DI PRELIEVO PACE GEN-PROBE (endocervicale o uretrale/congiuntivale) e
agitare con un Vortex.
Per i ceppi di Chlamydia, usare i corpi elementari raccolti a partire da colture cellulari e preparare
una soluzione con titolazione di circa 3 X 108 IFU/ml. Dispensare 10 µl di ogni sospensione in una
provetta di trasporto del KIT DI PRELIEVO PACE GEN-PROBE (endocervicale o
uretrale/congiuntivale) e agitare con un Vortex. Trattare i controlli allo stesso modo dei campioni,
cominciando dalla tappa C1 del procedimento. I controlli cellulari positivi devono evidenziare dei
risultati positivi ed i controlli cellulari negativi dei risultati negativi.
LIMITI DEL TEST
Questo metodo è stato sperimentato soltanto su campioni endocervicali nella donna, uretrali
(nell’uomo). Le sue performance non sono state valutate su altri campioni.
Non è stato stabilito se, in genere, la presenza di sangue nei campioni possa influire sulle
performance del test. È possibile, tuttavia, che una forte concentrazione di sangue in un campione
(superiore a 80 µl di sangue totale in 1 ml di terreno di trasporto) possa pregiudicare l’attendibilità
del test.
74
Non è stata osservata alcuna interferenza con i lubrificanti ginecologici o gli spermicidi usati
normalmente. Per informazioni su prodotti particolari, contattare il distributore Gen-Probe.
Possono essere presenti altre sostanze endogene nei campioni ed interferire con il test.
Tutti i metodi di identificazione della Chlamydia trachomatis e della Neisseria gonorrhoeae possono
fornire risultati falso-positivi (FP). Nel caso in cui il risultato dell’analisi possa avere un impatto
psicosociale negativo, si consiglia di utilizzare un altro metodo a conferma del risultato. La ricerca
colturale è l’unico metodo raccomandato per diagnosticare una infezione da Chlamydia o per le
applicazioni medico-legali.
Come per qualsiasi altra malattia, il valore predittivo positivo di questo test decresce con il diminuire
dell’incidenza nella popolazione. L’attendibilità dei risultati dipende dalla qualità del prelievo. Il
sistema di trasporto impiegato per questo test non permette di verificare mediante l’osservazione al
microscopio del campione se il prelievo sia stato correttamente eseguito e quindi occorre formare
il personale alle tecniche di prelievo. Leggere le raccomandazioni indicate nei paragrafi PRELIEVO
DEI CAMPIONI e CONSERVAZIONE di questo prospetto.
Il risultato del test non fornisce indicazioni sul successo od il fallimento di una terapia in quanto la
presenza di acidi nucleici può persistere anche dopo una terapia anti-microbica adeguata.
GONORRHOEAE devono essere interpretati tenendo conto degli altri dati del laboratorio ed essere
correlati ai dati clinici.
Un test negativo non esclude la possibilità di un’infezione poiché il numero di C. trachomatis e/o di
N. gonorrhoeae può essere inferiore al limite di rilevazione del test. Un secondo campione può
essere prelevato mediante tampone e coltivato per confermare il risultato. I risultati del test possono
essere pregiudicati da un cattivo prelievo, da un errore tecnico, da un’inversione dei campioni o da
un trattamento antibiotico in corso.
Se un risultato PACE 2C positivo è in contraddizione con altri dati clinici o informazioni fornite dal
paziente, o se il paziente appartiene ad una categoria menzionata nelle direttive del 1993 dal CDC
relativamente alla C. trachomatis (CDC, MMWR, Vol. 42, N° RR 12, 1993) la verifica del risultato
può essere giustificata.
Il test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE è un
test di rilevazione della C. trachomatis e/o della N. gonorrhoeae. L’infezione può essere duplice e
quindi occorre condurre ulteriori test sui campioni PACE 2C positivi allo scopo di rilevare
singolarmente la presenza di C, trachomatis e N. gonorrhoeae.
Italiano
75
VALORI ATTESI
DISTRIBUZIONE DEI RISULTATI CLINICI
A partire dai risultati ottenuti nelle prove cliniche del test PACE 2C, è stata stabilita la distribuzione
dei valori di lettura dei campioni (valori indicati in RLU) rispetto al valore limite del test. I dati, dopo
risoluzione dei risultati discordanti, vengono di seguito indicati. Il numero dei rispettivi falso-positivi
(FP) e falso-negativi (FN) viene indicato nella parte sottostante del quadro.
FP
FN
13
10
10
2
14
11
8
7
11
PERFORMANCE
A.
PRECISIONE INTRA-TEST
La precisione intra-test del test PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE è stata stabilita analizzando quattro concentrazioni di C. trachomatis (misurata in
IFU: Inclusion-forming Units) e di N. gonorrhoeae per 5 volte in una stessa serie. È stato anche
analizzato un campione negativo.
Campione
Numero di test
Risposta media (RLU)
Deviazione standard (RLU)
Coefficiente di variazione
B.
A
B
C
D
E
5
9.530
210
2,2%
5
2.075
143
6,9%
5
1.041
42
4,0%
5
767
52
6,8%
5
49
2
n/a
PRECISIONE INTRA-TEST
La precisione intra-test è stata stabilita analizzando le stesse quattro concentrazioni di C.
trachomatis (numero di IFU) e di N. gonorrhoeae ed un campione negativo durante tre serie di
seguito.
Campione
A
B
C
D
E
Numero di test
3
10.147
917
9,0%
3
2.259
240
10,6%
3
968
66
6,8%
3
690
74
10,7%
3
51
4
n/a
76
C.
PRECISIONE DEL CONTROLLO POSITIVO
La precisione per i controlli positivi di C. trachomatis e N. gonorrhoeae è stata determinata a partire
da test PACE 2C condotti su cinque centri diversi negli Stati Uniti. Ogni controllo positivo è stato
testato una volta in ogni serie.
Campione
Controllo positivo
Controllo negativo
C. trachomatis
N. gonorrhoeae
Numero di test
69
69
1.837
2.165
329
425
5,6%
5,1%
D.
SENSIBILITÀ ANALITICA
La sensibilità analitica (limite di rilevazione) del test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA
TRACHOMATIS è stata determinata analizzando comparativamente i risultati della coltura e del test
PACE 2C su diluizioni di C. trachomatis e di N. gonorrhoeae provenienti da colture fresche.
La sensibilità osservata variava da 24 a 2.232 IFU (Inclusion-forming Units) per i 15 sierotipi di C.
trachomatis con una soglia di positività di 300 RLU più la media delle referenze negative. Si tratta
di una media di 966 IFU/test. Per N. gonorrhoeae è stata determinata una sensibilità di circa 650
CFU/test (0,1 ml di terreno di trasporto inoculato).
E.
SPECIFICITÀ ANALITICA
Un totale di ottanta colture è stato analizzato con il test PACE 2C. Queste colture comprendevano
20 microrganismi suscettibili di isolamento nel tratto urogenitale ed un panel filogenetico di altri 30
microrganismi. Sono stati inoltre analizzati sierotipi diversi di C. trachomatis (15), N. gonorrhoeae,
Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, e 12 specie di Neisseriaceae. Soltanto i sierotipi di C.
trachomatis e N. gonorrhoeae sono risultati positivi con il sistema GEN-PROBE PACE 2C PER
CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE.
F.
TEST DI SOVRACCARICO
A campioni contenenti diverse concentrazioni di rRNA di C. trachomatis e/o di N. gonorrhoeae è
stata aggiunta una quantità di 0,1 µg/test di RNA ribosomiale isolato da C. psittaci, Ureaplasma
urealyticum, e Neisseria meningitidis. Non è stata rilevata alcuna interferenza sulla ricerca di C.
trachomatis o di N. gonorrhoeae con il test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS
e NEISSERIA GONORRHOEAE.
Italiano
77
G.
RISULTATI DEL TEST CLINICO
Il test GEN-PROBE PACE 2C CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE è
stato raffrontato con le metodiche tradizionali di coltura su 1.266 campioni endocervicali e 849
campioni uretrali nell’uomo. Questi test sono stati condotti su cinque centri impiegando una soglia
netta di 300 RLU. I dati clinici ottenuti prima e dopo la risoluzione delle discordanze vengono di
seguito presentati:
1.
RIASSUNTO DELLE PERFORMANCE PRIMA DELL’ANALISI DELLE
DISCORDANZE
PACE 2C
Coltura
Pos
Pos
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensibilità/
Specificità
%
9
6
219
92,5/96,1
8
3
313
94,1/97,5
6
8
221
89,9/97,4
4
1
263
92,3/98,5
17
11
208
97,1/92,4
Pos
Neg
Popolazione
(% CT / % NG prevalenza; N. di siti)
Popolazione femminile
sintomatica
Elevata prevalenza
74
(13,6%/16,2%; 2 siti)
Debole prevalenza
(8,9%/7,0%; 2 siti)
48
asintomatica
Elevata prevalenza
71
(12,1%/17,0%; 2 siti)
Debole prevalenza
(3,2%/1,8%; 2 siti)
12
Popolazione maschile
sintomatica
371
(11,5%/ 55,7%; 4 siti)
asintomatica
(6,6%/5,4%; 4 siti)
26
11
2
203
92,9/94,9
Totale
(10,1%/41,3%; 4 siti)
397
28
13
411
96,8/93,6
78
2.
RIASSUNTO DELLE PERFORMANCE DOPO ANALISI DELLE DISCORDANZE
I risultati discordanti per C. trachomatis sono stati risolti mediante immunofluorescenza
diretta dopo rimessa in coltura. I campioni discordanti per N. gonorrhoeae non sono stati
rimessi in coltura.
Intervallo di
Sensibilità/
confidenza al
PACE 2C
Pos
Pos
Neg
Neg
Specificità
95%
Pos
Neg
Pos
Neg
%
Sensibilità/
Coltura
Specificità %
Popolazione
sintomatica
Elevata
prevalenza
77
6
6
219
92,8/97,3
86,7-97,9 /
94,7-99,1
Debole
prevalenza
7
3
313
94,2 / 97,8
86,5-100,0 /
95,6-99,1
asintomatica
Elevata
prevalenza
71
6
8
221
89,9 / 97,4
81,0-94,9 /
94,7-99,1
Debole
prevalenza
13
3
1
263
92,9 / 98,9
71,4-100,0 /
97,4-100,0
Popolazione
maschile
Sintomatica
373
15
11
208
97,1 / 93,3
Asintomatica
28
9
2
203
93,3 / 95,8
Totale
401
24
13
411
96,9 / 94,5
95,3-98,7 /
89,7-96,0
83,3-100,0 /
92,5-98,1
94,9-98,3 /
92,0-96,3
49
3.
RIASSUNTO DELLE PERFORMANCE: MICRORGANISMI SINGOLI
La capacità del PACE 2C relativa alla singola rilevazione della C. trachomatis e della N.
gonorrhoeae è stata valutata confrontando i risultati del test PACE 2C dopo risoluzione delle
discordanze e la coltura per campioni positivi. Questo è stato fatto per entrambi i
79
Italiano
Sui 55 campioni PACE 2C positivi, coltura negativi, 15 sono risultati negativi dopo essere stati
sottoposti a singoli test PACE 2 per C. trachomatis e N. gonorrhoeae. È stato anche impiegato
un test di ricerca mediante amplificazione per testare alcuni campioni PACE 2C falso-positivi,
anche se questo test non è compreso nel protocollo di risoluzione delle discordanze di cui
sopra. 26 campioni su 40 PACE 2C positivi, coltura negativi, testati mediante amplificazione,
contenevano rRNA di C. trachomatis e 11 contenevano rRNA di N. gonorrhoeae. Questo
dimostra che la maggioranza dei falso-positivi erano in realtà veri positivi che la coltura non
aveva evidenziato. I campioni sono stati comunque classificati come falso-positivi dato che il
test di amplificazione impiegato era un test di ricerca.
microrganismi target. Allo scopo di semplificare, i campioni doppio positivi sono stati inclusi
sia nei dati della C. trachomatis che fra quelli relativi alla N. gonorrhoeae. Ne consegue che
il numero totale di campioni positivi del quadro di seguito indicato sia aumentato di 59 unità
rispetto ai quadri relativi ai dati clinici.
PACE 2C
Positivi
Negativi
C. trachomatis Positivi in Coltura
N. gonorrhoeae Positivi in Coltura
109
79
12
12
132
350
6
1
80
Para a detecção de Chlamydia trachomatis e/ou de Neisseria gonorrhoeae em amostras
endocervicais e uretrais masculinas.
UTILIZAÇÃO
GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE é um
teste que utiliza sondas de ADN e a técnica de hibridização de ácidos nucleicos para detectar a
presença de Chlamydia trachomatis e/ou de Neisseria gonorrhoeae nas amostras endocervicais e
uretrais masculinas. As colheitas devem ser efectuadas com as embalagens de colheita PACE
GEN-PROBE.
Nas amostras positivas com o teste PACE 2C é necessário efectuar testes complementares para
detectar individualmente C. trachomatis e N. gonorrhoeae.
INTRODUÇÃO
As Chlamydiae são bactérias intracelulares, imóveis, Gram negativas, que utilizam o ATP produzido
pela célula hospedeira para a sua replicação. Desde há muito que se conhecem as infecções por
Chlamydiae. No entanto, a patogenicidade de Chlamydia trachomatis tem sido avaliada de forma
cada vez mais precisa ao longo do tempo (23, 25). Chlamydia trachomatis é responsável por cerca
de 50 a 80% dos casos de uretrites não gonocócicas (9, 10).
A espécie Chlamydia trachomatis compreende 15 serotipos responsáveis pelas seguintes doenças:
tracomas, conjuntivites por inclusões, linfogranulomas venéreos e outras doenças sexualmente
transmissíveis. Os serotipos D a K são a causa mais frequente das infecções genitais por
Chlamydiae tanto no homem como na mulher (26). As uretrites não gonocócicas, as epididimites,
as proctites, as cervicites e as salpingites agudas fazem parte das manifestações patológicas
ligadas à Chlamydia trachomatis (9, 24, 27). Para além das infecções sexualmente transmissíveis
, os recém-nascidos de mães infectadas podem também desenvolver infecções por Chlamydiae,
tais como as pneumonias ou conjuntivites de inclusões (1, 7, 28).
A gonorreia é a infecção bacteriana mais frequentemente detectada nos Estados Unidos, com
aproximadamente 392.200 casos diagnosticados em 1993 (4). Esta doença sexualmente
transmissível (DST) manifesta-se, geralmente, por uma uretrite anterior acompanhada de
exsudado purulento no homem. Na mulher, é geralmente o colo do útero que é atingido, mas a
81
Português
Vários métodos têm sido utilizados para detectar a presença de Chlamydia trachomatis nos tecidos
infectados. Estes englobam a observação ao microscópio óptico dos tecidos infectados após
coloração de Giemsa, a cultura celular seguida da visualização das inclusões intracelulares com
iodo, fluoresceína, ou com anticorpos conjugados com um marcador (5, 19, 26, 31). Recentemente,
foram desenvolvidos métodos rápidos que utilizam a detecção de antigénios e a hibridização de
ácidos nucleicos (13, 14).
vagina e o útero também podem ser infectados. Além das complicações graves e esterilidade que
podem ocorrer em indivíduos não tratados, frequentemente são detectadas infecções
assintomáticas. As infecções gonocócicas podem também ser diagnosticadas a partir de outras
mucosas, em especial a conjuntiva, o ânus e a orofaringe (17).
A Neisseria gonorrhoeae é o agente responsável pelas gonorreias; é um diplococo Gram negativo,
oxidase positiva, cujo crescimento requer condições estrictas (8, 12, 29). O diagnóstico das
gonorreias baseia-se no isolamento do microrganismo em cultura, no exame microscópico após
coloração de Gram, e na detecção da citocromo oxidase (8, 12). Para confirmar o diagnóstico de
uma infecção gonocócica, podem utilizar-se outros métodos, como a revelação através de
anticorpos fluorescentes, a degradação de carbohidratos e testes de aglutinação e fermentação de
açúcares, (6, 11, 16, 18, 22, 30). Recentemente, a técnica de hibridização de ácidos nucleicos tem
sido utilizada para o diagnóstico das infecções gonocócicas directamente a partir de amostras
clínicas (21).
GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE
utiliza a técnica de hibridização de ácidos nucleicos (15) para detectar a presença de Chlamydia
trachomatis e/ou Neisseria gonorrhoeae directamente a partir de amostras endocervicais e uretrais
masculinas. O teste não permite diferenciar os dois microrganismos, mas indica se um, ou ambos,
estão presentes na amostra.
PRINCÍPIO
Os testes por hibridização de ácidos nucleicos baseiam-se na capacidade de cadeias
complementares de ácidos nucleicos emparelharem de forma específica para formar complexos
bicatenários estáveis (15). O teste GEN-PROBE PACE 2C utiliza sondas de ADN monocatenárias
conjugadas com um marcador quimioluminescente, complementares do ARN ribossómico (ARNr)
dos organismos alvo. Após a libertação do ARNr dos organismos alvo, as sondas de ADN
marcadas hibridizam com este para formar complexos ADN-ARN estáveis. Em seguida, as sondas
hibridizadas são separadas das não hibridizadas. O luminómetro GEN-PROBE LEADER permite
medir o sinal luminoso emitido pelos híbridos ADN-ARN. O resultado do teste é a diferença entre
a resposta da amostra e a resposta média das referências negativas.
REAGENTES
Tampão de Hibridização PACE 2 (Solução tampão) (HB) contendo < 20% de detergente.
Reagente Sonda PACE 2C para Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae (P) Sonda
ADN marcada, liofilizada (< 500 ng/frasco).
Reagente de Selecção PACE 2 (Solução tampão) (S) contendo < 8% de detergente.
Reagente de Separação MST PACE 2 (SR) fase sólida (1,25 mg/ml) numa solução contendo
0,02% de azida sódica (conservante).
Referência Negativa MST PACE 2 (NR) Ácido nucleico não infeccioso numa solução tampão
contendo < 5% de detergente.
Controlo Positivo para Chlamydia trachomatis (PCT) Ácido nucleico não infeccioso de C.
trachomatis numa solução tampão contendo < 5% de detergente.
Controlo Positivo para Neisseria gonorrhoeae (PGC) Ácido nucleico não infeccioso de N.
gonorrhoeae numa solução tampão contendo < 5% de detergente.
Solução de Lavagem MST PACE 2 (Solução tampão) (W) contendo < 2% de detergente.
Folhas autocolantes para cobrir os tubos. uma embalagem.
82
REAGENTES DE DETECÇÃO GEN-PROBE (vendido em separado)
Reagente de Detecção I (RI) 0,1% de peróxido de hidrogénio em solução de ácido nítrico 0,001
N.
Reagente de Detecção II (RII) hidróxido de sódio 1N.
PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
A.
Unicamente para diagnóstico in vitro.
B.
Este teste foi avaliado unicamente com amostras endocervicais e uretrais masculinas. O
comportamento funcional do teste com outro tipo de amostras não foi estudado.
C.
NUNCA congelar o Reagente de Separação. A performance do teste pode ser afectada por
uma má conservação deste reagente. Se o reagente tiver sido congelado, as partículas em
suspensão podem agregar-se. O aspecto granular persiste mesmo após agitação da solução.
Os agregados de partículas do Reagente de Separação podem aderir às paredes do frasco.
Se isso acontecer, contactar o seu distribuidor Gen-Probe.
D.
Deve utilizar-se material de laboratório limpo para a preparação dos reagentes. Aconselhase vivamente a utilização de recipientes em poliestireno.
E.
Observar as precauções habituais. Não pipetar com a boca. Não comer, beber ou fumar na
zona de trabalho. Usar luvas de utilização única e batas aquando da manipulação das
amostras e dos reagentes. Lavar cuidadosamente as mãos após a manipulação das
amostras e dos reagentes.
F.
Algumas amostras podem ser infecciosas. Ter as precauções necessárias na realização de
qualquer técnica de biologia molecular (3). Devem ser estabelecidos procedimentos precisos
de manipulação e de eliminação pelo director do laboratório. Apenas as pessoas com
formação sobre a manipulação do material infeccioso serão autorizadas a efectuar este tipo
de diagnóstico.
1.
2.
Limpar minuciosamente e desinfectar todas as superfícies de trabalho.
Autoclavar o material contaminado antes da eliminação.
G.
O Reagente de Separação contém azida sódica susceptível de reagir com as canalizações
de chumbo ou de cobre formando azidas metálicas explosivas. Quando eliminar estes
reagentes, é aconselhável diluí-los com bastante água para evitar a formação de azidas na
canalização.
H.
Evitar qualquer contacto dos Reagentes de Detecção l e ll com a pele, os olhos e as
mucosas. ATENÇÃO: PRODUTO CORROSIVO. Em caso de contacto lavar com água. Se
estes reagentes forem derramados, diluí-los com água antes de limpar.
I.
Não misturar reagentes provenientes de kits de lotes diferentes, exceptuando a solução de
lavagem MST.
CONSERVAÇÃO
O Reagente Sonda PACE 2C conservado a 2º - 8ºC permanece estável durante 3 semanas após
a reconstituição.
83
Português
O Reagente Sonda PACE 2C e o Reagente de Separação PACE 2 devem ser conservados a
2° - 8°C.
A Solução de Separação reconstituída permanece estável durante 6 horas à temperatura ambiente
(20° - 25°C).
Todos os outros reagentes contidos em PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e
NEISSERIA GONORRHOEAE devem ser conservados entre 2° e 25°C e permanecem estáveis até
à data de validade indicada.
NÃO CONGELAR OS REAGENTES CONTIDOS NESTE KIT.
COLHEITA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
destina--se à detecção da presença de C. trachomatis e/ou de N. gonorrhoeae nas amostras
endocervicais e uretrais masculinas, colhidas usando as embalagens de colheita PACE.
Para as colheitas apenas podem ser usadas as zaragatoas contidas nas embalagens de colheita
PACE. As amostras devem sempre ser transportadas para o laboratório no meio de transporte
GEN-PROBE.
A.
Colher as amostras como segue:
1.
Amostras endocervicais colhidas com zaragatoa
a.
b.
c.
d.
e.
f.
2.
Retirar o excesso de muco à volta do colo cervical utilizando uma das duas
zaragatoas fornecidas no kit e eliminá-la.
Inserir a segunda zaragatoa no canal endocervical.
Efectuar rotações durante 10 a 30 segundos para obter uma boa colheita.
Retirar cuidadosamente a zaragatoa; evitar qualquer contacto com a mucosa
vaginal.
Introduzir completamente a zaragatoa no tubo de transporte GEN PROBE.
Partir a haste da zaragatoa na parte tracejada e fechar hermeticamente o tubo.
Amostras uretrais masculinas colhidas com zaragatoa
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Os pacientes não devem ter urinado na hora anterior à colheita.
Inserir a zaragatoa da embalagem de colheita uretral/conjuntival na uretra a 2 ou
4 cm de profundidade, rodando para facilitar a introdução.
Depois de introduzida a zaragatoa, efectuar rotações suaves durante 2 a 3
segundos, pressionando o suficiente para assegurar um bom contacto com toda
a superfície uretral.
Retirar a zaragatoa.
Introduzir completamente a zaragatoa no tubo de transporte GEN-PROBE.
Partir a haste da zaragatoa na parte tracejada e fechar hermeticamente o tubo.
B.
Transportar os tubos para o laboratório mantendo-os entre 2° e 25°C e conservá-los a esta
temperatura até as amostras serem analisadas. As amostras devem ser analisadas nos 7
dias a seguir à coleta, com GEN-PROBE PACE 2C. Se for necessária uma conservação mais
prolongada, tratar as amostras de acordo com as instruções em PREPARAÇÃO DAS
AMOSTRAS e congelá-las entre -20° e -70°C por até 90 dias após a coleta.
C.
Em análises de rotina, não foi estabelecido que a presença de sangue nas amostras tivesse
alguma interferência no comportamento funcional do teste. No entanto, é possível que uma
amostra com muito sangue (superior a 80 µl de sangue total em 1 ml de meio de transporte)
cause interferências.
D.
O transporte das amostras deve ser efectuado em conformidade com a regulamentação em
vigor. Conservar e testar as amostras como descrito (consultar o parágrafo B, aqui acima).
84
MATERIAL FORNECIDO
100 testes
Tampão de Hibridização PACE 2 (HB)
2 x 6 ml
Reagente Sonda PACE 2C
2 x 6 ml
(após reconstituição)
Reagente de Selecção PACE 2 (S)
1 x 100 ml
Reagente de Separação DST PACE 2 (SR)
1 x 9 ml
Referência Negativa DST PACE 2 (NR)
1 x 7 ml
Controlo Positivo (PCT)
1 x 3 ml
Controlo Positivo (PGC)
1 x 3 ml
Solução de Lavagem DST PACE 2 (W)
3 x 200 ml
Folhas autocolantes para cobrir os tubos
1 embalagem
Tubos de reacção GEN-PROBE de utilização única
em poliestireno (12 x 75 mm)
120 tubos por caixa
MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
Vortex
Banho-maria coberto (60° ± 1°C)
Micropipetas (100 µl)
Pipetas com capacidade de 1 a 25 ml
Papel absorvente
MATERIAL DISPONÍVEL NO SEU DISTRIBUIDOR GEN-PROBE
Embalagem de colheita GEN-PROBE PACE
Uretral/Conjuntival:
(bioMérieux ref. 39309 / Gen-Probe Cat. No. 3275) (50 por caixa)
Endocervical:
(bioMérieux ref. 39301 / Gen-Probe Cat. No. 3300) (50 por caixa)
Reagentes de Detecção GEN-PROBE (1200 testes)
Base magnética
Luminómetro GEN-PROBE LEADER 50i
GEN-PROBE FAST EXPRESS
PROCEDIMENTO
A.
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
3.
4.
Deixar as amostras atingirem a temperatura ambiente antes de começar a análise.
Agitar os tubos de transporte GEN-PROBE utilizando um Vortex durante, pelo menos,
5 segundos.
Eliminar o máximo de líquido da zaragatoa, espremendo-a contra as paredes do tubo.
Eliminar a zaragatoa.
Antes de começar o teste, agitar novamente cada tubo de transporte num Vortex
durante, pelo menos, 5 segundos para assegurar a homogeneidade da amostra.
85
Português
1.
2.
B.
PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
1.
Deixar todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente antes da utilização COM
EXCEPÇÃO do Reagente Sonda e do Reagente de Separação. O Reagente Sonda e
o Reagente de Separação devem ser conservados a 2º - 8°C até à sua utilização.
2.
Reagente Sonda
Agitar o Tampão de Hibridização PACE 2 durante 10 segundos num Vortex. Aquecê-lo
agitando ligeiramente durante 3-4 minutos num banho-maria a 60° ± 1°C. Agitá-lo
novamente num Vortex durante 10 segundos para assegurar que a solução fica
homogénea. Pipetar 6 ml do Tampão de Hibridização para o Reagente Sonda PACE 2C
C. TRACHOMATIS e N. GONORRHOEAE liofilizado (Reagente Sonda PACE 2C).
Deixar repousar durante 2 minutos à temperatura ambiente, depois agitar em Vortex
durante 10 segundos antes da utilização. Verificar visualmente se o reagente está
completamente rehidratado e homogeneizado. Anotar na etiqueta a data da
reconstituição. O Reagente Sonda PACE 2C assim reconstituído permanece estável
durante 3 semanas quando conservado a 2º - 8°C, dentro da validade indicada na
embalagem. Se o Reagente Sonda PACE 2 C reconstituído tiver sido colocado no
frigorífico, agitá-lo num Vortex durante 10 segundos e aquecê-lo, em seguida,
colocando o frasco num banho-maria a 60° ± 1°C agitando ligeiramente durante 2
minutos. Antes da utilização, homogeneizar agitando num Vortex durante 10 segundos.
Pode ser necessário repetir esta operação se o reagente reconstituído não estiver bem
homogéneo.
3.
Solução de Separação
Determinar o número de testes a efectuar. Calcular os volumes dos reagentes de
Selecção e de Separação como segue:
Volume de Reagente de Selecção (ml)= Número de testes + 2 testes suplementares
(com a pipeta de repetição Eppendorf)
= Número de testes + 10 testes suplementares
(com um distribuidor automático)
Volume do Reagente de Separação (ml)
= Volume de Reagente de Selecção (ml)
20
Deitar a quantidade necessária de Reagente de Selecção num recipiente seco e limpo.
Agitar o Reagente de Separação e adicionar a quantidade necessária de Reagente de
Selecção; agitar novamente. Esta Solução de Separação preparada conserva-se à
temperatura ambiente e permanece estável durante 6 horas.
Preparação da Solução de Separação
(Exemplo)
8 testes + 2 = 10 testes
Número
de testes
8
18
48
98
+
+
+
+
2
2
2
2
Reagente
de Selecção
10
20
50
100
ml
ml
ml
ml
86
Reagente
de Separação
0,5
1,0
2,5
5,0
ml
ml
ml
ml
C.
HIBRIDIZAÇÃO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
D.
Identificar os tubos com o número da amostra correspondente. Adicionar 3 tubos para
a Referência Negativa, um tubo para o Controlo Positivo C. trachomatis, e um tubo para
o Controlo Positivo N. gonorrhoeae. Escrever unicamente na parte superior do tubo. A
referência e os controlos devem ser testados com cada série de amostras.
Colocar os tubos no suporte GEN-PROBE. Afastar a base magnética para uma
utilização posterior.
Agitar cada amostra num Vortex durante 5 segundos.
Distribuir 100 µl de cada controlo e 100 µl de cada amostra no fundo do tubo
correspondente.
Colocar 100 µl do Reagente Sonda PACE 2C no FUNDO de cada tubo, tendo o cuidado
de não tocar no bordo ou nas paredes do tubo.
Cobrir os tubos com folhas autocolantes e assegurar-se que todos os tubos estão bem
fechados.
Agitar o suporte 3 a 5 vezes para misturar.
Incubar os tubos num banho-maria a 60° ± 1°C durante uma hora. NÃO colocar a base
magnética no banho-maria.
PREPARAÇÃO DO MATERIAL
Preparar o luminómetro LEADER GEN-PROBE. Verificar se há um volume suficiente
de Reagentes de Detecção I e II para efectuar os testes.
E.
SEPARAÇÃO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
DETECÇÃO
1.
2.
Seleccionar o protocolo apropriado no luminómetro LEADER.
Para eliminar todos os resíduos da superfície dos tubos, limpá-los com papel
absorvente húmido. Verificar se o sedimento está bem suspenso e inserir os tubos no
luminómetro de
87
Português
F.
Retirar o suporte do banho-maria e remover as folhas autocolantes.
Distribuir 1 ml da Solução de Separação, bem homogeneizada, em cada tubo.
Cobrir os tubos com as folhas autocolantes e agitar o suporte vigorosamente, 3 a 5
vezes, para misturar. Deve ser visível espuma em cada tubo.
Colocar imediatamente os tubos num banho-maria a 60° ± 1°C e incubá-los durante 10
minutos.
Retirar o suporte do banho-maria. Remover as folhas autocolantes. Colocar o suporte
dos tubos na base magnética durante 5 minutos à temperatura ambiente.
Mantendo juntos o suporte e a base magnética GEN-PROBE, decantar o sobrenadante
virando-os ao contrário. Antes de voltar a virar o suporte, agitá-lo 2 ou 3 vezes e
escorrer os tubos batendo-os 3 vezes em papel absorvente.
SEM RETIRAR O SUPORTE DA BASE MAGNÉTICA GEN-PROBE, encher cada tubo
até ao cimo com a Solução de Lavagem. (Consultar NOTAS relativamente à adição de
Solução de Lavagem).
Deixar os tubos na base magnética durante 20 minutos à temperatura ambiente.
Mantendo juntos o suporte e a base magnética, decantar o sobrenadante virando-os ao
contrário. NÃO ESCORRER OS TUBOS em papel absorvente. Devem ficar cerca de
50 a 100 µl de Solução de Lavagem no fundo dos tubos.
Retirar o suporte da base magnética e agitá-lo para suspender os sedimentos.
acordo com as instruções afixadas no aparelho.
Efectuar a leitura dos tubos pela ordem seguinte:
Referência negativa, 3 tubos
Controlo positivo C. trachomatis, 1 tubo
Controlo positivo N. gonorrhoeae, 1 tubo
Tubos contendo amostras clínicas
3.
Quando a leitura tiver terminado, retirar os tubos do luminómetro.
NOTAS
A.
TAMPÃO DE HIBRIDIZAÇÃO PACE 2: É imperativo o aquecimento a 60° ± 1°C do Tampão
de Hibridização PACE 2 e do Reagente Sonda reconstituído para evitar a formação de um
precipitado e assegurar a homogeneidade da solução.
B.
AMOSTRAS: Algumas amostras são, por vezes, demasiado viscosas para serem pipetadas.
Assegurar-se de que estas estão à temperatura ambiente e agitá-las num Vortex. Podem
adicionar-se algumas gotas do reagente GEN-PROBE FAST EXPRESS para facilitar a
preparação e fluidificação das amostras. Contactar o seu distribuidor GEN-PROBE para
informação.
C.
PIPETAGEM: Por comodidade, as mesmas pipetas ou distribuidores podem ser utilizados
para a adição do Reagente Sonda PACE 2C, da Solução de Separação e da Solução de
Lavagem. São recomendadas pipetas com pontas descartáveis para pipetar as amostras e
os controlos, de modo a evitar qualquer contaminação entre tubos. Ter o cuidado de colocar
o Reagente Sonda PACE 2C NO FUNDO dos tubos, sem inserir a ponta da pipeta nos tubos
e sem tocar nos bordos. Para evitar projecções, distribuir os reagentes contra a parede dos
tubos e não para o fundo.
D.
ESCORRIMENTO DOS TUBOS: Substituir o papel absorvente após cada escorrimento para
evitar qualquer contaminação. NÃO ESCORRER APÓS A ETAPA DE LAVAGEM.
E.
TEMPERATURA: A hibridização e a separação são reacções termo-dependentes. Em
consequência, é indispensável que o banho-maria e os tubos fiquem a uma temperatura
constante durante estas etapas. Deverá utilizar-se um banho-maria coberto capaz de manter
uma temperatura de 60° ± 1°C.
F.
LAVAGEM: A Solução de Lavagem deve ser distribuída energicamente em cada tubo.
Inclinar a pipeta contra a parede do tubo e não para o fundo, para evitar as projecções. Deve
ser visível espuma com uma altura de 1 cm se a Solução de Lavagem tiver sido
energicamente distribuída. Em seguida, encher cada tubo com a Solução de Lavagem para
eliminar a espuma. Os resultados podem ser falseados se a etapa de lavagem não tiver sido
correctamente efectuada.
G.
FRASCO COM DISTRIBUIDOR AUTOMÁTICO: Este método de distribuição da Solução de
Lavagem é opcional. Cada laboratório deverá validar as performances deste dispositivo em
relação ao método habitual. Antes de utilizar um distribuidor, transferir a Solução de Lavagem
para o frasco. Enroscar a tampa. Premir e rejeitar os 5 primeiros mililitros.
H.
Como em qualquer método que utilize reagentes, o excesso de pó nas luvas pode levar à
contaminação de reagentes e de tubos de reacção abertos. A GEN-PROBE recomenda aos
clientes que tiverem dificuldades com o teste, evitarem a utilização deste tipo de luvas de
laboratório. É aconselhada a utilização de luvas sem pó de talco.
I.
DETECÇÃO: Os tubos deverão ser lidos no luminómetro LEADER nos 60 minutos a seguir à
lavagem. Os tubos deverão ser conservados entre 20° e 25°C antes da leitura.
88
RESULTADOS
A.
CÁLCULO DOS RESULTADOS:
Os resultados do teste GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE calculam-se como a diferença, em RLU (Relative Light Units), entre o valor da
leitura da amostra e a média das 3 Referências Negativas.
Média das referências negativas = soma das 3 Referências Negativas, dividida por 3.
Exemplo:
Média das referências negativas =
(65 RLU + 71 RLU + 80 RLU) = 72 RLU
3
Limiar determinado = 300 RLU
Limiar calculado = 300 RLU + 72 RLU = 372 RLU
Valor de leitura da amostra = 900 RLU POSITIVO
O luminómetro LEADER imprime o valor de leitura da amostra e compara-a ao valor limiar
calculado. A interpretação da positividade ou negatividade efectua-se em relação a este limiar e é
impressa pelo luminómetro. Consultar o Manual de Utilização do luminómetro LEADER para mais
informação sobre o protocolo de leitura.
B.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Os resultados de GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE deverão ser interpretados tendo em conta outros dados do laboratório e devem
ser correlacionados com os dados clínicos.
POSITIVO - A diferença é superior ou igual à soma de 300 RLU com a média das Referências
Negativas.
NEGATIVO - A diferença é inferior à soma de 300 RLU com a média das Referências Negativas.
Um resultado positivo indica a presença de ARNr de Chlamydia trachomatis e/ou de ARNr de
Neisseria gonorrhoeae na amostra testada. Em seguida, é necessário efectuar testes
complementares para a identificação individual de C. trachomatis e N. gonorrhoeae.
Se os testes individuais forem negativos, o resultado é inconclusivo e deve ser efectuada uma nova
colheita.
Um resultado negativo indica que nem o ARNr de Chlamydia trachomatis nem o ARNr de Neisseria
gonorrhoeae foram detectados na amostra testada.
C.
CONTROLO DE QUALIDADE E VALIDAÇÃO DOS RESULTADOS
NOTA: As Referências Negativas e o Controlo Positivo fornecidos permitem controlar unicamente
o teste PACE 2C. Não permitem controlar a lise do microrganismo alvo no meio de transporte da
amostra.
Referência Negativa:
O valor de leitura de cada Referência Negativa deve ser inferior a 200 RLU. Todos os valores das
Referências Negativas devem estar compreendidos num intervalo de 30% relativamente ao valor
médio das Referências Negativas (o coeficiente de variação deve ser inferior a 30%). Se um valor
89
Português
A Referência Negativa permite medir o branco do teste e é utilizada para calcular o limiar de
positividade da série. Os valores esperados para a Referência Negativa foram validados
efectuando 69 séries de testes (3 ensaios/série) em cinco locais diferentes dos Estados Unidos.
sair fora deste intervalo, pode ser eliminado dos cálculos; seguir as indicações do Manual de
Utilização do luminómetro LEADER. Se dois valores saírem fora deste intervalo, o teste deverá ser
repetido. Se o problema se repetir com frequência, rever a técnica utilizada e contactar o seu
distribuidor Gen-Probe se o problema persistir.
Controlos Positivos:
Os valores esperados para cada Controlo Positivo foram validados efectuando 69 séries de testes
em cinco locais diferentes dos Estados Unidos.
Para que a série seja válida, a diferença entre o valor de cada Controlo Positivo e o valor médio
das Referências Negativas deve ser superior a 600 RLU e inferior a 3.200 RLU. Se os valores dos
Controlos Positivos se situarem, de forma repetida, fora deste intervalo, contactar o seu distribuidor
Gen-Probe. Os resultados de GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e
NEISSERIA GONORRHOEAE devem ser interpretados tendo em conta outros dados do
laboratório e correlacionados com os dados clínicos.
Se os valores dos Controlos Positivos ou das Referências Negativas não estiverem dentro dos
intervalos requeridos, os resultados do teste não devem ser validados.
Cada laboratório deve determinar, em condições de rotina, os seus próprios valores e intervalos
para as Referências Negativas e os Controlos Positivos, e arquivá-los em conformidade com as
boas práticas de laboratório (2, 20).
Controlos de tratamento das amostras:
Para testar a eficácia do tratamento da amostra, controlos celulares positivos e negativos podem
ser testados, em paralelo com as amostras. Por exemplo, as estirpes C. trachomatis ATCC VR878
e N. gonorrhoeae ATCC 19424 podem ser utilizadas como controlos positivos e a estirpe N.
mucosa ATCC 19696 como controlo negativo.
Para as estirpes de Neisseria, utilizar culturas em crescimento e preparar suspensões com cerca
de 3 x 108 UFC/ml em soro fisiológico estéril. Transferir 10 µl de cada suspensão celular para um
tubo de transporte de embalagem de colheita GEN-PROBE PACE (endocervical ou
uretral/conjuntival) e agitar num Vortex.
Para as estirpes de Chlamydia, utilizar os corpos elementares obtidas a partir de culturas celulares
e preparar uma solução titulada com cerca de 3 x 108 UFI/ml. Transferir 10 µl de cada suspensão
para um tubo de transporte do kit de colheita GEN-PROBE PACE(endocervical ou
uretral/conjuntival) e agitar num Vortex. Tratar os controlos da mesma forma que as amostras,
começando pela etapa C1 do procedimento. Os controlos celulares positivos devem dar resultados
positivos e os controlos celulares negativos devem dar resultados negativos.
LIMITES DO TESTE
Este método foi testado unicamente com amostras endocervicais e uretrais masculinas. A sua
performance não foi avaliada para outras amostras.
No decurso de análises de rotina, não foi estabelecido que a presença de sangue nas amostras
tivesse alguma incidência na performance do teste. No entanto, é possível que uma amostra com
muito sangue (superior a 80 µl de sangue total em 1 ml de meio de transporte) possa ter
interferência no resultado.
Não foi observada nenhuma interferência causada por lubrificantes ginecológicos e espermicidas,
quando estes produtos são utilizados normalmente. Para informações sobre produtos particulares,
contactar o seu distribuidor Gen-Probe.
Outras substâncias endógenas podem estar presentes nas amostras dos pacientes e interferir com
o teste.
90
Todos os métodos de identificação de Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae são
susceptíveis de dar resultados falsos positivos. No caso de o resultado da análise ser susceptível
de ter um impacto psicossocial negativo, é aconselhável confirmar o resultado utilizando um outro
método. A cultura é o único método recomendado para efectuar o diagnóstico de uma infecção por
Chlamydiae ou gonorreia, em situações médico-legais.
Como para qualquer doença, o valor predictivo positivo deste teste diminuirá com a diminuição da
prevalência da doença na população. A fiabilidade dos resultados depende da qualidade da
colheita. Dado que o sistema de transporte utilizado para este teste não permite verificar, por
observação ao microscópio, a qualidade da colheita, é necessária formação nas técnicas de
colheita. Consultar as recomendações indicadas em COLHEITA DAS AMOSTRAS e
CONSERVAÇÃO.
O resultado do teste não é indicativo do sucesso ou insucesso de uma terapia, visto que a presença
de ácidos nucleicos pode persistir mesmo após uma terapia anti-microbiana apropriada.
Os resultados de GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE devem ser interpretados tendo em conta outros dados do laboratório e devem
ser correlacionados com os dados clínicos.
Um teste negativo não exclui a possibilidade de uma infecção, podendo o número de C.
trachomatis e/ou N. gonorrhoeae ser inferior ao limite de detecção do teste. Uma segunda amostra
pode ser colhida com zaragatoa e cultivada para confirmação do resultado. Os resultados do teste
podem também ser afectados por uma má técnica de colheita, um erro da manipulação, uma troca
de amostras ou um tratamento antibiótico em curso.
Se um resultado PACE 2C-positivo estiver em contradição com outros dados clínicos ou com
informações fornecidas pelo paciente, ou se o paciente pertencer a uma categoria citada nas
directivas de 1993 do CDC relativas a C. trachomatis (CDC, MMWR, Vol. 42, No. RR-12, 1993),
deve verificar-se o resultado.
GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE é um
teste de despiste de C. trachomatis e/ou N. gonorrhoeae. Podendo a infecção ser dupla, é
necessário efectuar testes complementares sobre as amostras PACE 2C positivas para detectar
individualmente a presença de C. trachomatis e N. gonorrhoeae.
Português
91
VALORES ESPERADOS
DISTRIBUIÇÃO DOS RESULTADOS CLÍNICOS
A partir dos resultados obtidos durante os ensaios clínicos do teste PACE 2C, foi estabelecida a
distribuição dos valores de leitura das amostras (valores indicados em RLU) em relação ao valor
limiar do teste. Os dados, após resolução dos resultados discordantes, figuram aqui abaixo. O
número de falsos-positivos (FP) e de falsos-negativos (FN) correspondentes estão indicados
abaixo do quadro.
FP
FN
10
10
11
COMPORTAMENTO FUNCIONAL
A.
PRECISÃO INTRA-ENSAIO
13
2
14
11
8
7
A precisão intra-ensaio do teste PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA
GONORRHOEAE foi estabelecida testando quatro concentrações de C. trachomatis (medida em
UFI:Unidade Formadora de Inclusão) e de N. gonorrhoeae, 5 vezes numa mesma série. Também
foi testada uma amostra negativa.
Amostra
Número de ensaios
Resposta média (RLU)
Desvio-padrão (RLU)
Coeficiente de variação
B.
A
B
C
D
E
5
9.530
210
2,2%
5
2.075
143
6,9%
5
1.041
42
4,0%
5
767
52
6,8%
5
49
2
n/a
PRECISÃO INTER-ENSAIO
A precisão inter-ensaio foi estabelecida testando as mesmas quatro concentrações de C.
trachomatis (número de UFI) e de N. gonorrhoeae, e uma amostra negativa, em três séries
consecutivas.
Amostra
Número de ensaios
A
B
C
D
E
3
10.147
917
9,0%
3
2.259
240
10,6%
3
968
66
6,8%
3
690
74
10,7%
3
51
4
n/a
92
C.
PRECISÃO DO CONTROLO POSITIVO
A precisão para os controlos positivos de C.trachomatis e N. gonorrhoeae foi determinada com
testes PACE 2C efectuados em cinco locais diferentes nos Estados Unidos. Cada controlo positivo
foi testado uma vez em cada série.
Amostra
Controlo
positivo
C. trachomatis
Número de ensaios
D.
69
1.837
329
5,6%
Controlo
negativo
N. gonorrhoeae
69
2.165
425
5,1%
SENSIBILIDADE ANALÍTICA
A sensibilidade analítica (limite de detecção) de GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA
TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE foi determinada por comparação directa de
diluições de C. trachomatis e N. gonorrhoeae a partir de culturas frescas com o teste PACE 2C.
A sensibilidade com um valor limiar de 300 RLU adicionado da média das Referências Negativas,
foi de 24 a 2.232 UFI(Unidades Formadoras de Inclusão)/teste (0.1 ml de meio de transporte
inoculado) para os 15 serotipos de C. trachomatis, ou seja, uma média de 966 UFI/teste. Para N.
gonorrhoeae, foi determinada uma sensibilidade de aproximadamente 650 UFC (Unidades
Formadoras de Colónias)/teste (0,1 ml de meio de transporte inoculado).
E.
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
Foram testadas com o teste PACE 2C oitenta culturas que incluiam 20 microrganismos
susceptíveis de serem isolados no tracto urogenital e 30 outros microrganismos muito próximos
filogeneticamente. Foram testadas também culturas de C. trachomatis (15 serotipos), N.
gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, e de 12 espécies de Neisseriaceae.
Apenas C. trachomatis e N. gonorrhoeae deram resultados positivos com GEN-PROBE PACE 2C
PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE.
F.
TESTE DE SOBRECARGA
Foi adicionada uma quantidade de 0,1 µg/teste de ARN ribossómico isolado de C. psittaci,
Ureaplasma urealyticum, e Neisseria meningitidis a amostras que continham diferentes
concentrações de ARNr de C. trachomatis e/ou de N. gonorrhoeae. Não foi observada nenhuma
interferência na detecção de C. trachomatis ou de N. gonorrhoeae com GEN-PROBE PACE 2C
PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE.
Português
93
G.
RESULTADOS DE ENSAIOS CLÍNICOS
GEN-PROBE PACE 2C PARA CHLAMYDIA TRACHOMATIS e NEISSERIA GONORRHOEAE foi
comparado com os métodos de cultura padrão para C. trachomatis e N. gonorrhoeae usando 1.266
amostras endocervicais e 849 amostras uretrais masculinas. Estes ensaios foram realizados em
cinco locais clínicos, utilizando um limiar de 300 RLU. Os dados clínicos obtidos antes e após a
resolução das discordâncias, são apresentados aqui abaixo:
1.
RESUMO DAS PERFORMANCES ANTES DA ANÁLISE DAS DISCORDÂNCIAS
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensibilidade/
Especificidade
%
9
6
219
92,5/96,1
8
3
313
94,1/97,5
6
8
221
89,9/97,4
4
1
263
92,3/98,5
17
11
208
97,1/92,4
Assintomáticos
26
(6,6%/5,4%; 4 locais)
11
2
203
92,9/94,9
Total
397
(10,1%/41,3%; 4 locais)
28
13
411
96,8/93,6
PACE 2C
Cultura
Pos
Pos
Pos
Neg
População
(%CT / %NG prevalência; Nº de locais
Mulheres com sintomas
Forte prevalência
74
(13,6%/16,2%; 2 locais)
Fraca prevalência
48
(8,9%/7,0%; 2 locais)
Mulheres assintomáticas
Forte prevalência
71
(12,1%/17,0%; 2 locais)
Fraca prevalência
12
(3,2%/1,8%; 2 locais)
Homens
Com sintomas
371
(11,5%/ 55,7%; 4 locais)
94
2.
RESUMO DAS PERFORMANCES APÓS ANÁLISE DAS DISCORDÂNCIAS
Os resultados discordantes para C. trachomatis foram resolvidos por imunofluorescência
directa após nova cultura. As amostras discordantes para N. gonorrhoeae não foram
novamente colocadas em cultura.
Intervalo de
confiança a
95%
Sensibilidade/
Especificidade %
Neg
Pos
Neg
Neg
Sensibilidade/
Especificidade
%
Mulheres com sintomas
Forte
prevalência
77
6
6
219
92,8/97,3
86,7-97,9 /
94,7-99,1
Fraca
prevalência
7
3
313
94,2 / 97,8
86,5-100,0 /
95,6-99,1
Mulheres assintomáticas
Forte
prevalência
71
6
8
221
89,9 / 97,4
81,0-94,9 /
94,7-99,1
Fraca
prevalência
13
3
1
263
92,9 / 98,9
71,4-100,0 /
97,4-100,0
Homens
Com sintomas
373
15
11
208
97,1 / 93,3
Assintomáticos 28
9
2
203
93,3 / 95,8
Total
24
13
411
96,9 / 94,5
95,3-98,7 /
89,7-96,0
83,3-100,0 /
92,5-98,1
94,9-98,3 /
92,0-96,3
PACE 2C
Cultura
Pos
Pos
Pos
Neg
População
49
401
3.
RESUMO DAS PERFORMANCES: MICRORGANISMOS INDIVIDUAIS
A capacidade do PACE 2C para detectar C. trachomatis e N. gonorrhoeae individualmente foi
determinada comparando os resultados do teste PACE 2C (após resolução das
discordâncias) com os resultados da cultura de amostras positivas separadamente para cada
um dos dois organismos-alvo. Para simplificar a análise, as amostras duplamente positivas
foram incluídas nos dados de C. trachomatis e de N. gonorrhoeae. Consequentemente, o
95
Português
Das 55 amostras PACE 2C-positivas, cultura-negativas, 15 revelaram-se negativas após
terem sido submetidas a testes individuais PACE 2 para C. trachomatis e N. gonorrhoeae. Foi
também utilizado um teste de detecção por amplificação para analisar algumas amostras
PACE 2C - falsamente positivas, ainda que este teste não figure no protocolo de resolução
das discordâncias descrito aqui acima. 26 das 40 amostras PACE 2C-positivas, culturanegativas, testadas por amplificação, continham ARNr de C. trachomatis e 11 destas
continham ARNr de N. gonorrhoeae. Estes dados indicam que a maioria dos falsos positivos
eram, de facto, verdadeiros positivos que não foram detectados em cultura. As amostras
foram, de qualquer modo, classificadas como falsos positivos, visto que o teste de
amplificação utilizado era um teste de pesquisa.
número total de amostras positivas do quadro seguinte está aumentado de 59 em relação aos
outros quadros dos dados clínicos.
PACE 2C
Positivas
Negativas
C. trachomatis Positivos em Cultura
Mulheres
Homens
N. gonorrhoeae Positivos em Cultura
Mulheres
Homens
109
79
12
12
132
350
6
1
96
BIBLIOGRAPHY
LITERATUR
BIBLIOGRAPHIE
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CHLAMYDIA TRACHOMATIS and NEISSERIA GONORRHOEAE

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