Quelques exemples de nos travaux

Quelques exemples de nos travaux
C. Renard
UMR SQPOV, Avignon
Fév 2010
Plan
•
•
•
•
•
•
Les pectines: définition et structure
Méthodes d'étude des pectines
Les pectines en tant qu'additifs
Les enzymes pectolytiques
Les pectines in situ:
Quelques exemples de nos travaux
–
–
–
–
Modification des homogalacturonanes
Quelques mots sur les polyphénols
Extraction de polyphénols de marc de pomme
Extraction de jus par microondes
Interaction
- Association spontanée et rapide polyphénols-paroi
cellulaire
- Affinité entre les tannins et les pectines
- Influences de DP (tannins) et de DM (pectines)
- Modification de l’extractibilité des polysaccharides
- Possibilité de mesurer l’interaction par la Calorimétrie
Isothermale de Titration
Préparation d’homogalacturonanes
substitués
• Pour étudier leurs interactions avec les polyphénols
• Homogalacturonanes par hydrolyse acide
• Substitution par halogénures d’alkyles
• Test: calorimétrie isothermale de titration
Expériences et Résultats
¾Pectines:
Pectines commerciales de pommes
Saponification
Pectates
Hydrolyse acide
Rendement
pondéral
(%)
Teneur
en Gal-A (mmol/g)
Rendement en
Gal-A (%)
Pectines
/
3,58
/
Pectates
94,9
3,69
97,9
HG
56,5
4,66
71,3
HG-TBA
221
2,4
100
Homogalacturonanes
Neutralisation
HG-TBA
Alkylation
HG
modifiés
100
100
Degré d'éthylation (%)
Degré de méthylation (%)
Efficacité de la substitution
Methylation
80
60
40
20
80
60
•
40
20
•
0
0
0
0,25 0,5 0,75
1
0
10
Degré de buthylation (%)
100
Propylation
80
60
40
20
-
0
0
0,25 0,5 0,75
1
Ratio molaire ProBr/Gal-A
0,25 0,5 0,75
1
10
Ratio molaire EtBr/Gal-A
Ratio molaire MeI/Gal-A
Degré de propylation (%)
•
Ethylation
10
100
•
Buthylation
80
60
40
20
0
0
0,25 0,5 0,75
1
Ratio molaire BuBr/Gal-A
10
Influence de
l’halogénure,
Encombrement de
la chaîne d’alkyle,
Relation linéaire
jusqu’au ratio 1
(alkylant/Gal-A),
Insolubilité des
molécules
hautement
substituées.
Sans diminution de la longueur de chaîne
• HPSEC
HG-TBA
HG-Me1
HG-Et6
HG-Pr12
8 min
13 min
Préparation des polyphénols
Poudre de pommes
lyophilisées
Extraction
Hexane
Méthanol
Eau-Acétone
Analyse par HPLC
Polyphénols extraits
SPE C18
Purification
Polyphénols purifiés
Concentration (mg/g de matière sèche)
Rendt
PCA (%)
PCA
ECAT
Ac. chlor
Ac. PCG
DHC
146,48
/
6,3
0,53
0,77
0,08
0,24
5,6
PPH Extraits
acétonique
2,899
22
69,8
0,85
1,97
0,14
0,16
10,9
PPH purifiés
0,236
80
686,3
7,6
/
/
2,02
10,8
Quantité (g)
Pomme
DP
Mesure de l’interaction par ITC
microcalorimètre
isothermale de titration
ITC; Résultat obtenu en 2008,
Procyanidines DP 35, 3mM,
Pectine DM 70, 1,5 mM
Avec les HGs: pic exothermique à 1/10
HG
35°C
HG-Me DS 41
HG-Bu DS 74
Pourquoi les polyphénols?
• Caractères organoleptiques
–
–
–
–
amertume et astringence
couleur : natifs, oxydés
relations structure/propriétés des polyphénols
rôle de la matrice
• Propriétés nutritionnelles
• Evolution des polyphénols au cours des procédés
– transferts depuis le fruit
– modifications des structures
• oxydations , condensations
• enzymatiques, chimiques: échelles de temps
De la matière première au produit
Pressage
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OH
O
OH
OH
OH
Clarifications
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OH
O
OH
OH
HO
Fermentation
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
Matière
première
Cuisson
Broyage
Raffinage
Cidre
Une démarche commune
• Observation
– Une observation qui ne « cadre pas » avec la théorie
générale
– Une question finalisée qui conduit à des interrogations
fondamentales
• Modélisation
– Elle permet d'analyser des phénomènes réels et de prévoir
des résultats à partir de l'application d'une ou plusieurs
théories à un niveau d'approximation donné.
– Modélisation « ad hoc »: boite noire (statistique), basée sur
des modèles descriptifs ou théoriques
• Validation
– Répéter l’observation initiale en faisant varier les leviers
identifiés par le modèle
– Le modèle permet-il de prévoir l’effet des modifications du
procédé?
Pour la caractérisation de procyanidines
OH
OH
Absorbance (280 nm)
HO
O
OH
OH
4
OH
OH HO
6
4
HO
HO
8
OH
OH
OH OH
HO
O
Procyanidols
OH
O
OH
OH
OH
0
10
OH
O
20
30
40
Temps de rétention (min)
Thiolyse
(dépolymérisation)
OH
HO
OH
O
OH
OH
1. Identification des unités
constitutives
Absorbance 280 nm
benzylthioéther
de (-)-épicatéchine
toluène-thiol
moyen de polymérisation
(-)-épicatéchine
0
10
20
30
2. Détermination du degré
40
Temps de rétention (min)
50
3. Quantification et
estimation de la pureté
La réaction de thiolyse
OH
OH
OH
extension
units
HO
O
HO
OH
OH
H+
O
+
O
OH
Procyanidin
(Adapted from Thompson et al., 1972)
HO
O
2
S
OH
OH
CH2
Benzylthioether
adduct
O
OH
unit
OH
OH
HO
terminal
OH
CH2
OH
OH
OH
2
OH
FlavanylC4-carbocation
+
OH
OH
HO
O
2
OH
OH
OH
HO
SH
OH
OH
OH
terminal unit
(flavanol)
Quantification par HPLC
A
2 4
Before
thiolysis
Absorbance (280 nm)
0,06
0,05
7
3
5
X
X
6
0,02
X
X1
0,01
9
7
B
After
thiolysis
0,06
0,04
0,03
2'
0,07
Absorbance (280 nm)
0,07
4
0,05
0,04
5'
12
0,03
10
0,02
6
0,01
8
X X X X
0,00
0,00
0
10
20
30
40
50
0
Retention time (min)
•
Avant
– Procyanidols
– Acides hydroxycinnamiques
•
10
20
30
Retention time (min)
Après
– Flavanols et dérivés
benzylthioethers
– Dérivés méthylés
40
50
Pourquoi le marc de pomme
• Un co-produit abondant et mal valorisé
– France: 200 KT pommes à cidre
– Marc: environ 5%
– Utilisation: extraction des pectines, alimentation des
animaux
Les ultrasons
Bumble bee
150 Hz
Prpoagation des sons en milieu liquide:
le phénomène de cavitation
Conséquences de la cavitation
Implosion des bulles: micro-réacteur
avec des conditions de T° et P extrèmes
Peut-on utiliser la cavitation en
extractions?
1.
2.
•
Sans ultrasons
Avec ultrasons
Extraction
– à partir de marc de pomme industriel
– par des solvants compatibles alimentaire
•
Dosage
– Polyphénols totaux (Folin)
– Polyphénols spécifiques (HPLC après thiolyse)
Essais préliminaires- 1
• Solvant (ratio Ethanol / H2O)
– 10g marc/ 100mL solvant
TPC
Eq.catechin
(g/L)
1,20
TPC (ECatechin g/L) = f (% EtOH)
Maximum
50% EtOH/H2O (v/v)
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0%
20%
40% EtOH 60%
80%
100%
Rapport liquide / solide
Concentration
Quantité effective d’extrait
TPC Ecatechin (g/L) = f (ratio S/L)
y = -8,1354x2 + 8,1092x
R2 = 0,9984
TPC Eq.
catechin (g/L)
2
1,8
1,6
Eq. Catechin
(g)
70,00
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
Quantity of extract recovered
2
R = 0,9986
60,00
0,2
0
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
50,00
35%
Ratio S/L
X
Volume récupérée
=
y = 617,22x
2
R = 0,9989
180,00
10,00
0,00
160,00
Volume (mL)
30,00
20,00
Solids and Liquids volumes recovered after
filtration step function of solid/liqui ratio
200,00
40,00
140,00
0%
120,00
Liquid
100,00
Solid
80,00
5%
10%
15%
20%
ratio S/L
25%
60,00
40,00
2
y = 396,83x - 325,24x + 99,698
2
R = 0,988
20,00
0,00
0%
5%
10%
15%
20%
Ratio S/L
25%
30%
35%
Rapport choisi
15% (w/v)
30%
35%
Extraction assistée par ultrasons
• Conditions fixées
– EtOH/H2O (50/50, v/v)
– Ratio S/L (w/v): 15%
– Ultrasonic bath: PEX 3
•
(REUS, Contes, France)
• Plan d’expérience
– Puissanced des US (W/g)
– Température (°C)
– Durée d’extraction
Plan d’expérience
+1
Box-Wilson (composite centré)
• 6 expériences au centre
-1
0
-1
• 8 expériences aux « coins »
• 6 expériences en étoile
0
0
+1
-1
20 expériences au total
+1
Valeurs utilisées et résultat PPT
Variables et leurs niveaux
Niveau
-α
-1
0
+1
+α
Puissance
US
(W/g)
Temp.
(°C)
Durée (min)
0,058
0,075
0,100
0,125
0,142
9,9
16,0
25,0
34,0
40,1
5
15
30
45
55
No.
Puissance
W/g
Temp.
°C
Durée
min
Eq.Catechin
[g/L]
1
-1
-1
-1
0,626
2
1
-1
-1
0,673
3
-1
1
-1
0,897
4
1
1
-1
0,865
5
-1
-1
1
0,783
6
1
-1
1
0,769
7
-1
1
1
1,056
8
1
1
1
1,104
9
-1,68179
0
0
0,843
10
1,68179
0
0
0,985
11
0
-1,68179
0
0,633
12
0
1,68179
0
1,175
13
0
0
-1,68179
0,658
14
0
0
1,68179
0,970
15
0
0
0
0,801
16
0
0
0
0,869
17
0
0
0
0,838
18
0
0
0
0,832
19
0
0
0
0,848
20
0
0
0
0,871
Exploitation des résultats
• Modèle statistique
– Modèle linéaire généralisé
– Equation prennant en compte des effets linéaires,
quadratiques et interactions
• Equation
– TPC = 0.844 + 0.021 P + 0.145 T + 0.086 t + 0.018 P2 +
0.015 T2 – 0.017 t2- 0.002 P.T + 0.002 P.t + 0.018 T.t
Avec,
P: Puissance US
T: Température
t: durée d’extraction
Puissance
Temp.
Durée
US
– Calcul des conditions optimales
0.142 W/g
40.1°C
45 min
Pour une concentration
en PPT maximale
Exploitation graphique
• Graphique de Pareto
– Choix des variables
p = 0.05
• Calcul des surfaces de réponse
Polyphénols spécifiques
• Mêmes extractions
– Dosage des polyphénols dans les extraits par LC-DAD après
thiolyse
– Quantification aux différentes longueurs d’onde
•
•
•
•
Flavanols: 280 nm (fluo)
Dihydrochalcones: 280 nm
Acides hydroxycinnamiques: 320 nm
Flavonols : 350 nm
– Calcul des équations et surfaces de réponse
-
280 nm
Variables
Flavan-3-ols
Dihydrochalcones
Phloretin
Xyloglucosi
de
Temp.
Extracti
on time
Monomeric
Flavan-3-ols
Polymeric
Flavan-3-ols
DP° PCA
-1
-1
-1
0,169
0,143
2,866
0,021
0,144
2
1
-1
-1
0,149
0,126
3,402
0,019
0,138
3
-1
1
-1
0,239
0,212
3,770
0,023
0,153
4
1
1
-1
0,195
0,165
4,618
0,021
0,148
5
-1
-1
1
0,200
0,172
3,898
0,023
0,145
6
1
-1
1
0,196
0,171
3,934
0,023
0,144
7
-1
1
1
0,303
0,274
4,267
0,030
0,154
8
1
1
1
0,328
0,297
4,009
0,031
0,175
9
-1,68179
0
0
0,220
0,194
3,960
0,024
0,153
10
1,68179
0
0
0,224
0,194
3,819
0,024
0,162
11
0
-1,68179
0
0,162
0,138
2,926
0,022
0,152
12
0
1,68179
0
0,318
0,281
4,322
0,027
0,176
13
0
0
-1,68179
0,154
0,132
3,556
0,019
0,134
14
0
0
1,68179
0,283
0,253
4,226
0,029
0,180
15
0
0
0
0,220
0,193
3,943
0,023
0,151
16
0
0
0
0,228
0,199
3,875
0,026
0,159
17
0
0
0
0,227
0,199
3,727
0,025
0,162
18
0
0
0
0,232
0,202
3,706
0,025
0,160
19
0
0
0
0,223
0,195
3,973
0,023
0,150
20
0
0
0
0,225
0,196
3,970
0,027
0,162
No.
US
Power
1
Phloridzin
-
Variables
325 nm
350 nm
No.
US Power
Temp.
Extraction
time
Chlorogenic
Acid
p-coumaroylquinic Acid
Flavo-nols
1
-1
-1
-1
0,049
0,012
0,075
2
1
-1
-1
0,040
0,007
0,078
3
-1
1
-1
0,048
0,008
0,094
4
1
1
-1
0,049
0,007
0,104
5
-1
-1
1
0,037
0,006
0,088
6
1
-1
1
0,039
0,007
0,088
7
-1
1
1
0,047
0,008
0,110
8
1
1
1
0,054
0,008
0,115
9
-1,68179
0
0
0,046
0,008
0,071
10
1,68179
0
0
0,055
0,007
0,090
11
0
-1,68179
0
0,037
0,010
0,078
12
0
1,68179
0
0,058
0,009
0,111
13
0
0
-1,68179
0,039
0,007
0,078
14
0
0
1,68179
0,061
0,009
0,108
15
0
0
0
0,042
0,007
0,096
16
0
0
0
0,044
0,008
0,099
17
0
0
0
0,050
0,008
0,098
18
0
0
0
0,051
0,008
0,101
19
0
0
0
0,043
0,007
0,096
20
0
0
0
0,048
0,009
0,101
Variables d’influence
Main effects
Quadratic effects
Interaction effects
Variables
X1
X2
X3
X1²
X2²
X3²
X1X2
X1X3
X2X3
TPC
p-value
F-ratio
0.0843
3.67
0.0000
174.20
0.0000
61.27
0.1213
2.87
0.2029
1.86
0.1387
2.59
0.8854
0.02
0.8720
0.03
0.2358
1.59
Yield
p-value
F-ratio
0.1094
3.09
0.0581
4.58
1.1969
1.91
0.6378
0.24
0.4335
0.67
0.3967
0.78
0.7923
0.07
0.6972
0.16
0.6907
0.17
Monomeric
Flavan-3-ols
p-value
F-ratio
0.2740
1.34
0.0000
383.05
0.0000
246.42
0.3257
1.07
0.0995
3.30
0.1435
2.52
0.8391
0.04
0.0053
12.56
0.0006
24.61
Polymeric Flavan3-ols
p-value
F-ratio
0.1649
2.25
0.0000
423.10
0.0000
283.02
0.3475
0.97
0.1094
3.09
0.2393
1.57
0.7854
0.08
0.0025
16.07
0.0002
0.2393
DP° Procyanidins
p-value
F-ratio
0.1609
2.29
0.0000
64.67
0.0018
17.83
0.6794
0.18
0.1142
2.99
0.6708
0.19
0.9700
0.00
0.0064
11.80
0.0050
12.85
Phloridzin
p-value
F-ratio
0.4782
0.54
0.0126
9.20
0.0064
11.76
0.4239
0.70
0.8835
0.02
0.3845
0.83
0.3806
0.84
0.2446
1.53
0.4219
0.70
Phloretin
Xyloglucoside
p-value
F-ratio
0.5388
0.40
0.0002
33.80
0.0000
71.34
0.3253
1.07
0.6222
0.26
0.3253
1.07
0.7873
0.08
0.1959
1.92
0.0123
9.29
Chlorogenic acid
p-value
F-ratio
0.4849
0.53
0.0118
9.43
0.2367
1.58
0.7133
0.14
0.7771
0.08
0.7952
0.07
0.3990
0.78
0.3416
1.00
0.3416
1.00
p-Coumaroylquinic acid
p-value
F-ratio
0.1313
2.70
0.5244
0.44
0.6958
0.16
0.4634
0.58
0.1244
2.81
0.8818
0.02
0.3577
0.93
0.0482
5.06
0.0482
5.06
p-value
F-ratio
0.0108
9.75
0.0000
87.30
0.0001
39.42
0.0010
21.28
0.7899
0.07
0.4771
0.55
0.3502
0.96
0.5283
0.43
0.7507
0.11
280 nm
325 nm
350 nm
Flavonols
Exemple des flavonols
• Graphique de Pareto
• Equation et conditions optimales:
Flavonols = 0.098 + 0.004 P + 0.011 T + 0.007 t – 0.005 P2
+ 0.002 P.T – 0.001 P.t – 0.001 T2 + 0.001 T.t – 0.001 t2
US Power
Temperature
Durée
0.117 W/g
37.8°C
55 min
Comparaison avec / sans US
• Dans les conditions optimales
TPC
Eq.Catechin
(g/L)
60,00
Comparison of extraction methods
50,00
> 20%
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
time (min)
40,00
50,00
Mécanisme
• Déstruction des structures
– cavitation sur les surfaces exposées
• Exemple (carvi)
Initial seed
Conventionnal Extraction
300 min. 69°C – Yield 1,6%
Sono-extraction
30 min. 20°C - Yield = 1,7%
Extraction de jus par microondes
• Thèse Aurélie Cendrès
• Prune (abricot, raisin)
Principe
Temperature
Sensor
Reflex
Oven opening
Microwave
oven
Fruits
PTFE grid
Fruit juice
Computer
« Easy Wave »
Oven
opening
Column
Graduated
cylinder
Chronograph
¾Fruits frais et non transformé
placés dans le micro-onde
¾Chauffage par micro onde de
l’eau intrinsèque des fruits
¾Génération d’un phénomène
d’hydrodiffusion de l’intérieur
Æl’extérieur du fruit
¾Le jus atteint l’extérieur du
fruit et tombe par gravité
¾Récupération directe du jus
sans étape supplémentaire
En pratique
Sonde (dans le fruit)
Jus
Et les produits
Est-ce que ça se boit?
Test par les membres du laboratoire (7 femmes, 6 hommes, 21-55 ans)
Je n’aime pas
J’aime
0
9
5.5
Raisin
5.4
Prune
Abricot
3.3
Impact de la puissance appliquée
Yield (ml.kg-1)
600
400
1.5 W.g-1
1 W.g-1
0.5 W.g-1
200
0
0
5
10
Time (min)
15
20
Augmentation de la puissance appliquée:
Extraction plus rapide mais rendement plus faible.
Le facteur limitant est la surchauffe des fruits
Modélisation de l’extraction
¾Une formule adaptée: y=a/(1+(x/x0)^b) décrit bien la forme de l’extraction
¾Les coefficients:
Æb=trouvé à environ –2, forme générale
Æa= plateau: volume maximal extrait
Æx0=point d’inflexion: point où la vitesse maximale est atteinte
Coef a
Coef xo
300
20
15
200
10
100
5
0
0
200
400
puissance
600
0
800
Coef a manip1
Coef a manip2
Coef x0 manip1
Coef x0 manip2
Le modèle permet de mieux quantifier
les impact des modifications de la
puissance appliquée sur l’extraction.
On devrait extraire plus et plus vite, or
on extrait moins: surchauffe.
Observation du phénomène
• Extraction à partir de fruits frais
Volume (ml) & Temperature (°C)
Vitesse (ml/min)
16
160
Vitesse maximale
120
80
12
12
40
4
3
8
4
Hydrodiffusion
0
0
0
10
Time (min)
20
30
Que se passe-t’il avec des fruits
initialement congelés?
• Extraction à partir de fruits congelés
Volume (ml) & Temperature (°C)
200
16
2
150
100
Vitesse (ml/min)
1
Hydrodiffusion
8
3
50
4
0
-50
12
0
10
Formation de
points chauds
Fonte de la glace
20
Temps (minutes)
30
Composition des produits
4
Polyphénols (g/L)
40
3
30
2
20
1
10
0
200
Prune
Abricot
Raisin
Anthocyanes (mg/L)
0
Sucres (g/L)
Prune
16
Abricot
Raisin
Acides (g/L)
160
12
120
8
80
4
40
0
0
Prune
Abricot
Raisin
Prune
Abricot
Raisin
Ratio of concentration
Des comportements différents des polyphénols
selon leur répartition dans le fruit
2
Polyphénols de la chair
(flavanols, acides
hydroxycinnamiques)
1,5
1
0,5
0
Ratio of concentration
0
50
100
150
Juice fraction (ml)
200
250
2
Polyphénols de l’épiderme
(anthocyanes et flavonols)
1,5
1
0,5
0
0
50
100
150
Juice fraction
200
250
Extraction microonde
• Mécanismes d’extraction
– Frais: chauffage du centre vers l’extérieur, moteur de
l’hydrodiffusion
– Congelé:
• déstructuration liée à la formation de cristaux de glace
• Fonte (points chauds puis conduction thermique)
• Hydrodiffusion après décongélation
• Des questions en suspens:
– Volume de vapeur produites (en fonction de la puissance
appliquée)
– Optimisation des rendements: éviter la surchauffe?
– Oxydation enzymatique: oui, non, quelles conditions?