ÉTUDE COMPARÉE DU SÉRUM SANGUIN ET DU LIQUIDE

ÉTUDE COMPARÉE DU SÉRUM SANGUIN
ET DU LIQUIDE FOLLICULAIRE PRÉOVULATOIRE
CHEZ LA VACHE
Y. MENEZO
TESTART*
J.
Chaqué
KHATCHADOURIAN
Laboratoire de Biologie 406, 1. N. R. A.,
Institut national des Sciences appliquées,
69621 Villeuvbanne
.,
*
Station de Physiologie animale,
Centve national de Recherches zootechniques, 1. N. R. !
.,
783b0
,Jouy
en
osas
J
RÉSUMÉ
Le sérum et le
critères :
liquide
folliculaire
préovulatoire
les protéines étudiées par électrophorèse
- les activités enzymatiques,
- la pression osmotique,
- les aminoacides libres.
-
de Vache ont été
sur
gel
de
comparés
selon
quatre
polyacrylamide,
Les diagrammes électrophorétiques folliculaires et sériques sont très voisins, l’albumine
est le composé le plus important des deux liquides testés.
Les taux des différents amino acides sont très voisins dans les deux liquides ; cependant
la concentration totale est plus faible dans le liquide folliculaire.
En ce qui concerne les activités enzymatiques, la principale différence est liée à la présence
dans le liquide folliculaire de N-acétyl glucosaminidase et de fi-glucuronidase, ces enzymes ne
sont pas décelables dans le sérum.
La pression osmotique est légèrement plus faible dans le liquide folliculaire (
88 millios2
moles) que dans le sérum (
310 milliosmoles).
INTRODUCTION
Le liquide folliculaire baigne l’ovocyte jusqu’au moment de l’ovulation et il est
donc nécessaire d’en connaître la composition pour aborder in vitro l’étude de la
maturation ovocytaire mais également de la fécondation dans la mesure où, chez les
bovins, le volume de liquide émis par le follicule au moment de l’ovulation est très
important.
Les études chez la Vache (I,uTwAh-l2naw, 4
ACHARlA ig:,8 :
Z
ENS et E,
J
N
)5 I
H
;
Ax
J
IWs
S
DIN
et al., 19
66), la Lapine (D
AVID
et al., ),
1973 la Truie (SaIVE
S et aL.,
R
), la Femme (S
4
6
9
i
r,Gi et al., z9!3), ont montré que le sérum participe de façon
HA
très importante à l’élaboration du liquide folliculaire. Le rôle des protéines, des
amino acides libres et de la pression osmotique (H
Ay
AIDRI et GwATKIrr, z
973
; Mi
MOTO et G,
HAN 1973 a, b, c) est primordial dans le processus de maturation ovocyC
taire et dans celui de la fécondation.
Ces trois paramètres et certaines activités enzymatiques ont été étudiés dans le
sérum et le liquide folliculaire afin de mieux connaître les relations existant au
niveau de la paroi du follicule et également afin de déterminer si le sérum peut être
employé pour l’élaboration des milieux de cultures de follicules et d’ovocytes.
MATÉRIEL
.
1
ET
MÉTHODES
Collecte des
-
liquides
folliculaire est collecté sur cinq vaches, de race Française Frisonne Pie Noire,
heures après le début des chaleurs, décelé par un taureau. A l’abattage, le liquide folliculaire du follicule le plus développé (environ 15 mm) est prélevé directement à l’aide d’une
5 ml. Le sang des mêmes animaux est également collecté pour analyse du sérum.
,
seringue de 2
Le
6 à
1
liquide
20
.
2
-
Électrophorèses
Les électrophorèses sont réalisées sur gel de polyacrylamide selon D
ms 4
A
g.
I
(
)
6 Le sérum
et le liquide folliculaire sont dilués au 1/10 avec du saccharose 0
25 M avant dépôt. La coloration
,
. La décoloration est
est réalisée à l’amido-Schwartz à I p. 1000 dans l’acide acétique p. 100
réalisée
électrophorétiquement.
3.
-
Zymogvammes
Le dispositif employé (
ARDON 68).
I9 Il permet l’établissement
(
) est celui de BuissiÈRE et N
1
des zymogrammes tissulaires et cellulaires et des liquides biologiques (P
ARDON
N
LANTEVIN et ,
I9!2 ; FLECHO:o.1 et MENEZO, I9!3). Le sérum et le liquide folliculaire, placés en solutions tampons
convenables sont incubés en présence d’un substrat chromogène sur un support de papier filtre
°C, le résultat
placé dans un réservoir capillaire plastique. Après trois heures d’incubation à 37
de la réaction enzymatique est estimé à l’oeil nu par lecture de la coloration observée. La liste des
8 enzymes testées et les substrats employés figurent dans le tableau i.
1
.
4
Les
mesures
-
Pression
osmotique
sont faites directement à l’osmomètre .
ROLABO
P
,5.
-
es
y
Acides aminés lib
Les analyses sont effectuées sur résine échangeuse d’ions (S
PACKMAN et al., 195
8) sur aminoONDI et ,
M
ONGIOVANNI Ic)!2 ; NOE et al., 1974
B
68 ; :o.10
; MENEZO I97
).
4
lyzer Optica (M
, I9
ONDINO
L’élution des amino acides neutres et acides est réalisée par des tampons au citrate de lithium de
manière à obtenir une séparation quantitative de la glutamine et de l’asparagine. Les échantillons
sont préparés de la façon suivante : 0
5 ml du liquide à analyser sont lyophilisés en présence de
,
quantités connues de norleucine et d’acide a-amino g-guanidino propionique utilisés comme
AMILTON
standards internes. Le lyophilisat est repris à l’acide sulfosalycilique 3 p. 100 selon H
I9 puis centrifugé. Le surnageant peut alors être utilisé directement pour analyse. L’étude
(
6z),
.
de la reproductibilité indique que l’erreur n’est pas supérieure à 5 p. 100
)
1
(
API
8
System, 3
-
La Balme les Grottes.
RÉSULTATS
i.
-
Électrophorèses (fig. i)
électrophorétiques ne font pas apparaître de différence entre
testés où l’albumine et la transferrine sont les composés les plus
Les diagrammes
les deux
liquides
importants.
Ces résultats sont en accord avec ceux de D
ESJARDINS et al., (i
66). Cependant,
9
si les y-globulines sont bien représentées dans le liquide folliculaire, la technique ne
permet pas de déterminer si quelques composés sériques de hauts poids moléculaires
en sont absents comme chez la Femme (S
I
G
HAL
et al., i9!3).
.
2
-
ammes (tabl. i)
y
Zymog
Les zymogrammes folliculaires et sériques sont assez voisins. Les activités phosphatasiques (déjà décrites dans le liquide folliculaire : KI;:!N!y, ),
973 estérasiques
z
et aminopeptidasiques, sont présentes dans les deux liquides. Une partie des enzymes
repérées dans le follicule semble donc provenir du sérum, par filtration comme cela
est observé pour les protéines non enzymatiques. Cependant, la différence la plus
intéressante est observée pour les activités glucuronidasiques et N-acétyl glucosaminidasiques, présentes dans le liquide folliculaire, mais non détectées dans le sérum.
Il semble que ces deux activités soient équivalentes à la hyaluronidase responsable
avec certaines enzymes protéolytiques de la rupture du follicule. Ces deux activités
enzymatiques n’ont pas été détectées dans le liquide de follicules en voie d’atrésie
40 à 5o heures après le début des chaleurs. Sous réserve que cette activité hyaluronidasique n’apparaisse pas, ou soit inhibée, ou se trouve à un taux trop faible dans
les follicules devant être frappés d’atrésie, la présence de cette enzyme pourrait être
un critère de l’évolution normale du follicule, et par là même de l’ovocyte. La
fi-glucuronidase du liquide folliculaire pourrait intervenir dans le processus de
des spermatozoïdes comme celà a été décrit chez le Hamster (G
KIN
T
WA
capacitation
et
TCHISON, 1971).
U
H
.
3
-
Pression
osmotique
AN DE
K ),
MAR
LDS et V
La pression osmotique est, en accord avec O
1957 de 288
(
milliosmoles, dans le liquide folliculaire ; elle est plus faible que celle du sérum :
10 milliosmoles.
3
.- Amino acides libres
4
(tabl.
,
2
fig. 2
)
Si la concentration totale en amino acides libres est légèrement plus faible dans
que dans le sérum, les taux relatifs des différents composés sont
assez voisins dans les deux liquides. L’acide glutamique + glutamine, la glycine,
l’alanine et la valine sont les composés les plus importants. Les quelques différences
observées sont dues aux teneurs en taurine, glycine, ornithine et arginine, sensiblement plus faibles dans le liquide folliculaire que dans le séruni. I,es amino acides du
cycle de l’urée semblent soit franchir difficilement la paroi du follicule, soit être métabolisés très rapidement à l’intérieur de celui-ci.
le
liquide folliculaire
La concentration en alanine est par contre plus importante dans le liquide
iD et G
A
H
i
WATKIN )
folliculaire que dans le sérum. R
1973 avaient observé que cet
(
à
la
maturation
du
follicule
de Hamster in vitro.
amino acide est indispensable
des
sur
le
sérum
sont
en accord avec ceux de
résultats
effectuées
Les
analyses
à
ce
du
De
même
FnHNirrG et al., 6
stade
sexuel.
cycle
D!sJnRDirrs et al., 66)
19
(
)
7
19
(
n’avaient pas observé de différences significatives entre le sérum et le liquide folliculaire pour l’azote aminé libre total.
CONCLUSIONS
Ces observations semblent favorables à l’utilisation du sérum dans les milieux
de culture de follicules et éventuellement d’oeufs fécondés. Cependant les différences
observées au niveau de la pression osmotique et surtout la présence de la p-glucuronidase et la N-acétyl glucosaminidase dans le liquide folliculaire indiquent claire-
ment que celui-ci ne provient pas exclusivement d’une filtration de composés sériques.
Il est en plus le résultat de l’activité hormonale et métabolique propre au follicule.
D’ailleurs T
HIBAULT 66)
19 avait obtenu des résultats nettement moins bons en
(
cultivant l’oeuf de Vache avec du sérum pur qu’avec du liquide folliculaire. Il semble
donc que dans l’élaboration des milieux de culture on puisse utiliser pour partie du
sérum, mais en tenant compte des faibles différences observées entre celui-ci et le
liquide folliculaire et dont le rôle physiologique nous échappe pour l’instant.
Requ pour publication
en
janvier 1975.
SUMMARY
COMPARATIVE STUDY OF BLOOD SERUM AND PR!OVUI,ATORY
FOLLICULAR FLUID OF THE COW
Cow’s blood
criteria :
serum
and
preovulatory
follicular fluid
were
compared according
to the follo-
wing
-
-
-
-
!
!
!
!
-
proteins studied by disc gel electrophoresis,
enzymatic activities,
osmolarity,
free aminoacids.
Disc gel electrophoresis do not show any difference between both fluids where albumin
is the major component.
The levels of the different aminoacids are not very different between the two fluids, however the total amount is slightly lower in follicular fluid.
The most important difference in the enzymatic activities is due to the presence in folli
cular fluid of N-acetyl-glucosaminidase and glucuronidase, not detected in blood serum.
Osmolarity is less important in follicular fluid (
88 miliosmols) than in serum (
2
io millios3
mols).
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