structure, dynamique, états excités - Germain Salvato

LABORATOIRE DE CHIMIE PHYSIQUE
Université Paris Sud 11
Etude théorique des propriétés photophysiques de la ECFP :
structure, dynamique, états excités
Directrice de stage : Isabelle Demachy
Vallverdu Germain
Magistère de Physico-Chimie Moléculaire
Année 2004/2005
1
Remerciements
Je remercie Mr Alain FUCHS, directeur du Laboratoire de Chimie Physique d'Orsay de m'avoir permis
de faire ce stage au sein du LCP.
Je remercie Mr Pascal PERNOT, de m'avoir accueilli au sein du groupe de Chimie Théorique du
Laboratoire de Chimie Physique d'Orsay.
Je tiens à remercier Mme Isabelle DEMACHY, pour son accueil, son encadrement, ses gateaux et
surtout son aide concernant le stage et beaucoup d'autres questions.
Enfin je remercie Jacqueline Ridard et Bernard Levy, pour leur aide et les nombreuses discussions
enrichissantes que j'ai pu avoir avec eux au cours de mon stage.
2
SOMMAIRE
Introduction ...................................................................................................................................... 5
I Méthodologie ............................................................................................................................... 7
1) Champ de force, Dynamique moléculaire .......................................................................................... 8
2) Calculs de mécanique quantique ........................................................................................................ 8
3) Calculs mixtes classique-quantique .................................................................................................. 10
II Influence d'un état de protonation ................................................................................. 11
1) Caractéristiques Structurales issues de la dynamique moléculaire ................................................... 12
2) Calculs des spectres d'absorption ...................................................................................................... 16
III Etat excité du chromophore et fluorescence de la ECFP ......................... 20
1) Etude du premier état excité du chromophore .................................................................................. 21
2) Etude de la fluorescence de la ECFP ................................................................................................ 24
Conclusion ...................................................................................................................................... 30
Bibliographie ......................................................................................................................................... 31
Annexe1 : Résultats antérieurs [8] ........................................................................................................ 32
Annexe2 : Géométries perpendiculaires ............................................................................................... 33
3
INTRODUCTION
4
1) Intérêt biologique des protéines luminescentes et objets de l'étude
Dans la famille des protéines bioluminescentes, la Green Fluorescent Protein (GFP), est
aujourd'hui largement utilisée pour suivre des processus cellulaires et biomoléculaires grâce à ses
propriétés de fluorescence dans le domaine visible [1,2]. En effet, la GFP peut être fusionnée avec une
protéine hôte sans perturber les caractéristiques (coefficient de diffusion, structure tridimensionnelle
...) ni la fonction de cette dernière. Le chromophore responsable de cette émission est fixé sur une
hélice  située au coeur d'un ensemble de feuillets  formant un tonneau qui protège le chromophore
de l'environnement extérieur de la protéine, ce qui confère à la luminescence de la GFP une grande
stabilité vis à vis des conditions physico-chimiques du milieu.
Des mutations d'un nombre limité de résidus ont été réalisées afin d'améliorer et de diversifier
les propriétés photophysiques de la GFP. L'une d'entre elle, la substitution de la tyrosine 66 par un
tryptophane, a conduit à la classe des CFPs, Cyan Fluorescent Protein, caractérisée par une émission
de couleur cyan. Pour obtenir une intensité de luminescence suffisante, d'autres mutations sont
nécessaires (S65T, F64L, N146I, M153T, V163A) et conduisent à la ECFP (enhanced CFP) [1] qui
constitue l'objet de notre étude. Une utilisation très répandue des mutants de la GFP, est l'étude, par
transfert résonant d'énergie de fluorescence (FRET), de l'interaction entre protéines [3]. Pour cela, un
couple donneur accepteur fréquemment employé est le couple constitué d'une Yellow Fluorescent
Protein, YFP, et de la ECFP.
Cependant, l'utilisation de ces protéines est encore limitée par la complexité de leurs
propriétés photophysiques. Une des difficultés vient de la dépendance de la fluorescence en fonction
de divers paramètres physico-chimiques du milieu (température, pH, ...). Il est donc nécessaire de
poursuivre les recherches permettant d'améliorer la compréhension des processus photophysiques
d'une protéine donnée. La fluorescence et les processus de désexcitation de la GFP ont été largement
étudiés [5,6]. Cependant, le chromophore de la CFP et ses propriétés photophysiques diffèrent
significativement de celles de la GFP et une analogie directe n'est pas envisageable.
Des travaux ont été effectués dans ce sens dans le groupe Chimie Théorique du Laboratoire de
Chimie Physique. Des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées sur la ECFP et son
chromophore dans son environnement réel [8]. L'analyse des résultats a permis, d'une part de
déterminer la structure de la protéine et d'autre part, d'obtenir les spectres d'absorption à l'aide de
calculs de mécanique quantique (annexe1). La nature des réseaux de liaisons Hydrogène et les
propriétés spectrales de la protéine dépendent en partie de l'état de protonation des chaines latérales
titrables (Acide Glutamique, Acide Aspartique, Lysine, Tyrosine et Histidine). Dans l'environnement
proche du chromophore, se trouvent plusieurs de ces résidus. Au cours de mon stage, une première
étape a consisté à étudier l'influence de l'état de protonation du résidu Glu222 qui est en interaction
directe avec le chromophore. Par ailleurs la première simulation moléculaire décrivant la dynamique
de l'état excité singulet du chromophore a été réalisée.
Dans une première partie, seront présentées les différentes méthodes de simulation numérique
mises en oeuvre : la dynamique moléculaire et les calculs quantiques. Une deuxième partie traitera de
l'influence d'un changement d'état de protonation sur la structure et le spectre d'absorption des
conformations de la protéine. Et en troisième partie, seront exposés les résultats de l'étude du
chromophore dans son état excité.
2) Détails sur la structure et les caractéristiques photophysiques de la Cyan Fluorescent Protein,
La ECFP est constituée de 229 acides aminés et présente une structure tridimensionnelle très
proche de celle des GFPs. Le tonneau engendré par 11 feuillets  crée une structure proche d'un
cylindre parfait (4,2 nm de long et 2,4 nm de diamètre) et confère à la protéine une certaine rigidité
(figure1). Le chromophore est fixé sur une hélice  centrale. Dans la EGFP, le chromophore est le 5Z5(1H-indol-3-ylemethylène-4H-imidazol-4-one) de formule brute C17H16N4O3. Il se forme par une
cyclisation auto-catalysée, postérieure au repliement de la protéine, entre les résidus 65-66-67 [1].
Dans la ECFP, trois acides aminés impliqués dans la formation du chromophore : la Thréonine 65, le
Tryptophane 66 et la Glycine 67 (figure 2).
5
Figure1 : La Cyan Fluorescent Protein,
le chromophore est représenté en bleu
Figure2 : Le chromophore de la CFP,
résultant de la cyclisation de
la Thréonine 65, le Tryptophane 66
et la Glycine 67
19
Une étude par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) du F [4] a permis de mettre en
évidence l'existence d'un échange entre deux conformations avec un temps caractéristique d'échange
d'une dizaine de millisecondes. Une étude aux rayons X [5] de la structure de la CFP a permis de
caractériser ces deux conformations appelées A et B. Elles pourraient être attribuées à deux
orientations différentes des chaînes latérales de plusieurs résidus dont les principaux sont His148 et
Tyr145 (figure3).
Figure3 : Conformations A et B de la ECFP, en bleu le chromophore, en rouge Tyr145, en vert His148
La ECFP, présente un maximum d'absorption à 436 nm et un maximum d'émission à 476 nm
responsable de sa couleur cyan. Le spectre de fluorescence est assez complexe. L'analyse des déclins
de fluorescence par des expériences résolues en temps réalisées par H. Laguitton Pasquier au
Laboratoire de Chimie Physique ont montré l'existence de quatre espèces émissives. Dont les durées de
vie et les intensités de fluorescence dépendent de la température et du pH. La nature de ces espèces ne
peut être déterminée directement par l'expérience. Il peut s'agir de différentes conformations, de
différents états de protonation de la protéine existant ou non à l'état fondamental ou encore de systèmes
résultant de processus de désactivation de l'état excité. Afin d'identifier ces espèces, une étude
théorique a été envisagée.
6
PREMIERE PARTIE
METHODOLOGIE
7
Le but de cette partie est d'exposer brièvement le principe des techniques classiques et
quantiques utilisées, et la façon de les associer pour effectuer des calculs mixtes classiques-quantiques.
I) Champ de force, Dynamique moléculaire
Les techniques de mécanique moléculaire s'appliquent principalement à l'étude des
conformations, des propriétés thermodynamiques et des modes vibrationnels des molécules. Ce sont
des méthodes utilisant la mécanique classique.
La molécule est modélisée par des sphères et des ressorts représentants les déformations
internes. Elle est décrite comme un système mécanique, sans prendre en compte explicitement la
nature microscopique et quantique des interactions entre les électrons et les noyaux. La densité
électronique est traitée de manière effective par l'intermédiaire de charges ponctuelles. L'énergie du
système est calculée par une somme de termes paramétrés, additifs et indépendants les uns des autres
(1). Ils correspondent aux énergies potentielles des différentes déformations possibles de la molécule et
des interactions entre atomes non liés : interactions électrostatiques (entre charges ponctuelles) et de
Van Der Waals (figure 4). Le champ de force, correspond à la définition de l'ensemble des fonctions
mathématiques et des paramètres relatifs aux différents termes de l'énergie. La recherche des
conformations d'équilibre consiste alors à la minimisation de cette énergie potentielle.
Figure 4 : déformations qui s'exercent sur les liaisons d'une molécule
et interactions entre atomes non-liés.
A partir de l'équation (1) et d'un champ de force, il est possible de réaliser des simulations
de dynamique moléculaire, mimant le comportement réel du système au cours du temps. Son évolution
est déterminée en définissant à chaque pas de temps un point de l'espace des phases à l'aide d'une
résolution numérique des équations du mouvement, dans le cadre de la mécanique Newtonnienne. Ces
simulations donnent des résultats statistiques sur les grandeurs géométriques du système et les
trajectoires des atomes ou résidus.
Un des grands avantages de ce type de calculs est leur rapidité ce qui permet d'étudier des
systèmes réels, plus complexes et plus gros, comme par exemple des systèmes biologiques. Alors que
les calculs quantiques sont limités à quelques centaines d'atomes, la mécanique moléculaire est adaptée
à des systèmes comportant jusqu'à une centaine de milliers d'atomes. La réorganisation électronique
n'étant pas prise en compte, il est impossible de simuler des phénomènes liés à des ruptures de liaison
ou à des transferts de charge.
II) Calculs de mécanique quantique
Pour obtenir les spectres d'absorption ou d'émission d'une molécule il est nécessaire de
calculer les énergies des transitions électroniques. Ces phénomènes mettant en jeu une réorganisation
du nuage électronique de la molécule, il faut prendre en compte les degrés de liberté électroniques.
8
Pour cela, des calculs de type interaction de configurations, ou basés sur la théorie de la fonctionnelle
de la densité dépendant du temps, TD-DFT, ont été mis en oeuvre.
1) Interaction de configurations
Les calculs avec interaction de configurations consistent à chercher la fonction d'onde sous la
forme d'une combinaison linéaire de déterminants de Slater. Grâce à cette méthode qui est une
extension des calculs de type Hartree-Fock, il est possible d'améliorer la qualité de la fonction d'onde
et la précision sur son énergie, en diminuant l'énergie de corrélation.
Cette méthode peut être mise à profit pour calculer l'énergie des transitions électroniques. La
méthode CIS, consiste à réaliser une interaction de configurations en cherchant la fonction d'onde sous
la forme d'une combinaison linéaire de déterminants de Slater comprenant celui de l'état fondamental
(0)
(1)
 et tous les déterminants correspondant aux configurations électroniques mono-excitées  (2).
S'ils sont construit sur la base des OM qui sont fonctions propres de l'opérateur de Fock i, il
(0)
(1)
n'existe aucun couplage entre le déterminant  et les déterminants  , car ils ne diffèrent que d'une
(0)
orbitale. Les fonctions propres de l'hamiltonien du système sont le déterminant  et des
combinaisons linéaires de déterminants mono-excités. La diagonalisation de l'hamiltonien donne donc
les énergies des premiers niveaux excités ainsi que l'analyse de la transition électronique de l'état
fondamental vers un état excité sous la forme d'une combinaison de transitions mono-électroniques
d'OM occupées vers des OM vacantes.
En précisant l'état électronique excité étudié, il est possible d'optimiser la géométrie de la
molécule pour minimiser l'énergie de l'état excité en question. De plus, cette méthode donne l'énergie
de la transition électronique ainsi que sa nature.
2) TD-DFT
La théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) est une méthode permettant de calculer
l'énergie d'un système dans son état fondamental. L'énergie est calculée à l'aide d'une fonctionnelle de
la densité électronique en prenant en compte les énergies d'échange et de corrélation. Par un calcul
DFT, il n'est pas possible d'optimiser la géométrie de l'état excité et de calculer son énergie.
Cependant, la théorie de la fonctionnelle de la densité dépendant du temps, TD-DFT, permet
de déterminer la nature et l'énergie d'une transition électronique de la façon suivante :
Soit Xla fonction d'onde de l'état fondamental, et A, celle d'un état excité. Soit TA un
opérateur linéaire, définit par
A = TA X
A et X étant des fonctions propres de l'hamiltonien du système H :
H X = EX X et HA = EAA
D'après la définition de l'opérateur TA : TA H X = EX TA A et H TA X = EA TA X
La différence de ces deux dernières équations, donne l'équation aux valeurs propres suivante :
[H,TA ] = (EA-EX)TA
La résolution de cette équation donne donc (EA-EX) qui est l'énergie de la transition
électronique conduisant de A à X, et TA qui définit entre quelles OM a lieu la transition électronique.
Pour résoudre cette équation, il est préférable de se placer dans le cadre de la seconde quantification, et
d'écrire les opérateurs TA et H en fonction des opérateurs création et annihilation. En faisant
l'approximation que la transition électronique est une combinaison linéaire de monoexcitations,
l'opérateur TA s'écrit alors : TA =Σtij ai*aj.
La diagonalisation du commutateur [H,TA ], dans la base des opérateurs {ai*aj}, conduit donc
aux énergies des transitions électroniques (les valeurs propres). Les vecteurs propres, TK , donnent la
décomposition sur les OM de la transition électronique.
Bien que moins précise que des méthodes multiconfigurationnelles, type CASPT2, pour la
description des états excités, la méthode TD-DFT se révèle très efficace pour traiter des systèmes
9
complexes comme des molécules organiques étendues ou des complexes de métaux de transition.
III) Calculs mixtes classique-quantique
Pour effectuer une étude à la fois structurale et photophysique, il est nécessaire de réaliser une
dynamique moléculaire de la protéine dans son solvant aqueux. En effet, si la dynamique est
suffisamment longue, elle fournira un échantillonnage de conformations de la protéine et de son
chromophore qui sera représentatif de la zone Franck-Condon. Un calcul des transitions électroniques
sur l'ensemble de ces conformations permettra ensuite de tracer les différents spectres, en les
approximant par l'histogramme des transitions électroniques pondérées par leur force d'oscillateur.
L'inspection du spectre expérimental (annexe1) montre qu'il faut considérer l'ensemble des transitions
électroniques de longueur d'onde entre 300 et 600 nm, c'est à dire les quatres premières. De plus, si la
densité électronique de l'état excité est trop différente de celle de l'état fondamental, la méthode TDDFT donne des résultats imprécis. Prendre en compte un plus grand nombre de transitions
électroniques apporterait donc beaucoup d'imprecisions et des informations inutiles.
Un calcul des conformations de la protéine ne nécessite pas l'utilisation de la mécanique
quantique. L'échantillon de conformations sera obtenu par une dynamique moléculaire utilisant un
champ de force. Les transitions électroniques sont obtenues par un calcul quantique sur un ensemble
d'atomes restreint, responsable des propriétés photophysiques de la protéine appelé chromophore.
Celui-ci est constitué de l'ensemble de la structure obtenue après cyclisation des résidus Thr65, Trp66
et Ser67, augmenté des liaisons peptidiques qui le lient à la protéine. La coupure intervient au niveau
de la liaison simple entre la fonction amide et le carbone alpha de chaque résidu voisin (Leu64 et
Val68) remplacé par un atome d'hydrogène (figure5). Le chromophore ainsi défini, qui sera utilisé
pour les calculs quantiques, comporte 46 atomes.
Figure 5 : Le chromophore, utilisé pour les calculs quantiques, avec la numérotation des atomes
Les dynamiques moléculaires ont été réalisées en utilisant le programme AMBER version 8
[9], et le champ de force AMBER 1999 [10] particulièrement adapté à la description des protéines, sur
une durée allant de 1 à 2 ns, avec un pas de calcul de 1 fs. Les simulations ont porté sur l'ensemble de
+
la protéine, plus les 166 molécules d'eau cristallographiques, ainsi que des ions Na afin de neutraliser
la protéine. Cet ensemble est placé dans une boite d'eau parallélépipédique contenant environ 8100
3
molécules d'eau dont les dimensions sont : 60x76x77 Å . La boite contient 28500 atomes au total, des
conditions périodiques aux limites sont imposées et les interactions électrostatiques sont décrites à
l'aide de la méthode d'Ewald [11]. Des conformations de la protéine ont été extraites toutes les 10 ps.
Pour chacune d'entre elles, un calcul des transitions électroniques du chromophore a ensuite été
effectué à l'aide du programme GAUSSIAN (2003) [12], en utilisant la méthode TD-DFT, et la
fonctionnelle hybride B3LYP [13,14] dans la base 6_31G*. Les calculs quantiques sont effectués sur
le chromophore défini plus haut (figure5), et son environnement est pris en compte en incluant le
champ électrostatique créé par les charges de la protéine et de l'eau.
10
DEUXIEME PARIE
INFLUENCE D'UN ETAT DE
PROTONATION
11
Afin d'étendre le champ de l'utilisation de la ECFP à des milieux de pH différents, il est
nécessaire de connaître les conséquences structurales et photophysiques des différents états de
protonation de la protéine. Parmi les acides aminés présents dans la ECFP, seuls 5 ont un caractère
acido-basique : L'Arginine, la Lysine, l'Histidine, l'Acide Aspartique et l'Acide Glutamique. Dans les
simulations effectuées précédemment, chacun de ces résidus a été pris dans son état de protonation
standard à pH neutre : déprotoné pour les acides Glutamique et Aspartique, protoné pour la Lysine et
l'Arginine et neutre pour les Histidine. Dans cette partie, sont exposés les résultats de l'étude d'un état
de protonation dans lequel le résidu Glu222 est sous sa forme acide, tous les autres acides aminés
titrables étant inchangés. Cet état a été choisi car le groupement carboxylate de Glu222 crée des
liaisons Hydrogène fortes avec le chromophore. De plus dans la GFP, il est généralement admis que ce
résidu est accepteur de proton au cours d'un transfert à l'état excité. Son état de protonation pourrait
donc jouer un rôle prépondérant dans les caractéristiques structurales et spectroscopiques.
I) Caractéristiques structurales issues de la dynamique moléculaire
1) Conformation A
La géométrie de départ a été obtenue à partir de la structure aux rayons X de la protéine issue
de Protein Data Bank [5]. Après l'ajout des atomes manquant (non discernables sous rayons X) avec le
programme Leap de Amber, l'énergie de l'ensemble de la boite décrite plus haut, a été optimisée en
trois étapes, à volume constant. Premièrement, seuls les hydrogènes ont été laissés libres, ensuite
l'ensemble de la protéine, en gelant les molécules d'eau, et enfin l'ensemble de la boite. Le système a
ensuite été chauffé de 100 K à 300 K en 60 ps. La dynamique moléculaire a alors été réalisée, à
pression (105 Pa) et température (300 K) constante, pendant 2 ns.
L'analyse des trajectoires des atomes au cours du temps, a permis d'étudier la structure de la
protéine et le réseau de liaisons Hydrogène entourant le chromophore. La figure 6 montre, en fonction
du temps, l'écart quadratique moyen de la position des carbones  par rapport à la structure aux rayons
X de la protéine (RMSd). Après une forte variation dans les 150 premières picosecondes, celui-ci se
stabilise et une légère dérive est observée, ce qui montre que la structure de la protéine est bien
conservée au cours de la simulation.
Figure 6 : RMSd : a) en noir les carbone  des résidus impliqués dans un feuillet  ou l'hélice 
centrale, b) en gris les autres carbone , c) tous les carbone 
L'étude des trajectoires des résidus et des molécules d'eau fait apparaître quatre zones : 200600 ps, 600-1000ps, 1000-1500ps, et 1500-1900ps, correspondant à quatre environnements différents
du chromophore. Ils diffèrent par la présence ou non de molécules d'eau provenant du solvant à
proximité de l'azote de l'indole (N9) et de l'oxygène de la fonction alcool de la Sérine 205 (OG)
(figure7a). Entre 200 et 600 ps, aucune molécule d'eau du solvant n'est proche du chromophore, une
première molécule d'eau W1' arrive vers 600ps, une deuxième W2' arrive vers 1000 ps, une troisième
W3' arrive vers 1500ps et W1' repart vers 1900ps pendant que la deuxième prend sa place. Un
12
deuxième événement justifie de scinder la simulation en deux parties aux alentours de 1000 ps. Il s'agit
de la rupture de la liaison Hydrogène entre OG et N9 (figure7b). Ceci est la conséquence d'une part
d'un mouvement de la chaîne principale de la Sérine205 et d'une torsion de la liaison entre le carbone
 et le carbone portant l'oxygène OG.
Figure 7 : a) Distance entre les molécules d'eau du solvant, W1', W2', W3' et l'alcool de Ser205
b) distance entre N9 et OG de Ser205
Des réseaux de liaisons Hydrogène ont été calculés pour les quatre zones décrites
précédemment (figure8). Ceux-ci présentent des différences significatives, d'une part par rapport au
réseau obtenu avec Glu222 non protoné (figure8a) et d'autre part en fonction de la partie de la
simulation à laquelle ils correspondent. Tout d'abord Glu222 forme une liaison Hydrogène forte (99%
sur les 2ns) avec l'atome O24 du chromophore par l'intermédiaire de son oxygène protoné.
Contrairement à la situation avec Glu222 non protoné, le O24 n'est pas situé dans une région
hydrophobe et engage une deuxième liaison Hydrogène avec la Valine61. D'autre part, Glu222 a
rompu ses liaisons avec Ser205 ou N9 du chromophore. Il semblerait qu'il se soit déplacé vers la
partie imidazolinone du chromophore (tableau1). Le deuxième oxygène du carboxylate est lié à des
molécules d'eau. De l'autre coté du chromophore, en comparant avec le réseau calculé pour Glu222
non protoné, O17 conserve une liaison forte avec l'Arginine 96 (95% sur les 2ns), par contre celle qu'il
engageait avec l'acide Glutamique 94 est absente.
Distance
O1-O24
O2-O24
O1-N9
O2-N9
Glu222 protoné (ce travail)
3,40 (0,23)
2,79 (0,14)
5,16 (0,94)
4,64 (0,66)
Glu222 non protoné [8]
5,9 (0,55)
5,73 (0,38)
3,40 (0,40)
4,56 (0,67)
Tableau 1 : Distance moyenne en Angstrom entre les oxygènes du carboxyle de Glu222 et les atomes
O24 et N9 du chromophore. Le chiffre entre parenthèses est l'écart quadratique moyen
L'environnement de N9 et de la Sérine 205 est plus fluctuant au cours du temps. Ceci est du
au fait que de la même manière que pour la GFP, les feuillets  des brins 6, 7 et 8 sont assez flexibles
[15]. Ainsi, dans la conformation A de la CFP dans son état de protonation standard, une dynamique
13
moléculaire a montré qu'une molécule d'eau du solvant rentre dans le tonneau. Au cours de la
simulation avec Glu222 protoné, 3 molécules d'eau entrent successivement dans le tonneau et se
placent près du chromophore. Celles-ci prennent progressivement la place de Ser205 et forment des
liaisons Hydrogène avec N9. Du fait du décalage de Glu222 vers l'oxygène O24, il semblerait que
l'espace entre les résidus Ser205, His148, et Thr203 se soit élargi et qu'ils ouvrent ainsi une voie
d'accès aux molécules d'eau provenant du solvant.
figure 8 : Réseaux de liaisons Hydrogène dans la conformation A, a) dans l'état de protonation
standard, puis avec Glu222 protoné : b) entre 200 et 600 ps, c) entre 600 et 1000 ps,
14
d) entre 1000 et 1500 ps, e) entre 1500 et 1900 ps, f) entre 1900 et 2100 ps.
Les flèches sont orientées de l'accepteur de doublet vers le donneur. Les nombres indiqués donnent en pourcentage le
temps pendant lequel la liaison Hydrogène existe. Les critères d'existence sont une distance inférieure à 3,2 A entre le
donneur et l'accepteur, et un angle (donneur,hydrogène,accepteur) supérieur à 120°.
Entre 1900 et 2100 ps, le réseau de liaisons Hydrogène ressemble beaucoup à celui de la zone
3 : 1000-1500ps, W1' ayant quitté l'intérieur du tonneau est remplacé par W2'. Deux situations peuvent
alors se produirent : soit un mouvement cyclique d'échange de molécules d'eau de solvant pourrait
s'installer, soit la protéine a atteint un état d'équilibre avec un réseau stable faisant intervenir deux
molécules d'eau du solvant. Dans les deux cas, pour obtenir une réponse, il faudrait prolonger la
simulation.
2) Conformation B
Une dynamique moléculaire de 1ns a été menée sur la conformation B avec Glu222 protoné,
de la même manière que dans le cas de la conformation A. Après une forte augmentation durant les
150 premières picosecondes, l'écart quadratique moyen de la position des carbone  par rapport à la
structure aux rayons X de la protéine (figure9) tend rapidement vers une constante. La structure de la
protéine est donc bien conservée et semble plus stable que pour la conformation A : le RMSd des
carbone semble stabilisé alors que dans la conformation A une dérive est observée.
Figure 9 : RMSd : a) en noir les carbone  des résidus impliqués dans un feuillet  ou l'hélice 
centrale, b) en gris les autres carbone , c) tous les carbone 
L'étude de la trajectoire des résidus de la protéine et du solvant confirme le fait que la
conformation B a une structure plus constante dans le temps. En effet, il est possible de représenter
l'environnement du chromophore au cours de la totalité de la simulation (1 ns) par un seul réseau de
liaisons Hydrogène (figure10b). Comme dans celui de la conformation B avec Glu222 non protoné
(figure10a), le feuillet  entre les résidus Ile146/Ser205 et His148/Thr203 (brins 6 et 7) est fortement
conservé (environ 88%). Cependant, la protonation du Glu222 a un fort impact sur les liaisons
Hydrogène impliquant la Sérine 205 et N9. En effet, les liaisons entre Glu222 et N9 ou OG de Ser205
ont disparu, N9 forme dans cette conformation une liaison forte avec OG de Ser205. Contrairement à
ce qui se passe dans la conformation A, ceci n'a pas pour conséquence la création d'une liaison
Hydrogène entre Glu222 et l'atome O24 du chromopore, le carboxyle crée un ensemble de liaisons
avec des molécules d'eau cristallographiques. De l'autre côté du chromophore, O17 conserve une forte
liaison Hydrogène avec Arg96 et comme dans la conformation A, la liaison entre O17 et Gln94 est
perdue alors qu'elle était présente lorsque Glu222 est non protoné.
15
Figure 10 : Réseau de liaisons Hydrogène de la conformation B a) avec Glu222 non protoné, b) avec
Glu222 protoné.
II) Calculs des spectres d'absorption.
Pour chaque simulation, les conformations ont été extraites à intervalles réguliers (toutes les
10ps), sur lesquelles les calculs quantiques ont été effectués. Ensuite un histogramme des longueurs
d'onde des quatres premières transitions électroniques pondérées par leur force d'oscillateur a été
construit. Dans cette partie sont présentés et commentés les spectres d'absorption ainsi obtenus.
1) Conformation A
La figure 11, représente les spectres d'absorption théoriques de la conformation A de la
protéine correspondant aux deux états de protonation de Glu222, ainsi que le spectre expérimental qui
correspond à un mélange des conformations A et B. Les spectres théoriques et le spectre expérimental
ne sont pas tracés avec la même échelle en ordonnée.
Figure 11 : Spectre d'absorption de la conformation A : a) en noir dans son état de protonation
standard, b) en rouge avec Glu222 protoné, c) en pointillé le spectre expérimental
Les spectres théoriques comportent deux bandes centrées respectivement sur 320 et 400 nm.
Cette dernière est due à la transition vers le premier état excité et pour la majorité des géométries du
16
chromophore considérées, c'est la seule transition active (force d'oscillateur non nulle). Cette
transition est de type , et est majoritairement homo->lumo (figure12a et b). La deuxième bande
d'absorption, est principalement due aux absorptions vers le troisième et le quatrième état excité du
chromophore (figure12a) mais elle est absente sur le spectre expérimental. Ceci peut être la
conséquence d'un artefact de calcul, lié au fait que la méthode TD-DFT donne des résultats plus
approximatifs pour les états électroniques très excités. Soit, les forces d'oscillateurs sont mals calculées
et cette deuxième bande n'existe pas, soit elle existe effectivement, mais l'énergie des transitions est
sous estimée, et elle est cachée par la bande d'absorption du tryptophane 57 située entre 250 et 320 nm.
La comparaison des deux spectres théoriques montre que la protonation de Glu222 a pour
effet de diminuer l'absorbance de la protéine (environ 30%) et d'augmenter la largeur à mi-hauteur qui
passe de 40 nm à 50 nm lorsque Glu222 est protoné, alors que la largeur expérimentale est de 65 nm.
Par contre la position des maxima d'absorption est inchangée.
Figure 12a : Décomposition du spectre d'absorption théorique par transition électronique
a) en trait plein noir transition vers le premier état excité, b) en vert transition vers le second état excité
c) en rouge transition vers le troisième excité, d) tirets transition vers le quatrième état excité
Figure 12b : Orbitales homo et lumo du chromophore
Afin de vérifier s'il existe une corrélation entre la variation du spectre et le réseau de liaisons
Hydrogène autour du chromophore, un histogramme a été réalisé pour chacune des quatres zones
identifiées au cours de la dynamique moléculaire de la conformation A (figure 13).
17
Figure 13 : Spectres d'absorption des différentes parties de la simulation a) en trait plein noir 200600ps, b) en rouge 600-1000ps, c) en vert 1000-1500ps, d) pointillés 1500-1900.
Il apparaît une différence significative entre les spectres obtenus pour des temps inférieurs à
1500ps et le spectre de la quatrième zone, 1500-1900ps. Cependant les variations dans les réseaux de
liaisons Hydrogène ne permettent pas d'isoler un phénomène prépondérant qui serait responsable du
décalage du spectre de la quatrième zone. Le changement le plus brusque dans les liaisons Hydrogène
au cours de la simulation est la rupture de la liaison entre OG de Ser205 et N9 mais elle intervient aux
alentours de 1000ps. D'une manière plus générale, au cours du temps, les spectres s'élargissent et se
décalent progressivement vers les courtes longueurs d'onde. Ceci peut être corrélé à l'entrée
progressive des molécules d'eau du solvant dans le tonneau de la protéine, proche du chromophore.
Cependant, la variation des spectres est certainement due à la superposition de nombreux effets
provenant des interactions entre le chromophore et l'ensemble de la protéine et du solvant.
2) Conformation B
La figure 14, représente les spectres d'absorption théoriques de la conformation B de la
protéine correspondant aux deux états de protonation de Glu222, ainsi que le spectre expérimental qui
correspond à un mélange des conformation A et B. Les spectres théoriques et le spectre expérimental
ne sont pas tracés avec la même échelle en ordonnée.
Figure 14 : Spectre d'absorption de la conformation B a) en noir dans son état de protonation standard,
18
b) en rouge avec Glu222 protoné, c) en pointillé le spectre expérimental
Les deux spectres théoriques de la conformation B, ont une forme et une position similaires.
L'effet de l'état de protonation de Glu222 sur le spectre ne provoque que de faibles variations dans la
largeur à mi-hauteur (35 nm au lieu de 30 nm) et dans l'intensité de l'absorption (diminution de 15%).
La deuxième bande entre 300 et 350 nm est présente également sur ces spectres.
La protonation de Glu222 a des conséquences d'amplitudes très différentes concernant
l'environnement du chromophore et les spectres d'absorption. Les réseaux de liaisons Hydrogène des
conformations A et B avec Glu222 protoné ont une structure très différente de ceux calculés pour les
conformations A et B dans leur état de protonation standard. Par contre, les différences entres les
spectres d'absorption sont faibles. Ceci traduit le fait qu'une variation dans le spectre d'une protéine ne
peut pas être reliée à un seul phénomène qui aurait alors un effet prépondérant. Elle est la conséquence
de la superposition d'une multitude de facteurs provenant des interactions de Van der Waals et
électrostatiques entre le chromophore et l'ensemble de la protéine. Dans le cas présent, une variation
significative des réseaux de liaisons Hydrigène n'induit pas de modifications nettes des propriétés
d'absorption.
19
TROISIEME PARTIE
ETAT EXCITE DU CHROMOPHORE ET
FLUORESCENCE DE LA ECFP
20
La fluorescence de la ECFP, bien que très utilisée en imagerie, est encore mal connue. Dans
cette partie est présenté une étude effectuée sur le premier état excité du chromophore de la ECFP. Une
première sous partie traitera de l'étude du chromophore dans son état excité. La deuxième exposera les
résultats de la dynamique moléculaire qui a été réalisée avec le chromophore dans son état excité ce
qui a permis d'obtenir le spectre d'émission du premier état excité.
I) Etude du premier état excité du chromophore
La caractérisation des principales géométries d'équilibre du chromophore à l'état excité a été
effectuée par des optimisations de géométries au niveau CIS 6-31G*, dans le vide. Les propriétés de
fluorescence du chromophore dans ces différentes géométries sont obtenus par des calculs TD-DFT.
1) Recherche de géométries de l'état excité
Les optimisations de géométries ont été réalisées en utilisant la méthodes CIS, décrite dans la
partie 1. Tout d'abord, la géométrie du chromophore dans son premier état excité la plus proche de
celle de l'état fondamental (notée Ex1) a été recherchée. L'ensemble de la molécule reste plane et les
déformations sont minimes par rapport à l'état fondamental. Les modifications les plus importantes
(tableau2) concernent les longueurs de liaison du pont entre les 2 cycles (indole et imidazolinone) ainsi
que les angles dièdres autour de ces liaisons (voir figure5).
Comparaison des distances du pont et du carbonyle
O17-C16
C12-C11
C11-C7
État excité
1,2103
1,4134
1,3899
Etat fondamental
1,2304
1,3638
1,4294
Comparaison des angles dièdres du pont


C1C7C11C12
État excité
169,5
-2,40
179,13
Etat fondamental
179,75
-1,59
178,86
Tableau 2 : Comparaison de la géométrie du chromophore dans l'état excité et dans l'état fondamental.
Les distances sont en Angstrom et les angles en degre.
Un allongement de la liaison C11-C12 et un raccourcissement de la liaison C11-C7 sont
observés quand le chromophore passe de l'état fondamental à l'état excité. Ceci est en accord avec le
changement de densité électronique entre ces atomes pour la transition homo->lumo (figure12b).
Parallèlement, la torsion autour des liaisons du pont dans l'état excité devrait présenter des tendances
inverses de celles de l'état fondamental. Afin de déterminer le comportement de ces liaisons, une étude
de l'énergie du chromophore en fonction de la variation des angles  et  a été menée. Une série de
calcul a été effectué sur le chromophore, par la méthode TD-DFT, en faisant progressivement varier
chaque angle dihèdre indépendemment, le reste de la molécule étant figé. Les résultats sont présentés
sur la figure 15, où l'énergie du chromophore a été tracée en fonction des angles  et . Ces courbes
représentent en fait l'énergie potentielle de torsion du chromophore autour des liaisons C11-C12 et
C11-C7. En effet, les variations de l'énergie ne sont dues qu'à la torsion des liaisons concernées.
21
Figure 15 : Energie du chromophore en fonction des angles et  dans l'état fondamental et dans l'état
excité calculé par la méthode TD-DFT
Ces courbes démontrent bien qu'il y a eu une inversion dans la nature des liaisons C11-C12 et
C11-C7. En effet, l'évasement des courbes, donc les constantes de forces, est inversé entre l'état
fondamental et l'état excité. De manière générale, la torsion est plus facile dans l'état excité, les puits
sont moins profonds. De plus, il apparaît qu'il existe des minima pour des géométries perpendiculaire
du chromophore (ou.
Des optimisations de géométries ont été réalisées afin de déterminer la géométrie d'équilibre
de ces états perpendiculaires. Les calculs ont été effectués avec la méthodes CIS, en faisant relaxer une
géométrie perpendiculaire du chromophore. Ce dernier étant dissymétrique, quatre géométries
différentes ont été optimisées, selon que la rotation de 90° par rapport à la géométrie plane avait eu
lieu dans un sens ou dans l'autre (annexe2). Les résultats sont présentés dans le tableau 3.




-1264,3149 -1264,3131 -1264,2780
Calculs non

0,68
-0,64
-2,22
terminé

-88,34
90,16
167,08
Energie CIS de l'état excité en géométrie plane : -1264,2735 ua
Tableau 3 : Résultats des optimisations de géométries de l'état excité du chromophore,
en partant d'une géométrie perpendiculaire.
D'après les résultats du tableau 3, il existe des géométries dans lesquelles l'angle  est proche
de l'angle droit, avec une énergie plus faible que la géométrie plane, ce qui confirme la forme de la
figure 15. Ceci est en accord avec le caractère de double liaison de C12-C11. En effet dans l'état
excité, la géométrie la plus stable d'un alcène est le plus souvent perpendiculaire. En ce qui concerne
l'angle , il semblerait que les géométries perpendiculaires ne soit pas des points stationnaires sur la
surface de potentiel. Les calculs convergent vers la géométrie plane Ex1. Ceci est en accord avec le
fait que la liaison C7-C11 a un caractère de liaison double dans l'état excité. La torsion de cette liaison
est donc plus difficile (figure15) et sa géométrie d'équilibre est plus proche d'une géométrie plane.
2) Champ de force de l'état excité du chromophore
Pour obtenir le sepectre de fluorescence de l'état excité de la ECFP, il est nécessaire
d'effectuer une dynamique moléculaire de la protéine avec un champ de force en accord avec la
géométrie et la structure électronique de l'état excité du chromophore. Un calcul des transitions
électroniques du chromophore sur un échantillon représentatif de géométries de la protéine permettra
22
ensuite d'obtenir le spectre de fluorescence de la même manière que les spectres d'absorption.
Dans une étude antérieure, un champ de force a déjà été créé pour le chromophore dans son
état fondamental. Pour construire celui de l'état excité, les paramètres qui sont significativement
différents entre l'état fondamental et l'état excité ont été ajustés.
a) Paramètres géométriques du chromophore dans son 1er état excité
Les paramètres géométriques de référence intégrés au champ de force sont les valeurs
d'équilibres des liaisons, des angles, ou des angles dièdres du minimum Ex1.
Les résultats du paragraphe 1), ont montré que dans la géométrie Ex1, seul le pont varie
significativement. Ainsi, en dehors des paramètres géométriques liés à cette partie du chromophore,
l'ensemble des constantes de foces relatives aux autres paramètres ont été conservées.
En ce qui concerne le pont le caractère des liaisons a été inversé (tableau2). Les constantes de
forces des liaisons ont été modifiés en procédent par analogie avec celles utilisées dans le champ de
force de AMBER en fonction de l'hybridation des carbone mis en jeu et de la distances d'équilibre de
la liaison. La constante de force correspondant aux angles de torsion  et  a été ajustée par
comparaison entre la courbe de l'énergie potententielle de torsion obtenue par des calculs quantiques et
celle obtenue avec le programme AMBER. La valeur retenue étant celle pour laquelle les deux courbes
d'énergie potentielle de torsion sont superposables. Les paramètres obtenus sont présentés dans le
tableau 4.
Etat fondamental
Etat excité
Constante de force Valeur d'équilibre Constante de force Valeur d'équilibre
C11-C12 469,0 kcal.mol-1.A-2
1,363
427,0
1,413
C11-C7 356,0 kcal.mol-1.A-2
1,429
469,0
1,390
-1
7,0 kcal.mol

180,0
12,0
180,0
-1

17,0 kcal.mol
180,0
2,0
180,0
Tableau 4 : Paramètres du champ de force du chromophore pour les liaisons et les torsions du pont.
b) Paramétrisation des charges du chromophore dans son premier état excité
Pour être la plus fidèle possible, la dynamique moléculaire doit tenir compte à la fois de la
géométrie de l'état excité du chromophore et de sa densité électronique. Celle-ci est représentée par un
ensemble de charges ponctuelles. Le passage de l'état fondamental vers l'état excité met en jeu une
réorganisation du nuage électronique. Les charges utilisées dans le champ de force de l'état
fondamental ne sont pas réutilisable. Il est nécessaire de les recalculer en fonction de la densité
électronique de l'état excité.
Pour ce faire, à partir de la géométrie optimisée du chromophore dans l'état excité, un
programme génère une grille de points situés sur l'enveloppe des sphères centrées sur les atomes, de
rayons proportionnels au rayon de Van Der Waals de chaque atome. Un second programme va calculer
le potentiel électrostatique généré par la densité électronique de l'état excité du chromophore (issue
d'un calcul quantique) en chacun des points de la grille. Ensuite, il va attribuer à chaque atome une
charge ponctuelle de telle sorte que l'ensemble des charges du chromophore génèrent, en chaque point
de la grille, le même potentiel électrostatique que la densité électronique issue du calcul Gaussian. Cet
ensemble de charges crée donc un champ électrostatique qui est représentatif de celui exercé par le
chromophore sur son environnement. Il est possible d'améliorer le potentiel électrostatique, créé par les
charges ponctuelles, en imposant qu'il corresponde à celui créé par la densité électronique du
chromophore en tous les points de plusieurs grilles qui correspondent aux enveloppes d'ensemble de
sphères de rayons différents.
Le calcul effectué pour obtenir les charges correspondant à l'état excité du chromophore a été
effectué en imposant que le champ électrostatique qui en découle, approche celui issu du calcul
quantique, en tous points de quatre grilles. Dans le champ de force AMBER, quelque soit le résidu, les
23
charges des atomes de la fonction amide sont identiques. Cette contrainte a été respectée en fixant
préalablement les charges des atomes correspondants. Les charges obtenues sont présentées dans le
tableau 5.
Etat excité Etat fondamental
-0,416
-0,416
0,272
0,272
-0,331
-0,397
0,249
0,212
0,478
0,331
-0,040
0,048
Thr65
-0,240
-0,251
0,055
0,087
0,082
0,099
0,064
0,112
-0,657
-0,647
0,395
0,339
0,302
0,323
-0,434
-0,393
0,077
0,052
-0,218
-0,106
0,512
0,464
-0,579
-0,597
-0,268
-0,061
Pont
0,170
0,173
Imidazolinone
Atome
N26
H26
C22
H22
C23
H23
C25
H25
H27
H28
O24
H24
C14
N13
C12
N15
C16
O17
C11
H11
Atome
C7
C8
H8
N9
H9
C6
C5
H5
C4
H4
C3
H3
C2
H2
C1
C18
H18
H19
C19
O21
Etat excité Etat fondamental
0,012
-0,103
0,051
0,002
0,132
0,189
-0,467
-0,429
0,395
0,397
0,256
0,241
-0,299
-0,322
Indol
0,181
0,176
Trp66
-0,087
-0,117
0,149
0,157
-0,240
-0,205
0,167
0,165
-0,135
-0,238
0,169
0,175
0,016
0,089
-0,033
0,153
0,126
0,053
0,106
0,046
Gly67
0,597
0,597
-0,568
-0,568
Tableau 5 : Charges du chromophore dans l'état fondamental et l'état excité.
De manière générale, la variation de la charge portée par chaque atome n'est pas très
importante. Le passage de l'état fondamental à l'état excité du chromophore n'est pas suivi d'un
transfert de charge. Cependant le C11, qui lie la partie provenant du tryptophane avec l'imidazolinone,
présente une variation significative. Ceci peut être relié au fait que les déformations géométriques qui
ont lieu lors du passage de l'état fondamental à l'état excité font intervenir directement C11, soit par les
torsions autour des angles  et  soit par l'élongation ou la contraction des liaisons du pont.
A l'aide des charges et des paramètres géométriques présentées ci dessus, il est possible de
construire un champ de force pour l'état excité du chromophore. Une étude dynamique du
chromophore dans son état excité, dans la protéine solvatée peut désormais être réalisée. Les résultats
fourniront des informations sur l'environnement du chromophore quand il est dans son état excité. De
plus il sera possible d'étudier les divers mécanismes d'extinctions de fluorescence envisageables.
II) Etude de la fluorescence de la ECFP
1) Résultats de la dynamique moléculaire
Une simulation de dynamique moléculaire de 1ns a été effectuée sur l'ensemble de la protéine
solvatée, avec le champ de force de l'état excité du chromophore, dans les mêmes conditions que celles
utilisées dans la partie 2. La structure de départ de la protéine est celle de la conformation majoritaire,
la conformation A, dans son état de protonation standard. La figure 16 montre, en fonction du temps,
l'écart quadratique moyen de la position des carbone  par rapport à la structure aux rayons X de la
protéine (RMSd). Après une forte variation dans les 200 premières picosecondes, celui-ci se stabilise
et reste à peu près constant au cours de la simulation, ce qui montre que la structure de la protéine est
bien conservée au cours de la simulation.
24
Figure 16 : RMSd : a) en noir les carbone  des résidus impliqués dans un feuillet  ou l'hélice 
centrale, b) en gris les autres carbone , c) tous les carbone 
L'étude des trajectoires des résidus et des molécules d'eau a permis d'établir le réseau de
liaisons Hydrogène autour du chromophore sur les 1ns de la simulation (figure 17). Dans ce dernier,
l'environnement de O17 et de la partie imidazolinone du chromophore est globalement identique à
celui obtenu dans la simulation de la protéine dans la conformation A avec le chromophore dans son
état fondamental. L'environnement de N9 est sensiblement différent. Tout d'abord, Glu222 vient se
placer en face de N9 qui se situe alors entre les deux oxygènes du groupement carboxylate.
Contrairement aux simulations antérieures, Glu222 engage des liaisons Hydrogène fortes avec N9.
Concernant OG de la Sérine 205, il conserve une liaison forte avec Glu222, mais elle est détachée du
N9. De plus, aucune molécule d'eau du solvant ne vient se placer entre les résidus His148, Ser205,
Thr203 et Ser147. Ceci peut être la conséquence d'un décalage de Glu222 vers N9, ce qui a conduit à
un rapprochement des résidus His148, Ser205 qui s'exprime par la création d'une liaison entre ces
résidus. Ainsi les molécules d'eau du solvant n'auraient plus la place de rentrer.
Figure 17 : Réseau de liaisons Hydrogène autour du chromophore pour la conformation A , a) dans
l'état fondamental, b) dans son état excité.
Le tableau 6, présente les données statistiques sur les angles  et , issues de la simulation de
la protéine avec le chromophore dans l'état excité et dans l'état fondamental.
Tableau 6 : Résultats statistiques sur les angles et
25




Moyenne
-6,76°
-16,18°
Min
-34,12°
-52,99°
Max
19,7°
23,67°
Max-Min
53,8°
76,7°
Rms
8,6°
12°
-5,97°
-1,74°
-28,67°
-31,35°
24,06°
24,44°
52,7°
55,8°
7,9°
7,4°
État excité
État fondamental
Ces résultats sont en accord avec ceux du paragraphe I, la géométrie du chromophore est plus
plane dans l'état fondamental que dans l'état excité. De plus, les écarts quadratiques moyens sont plus
importants dans l'état excité, ce qui est en accord avec la forme des courbes d'énergies potentielles de
torsion (figure 15). En effet, les courbes d'énergie potentielles de torsion étaient plus évasées et donc il
est normal que les mouvement correspondant soit de plus grande ampleur. Le champ de force utilisé a
permis de reproduire les caractéristiques de la torsion dans l'état excité.
Afin d'analyser la faible amplitude du mouvement de torsion du chromophore, un programme
a été écrit pour générer des géométries de la protéine dans lesquelles seuls les angles de torsion des
liaisons du pont du chromophore variaient. Le programme a alors calculé pour chaque angle les
contacts trop proches entre les résidus et le chromophore, une approche qualitative des contraintes
géométriques imposées au chromophore par la protéine est ainsi accessible. Les géométries de départ
ont été prises au hasard parmi les conformations qui ont été extraites pour calculer le spectre. Ces
résultats sont reportés dans le tableau 7. La valeur de départ est celle de l'angle de torsion à l'instant de
la simulation où la géométrie a été extraite.



Valeur de départ
Min
Max
Max-Min
10°
-10°
20°
30°
-14°
-35°
5°
40°
171°
160°
210°
50°
Tableau 7 : Torsion du chromophore dans la protéine
Ces résultats montrent que les résidus voisins du chromophore exerce une contrainte sur sa
géométrie. En effet, l'intervalle de valeur des angles pour lesquels le chromophore n'est en contact avec
aucun résidu est fonction de l'angle de torsion de départ. Ainsi la géométrie du chromophore serait
imposée par les mouvement des chaînes latérales de la protéine.
Cette contrainte exercée sur la géométrie du chromophore justifie le choix de la géométrie
plane pour ajuster les paramètres du champ de force de l'état excité du chromophore.
2) Spectre d'émission du premier état excité
Le spectre d'émission a été obtenu en faisant l'histogramme de la première transition
électronique en fonction de la longueur d'onde, pondérée par leur force d'oscillateur. Cette transition a
été calculée sur le chromophore, sur l'ensemble des conformations de la protéine qui ont été extraites
au cours de la simulations. Les conformations ont été extraites toutes les 5 ps. Le spectre obtenu par le
calcul est présenté sur la figure 18, ainsi que le spectre d'absorption obtenu par la même méthode et les
spectres d'absorption et de fluorescence expérimentaux. Les échelles des ordonnées des spectres
théoriques et des spectres expérimentaux n'ont pas de lien.
26
Figure 18 : Spectres théoriques d'absorption (en rouge) et d'émission (en noir), les spectres
expérimentaux correspondant (pointillé) ne sont pas tracés sur la même échelle.
Premièrement, le spectre d'émission est décalé vers le rouge, ce qui était attendu. Bien que les
maxima théoriques ne soient pas superposables aux maxima expérimentaux, les calculs décrivent
correctement les phénomènes d'abosrption et d'émission. Cependant l'écart entre les spectres
d'absorption et d'émission théorique n'est que de 20 nm, alors qu'expérimentalement il est de 40nm.
Ceci peut être du, soit à un mauvais choix dans la manière d'effectuer les calculs, soit à une description
trop simpliste de l'état excité du chromophore dans la protéine. En effet, il est possible que l'état excité
qui a été modélisé et sur lequel a été effectuée la dynamique, ne soit pas l'état qui fluoresce dans la
ECFP. Dans notre modèle, seule la réorganisation géométrique a été prise en compte : les transferts
d'électrons et ou de protons ne sont pas modélisé et pourraient intervenir avant la fluorescence.
3) Extinction de l'émission
a) Torsion autour du pont du chromophore
Une première cause de l'extinction de l'émission du premier état excité du chromophore est la
torsion de ce dernier autour des liaisons du pont (angle  et ). En effet, lorsque la géométrie s'écarte
fortement d'une géométrie plane, la force d'oscillateur chute et tend vers zéro (figure 19).
Figure 19 : force d'oscillateur de la première transition en fonction des angles de torsions  et .
La diminution de la force d'oscillateur lorsque la géométrie du chromophore est
27
perpendiculaire est due au fait que dans cette géométrie la première transition électronique est la
conséquence d'un transfert de charge important. Ainsi la transition est interdite ce qui diminue
fortement sa force d'oscillateur (figure 20).
Figure 20 : OM du chromophore, a) la HOMO, b) la LUMO
Pour que la fluorescence du premier état excité soit annihilée par cette torsion, il faut que le
chromophore se place dans une géométrie perpendiculaire. Or comme cela a été dit au paragraphe II
1), les résidus voisins du chromophore exercent une contrainte qui limite sa torsion à des petites
amplitudes. Ainsi le chromophore adopte des géométries pour lesquelles la force d'oscillateur de la
première transition varie peu. L'extinction de fluorescence due à la torsion du chromophore autour des
liaisons du pont est donc faible.
b) Croisement entre états excités
La figure 21 présente un schéma des courbes d'énergie potentielle de l'état fondamental et des
deux premiers états excités du chromophore. Pour des géométries proches des géométries d'équilibre
de l'état fondamental, l'état S1 présente un faible caractère de transfert de charge et une probabilité
d'émission non nulle (f≠0). La transition électronique est majoritairement de type homo-lumo
(figure12b). Le second état excité, S2, est formé à partir d'une transition faisant intervenir une OM de
type , à caractère non liant et présente un fort caractère de transfert de charge. Cet état est non
fluorescent (f~0). Pour certaines géométries de la protéine, ces états peuvent se mélanger fortement.
Ainsi après le croisement évité, les état S1 et S2 (états adiabatiques, en bleu) changent de nature : S1
devient sombre et S2 fluorescent. Il y a donc eu une extinction de la fluorescence de S1. Au cours de la
dynamique moléculaire qui a été effectuée pour l'état S1, trois situations peuvent être rencontrées,
représentées par les points M, M' et M''.
Figure 21 : Schéma, représentant les niveaux électroniques du chromophore.
28
En M, l'état S1 est fluorescent (f>0) et l'état S2 est sombre (f~0). En M'', il y a eu un
changment de la nature des états S1 et S2, S2 est fluorescent et S1 est sombre. En M', les deux états
sont proches en énergie et il y a un mélange d'états électroniques. Ceci se traduit par l'existence de
deux transitions de forces d'oscillateur similaires et non nulles.
Au cours de la dynamique moléculaire effectuée sur le premier état excité, ces situations sont
observables. Sur la figure 22, qui présente la force d'oscillateur des transitions électroniques issuent de
S1 ou S2, il apparaît que de manière générale S1 est fluorescent (<f1>=0,6) et S2 est sombre
(<f2>=0,08), ce qui correspond au point M. De plus, il existe un certain nombre d'instants où les forces
d'oscillateur de S1 et S2 sont équivalentes, ce qui correspond au point M', c'est à dire à un croisement
entre les états excités et donc éventuellement à une exctinction de la fluorescence du premier état
excité si le croisement est dépassé (point M'').
Figure 22 : Force d'oscillateur des deux premières transitions, en noir la transition 1 et en rouge la
transition 2
A partir de la figure 22, il est possible d'estimer un ordre de grandeur de la constante de
vitesse de désactivation du premier état excité par ce processus : il existe une quinzaine de cas
correspondant au point M', sur 190 géométries extraites au total. Chaque point de la courbe correspond
à un intervalle de 5 ps (le calcul des transitions électroniques et des forces d'oscillateur a été effectué
sur des géométries exrtaites toutes les 5 ps). Sur 5 ps, la probabilité d'être au point M' est donc de
15/190. Pour qu'il y ait extinction de la fluorescence de l'état S1, il faut que la protéine atteigne le point
M''. Par hypothèse et en absence de toute autre information, la probabilité que le croisement soit
dépassé ou non est prise égale à 1/2. Ainsi la probabilité qu'il y ait extinction de l'émission de S1 est de
0,04 sur 5 ps.
La probabilité, peut être reliée à la constante de vitesse de la manière suivante : Soit N la
population de l'état S1. Il se dépeuple selon l'équation (3).
En isolant la constante de vitesse k, il vient :
Ainsi la constante de vitesse obtenue est k = 0,04/5 ps-1 soit, k ~ 10 ns-1. Cet ordre de grandeur
est cohérent avec les durées de vie mesurées expérimentalement, bienqu'il fasse partie des plus rapides.
29
CONCLUSION
L’étude des propriétés structurales et photophysiques de la ECFP a été abordée dans ce
travail par l'utilisation de simulations de dynamique moléculaire, qui utilisent la mécanique classique,
afin d’obtenir un échantillon représentatif des géométries adoptées par la protéine au cours du temps.
En étudiant les données statistiques issues de ces simulations le réseau de liaisons Hydrogène autour
du chromophore a été calculé. De plus, des calculs quantiques, sur un système restreint, utilisant la
méthode TD-DFT, sur l’ensemble des géométries extraites des simulations ont permis d’obtenir pour
la première fois dans ces systèmes, les spectres d’absorption et de fluorescence théorique du
chromophore de la ECFP en prenant en compte l'effet de l'environnement (protéine solvatée).
Cette méthode a été utilisée pour étudier l’influence de l’état de protonation de Glu222
sur la structure et le spectre d’absorption de la protéine. Les résultats ont montré que bien que les
réseaux de liaisons hydrogène soient profondément modifiés, les propriétés photophysiques varient
peu. Ceci montre qu’une variation dans le spectre d’absorption ne peut pas être reliée à un seul
phénomène qui aurait alors un effet prépondérant. Elle est la conséquence de la superposition d’une
multitude de facteurs provenant des interactions électrostatiques et de Van Der Waals entre le
chromophore et l’ensemble de la protéine. De ce fait, l’effet d'un état de protonation de la protéine sur
ses propriétés photophysiques, nécessite d’obtenir la nature et la probabilité d’existence des états de
protonations de la protéine. Une collaboration avec Matthias Ullmann, de l'univesité de Bayreuth, a été
mise en place par l'équipe dans laquelle ce travail a été effectué, pour continuer sur cette voie.
En parallèle, une étude du premier état excité du chromophore et de sa fluorescence a été
effectuée. Des calculs quantiques ont permis de déterminer les caractéristiques géométriques de l’état
excité et de paramétrer son champ de force. Avec celui-ci, une dynamique moléculaire a été réalisée et
a permis d’obtenir le spectre de fluorescence et d’étudier les facteurs pouvant l’influencer. Les
résultats montrent que le décalage entre les spectres théoriques d'absorption et de fluorescence est plus
faible que celui observé expérimentalement. De plus, il a été possible de calculer un ordre de grandeur
d'une constante de vitesse de désactivation d'environ 10 ns-1. Ces résultats montrent que la
modélisation du premier état excité du chromophore doit être étendu à d'autres phénomènes de
désactivation. En effet, les diverses processus de transferts de charge (protons, électrons ...) dans l'état
excité n'ont pas été pris en compte dans les simulations de dynamique moléculaire. Une modélisation
de ces effets pourrait conduire à une meilleure description de la fluorescence et éventuellement à une
identification des différentes espèces émissives et de leurs temps de vie.
30
Bibliographie
[1] Tsien, R.Y. Annu. Rev. Biochem. 1998,509-544
[2] Zimmer, M. Chem. Rev. 2002, 102, 759-781
[3] Fred S. Wouters, Peter J. Verveer and Philippe I.H. Bastians Trends in cell Biology 2001, vol. 11,
n° 5
[4] Seifert M.H.J., Ksiazek D., Azim M.K., Simialowsli P., Budisa N., Holak T.A. J.Am.Chem.Soc
2002, 124, 7932-7942
[5] J.H. Bae, M.Rubini, G. Jung, G. Wiegand, M.H.J. Seifert, M. Kamran Azim, J.S. Kim, A;
Zumbusch, T.A. Holak, L. Moroder, R. Huber, N. Budisa. J.Mol.Biol. 2003, 328, 1071-1081
[6] M.E. Martin, F. Negri, M. Olivucci J.Am.Chem.Soc 2004, 126, 5452-5464
[7] T. Laino, R. Nifosi, V. Tozzini Chem. Rev. 2004, 298, 17-28
[8]J. Ridard, E.Durnerin, I. Demachy, G. Vallverdu, P. Archirel, B. Levy, soumis J.Phys.Chem B 2005
[9] D.A. Case, T.A. Darden, T.E. Cheatham III, C.L. Simmerling, J. Wang, R.E. Duke, R. Luo, K.M.
Merz, B. Wang, D.A. Pearlman, M. Crowley, S. Brozell, V. Tsui, H. Gohlke, J. Mongan, V. Hornak,
G. Cui, P. Beroza, C. Schafmeister, J.W. Caldwell, W.S. Ross, P.A. Kollman 2004, AMBER 8,
University of California, San Fransisco.
[10] Wang J., Cieplak P., Kollmann P.A. J.Comput.Chem. 2000, 21, 1049-1074
[11] Darden T., Lee H., Pedrsen L.G. J.Chem.Phys. 1995, 103, 8577-8593
[12] Gaussian 03, Revision B.04, M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A.
Robb, J. R. Cheeseman, J. A. Montgomery, Jr., T. Vreven, K. N. Kudin, J. C. Burant, J. M. Millam, S.
S. Iyengar, J. Tomasi, V. Barone, B. Mennucci, M. Cossi, G. Scalmani, N. Rega, G. A. Petersson, H.
Nakatsuji, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda,
O. Kitao, H. Nakai, M. Klene, X. Li, J. E. Knox, H. P. Hratchian, J. B. Cross, C. Adamo, J. Jaramillo,
R. Gomperts, R. E. Stratmann, O. Yazyev, A. J. Austin, R. Cammi, C. Pomelli, J. W. Ochterski, P. Y.
Ayala, K. Morokuma, G. A. Voth, P. Salvador, J. J. Dannenberg, V. G. Zakrzewski, S. Dapprich, A.
D. Daniels, M. C. Strain, O. Farkas, D. K. Malick, A. D. Rabuck, K. Raghavachari, J. B. Foresman, J.
V. Ortiz, Q. Cui, A. G. Baboul, S. Clifford, J. Cioslowski, B. B. Stefanov, G. Liu, A. Liashenko, P.
Piskorz, I. Komaromi, R. L. Martin, D. J. Fox, T. Keith, M. A. Al-Laham, C. Y. Peng, A.
Nanayakkara, M. Challacombe, P. M. W. Gill, B. Johnson, W. Chen, M. W. Wong, C. Gonzalez, and
J. A. Pople, Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 2003.ref gaussian 2003
[13] C. Lee, W. Yang, and R. G. Parr, Phys. Rev. B 37, 785 1988
[14] B. Miehlich, A. Savin, H. Stoll, and H. Preuss, Chem. Phys. Lett. 157, 200 1989
[15] Helms V., T.P. Straatsma, J. A. McCammon J.Phy.Chem. B 1999, 103, 3263-3269
31
Annexe 1 : Résultats antérieurs [8]
Spectre d'absorption : a) en noir, spectre théorique de la conformation A, b) en gris, spectre théorique
de la conformation B, c) en pointillé,spectre expérimental.
Réseau de liaisons
Hydrogène de la conformation A
Réseau de liaisons
Hydrogène de la conformation B
32
Annexe 2 : Géométries perpendiculaires
Géométrie 
Géométrie 
Géométrie 
Géométrie 
33