contrôle de la stérilité ou de l”absence de contamination des

Transcription

CHAPITRE 1.1.9.
CONTRÔLE DE LA STÉRILITÉ OU
DE L’ABSENCE DE CONTAMINATION
DES MATÉRIELS BIOLOGIQUES
INTRODUCTION
La stérilité est définie par l’absence d’organismes vivants. Elle est réalisée par chauffage, filtration,
traitement aux rayons ionisants ou par l’oxyde d’éthylène, et par l’application ultérieure de tout
procédé d’asepsie. L’absence de contamination est définie comme l’absence d’organismes
spécifiés vivants. Cet état est généralement obtenu en choisissant un matériel provenant d’une
source indemne d’organismes spécifiés et en réalisant des procédures ultérieures aseptiquement.
Une garantie suffisante de la stérilité et de l'absence de contamination ne peut être obtenue que
par un contrôle adapté des produits primaires utilisés et de leur condition de transformation et de
stockage. Des tests sur le produit sont nécessaires pour vérifier que le contrôle a été réalisé de
façon adéquate.
A. PROCÉDURES GÉNÉRALES
1.
Les matières premières doivent être collectées à partir de sources indemnes de contamination ; les
manipulations des produits devront minimiser les contaminations et réduire les chances de multiplication des
micro-organismes.
2.
Les matières premières qui peuvent être stérilisées sans perte de leurs activités biologiques doivent être
stérilisées par une méthode efficace appropriée. Le procédé doit réduire le niveau de contamination à un
niveau inférieur au seuil de détection, défini selon un test de stérilité approprié (voir paragraphe
B.3 ci-dessous).
3.
Si un procédé de stérilisation est utilisé, il doit être validé pour démontrer son adéquation et contrôlé de
façon optimale pour prouver à chaque fois le bon fonctionnement du procédé.
4.
Les matières premières qui ne sont pas stérilisées et celles qui doivent être transformées après un procédé
de stérilisation doivent être manipulées aseptiquement.
5.
L’environnement dans lequel les manipulations aseptiques sont opérées doit être maintenu propre et
protégé des sources de contamination extérieures ; un contrôle régulier doit être effectué afin de prévenir les
contaminations internes.
B. VACCINS À VIRUS NON INACTIVÉS ADMINISTRÉS PAR INJECTION
1.
Les produits biologiques d’origine animale (a) doivent être stérilisés, ou (b) doivent dériver d’animaux en
bonne santé, indemnes d’organismes pathogènes transmissibles de l’espèce d’origine aux espèces
vaccinées ou de toutes espèces en contact avec eux, ou (c) l’absence de tels agents pathogènes doit être
prouvée à partir du matériel initial.
2.
Les lots de semence virales et les lignées cellulaires continues utilisées pour la croissance virale doivent
être indemnes de bactéries, champignons, mycoplasmes, virus étrangers, et de tout autre agent pathogène
qui peut être transmis de l’espèce d’origine à l’espèce devant être vaccinée ou à tout autre espèce animale
entrant en contact avec les animaux vaccinés. Pour la production des vaccins aviaires et pour les
116
Manuel terrestre de l’OIE 2008
Chapitre 1.1.9. — Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques
procédures de contrôle de ces vaccins, il est recommandé d’utiliser des œufs embryonnés de poules
indemnes d’agents pathogènes spécifiques.
3.
Chaque lot de vaccin doit satisfaire à un test de stérilité qui est semblable à celui qui est décrit dans les
méthodes publiées (réf. 1 à 3 et 6).
4.
Chaque lot de vaccin doit satisfaire à des tests appropriés pour montrer que la suspension vaccinale est
indemne de tout virus étranger (Ces tests comprennent des tests en cultures cellulaires sensibles aux virus
de l’espèce devant être vaccinée, des tests sur œufs embryonnés, et si nécessaire des tests sur animaux).
5.
Certains pays imposent que chaque lot de vaccin soit indemne de mycoplasmes. Des tests de contrôle
appropriés ont été publiés (1, 2, 6).
6.
Des tests montrant l’absence de certaines bactéries spécifiques comme Salmonella pullorum,
Mycobacterium tuberculosis et M. paratuberculosis, Brucella spp. et Leptospira spp. peuvent être
exigés (1, 2).
C. VACCINS À VIRUS NON INACTIVÉS ADMINISTRÉS DANS L’EAU DE BOISSON,
PAR NÉBULISATION OU PAR SCARIFICATION CUTANÉE
1.
Appliquer les paragraphes B.1, 2, 4, 5 et 6.
2.
Un nombre limité de contaminants, de bactéries et champignons non pathogènes peuvent être admis (voir la
section J.2.5, ci-dessous).
D. VACCINS À VIRUS INACTIVÉS
1.
Appliquer les paragraphes B.1, 2 et 3.
2.
Chaque lot de vaccin devra satisfaire au test concernant le contrôle de l’inactivation. Celui-ci est réalisé
avant l’addition d’agents de conservation. La procédure d’inactivation et les tests utilisés pour détecter les
virus vivants après inactivation doivent être validés et en adéquation avec l’objectif fixé.
3.
La preuve que la méthode d’inactivation inactive aussi des agents pathogènes typiques peut s’avérer
nécessaire à moins que le vaccin ne satisfasse aux conditions des paragraphes B.4 et B. 5.
E. VACCINS À BACTÉRIES VIVANTES
1.
Appliquer le paragraphe B.1.
2.
L’absence de contaminants fongiques, bactériens et mycoplasmiques doit être montrée au niveau des lots
de semence de bactéries.
3.
Un test de pureté de souche bactérienne doit être réalisé sur chaque lot de vaccin en utilisant un milieu
solide et en ne tenant pas compte de la croissance de la souche bactérienne vaccinale.
4.
Certains pays imposent que chaque lot de vaccin bactérien soit indemne de mycoplasmes. Des tests de
contrôle appropriés ont été publiés (réf. 6 et pour les mycoplasmes aviaires, réf. 2).
F. VACCINS À BACTÉRIES INACTIVÉES
1.
Appliquer les paragraphes B.1, B.3, et E.2.
2.
Chaque lot de vaccin devra satisfaire le test concernant le contrôle de l’inactivation des bactéries. Le test de
stérilité peut convenir pour ce sujet s’il est adapté.
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G. SÉRUMS ADMINISTRÉS AUX ANIMAUX
1.
Appliquer le paragraphe B.1. Certains pays exigent que tous les animaux donneurs soient soumis à une
quarantaine, soient munis d’un certificat de santé et qu’ils soient soumis à des tests pour des maladies
spécifiques.
2.
Appliquer le paragraphe B.2 ou E.2, en fonction de la nature virale ou bactérienne de l’antigène utilisé pour
produire le sérum.
3.
Chaque lot de vaccin doit répondre à un test de stérilité. Des méthodes sont disponibles et ont été publiées
(1, 2).
4.
Chaque lot de sérum doit satisfaire aux tests appropriés pour montrer que le sérum est exempt de tout virus
étranger (ces tests comprennent les tests en cultures cellulaires sensibles aux virus de l’espèce devant être
traitée par le sérum, des tests sur œufs embryonnés, et si nécessaire des tests sur animaux).
5.
Certains pays imposent que chaque lot de sérum soit exempt de mycoplasmes. Des tests de contrôle ont
été décrits (réf. 6 et pour les mycoplasmes aviaires, réf. 2).
H. RÉACTIFS DIAGNOSTIQUES ADMINISTRÉS AUX ANIMAUX
1.
Appliquer les paragraphes B.1 et B.3.
2.
Les paragraphes B.2 et D.2 doivent être appliqués si un virus est utilisé dans la production du réactif de
diagnostic et les paragraphes E.2 et F.2, si une bactérie est utilisée.
I. EMBRYONS, OVULES, ET SPERME
Des règles spécifiques doivent être suivies si des embryons, ovules ou sperme sont utilisés (4).
J. EXEMPLES DE PROTOCOLE
1.
Procédures générales
Les matières premières utilisées pour la production de produits biologiques doivent être stérilisées et/ou testées
pour montrer l’absence de contaminant avant leur emploi. Les contaminants bactériens, viraux ou
mycoplasmiques seront recherchés dans des échantillons du produit biologique fini.
Les tests décrits dans le présent chapitre pour la recherche de bactéries, de mycoplasmes, de virus ou de
champignons proviennent de différentes sources et ils sont donnés à titre d’exemples qui peuvent être utilisés
avec confiance.
2.
Détection de bactéries et champignons
Ces tests décrivent les produits et méthodes qui sont utilisés pour la détection de bactéries et champignons soit
par la méthode de filtration sur membrane, soit par l’inoculation directe de milieu liquide utilisé pour les produits
ne permettant pas la filtration sur membrane.
2.1. Procédure générale pour détecter des bactéries ou champignons viables
Les tests normalisés pour détecter des bactéries ou champignons étrangers dans les matières premières
brutes, les lots de semence ou le produit fini sont : le test de filtration sur membrane ou le test de stérilité par
l’inoculation directe.
Pour la technique de filtration sur membrane, un filtre disposant d’une porosité nominale ne dépassant pas
0,45 µm et ayant un diamètre d’au moins 47 mm devra être utilisé. Les filtres en nitrate de cellulose doivent
être utilisés si le matériel est aqueux ou huileux ; des filtres à base d’acétate de cellulose seront utilisés si le
matériel est fortement alcoolique, huileux ou s’il renferme un adjuvant huileux. Le filtre est imbibé avec
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20 à 25 ml de diluant A ou B immédiatement avant que le contenu du récipient ou des récipients devant être
testés ne soit filtré.
Diluant A − pour les produits ou matières premières aqueuses : dissoudre 1 g d’hydrolysat peptique de tissu
animal dans de l’eau et porter à 1 litre, filtrer ou centrifuger pour clarifier, ajuster le pH à 7,1 ± 0,2, répartir
dans des flacons de 100 ml et stériliser à la vapeur.
Diluant B − pour les produits à base d’adjuvant huileux ou matières premières huileuses : ajouter 1 ml de
polysorbate 80 à 1 litre de Diluant A, ajuster le pH à 7,1 ± 0,2, répartir dans des flacons de 100 ml et
stériliser à la vapeur.
Si le produit biologique devant être testé a des propriétés anti-microbiennes, la membrane est lavée 3 fois
après l’application de l’échantillon avec environ 100 ml du diluant approprié (A ou B). La membrane est
ensuite transférée en totalité sur un milieu de culture, coupée de façon aseptique en parties égales dans le
milieu ou bien le milieu est transféré sur la membrane en utilisant l’appareil à filtration. Si l’échantillon à
tester contient du merthiolate comme agent de conservation, le milieu liquide au thyoglycollate (FTM pour
Fluid Thioglycollate Medium) est utilisé et les membranes sont incubées entre 30 °C et 35 °C et 20 °C et
25 °C. Si l’échantillon à tester est un produit biologique inactivé sans conservateur à base de merthiolate, le
FTM est utilisé entre 30 °C et 35 °C et le milieu à base d’hydrolysat de caséine de soja (SCDM, Soybean
Casein Digest Medium) entre 20 °C et 25 °C. Si l’échantillon testé est une suspension virale non inactivée,
le milieu SCDM est utilisé aux deux températures d’incubation. Il a été suggéré récemment d’utiliser de la
gélose sulfite de polymixine-sulfadiazine pour améliorer la détection de Clostridium spp. quand la technique
de filtration sur membrane est employée (5).
Si une inoculation directe du milieu de culture est choisie, une pipette stérile ou une seringue et une aiguille
sont utilisées pour transférer aseptiquement le matériel biologique directement dans le milieu liquide. Si le
produit biologique devant être testé a des propriétés anti-microbiennes, le ratio inoculum/volume de culture
du milieu doit être déterminé avant de débuter le test. Afin de déterminer le volume de milieu approprié pour
négativer l’activité anti-microbienne, 100 unités formant colonie (UFC) d’un micro-organisme témoin listé
dans le tableau 1 sont utilisées. Si le produit à tester contient du merthiolate comme agent de conservation,
le FTM est utilisé aux températures entre 30 °C et 35 °C et 20 °C et 25 °C comme contrôle. La croissance
doit être nettement visible après un temps d’incubation approprié (voir paragraphe J.2.2). Si le produit à
tester est inactivé et ne contient ni merthiolate ni bactéries vivantes, le FTM est utilisé entre 30 et 35 °C et le
SCDM entre 20 °C et 25 °C. Si le produit à tester est constitué d’une suspension virale non inactivée, le
SCDM est utilisé aux 2 températures d’inactivation. Si le vaccin bactérien inactivé renferme des clostridies
ou contient un composant dérivant de clostridies, l’utilisation de FTM avec 0,5 % d’extrait de bœuf (FTMB)
au lieu du FTM est préférée. Il peut être souhaitable d’utiliser à la fois le FTM et le SCDM pour tous les
tests.
Tableau 1. Souches de la collection de culture de référence (ATCC)1 avec leur milieu respectif de croissance
et les conditions d’incubation.
Incubation
Milieu
Micro-organisme témoin
Température (°C)
Conditions
FTM
Bacillus subtilis-ATCC # 6633
30 à 35
Aérobie
FTM
Candida krusei-ATCC # 6258
20 à 25
Aérobie
SCDM
Bacillus subtilis-ATCC # 6633
30 à 35
Aérobie
SCDM
Candida krusei-ATCC # 6258
20 à 25
Aérobie
FTMB
Clostridium sporogenes-ATCC # 11437
30 à 35
Anaérobie
FTMB
Staphylococcus aureus ATCC #6538
30 à 35
Aérobie
Pour les deux tests de stérilité par filtration sur membrane ou inoculation directe, au minimum 14 jours
d’incubation sont nécessaires à tous les milieux. Les milieux sont examinés à intervalles réguliers et après
14 jours d’incubation pour rechercher une croissance microbienne qui sera confirmée par une sous-culture
et une coloration de Gram.
1
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA.
119
2.2. Stimulation de la croissance et interférence du test
La stérilité du milieu doit être confirmée en incubant des flacons représentatifs à la température appropriée
et pendant le temps nécessaire spécifié pour chaque test.
La capacité du milieu de culture pour supporter une croissance en présence ou absence du produit
biologique, de composants du produit, de cellules, de semences, ou d’autres produits doit être validée pour
chaque produit testé, et pour chaque nouveau lot ou préparation de milieu de culture.
Le milieu doit être inoculé avec 10 à 100 micro-organismes témoins viables appartenant à une lignée de
l’American Type Culture Collection (ATCC) (voir note de bas de page n°1) listée dans le tableau 1, et incubé
selon les recommandations de la procédure, afin de montrer que le test permet une croissance en l’absence
de produit test.
Pour tester la capacité du milieu de culture à supporter la croissance en présence du produit test, les flacons
doivent être inoculés simultanément avec le produit test (voir section J.2.3) et 10 à 100 micro-organismes
témoins viables. Le nombre de flacons utilisés doit être égal à au moins la moitié du nombre utilisé pour
tester le produit ou les composants du produit. Les milieux de culture sont satisfaisants si la croissance des
micro-organismes témoins est clairement établie au cours des 7 jours suivant l’inoculation dans tous les
milieux de culture. Lors d’une croissance nette de micro-organismes, il est nécessaire de confirmer la nature
du micro-organisme en cause pour vérifier qu’il correspond bien à l’organisme initialement ajouté au milieu.
Le test de stérilité n’est pas validé si la croissance des micro-organismes n’est pas adéquate ou si le
micro-organisme trouvé ne correspond pas à l’agent ayant servi à l’inoculation.
2.3. Nombre de flacons devant être testés
Le nombre d’unité de production dans un lot détermine le nombre de flacons qui doivent être contrôlés pour
leur stérilité. Si la taille du lot est inférieure à 100 unités alors 10 % d’entre elles ou 4 flacons et cela qu’elle
que soit leur capacité, doivent être testés. Si le lot contient entre 100 et 500 flacons, 10 d’entre-eux doivent
être testés. Si le lot a plus de 500 flacons, 2 % ou 20 flacons, (le plus petit des deux) doivent être testés.
Une alternative consiste, pour les produits autres que les produits autogènes, à tester un maximum de 10
flacons pour chaque série.
La quantité de l’inoculum pour le test de stérilité dépend de la quantité de matériel biologique dans chaque
flacon. Si la quantité est inférieure à 1 ml, alors le contenu total est utilisé pour chacun des milieux. Si le
volume est compris entre 1 et 4 ml, alors la moitié de cette teneur est utilisée pour chaque milieu. Si la
quantité est comprise entre 4 et 20 ml, un inoculum de 20 ml par milieu est utilisé. Si la quantité dans
chaque flacon est comprise entre 20 et 100 ml, 10 % du volume sont utilisés par milieu. Si la quantité
dépasse 100 ml par flacon, alors on utilise 10 % ou 50 ml (le plus grand des deux) pour inoculer chaque
milieu.
2.4. Interprétation des résultats du contrôle de la stérilité
Si une croissance de micro-organismes est observée dans un milieu, mais que les témoins montrent que le
milieu est impropre alors ce premier test est déclaré invalide et pourra être répété. Si une croissance
microbienne est observée au cours du premier test à partir de certains flacons et qu’il n’y a pas d’invalidation
du test à partir des témoins alors un deuxième test peut être conduit. Le nombre minimum de flacons, de
récipients tests, de filtres dans le deuxième test est le double de celui du premier test. Si aucune croissance
n’est observée dans le premier ou deuxième test, alors le produit biologique satisfait les conditions du test et
est considéré comme satisfaisant en ce qui concerne la stérilité. Si une croissance microbienne est
observée dans un récipient re-testé, le produit biologique est considéré comme non satisfaisant vis-à-vis de
la stérilité. Cependant, si une erreur au niveau des milieux ou de la technique est prouvée à partir des
témoins pour le deuxième test, alors il est possible de tester à nouveau.
2.5. Procédures générales pour tester des vaccins à virus atténué produits sur œufs et administrés dans
l’eau de boisson, par nébulisation ou scarification cutanée pour tester la présence de bactéries ou
de champignons
Chaque lot de flacons contenant le produit biologique final doit présenter une contamination moyenne
inférieure à une colonie bactérienne ou fongique par dose pour les vaccins recommandés pour les volailles,
ou 10 colonies par dose pour les autres animaux (voir Section J.2.3 ci-dessus pour déterminer le nombre
d’échantillons à tester). À partir de chaque échantillon de flacons, deux boîtes de Petri sont inoculées avec
10 doses de la suspension vaccinale si le vaccin est destiné aux volailles, ou une dose s’il est recommandé
pour d’autres animaux. À chaque boîte, on ajoute 20 ml de gélose à base d’infusion cœur-cerveau en
120
présence de 0,007 UI (Unités Internationales) de pénicillinase/ml. Une boîte devra être incubée entre 30 °C
et 35 °C pendant 7 jours et la seconde devra être incubée entre 20 °C et 25 °C pendant 14 jours. Le nombre
de colonies est calculé à la fin de chaque temps d’incubation. Le nombre moyen de colonies de toutes les
boîtes représentant un lot doit être réalisé pour les différentes conditions d’incubation. Si le nombre moyen
de colonies pour chaque condition d’incubation excède un par dose pour les vaccins recommandés aux
volailles, ou 10 colonies par dose pour les vaccins destinés aux autres espèces animales au cours du
premier test, un deuxième test pour éliminer toute erreur technique peut être opéré en utilisant un nombre
double du conditionnement final non ouvert. Si le nombre moyen de colonies dépasse, pour les
deux conditions d’incubation, 1 par dose pour les vaccins recommandés aux volailles ou 10 par dose pour
les vaccins utilisés dans les autres espèces animales, alors le lot de vaccin devra être reconnu comme non
satisfaisant.
2.6. Procédures générales pour tester la pureté des lots de semence de bactéries ou de produits
biologiques à base de bactéries vivantes
La pureté de chaque lot de semence bactérienne ou de chaque lot de produit biologique à base de bactéries
vivantes doit être testée en inoculant un milieu SCDM qui est incubé entre 20 °C et 25 °C pendant 14 jours,
et un milieu FTM, qui est incubé entre 30 °C et 35 °C pendant 14 jours (voir Section J.2.3 ci-dessus pour
déterminer le nombre d’échantillons devant être testé et le volume de l’inoculum à utiliser). Une pipette
stérile ou une seringue et une aiguille sont utilisées pour transférer directement de façon aseptique la
quantité de matériel biologique sur les 2 types de milieu de culture. Le ratio minimal inoculum/milieu de
culture est de 1/15.
Si l’inoculum ou la croissance du vaccin bactérien rend le milieu turbide masquant lors d’un examen visuel la
croissance d’un autre micro-organisme atypique, alors des sous-cultures sont réalisées à partir de tous les
tubes ayant une turbidité entre le jour 3 et 11. Les sous-cultures sont réalisées en transférant 0,1 à 1,0 ml à
différents bouillons ou boîtes de gélose et en incubant pendant une période de 14 jours. Un examen
microscopique après coloration de Gram doit être également réalisé.
Si aucune croissance atypique n’est observée à partir de différents flacons tests et si le témoin positif inclus
dans le test est satisfaisant, le lot du produit biologique peut être considéré comme pur. Si une croissance
atypique est montrée alors que les témoins prouvent qu’il y a une insuffisance du milieu ou de la technique,
le test peut être répété. Si une croissance atypique est mise en évidence avec des témoins valides, un
deuxième test doit être réalisé. Le nombre de flacon testé dans le deuxième contrôle est égal au double de
celui initialement testé. Si aucune croissance atypique n’est montrée dans le deuxième test, le produit
biologique est considéré comme pur. Si une croissance atypique est mise en évidence dans le deuxième
test, le produit biologique est considéré comme non satisfaisant en ce qui concerne la pureté. Cependant, si
les témoins montrent une défaillance de la technique ou du milieu, alors un autre test peut être fait.
3.
Détection de contamination par Mycoplasma
3.1. Procédure générale pour la détection de contamination par Mycoplasma
Chaque lot de vaccin à virus vivant, chaque lot de semence primaire (MSV, Master Seed Virus), chaque lot
primaire (MCS, Master Cell Stock) ou secondaire de cellules, et tous les composants d’origine animale qui
ne sont pas stérilisés par la vapeur doivent être testés pour déterminer l’absence de mycoplasmes. Des
milieux liquides et solides qui permettent la croissance d’un petit nombre de micro-organismes tests comme
les micro-organismes contaminants courants Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, M. fermentans,
M. hyorhinis, M. orale et M. synoviae devront être utilisés. Les caractéristiques nutritives du milieu solide
doivent permettre la croissance d’au moins 100 UFC quand le milieu a été ensemencé avec 100 à 200 UFC
par boîte. Un changement de couleur approprié doit survenir dans le milieu liquide quand environ 20 à
40 UFC de chaque micro-organisme test sont inoculées. La capacité du milieu de culture à permettre la
croissance en présence de produit doit être validée pour chaque produit devant être testé, et pour chaque
nouveau lot ou unité de production de milieu de culture.
Un échantillon de chaque lot de vaccin, MSV, etc., doit être testé. Quatre boîtes de milieu solide sont
inoculées avec 0,25 ml de l’échantillon devant être testé, et 100 ml de milieu liquide sont ensemencés avec
10 ml de l’échantillon. Il est aussi possible d’inoculer chaque boîte avec 0,1 ml et d’inoculer 1 ml de
l’échantillon à tester dans 100 ml de milieu liquide. Deux boîtes sont incubées entre 35 et 37 °C en
atmosphère aérobie (atmosphère contenant 5 à 10 % de CO2 et une humidité adéquate) et 2 boîtes sont
placées en atmosphère anaérobie (atmosphère en présence d’azote contenant 5 à 10 % de CO2 et une
humidité adéquate) pendant 28 jours. Trois ou quatre jours après l’inoculation, une sous-culture avec
0,25 ml de milieu liquide est réalisée par un étalement sur 2 boîtes de milieu solide. Incuber une boîte en
milieu aérobie et la seconde en milieu anaérobie entre 35 et 37 °C jusqu’au jour 28 du test. Répéter la
121
procédure de sous-culture aux jours 6, 7, ou 8 et également au jour 13 ou 14. Une méthode alternative
consiste à pratiquer des nouvelles cultures sur milieu solide aux jours 3, 5, 10 et 14 et de les incuber
pendant 14 jours. Observer le milieu liquide tous les deux à trois jours et, lors d’un changement de couleur,
réaliser immédiatement une sous-culture.
3.2. Interprétation des résultats du test pour recherche de Mycoplasma.
À la fin de la période d’incubation (jour 28) tous les milieux solides inoculés sont examinés au microscope
pour rechercher la présence de colonie de mycoplasmes. L’échantillon analysé passe le test si la croissance
de colonie de mycoplasme est observée sur les témoins positifs, et si aucune croissance n’est observée sur
les milieux solides inoculés avec le matériel de test. Si à un quelconque moment de l’analyse, plus d’une
boîte est accidentellement contaminée avec des bactéries ou des champignons, ou est cassée, le test n’est
pas validé et doit être répété. Si des colonies de mycoplasmes sont rencontrées sur des boîtes d’agar, le
test devra être répété une 2e fois pour confirmer la contamination par des mycoplasmes. Le double du
volume (0,5 ml) de matériel biologique devant être testé sera utilisé pour le deuxième test. Si des colonies
de mycoplasmes sont trouvées sur l’une des boîtes du deuxième test, l’échantillon est considéré comme
non satisfaisant du fait d’une contamination mycoplasmique. Certains mycoplasmes ne peuvent pas être
cultivés, auquel cas, les MSV et MCS doivent être testés en utilisant une lignée cellulaire indicatrice
(Cellules Vero), ou en effectuant une coloration de l’ADN ou une réaction d’amplification en chaîne par
polymérase (PCR).
4.
Détection de contamination par Salmonella
Chaque lot de produit biologique à base de virus non inactivé produit sur œufs doit être exempt de Salmonella.
Cette recherche doit être réalisée avant que des produits bactériostatiques ou bactéricides ne soient ajoutés.
Cinq échantillons de chaque lot doivent être testés ; 5 ml ou la moitié du contenu d’un flacon (ce qui correspond à
la plus faible quantité) sont utilisés pour inoculer 100 ml de bouillon de tryptose et de bouillon au tétrathionate.
Les bouillons inoculés doivent être incubés pendant 18 à 24 h et entre 35 °C et 37 °C. Des inoculums sont
réalisés à partir de ces bouillons pour ensemencer une gélose MacConkey et une gélose Salmonella-Shigella ;
les milieux inoculés sont incubés pendant 18 à 24 h, et sont examinés. Si aucune croissance typique de
Salmonella est observée, les boîtes d'agar doivent être incubées pendant 18 à 24 h et examinées à nouveau. Si
des colonies typiques de Salmonella sont observées, une sous-culture sur des milieux sélectifs adaptés doit être
réalisée pour permettre une identification positive. Si une Salmonella est isolée, le lot du produit biologique est
considéré comme non satisfaisant.
5.
Détection de virus dans les produits biologiques
Les produits biologiques qui sont susceptibles d'héberger des virus et qui ne peuvent pas subir une stérilisation
avant leur utilisation doivent être testés avant leur emploi. Ce sont les produits dérivés d'animaux (par exemple le
sérum), des cellules primaires, des lignées cellulaires ou des stocks viraux de semence. Différents tests ont été
décrits pour identifier des contaminants viraux : mise en évidence d'effet cytopathogène (ECP), hémadsorption,
hémagglutination, techniques à base d'anticorps fluorescents et toutes autres méthodes adéquates, par exemple
la PCR ou la méthode immuno-enzymatique ELISA. Tous les produits biologiques doivent être spécifiquement
testés pour la présence de pestivirus. Les produits biologiques et les vaccins aviaires doivent être inoculés sur
des cultures cellulaires de première explantation, sur des œufs et/ou chez des poussins pour la détection de virus
aviaires. En plus de rechercher un ECP ou des modifications cellulaires dans les cellules, les œufs ou les
poussins, il convient de pratiquer des tests pour la recherche de virus hémadsorbants et hémagglutinants.
Les cellules doivent être testées de la manière suivante. Au jour 0, les cellules congelées ou primaires devant
être testées sont ensemencées dans des flacons de 75 cm2 (ou semblable) ; 7 jours plus tard, au moins 2 flacons
de 75 cm2 sont préparés. Au jour 14, un flacon est utilisé pour tester les cellules pour un ECP, pour réaliser une
hémadsorption et une immunofluorescence (procédures ci-dessous). L'autre flacon est soumis à un deuxième
passage et au jour 21, 3 cycles de congélation-décongélation sont réalisés. Il est aussi possible de
congeler-décongeler les cellules au jour 21, plutôt qu’au jour 26. À l'issue de ce traitement, les cellules sont
centrifugées à 2 000 g pendant 10 min, et le surnageant est utilisé pour inoculer des cellules appropriées
sensibles à des virus par exemple des cellules sensibles à des virus que l’on peut retrouver dans l’espèce
animale à partir de laquelle les cellules ont été obtenues ou bien encore des cellules sensibles aux virus qui
peuvent survenir chez des animaux pour lesquels les prélèvements sont en cours d’utilisation et des cellules
sensibles aux virus de la peste. Ces cellules sont soumises à 2 passages espacés de 7 jours, et sont testées
pour un ECP ; une hémadsorption et une immunofluorescence sont réalisées.
Les substances d'origine animale sont testées sur les cellules rénales du singe vert africain (Vero) et sur une
lignée cellulaire ou une culture primaire dérivées de la même espèce que les substances éprouvées. Les cellules
sont inoculées en flacons de 75 cm2 avec 3,75 ml de matériel test repris dans 25 ml de milieu ou 15 % de la
122
substance à tester (choisir le plus faible volume). Les cellules sont repiquées 2 ou 3 fois à 7 jours d'intervalle et
sont testées pour un ECP ; une hémadsorption et une immunofluorescence. Les cellules doivent être observées
pour un ECP tous les deux à trois jours, et avant chaque sous-culture, pendant la période d’incubation.
Les semences primaires sont testées sur cellules VERO, sur des lignées cellulaires continues ou des cultures
primaires dérivant des espèces auxquelles le produit est destiné. Elles sont également testées sur des lignées
cellulaires continues ou des cultures primaires dérivant de l'espèce productrice du produit (si celle-ci est différente
de l'espèce destinatrice).
Pour chaque type cellulaire exigeant un contrôle, 1 ml de MSV à tester est décongelé ou reconstitué et neutralisé
par l'addition de 1 ml d'antisérum monospécifique. Le sérum doit être dépourvu d’anticorps dirigés contre les
contaminants pour lesquels le test est développé. Les antisérums doivent aussi être testés pour vérifier l’absence
d’effets inhibiteurs non spécifiques. Au moins deux types cellulaires sont toujours requis avec un minimum de
2 ml de MSV et 2 ml d'antisérum. L'antisérum assure une neutralisation virale à température ambiante en 1 h.
2
2 ml du mélange MSV/antisérum sont inoculés à des flacons de 75 cm contenant les cellules appropriées. Si la
semence primaire présente un titre élevé ou est difficile à neutraliser ou si l'antisérum a un titre faible, l'antisérum
peut être ajouté au milieu de culture à la concentration finale de 1 à 5 %. Les cellules doivent être repiquées au
moins deux fois pendant une période de 14 jours et la culture finale est examinée pour un ECP ; une
hémadsorption et une immunofluorescence sont également réalisées.
La coloration de May-Grünwald-Giemsa (MGG) est utilisée pour détecter un ECP provoqué par des virus
adventices. Des tapis cellulaires sont préparés sur des lames pour culture cellulaire à deux chambres ; les tapis
sont incubés pendant 7 jours. Les puits en plastique de la lame sont retirés en prenant soin de laisser la base en
caoutchouc fixée sur la lame. Les lames sont lavées dans une solution physiologique tamponnée au phosphate
(PBS) de Dulbecco, puis sont fixées à l'alcool et placées sur un portoir pour la coloration. Les lames sont colorées
pendant 15 min à la température ambiante avec le MGG dilué au 1/5 dans du méthanol absolu. Le colorant est
retiré en inversant les lames. Les lames sont ensuite colorées pendant 20 min avec le colorant dilué au 1/15 dans
de l'eau désionisée. Le colorant est retiré en inversant les lames et en les rinçant avec de l'eau désionisée
pendant 10 à 20 s. Les lames sont séchées à l'air et une lamelle est appliquée avec une goutte d'huile de
paraffine. Le colorant MGG permettra de différencier les nucléoprotéines à base d'ADN de celles à base d'ARN.
Les nucléoprotéines à base d'ADN sont colorées en rouge-pourpre alors que les nucléoprotéines à base d'ARN
sont colorées en bleu. Les tapis cellulaires sont examinés avec un microscope conventionnel pour la recherche
de corps d'inclusion, d’un nombre anormal de cellules géantes ou de tout autre ECP attribuable au contaminant
viral. Les tapis inoculés sont comparés avec les tapis non inoculés. Si un ECP attribuable à un virus étranger est
trouvé, le produit testé doit être considéré comme non satisfaisant.
La détection de virus étrangers provoquant une hémadsorption dans des cellules infectées est généralement
réalisée sur des tapis ayant un deuxième passage du produit biologique testé et inoculé à un tapis cellulaire ; le
même test est réalisé avec un tapis cellulaire non inoculé. Le tapis cellulaire est généralement préparé dans un
flacon en plastique de 75 cm2. Des hématies de cobaye, poulet ou tout autre animal de laboratoire sont
collectées dans un volume égal de solution d'Alsever. Le sang peut être conservé à 4 °C pendant 7 jours s'il est
lavé plusieurs fois dans une solution d'Alsever avant un stockage dans un volume égal de solution d'Alsever.
Avant leur utilisation, les érythrocytes sont à nouveau lavés en ajoutant 5 ml de la suspension dans la solution
d'Alsever à 45 ml de PBS sans calcium et sans magnésium ; la solution est centrifugée à 500 g pendant 10 min.
Le surnageant est retiré par aspiration et les érythrocytes sont repris dans du PBS avant d'être centrifugés à
nouveau. Cette procédure de lavage est répétée au moins 2 fois jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Les
érythrocytes de chaque espèce sont mélangés en ajoutant 0,1 ml de chacun des types de cellules sédimentées à
100 ml de PBS. Les érythrocytes des différentes espèces peuvent être gardés séparés ou mélangés. Sont
ajoutés à chaque flacon 5 ml de la suspension d'érythrocytes ; une incubation de 30 min à 4 °C est réalisée. Les
tapis cellulaires sont lavés 2 fois avec du PBS et sont examinés pour leur hémadsorption. Si aucune
hémadsorption n'est visible, 5 ml de la suspension d'érythrocytes sont ajoutés à chaque flacon et sont incubés
entre 20 et 25 °C pendant 30 min ; les tapis sont rincés comme précédemment et sont examinés pour leur
hémadsorption. Des flacons différents peuvent être utilisés pour chaque température d'incubation en cas de
besoin. Les tapis cellulaires sont examinés macroscopiquement (en utilisant un transilluminateur) et au
microscope. Il est important de comparer les tapis inoculés avec les tapis témoins non inoculés afin d'identifier
une hémadsorption non spécifique qui peut survenir avec certains types cellulaires. L'utilisation de PBS sans
calcium et sans magnésium et des hématies fraîches doit empêcher la plupart des hémadsorptions non
spécifiques. Si une hémadsorption spécifique est liée à un agent étranger, le produit biologique testé doit être
considéré comme non satisfaisant.
Les tests pour détecter des virus étrangers par immunofluorescence utilisent en général des tapis cellulaires du
deuxième passage du produit biologique testé ; une comparaison est réalisée avec des tapis cellulaires non
inoculés. Les tapis cellulaires sont constitués de lames avec 8 puits de culture. Une lame témoin positif (avec
123
8 puits ensemencés) est réalisée avec chaque conjugué antiviral en inoculant chaque tapis cellulaire avec
100 DICT50 (dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire) du virus approprié. Trois groupes de tapis
cellulaire sont colorés avec le conjugué antiviral. Le Groupe 1 est constitué par le deuxième passage du produit
biologique inoculé à des cellules ; le Groupe 2 correspond au deuxième passage du tapis cellulaire non inoculé et
le Groupe 3 correspond au deuxième passage du tapis cellulaire non inoculé (pour la production du témoin
culture cellulaire positif). Lors de la coloration, les bords des puits sont enlevés, mais le joint de caoutchouc est
laissé en place sur la lame. Les lames sont lavées dans un milieu PBS de Dulbecco puis sont fixées pendant au
moins 10 min dans de l'acétone à 4 °C et sont séchées. Environ 0,1 ml de chacun des conjugués est placé au
centre de chaque puits d'une lame des Groupes 1 et 2 ainsi que dans les puits du témoin positif du groupe 3. Les
lames sont incubées dans une chambre humide à 37 °C pendant 30 min, et sont rincées une fois avec du PBS de
Dulbecco ; les lames sont ensuite placées dans un bac contenant du PBS de Dulbecco pendant 10 min. Les
lames sont ensuite lavées de façon intensive avec de l'eau désionisée avant d'être séchées. Toutes les lames
sont observées pour rechercher une fluorescence spécifique attribuable à un virus particulier. Trois lames de
chacun des groupes, marquées par un même fluorochrome, sont comparées. Si la lame préparée à partir des
cellules inoculées avec le produit biologique testé, présente une fluorescence spécifique de fluorescence virale,
alors le MSV doit être considéré comme non satisfaisant.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (2007). Animals and Animal Products, Title 9, Parts 1–199. The Office of the
Federal Register, National Archives and Records Administration. US Government Printing Office,
Washington DC, USA.
2.
COUNCIL OF EUROPE (2006). European Pharmacopoeia, Fifth Edition. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France. ISBN 92-871- 4587-3.
3.
EUROPEAN UNION (1999). The Rules Governing Medicinal Products in the European Union. Eudralex, Vols 49. Office Publications of the European Communities, Luxembourg.
4.
HARE W.C.D. (1985). Diseases transmissible by semen and embryo transfer techniques. OIE Technical
Series No. 4. OIE, Paris, France. ISBN 92-9044-164-1.
5.
TELLEZ S., CASIMIRO R., VELA A.I., FERNANDEZ-GARAYZABAL J.F., EZQUERRA R., LATRE M.V., BRIONES V.,
GOYACHE J., BULLIDO R., ARBOIX M. & DOMINGUEZ L. (2005). Unexpected inefficiency of the European
pharmacopoeia sterility test for detecting contamination in clostridial vaccines. Vaccine, 24, 1710–1715.
6.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) (1998). WHO Expert Committee on Biological Standardization. World
Health Organization Technical Report Series, Report No. 858. World Health Organization, Geneva,
Switzerland. ISBN 92-4-120878-3.
AUTRES LECTURES
Des détails sur les méthodes et les milieux de cultures seront trouvés dans les ouvrages suivants ainsi que dans
les catalogues commerciaux.
A.
BARROW G.I. & FELTHAM R.K.A. eds. (1993). Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical
Bacteria, Third Edition. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
B.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (2003) Subchapter E. Viruses, serums, toxins, and analogous products;
organisms and vectors. In: Code of Federal Regulation, Animals and Animal Products, Title 9, Parts 101–
124. The Office of the Federal Register, National Archives and Records Administration. U.S. Government
Printing Office, Washington, DC, USA, 557–737.
C.
COLLINS C.H., LYNE P.M. & GRANGE J.M., eds. (1995). Collins and Lyne’s Microbiological Methods, Seventh
Edition. Butterworth Heinemann, Oxford, UK.
D.
MURRAY P.R., ed. (2003). Manual of Clinical Microbiology, Eighth Edition. American Society for Microbiology
Press, Washington DC, USA.
*
* *
124
ANNEXE 1.1.9.1.
ANALYSE DE RISQUE
RELATIVE AUX PRODUITS BIOLOGIQUES
À USAGE VÉTÉRINAIRE
AUTRES QUE LES VACCINS
INTRODUCTION
Aux fins de l'application des dispositions énoncées dans le présent chapitre, on entend par « produits
biologiques » les « produits biologiques à usage vétérinaire autres que les vaccins ».
CLASSIFICATION DES PRODUITS BIOLOGIQUES
La classification est un moyen de faciliter l'analyse de risque relative aux échanges internationaux de produits
biologiques.
Le système de classification doit tenir compte de l'origine, la nature et la destination déclarée des produits
biologiques. En procédant à des analyses de risque de portée générale, et en mettant au point des procédures
générales de certification et d'assurance qualité, la fourniture de produits peut être assurée en permanence sans
avoir à répéter les procédures d'appréciation de risque, qui sont onéreuses et mobilisent des ressources
importantes. Une fois réalisée, l'appréciation du risque peut être mise en relation avec les paramètres appropriés
relatifs à la fabrication et au contrôle. Les catégories de produits biologiques à usage vétérinaire pouvant faire
l'objet d'appréciations génériques des risques sont les suivantes (liste présentée sans ordre d'importance du
risque) :
1.
produits de synthèse ;
2.
acides aminés, alcools, esters, sucres et vitamines ;
3.
produits cosmétiques ;
4.
extraits végétaux et substances biochimiques traitées d'origine végétale ;
5.
produits obtenus par fermentation microbienne ;
6.
kits de diagnostic, analytiques et immunochimiques pour usage in vitro ;
7.
produits d'origine humaine ;
8.
produits thérapeutiques ;
9.
implants d'origine animale ;
10. anticorps et immunoglobulines ;
11. acide désoxyribonucléique (ADN), acide ribonucléique (ARN), enzymes de restriction et autres produits
issus de la biologie moléculaire ;
12. lignées cellulaires et hybridomes ;
13. protéines animales, hormones, enzymes, albumines, extraits tissulaires et milieux de culture contenant des
produits d'origine animale ;
14. sérum animal ;
15. micro-organismes (conventionnels ou génétiquement modifiés) ;
16. agents probiotiques ;
17. prélèvements conservés, lames et frottis pour examens microscopiques.
125
Selon leur origine et les procédures de traitement appliquées, tous ces produits peuvent contenir des agents
pathogènes.
INFORMATION À FOURNIR
LORS DE LA DEMANDE D'AUTORISATION D'IMPORTATION
Pour procéder à une analyse de risque relative aux produits biologiques, les Autorités vétérinaires doivent suivre
les recommandations du Manuel terrestre. Le fabricant ou les Autorités vétérinaires du pays exportateur doivent
fournir, de façon confidentielle si nécessaire, des informations détaillées sur l'origine des composants employés
pour la fabrication du produit (substrats, par exemple). Ils doivent aussi donner des précisions sur le procédé de
fabrication (et d'inactivation, s'il y a lieu) utilisé pour les substrats et les composants, sur les procédures
d'assurance qualité appliquées à toutes les étapes du processus, sur les protocoles de contrôle du produit fini et
sur la pharmacopée à laquelle le produit doit être conforme dans le pays d'origine. Ils doivent également mettre à
disposition les souches d'épreuve utilisées, en précisant leurs biotypes ainsi que les sérums de référence
correspondants, et tout autre moyen de contrôle approprié du produit.
PROCESSUS D'ANALYSE DE RISQUE
L'analyse de risque doit être aussi objective et transparente que possible et se dérouler conformément aux
dispositions énoncées au titre 1.3. du Code terrestre ; de même, la procédure de certification doit être conforme
aux dispositions énoncées au titre 1.2. du Code terrestre. Pour l'essentiel, l'évaluation des facteurs pays et
marchandise ainsi que les mesures de réduction des risques reposent nécessairement sur les données fournies
par le fabricant. Ces données dépendent de l'assurance qualité appliquée à toutes les étapes de la fabrication et
non du seul contrôle exercé sur le produit fini.
Le degré d'exposition à l'intérieur du pays peut varier en fonction de l'usage autorisé du produit dans le pays
concerné. Les Autorités vétérinaires peuvent limiter l'utilisation de certains produits (aux établissements dotés
d'installations de sécurité biologique adaptées, par exemple).
CONFINEMENT BIOLOGIQUE
Des méthodes adaptées de confinement biologique peuvent être nécessaires pour de nombreux types de
produits biologiques. En particulier, l'importation de micro-organismes exotiques doit s'effectuer dans les
conditions prévues au chapitre 1.1.2., « Biosécurité et Biosûreté au laboratoire de microbiologie vétérinaire et
dans les animaleries ».
*
* *
126

contrôle de la stérilité ou de l”absence de contamination des

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