DE LA FISH AUX PUCES A ADN - Association des Techniciens en

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TECHNIQUES
DE
CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :
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DE LA FISH
masque
AUX PUCES A ADN
KARINE CORDIER-COUREL
XXème colloque ATC
Aix-en-Provence - 2010
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LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
Cytogénétique
conventionnelle
Cytogénétique
moléculaire
Biologie moléculaire
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DE LA FISH AUX PUCES A ADN
FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)
v
•
Principe
•
Différents types de sondes
•
Applications
•
Avantages et inconvénients
CGH (Hybridation Génomique Comparative)
v
•
Principe
•
Sensibilité
v
FISH et CGH : Limites des techniques
v
Puces à ADN
•
Définitions
•
Différents types de puces
•
CGH-array
•
Puces à SNP
•
Intérêts, applications, inconvénients
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FISH : Principe
FISH = Fluorescence In Situ Hybridization
v
Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un
génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci
spécifiques et peintures
v
Détection de délétions, identification de translocations ou
d’autres réarrangements chromosomiques
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FISH : Principe
SONDE
CIBLE
ADN double
brin marqué
ADN double
brin (mitoses
ou noyaux
interphasiques)
Dénaturation
thermique
TAAGGATA
ATTCCTAT
Hybridation
complémentaire
37°C O/N
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FISH : Principe
Elimination des
sondes non
spécifiquement fixées
Lavages
La sonde moléculaire
se fixe sur sa cible
Pas de sonde fixée
= délétion
Analyse au microscope en
épifluorescence (filtres adaptés
aux différents fluorochromes)
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FISH : Différents types de sondes
Peintures chromosomiques
Sondes centromériques
M-FISH
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FISH : Différents types de sondes
Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)
Sondes télomériques
RP11-335E8 2p12
Sondes de BACs
RP11-356H17 2p13.3
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FISH : Sondes de BAC
v Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien
dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été
inséré
v Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une
séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de
clonage
bactérien
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FISH : Choix des BACs
v Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en
fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un
gène
d’intérêt
v Séquençage du génome humain
=> Cartographie des chromosomes
=> bases de données
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FISH : Choix des BACs
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?
taxid=9606
University of California Santa Cruz
http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway
Ensembl Genome Browser
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
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FISH : Choix des BACs
NCBI
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FISH : Choix des BACs
NCBI
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FISH : Fabrication de sondes de BAC
Extraction
de l’ADN
bactérien
Culture
bactérienne
Technique « lourde »
6 à 8 jours
BAC
Extraction et
fragmentation
de l’ADN
bactérien
Marquage par
nick-translation
(DNaseI, ADN pol,
dNTP, dUTP*)
cot 1, AcNa, EtOH
Technique rapide
3 à 5 jours
Marquage par
nick-translation
(DNaseI, ADN pol,
dNTP, dUTP*)
Amplification par
PCR (dNTP, amorces,
ADN pol)
Sonde prête à
l’emploi pour
la FISH
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FISH : Applications
v
Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype
v
Précision de points de cassure
v
Origine des marqueurs, dm, hsr
v
Détection des aneuploïdies
v
Détermination du sexe
v
Microdélétions
v
Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle
v
Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle
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FISH : Avantages et Inconvénients
Avantages
v
Technique sensible (noyaux et
Inconvénients
v
Technique lourde nécessitant des
traitements différents selon la
nature de l’échantillon à analyser
(métaphases, noyaux, tissus)
v
Analyse ciblée : Nécessité d’avoir
une idée préalable de la région
chromosomique ou du gène à
étudier
v
3 cibles maximum par test
métaphases)
v
Grand choix de sondes
(commerciales ou « maison »)
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CGH : Principe
ADN de référence
ADN à tester
Co-hybridation
nb copies ADN de
référence > nb copies
ADN test
=> délétion
nb copies ADN test > nb
copies ADN de référence
=> amplification
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FISH et CGH : Limites des techniques
Caryotype
CGH
Analyse globale du génome
Résolution = 5-10 Mb
FISH
Etude ciblée
Résolution = 100-300Kb
Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution?
⇒
Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon?
⇒
Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?
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PUCES A ADN : Définitions
v
Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de
sondes ont été fixées
v
Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou microarrays
v
BAC-array = sondes de BACs
v
DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers
de sondes)
v
DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes)
v
puces « pangénomiques » = ensemble du génome
v
puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une
pathologie
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PUCES A ADN : Différents types de puces
Il existe trois types de technologies :
v
CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par
rapport à un ADN de référence)
Ø
Ø
v
Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) :
résolution limitée (50-200Kb)
Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de
60-mer)
Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina,
Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) +
recherche de régions de perte d’hétérozygotie
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PUCES A ADN : Etapes techniques
v
Extraction de l’ADN
=> quantification (A260nm)
=> pureté (A260nm / A280nm)
=> intégrité (migration sur gel d’agarose)
v
Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR
v
Marquage et Fragmentation
v
Hybridation
v
Lavages
v
Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par
un scanner)
v
Numérisation par un logiciel spécifique
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CGH-array : Principe
v
Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN
(ou ARN/ARN)
v
Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et
témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci
spécifiques présents sur un support solide (lame de verre)
v
Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci
spécifiques et connus sur un génome entier
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CGH-array : Principe
Loci spécifiques (BAC /
PAC / oligonucléotides de
synthèse)
ADN test marqué
en CYA3
Dénaturation et hybridation
sur puce à ADN
Lame de
verre
SCANNER
ADN de référence
marqué en CYA5
Défaut d’ADN
test
Excès d’ADN
test
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CGH-array : Capture et Analyse des résultats
Ex : BAC-array / Array-300 Abbott®
DAPI IV (sondes)
Cy3 (ADN Test)
Cy5 (ADN Référence)
3 spots /
clone
0.8 < T/R < 1.2
=> pas de déséquilibre
•
T/R < 0,8
=> délétion
•
T/R > 1,2
=> amplification
•
ratio T/R calculé
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CGH-array: Exemple d’application
v
Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)
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CGH-array: Exemple d’application
v
Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9)
Peinture du chromosome 9
Peinture du chromosome 5
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CGH-array: Exemple d’application
v
Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®
9p21 - CDKN2A(p16),MTAP
9p11.2 - AFM137XA11
9q21 - D9S166
9q22.3 - PTCH
9q33.2 - DBCCR1
1,13
1,35
1,51
1,41
1,08
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CGH-array: Exemple d’application
v
Résultats analyse sur puce IntegraGen®
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Puces à SNP: Principe
v
Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la
puce
v
Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN
(ou ARN/ARN)
v
L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire
fixée sur la puce
v
Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des
marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier
v
Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Puce SNP6.0 / Affymetrix ®
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Puces à SNP: Analyse des résultats
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Puces à SNP: Analyse des résultats
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Puce SNP6.0 / Genotyping Console / Affymetrix ®
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Allèle Différence
Log2Ratio
Copy Number state
Segments
Fishclones (BACs)
Genomic variants
(polymorphismes)
Refseq (gènes)
Idéogramme / règle
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Puces à SNP: Analyse des résultats
FISH CLONES (BAC)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Refseq (gènes)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Genomic Variants
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Puces à SNP: Analyse des résultats
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Puces à SNP : Résolution
SNP6.0 (Affymetrix)
Cytogenetics Array
(Affymetrix)
Copy Number Marker
1 878 785
2 761 979
SNP
945 806
400 103
RefSeq genes
12 093 (64,7%)
18 270 (97,7%)
Cancer genes
233 (73,3%)
318 (100%)
OMIM genes
8 068 (43,1%)
12 046 (97,6%)
Average marker spacing
(bp)
1,629
1,086
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Puces à ADN : Intérêts
v
Pas de mise en culture des cellules à analyser
v
Analyse l’ADN de tout type de tissus
v
Technique hautement résolutive (< 150 Kb)
v
Analyse pangénomique qui ne nécessite pas d’avoir une idée
préalable de chromosomes impliqués (# FISH)
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Puces à ADN : Applications
v
Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques
v
Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN )
v
Comparaison tumeur/tissu sain
v
Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et
compréhension des mécanismes géniques
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Puces à ADN : Inconvénients
v
Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables
v
Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet)
v
Seuil de sensibilité, mosaïques faibles?
v
Plateau technique onéreux
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CONCLUSION
CIBLES
SUPPORT
CARYOTYPE
5-10 Mb
FISH
Recherche d’
Génome entier
Chromosomes entiers
Régions spécifiques
5 Mb à
100-300 Kb
CGHARRAY /
PUCES ADN
10-300 Kb
INTERETS
(sub-télomèriques,
centromériques, loci,…)
Métaphases
Métaphases
Micro-remaniements
Noyaux
interphasiques
Points de cassures
Génome entier
Marqueurs
Aneuploïdie
Coupes de tissus
Sexe
Technique longue
Peu sensible pour les anomalies
cryptiques (mais technique de
référence en cytogénétique)
TK lourde et peu automatisable
3 cibles / test
Recherche ciblée
Suivi de maladie Analyse de
Loci spécifiques
(BACs ou oligonucléotides
de synthèse)
Anomalies
chromosomiques
LIMITES
tout type d’échantillon
ADN ou ARN
(sang, moelle, tissu sain,
tumeur)
Ne détecte pas les anomalies
chromosomiques équilibrées
Polymorphismes
Détection de déséquilibres
cryptiques non détectable
par les autres techniques
Mosaïques faibles
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Remerciements
v
Département Génétique du Laboratoire
v
Equipe de R&D: Azarnouche Ardalan, Anne Bazin, Catherine
Destigny, Hossein Mossafa
v
Françoise Allamy et son équipe de FISH
v
Sophie Pedronno et son équipe de Biologie moléculaire