Préparation des tissus en microscopie électronique

Type
Réf. Modèle
Réf. Documentaire
Version
Appliqué(e) le
04- Mode opératoire (2
signatures)
003
7405
001
10/02/2012
Pôle Biologie Clinique\Anapath
Préparation des tissus en microscopie électronique
Description de la dernière évolution :
Nom(s) et
fonction(s)
Date
Rédaction
Damien GENTY (Gedi : Rédacteur - CHU\Pôles Directions\Pôles Médicaux\Biologie
Clinique\Anatomie Pathologie), Marianne
PARESY (Gedi : Rédacteur - CHU\Pôles Directions\Pôles Médicaux\Biologie
Clinique\Anatomie Pathologie)
07/02/2012 15:46:52, 09/02/2012 16:08:55
Approbation
Francoise LEMOINE (Gedi : Approbateur - CHU\Pôles Directions\Pôles Médicaux\Biologie Clinique\Anatomie
Pathologie)
10/02/2012 08:39:39
Sommaire
Objet
1
Domaine d'application
1
Référence(s) et document(s) associé(s) .................................................................................... 1
3.1
Référence(s) ......................................................................................................................... 1
4 Définitions et abréviations
2
5 Responsabilités et personne(s) ressource(s) ............................................................................ 2
5.1
Responsabilités ..................................................................................................................... 2
5.2
Personne(s) ressource(s)....................................................................................................... 2
6 Contenu
2
6.1
Acheminement des prélèvements........................................................................................... 2
6.2
Premiere fixation dans le glutaraldehyde a 2% ........................................................................ 2
6.3
Rinçages dans le tampon cacodylate 0,1M ............................................................................. 3
6.4
Post-fixation dans le tétroxyde d’osmium à 2% ....................................................................... 3
6.5
Déshydratation ...................................................................................................................... 3
6.6
Substitution en résine époxy .................................................................................................. 3
6.7
Inclusion ............................................................................................................................... 4
6.8
Préparation des réactifs ......................................................................................................... 4
6.9
Elimination des déchets ......................................................................................................... 5
1
2
3
1 Objet
Technique permettant de préparer les tissus solides en vue d'une étude ultra-structurale.
2 Domaine d'application
Techniciens.
3 Référence(s) et document(s) associé(s)
3.1 Référence(s)
AFAQAP: Guide de bonne exécution des analyses de biologie: arrêté du 6/11/1999.
- Norme européenne NF EN ISO 15189 (octobre 2003): Laboratoires d’analyses de biologie médicale: Exigences particulières
concernant la qualité et la compétence.
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4 Définitions et abréviations
La fixation chimique et l'inclusion en résine des tissus permettent de les conserver dans leur état initial, de les stocker p our
éventuellement confirmer un diagnostic.
5 Responsabilités et personne(s) ressource(s)
5.1 Responsabilités
Médecins et techniciens de laboratoire.
5.2 Personne(s) ressource(s)
5.2.1
Participant(s) à la rédaction
Damien GENTY, technicien de laboratoire.
Marianne PARESY, technicienne de laboratoire.
5.2.2
Référent(s)
Martine DI ZAZZO cadre supérieur de santé.
6 Contenu
6.1 Acheminement des prélèvements
Il est impératif que le tissu soit fixé aussitôt prélevé. Le médecin qui souhaite demander une étude en microscopie
électronique doit s’assurer qu’il y a bien du fixateur dans son service. Le fragment tissulaire doit être rapidement plongé dans
le fixateur (glutaraldéhyde à 2% stocké à +4°C) afin d’éviter les chocs osmotiques et le contact avec l’air qui altèrent l’ul trastructure cellulaire et acheminé directement au laboratoire d’anatomie et cytologie pathologiques
6.2 Première fixation dans le glutaraldehyde à 2%
Travailler sous hotte
A l'aide d’une pince, sortir le prélèvement du pilulier contenant le fixateur et le déposer sur la plaque en téflon. Recouvrir le
tissu avec quelques gouttes de fixateur afin qu'il ne se dessèche pas. Avec une lame de rasoir dégraissée avec de l'alcool,
3
couper en petits fragments d'1 mm maximum. A l'aide d'une pipette en plastique , aspirer le fixateur et une vingtaine de
fragments pour les remettre dans le flacon.
Remarque: pour un tissu tumoral, privilégier les fragments concernant les zones denses et blanchâtres. Eliminer les zones
hémorragiques.
Eliminer le reste du prélèvement dans l'ecobox . La lame de rasoir est jetée dans les boites à objets tranchants. Nettoyer la
plaque de téflon avec la pissette d'alcool.
Mettre le flacon contenant le prélèvement à fixer une heure dans le réfrigérateur .
Stockage: il n'y a pas de sur-fixation avec le glutaraldéhyde. L'échantillon peut éventuellement passer la nuit dans le fixateur si
on ne peut pas aller plus loin dans la technique.
6.2.1
Poumon
L'air contenu dans le poumon ralentit la pénétration du fixateur. Augmenter le temps de fixation jusqu'à deux heures. Si le
prélèvement est suffisamment volumineux, le maintenir immergé à l’aide d’une épingle plantée dans de la cire d entaire. Une
fois la fixation terminée, éliminer le tissu endommagé par l’épingle.
6.2.2
Cerveau
Utiliser une solution de glutaraldéhyde à 3 % et prolonger la fixation jusqu'à quatre heures.
6.2.3
Muscle
Les muscles sont préparés par les techniciennes du secteur des biopsies (voir mode opératoire de traitement des biopsies
musculaires) et un fragment est épinglé sur de la cire dentaire et plongé dans le fixateur(cf GEDI 6887)
Mettre au réfrigérateur 20 minutes.
Sur une plaque en téflon, retirer les épingles et éliminer la cire dentaire. Recouvrir de quelques gouttes de fixateur. A l'aide
d'une lame de rasoir couper les deux extrémités du fragment musculaire altérées par les épingles.
Débiter en cinq fragments en forme de bâtonnet d'1 mm d'épaisseur maximum.
Couper chaque fragment au tiers de sa longueur. On obtient cinq bâtonnets courts en vue de l'orientation longitudinale des
fibres et cinq bâtonnets longs en vue de l'orientation transversale.
Mettre le flacon contenant les fragments de muscle à fixer une heure dans le réfrigérateur.
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6.2.4
Peau
Poser la biopsie sur les lames du hachoir, l'épiderme orienté vers le haut. Glisser les dents du peigne entre les lames. App uyer
sur la biopsie. Récupérer les tranches obtenues à l'aide d'un pic. Plonger dans le fixateur. Mettre l e flacon contenant les
prélèvements de peau à fixer une heure dans le réfrigérateur .
6.2.5
Prélèvement congelé
Plonger le fragment congelé dans le fixateur. Attendre 30 minutes avant de le couper en petits fragments . Mettre le flacon
contenant les prélèvements à fixer une heure dans le réfrigérateur.Cette technique donne une architecture ultra-structurale de
qualité médiocre.
6.2.6
Prélèvement formolé
Couper en petits fragments le prélèvement et passer directement à l’étape 6.3 (rinçages). Cette technique donne une
architecture ultra-structurale de qualité médiocre.
6.2.7
Prélèvement inclus en paraffine
Cette technique donne une architecture ultra-structurale de mauvaise qualité. Préférer la réserve formolée s’il n’a pas été
réalisé de prélèvement pour la microscopie électronique à l’état frais.
3
A l’aide d’une lame de rasoir, prélever dans le bloc BH (histologie) une portion de tissu. Débiter en fragments d’1 mm . Effectuer
les changements de bains suivants :
Déparaffiner dans le xylène 1 heure.
Xylène/éthanol : 30 minutes.
Ethanol : 3x 20 minutes.
Ethanol+ 25% de liquide de rinçage : 20 minutes.
Ethanol+ 50% de liquide de rinçage : 20 minutes.
Ethanol+ 75% de liquide de rinçage : 20 minutes.
Passer directement à l’étape 6.3 (rinçages)
6.2.8
Prélèvement calcifié
Mettre le prélèvement deux heures dans le réfrigérateur à fixer. Eliminer le fixateur à l'aide d'une pipette pasteur. Remplir le
pilulier avec 3 ml environ de liquide de rinçage (tampon cacodylate 0,1M+ saccharose 0,16M – PH 7,3 – 360 mOsm). Effectuer
3 bains de 10 minutes chacun.
Remplacer le dernier bain de rinçage par 3 ou 4 ml de milieu décalcifiant ( EDTA 0,1M dans du tampon cacodylate 0,1M
contenant 0,83% de glutaraldéhyde) et laisser le tissu se déminéraliser dix jours au réfrigérateur.
6.3 Rinçages dans le tampon cacodylate 0,1M
Eliminer le fixateur à l'aide d'une pipette pasteur. Remplir le pilulier avec 3 ml environ de liquide de rinçage.
Effectuer 3 bains de 10 minutes chacun.
Stockage: L'échantillon peut séjourner 48 heures à +4°C dans le liquide de rinçage si on ne peut pas aller plus loin dans la
technique.
6.4 Post-fixation dans le tétroxyde d’osmium à 2%
Fixer 1 heure à +4°C (ne pas dépasser 1h30 : danger de sur-fixation)
Eliminer le fixateur à l'aide d'une pipette pasteur
Rincer 5 minutes dans l'eau distillée
Stockage: Plonger le fragment dans l'acétate d'uranyle à 0,5% si on ne peut aller plus avant. Stockage de 72 heures possible à
4°C.
6.5 Déshydratation
Ethanol à 70% dans l’eau distillée : 3x10 min à température ambiante.
Ethanol à 95% : 3x10mn.
Ethanol pur (sur gel de silice): 3x20mn.
Stockage: Possibilité de stocker 48 heures dans l'éthanol pur à 4°C.
Acétone/éthanol (volume/ volume) : 30mn.
Acétone pur : 1 heure.
6.6 Substitution en résine époxy
NB: sortir les seringues de résine du congélateur 1heure avant leur utilisation.
6.6.1
Imprégnation standard
er
1 bain: résine diluée à 50% dans l'acétone = 1h (sous agitation)
ème
2 bain: résine pure = 1h (+agitateur)
ème
3
bain: résine pure = 1h (+agitateur) dans un pilulier propre.
ème
4
bain: résine fraîche, non congelée = 1 nuit dans un pilulier propre et dans la pompe à vide.
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6.6.2
Imprégnation temps long pour prélèvement "dur" (épiderme, nerf,
prélèvement fibreux).
er
1 bain: résine diluée à 25 % dans l'acétone = 4 heures
ème
2 bain: résine diluée à 50 %= 1 nuit
ème
3
bain: résine diluée à 75 % = 4 heures
ème
4
bain: résine pure = 1 nuit (+pompe à vide).
6.7 Inclusion
Sortir la résine du congélateur 1h avant son utilisation.
Placer les gélules sur les portoirs.
Verser 1 goutte de résine au fond de chaque gélule.
Déposer à l'intérieur un fragment de prélèvement à l'aide d'une pointe montée.
Emplir la gélule jusqu'à 2mm du bord.
Inscrire sur une bandelette de papier d’environ 4mm de large sur 2 cm de long, le N° de l'examen et un sous numéro pour la
gélule (Ex: 1-12 ; 1-12  …)
Faire en général dix gélules.
Cas particuliers: a) biopsie rénale
Inclure la totalité de la biopsie.
b) muscle Inclure 5 fragments (les bâtonnets longs) en transversal dans des moules spéciaux.
c) peau pour recherche de Cadasil Inclure 20 fragments.
.
Mettre les portoirs dans l'étuve à 60°C pendant 48 heures pour la polymérisation de la résine .
Laisser refroidir les gélules au moins deux heures à température ambiante avant de procéder au fraisage.
6.8 Préparation des réactifs
Stocker les solutions au réfrigérateur.
6.8.1
Premier fixateur
Glutaraldéhyde à 2% dans du tampon cacodylate 0,1M-PH 7,3- 400mOsm :
Dans 1 bécher:
Peser 0,04 g de chlorure de calcium
Peser 2,01g de cacodylate de sodium
Ajouter 8 ml de glutaraldéhyde à 25% (congélateur)
Ajouter environ 90 ml d'eau distillée
Agitation magnétique
Ajuster à PH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1N puis 0,5N
Verser dans 1 fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait avec de l'eau distillée.
Glutaraldéhyde à 3 % dans du tampon cacodylate 0,05M-PH 7,3- 400mOsm :
Dans 1 bécher:
Peser 1,07 g de cacodylate de sodium
Ajouter 12 ml de glutaraldéhyde à 25% (congélateur)
Ajouter environ 90 ml d'eau distillée
Agitation magnétique
Ajuster à PH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1N puis 0,5N
Verser dans 1 fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait avec de l'eau distillée
Glutaraldéhyde à 0.83 % dans du tampon cacodylate 0,1M- EDTA 0,1 M -PH 7,3
Dans 1 bécher:
Peser 3.72 g d’EDTA
Peser 2,14g de cacodylate de sodium
Ajouter 3,32 ml de glutaraldéhyde à 25% (congélateur)
Ajouter environ 90 ml d'eau distillée
Agitation magnétique
Ajuster à PH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1N puis 0,5N
Verser dans 1 fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait avec de l'eau distillée
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6.8.2
Liquide de rinçage
Tampon cacodylate de sodium 0,1M+ saccharose 0,16M –PH 7,3 – 360 mOsm
Dans un bécher:
Peser 0,04g de chlorure de calcium
Peser 2,14 g de cacodylate de sodium
Peser 5,09 g de saccharose
Ajouter environ 90 ml d'eau distillée
Agitation magnétique
Ajuster à PH 7,3 avec de l'acide chlorhydrique 1N puis 0,5N
Verser dans 1 fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait avec de l'eau distillée
6.8.3
Post-fixation
Tétroxyde d'osmium à 2% dans un tampon cacodylate de sodium 0,1M + saccharose 0,05M- environ PH7,3 -330 mOsm
Solution stock : tampon cacodylate de sodium 0,2 M
Dans 1 bécher:
Peser 2,14g de cacodylate
Peser 1,71g de saccharose
Ajouter environ 45 ml d'eau distillée
Agitation magnétique
Ajuster à PH 7,42 – 7,44
Verser dans une fiole jaugée de 50 ml et compléter au trait avec de l'eau distillée
Préparation du post-fixateur :
Diluer les ampoules de 5 ml de tétroxyde d'osmium à 4% (réfrigérateur) avec 5 ml de solution stock.
6.8.4
Résine époxy
Dans 1 bécher:
Peser sous la hotte 40,15 g de MNA (durcisseur)
Peser 16 g de DDSA (durcisseur)
Peser 62,7 g de polybed 812 (résine base)
10 mn à l'étuve à 60°C pour diminuer la viscosité des produits et faciliter le mélange.
Agitation magnétique 20mn – ajuster la vitesse du barreau pour permettre un mélange suffisant des résines mais sans
formation de bulles d'air.
Ajouter 2,5 ml de BDMA (accélérateur )
Continuer l'agitation 10 mn
La résine non utilisée peut être congeler jusqu’à 4 mois : aspirer la résine dans des seringues de 5, 10 ou 20 ml et boucher
avec une aiguille. Congeler.
6.9 Elimination des déchets
Seuls les bains d'alcools sont éliminés à l'évier
L'acétate d'uranyle est un produit radioactif. Quand la bouteille de déchets est pleine, prévenir le cadre médico -technique qui
s'occupera de contacter la personne de l’I.B.C. se chargeant du relais entre l'hôpital et l'ANDRA
Sous la hotte, il existe quatre récipients à déchets:
- glutaraldéhyde + cacodylate
- tétroxyde d'osmium ( ajouter 100 ml d' huile d'arachide)
- acétone + alcool
- acétone + résine
Quand les récipients sont pleins, faire une liste des produits et de leur volume à remettre au cadre médico-technique et les
porter dans le local à alcools.
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