Méthode standard de préparation des échantillons pour la

Méthode standard de préparation des échantillons biologiques pour
la microscopie électronique en transmission (TEM)
1. Fixation chimique
- Prélever l’échantillon le plus rapidement possible et le couper en petits fragments
d’environ 1mm de côté sous forme de cube si l’orientation est aléatoire ou sous
forme de parallélépipède.
- Immerger directement l’échantillon dans une solution à 2,5% en glutaraldéhyde et à
0,1M en cacodylate pH 7,4. Le laisser pendant 2h30 à 4°C.
- Le rincer 3 x 10 minutes avec une solution à 0,2M en cacodylate pH 7,4.
- Le plonger, ensuite, pendant 1h à 4°C dans une solution d’acide osmique à 1% et
de cacodylate 0,1M pH 7,4.
- Le placer dans la solution à 0,2M en cacodylate pH 7,4. Il peut y être conservé
plusieurs semaines…
2. Déshydratation
Rincer l’échantillon dans différents bains d’alcool :
-
Dans l’éthanol à 30°, 1 x 5 minutes, puis 1 x 10 minutes,
-
dans l’éthanol à 50°, 1 x 5 minutes, puis 1 x 10 minutes,
-
dans l’éthanol à 70°, 1 x 5 minutes, puis 1 x 10 minutes,
-
dans l’éthanol à 85°, 1 x 5 minutes, puis 1 x 10 minutes,
-
enfin, 3 x 10 minutes dans l’éthanol absolu.
3. Enrobage ou inclusion en résine
- Rincer l’échantillon 4 x 5 minutes dans l’oxyde de propylène.
- Sous hotte et en l’agitant, le laisser 2 x 15 minutes dans un mélange 1:1 oxyde de
propylène et résine.
- Toujours en l’agitant, le mettre 1 x 30 minutes à l’étuve à 37°C dans la résine pure.
- Placer l’échantillon dans un moule ou une gélule et le recouvrir de résine nouvelle.
- Le faire passer successivement dans une étuve à 37°C (une nuit), dans une étuve
à 45°C (une journée) et dans une étuve à 60°C (trois jours).