TP10 TP CONTRÔLE

TP10 TP CONTRÔLE
BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR BIOANALYSES ET CONTROLES
Durée : 4 h
LA LEVURE DE MELASSE
Elle est reconnue pour ses vertus nutritionnelles et thérapeutiques, de plus sa fabrication simple, rapide
et peu coûteuse permet d'envisager une production massive en faveur des hommes souffrant de
carence alimentaire.
La levure de mélasse est utilisée au laboratoire de fermentation en vue de l'obtention de la βfructosidase L'étude portera sur la purification de l'enzyme à partir du moût de fermentation.
Après fermentation, les cellules sont séparées du moût par centrifugation et broyées. On obtient un
extrait brut B dont on prélève un aliquot pour analyse, le reste subissant diverses étapes de purification
qui conduisent à l'extrait purifié P.
MOUT
centrifugation
broyage
↓
↓
CELLULES
SURNAGEANT(éliminé)
↓
BROYAT CELLULAIRE
centrifugation
↓
EXTRAIT BRUT B
(volume 2,00 litres)
purification
DEBRIS CELLULAIRES
(éliminés)
↓
EXTRAIT PURIFIE P
(volume 0,80 litre)
1. Mesure de l'activité enzymatique des extraits B et P
La β-fructosidase catalyse la réaction suivante :
Saccharose + H2O
→
Glucose + Fructose (sucre inverti)
La mesure de l'activité est réalisée par la méthode "deux points" et la variation de concentration du
produit obtenu est mesurée par le dosage des sucres réducteurs formés par colorimétrie au 3-5
dinitrosalicylate (3-5 DNS). On appelle sucre inverti le mélange équimolaire de Glucose et Fructose.
1.1. Étalonnage et contrôle
Le 3,5-DNS (acide 3,5-dinitrosalicylique) forme quantitativement, à chaud, avec les sucres réducteurs un
dérivé rouge orangé dont l'absorbance est mesurée à 530 nm.
Le développement de la coloration à 100°C et les mesures d'absorbance des contrôles devront être
menés simultanément.
Cette réaction n'est pas stoechiomètnque et est liée au temps d'incubation à 100°C; le candidat veillera
donc :
à placer ses tubes dans un bain marie à ébullition. avec un niveau d ;eau dépassant le niveau de
liquide dans les tubes ;
à mesurer le temps d'incubation à 100°C avec précision : à refroidir immédiatement après la
sortie du bain marie dans un bain d'eau froide.
Fanny Demay
BTS BioAnalyses & Contrôles
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Réaliser la gamme d'étalonnage suivante (volumes en mL) :
Tubes n°
Solution de sucre inverti à 5mmol/L
(glucose à 5mmol/L et fructose à
5mmol/L)
Eau distillée
0
1
2
3
4
5
0
0,25
0,5
0,75
1
1 25
Solution de saccharose à 0,3mol/L
1
1
1
1
1
1
Solution de 3-5 DNS
2
2
2
2
2
2
Qsp 2mL
Boucher les tubes avec du papier aluminium. Les porter au bain-marié bouillant pendant 5 minutes
exactement. Refroidir dans un bain d'eau froide, et ajouter 12 mL d'eau distillée dans chaque tube.
Homogénéiser et laisser reposer environ 15 minutes.
Lire l'absorbance à 530 nm contre le tube 0.
Déterminer le nombre de micromoles de sucre inverti par tube de gamme. A l'aide d'un ordinateur, tracer
la courbe d'étalonnage : Abs = f (sucre inverti / tube). Valider les points expérimentaux et donner les
paramètres de la droite de régression.
1.2. Validation
Réaliser 2 essais contrôles dans les mêmes conditions que la gamme étalon avec 2 mL de la solution
contrôle à 2,5 mmol/L de glucose et à 2,5 mmol/L de fructose
Déterminer l'inexactitude relative de la méthode.
Valider la mesure; la méthode est validée par un résultat compris entre la valeur cible moins 2 s r et la
valeur cible plus 2 sr.
Données: le coefficient de variation (C.V.) de la méthode est de 2 %
C.V. = sr x 100 / valeur cible du contrôle ; (sr = écart type de reproductibilité)
2. Détermination de l'activité enzymatique des extraits B et P
Diluer l'extrait B au 1/50 et l'extrait P au 1/100, et réaliser les tubes suivants :
Extrait dilué
1 mL
Eau déminéralisée
0,5 mL
Tampon acétate pH 4.7
0,5 mL
Préchauffer 5 minutes au bain-marié à 30°C. Déclencher la réaction par addition de 1 mL de solution de
saccharose à 0,3 mol/L, préalablement préchauffée à 30°C.
Après 5 minutes, arrêter la réaction par ajout de 2mL de réactif au 3-5 DNS et agiter le contenu. Porter
au bain-marie bouillant pendant exactement 5 minutes puis refroidir ; ajouter 12 mL d'eau déminéralisée.
Homogénéiser et laisser reposer environ 15 minutes.
Lire l'absorbance contre le tube 0.
Déterminer les activités enzymatiques volumiques des extraits B et P, en U/mL d'extrait.
L'unité d'invertase (U) est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une micromole de
saccharose (ou l'apparition d'une micromole de sucre inverti) par minute, dans les conditions opératoires
décrites.
Fanny Demay
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3. Dosage des protéines par la méthode de Kjeldahl
3.1. Étalonnage d'une soude de concentration voisine de 0,1 mol/L (2 essais)
La soude sera étalonnée par pesée d'hydrogénophtalate de potassium en présence de phénolphtaléine:
peser exactement une masse d'hydrogénophtalate de potassium (monoacide faible ; MM 204,2 g/mol)
voisine de 0,2 g et étalonner la soude selon le protocole suivant :
- transvaser quantitativement la poudre dans un Bêcher,
- ajouter environ 20 mL d'eau déminéralisée, quelques gouttes de phénolphtaléine
- verser la soude jusqu'au virage de l'indicateur.
Déterminer la concentration de la soude.
Valider la répétabilité de l'étalonnage selon la norme ISO 5725-6 ; données : s r = 0,5 mmo/L (avec s r:
écart type de répétabilité) ; voir annexe, cas d'une « manipulation coûteuse »
3.2. Dosage du minéralisât
On a réalisé la défécation de 0,1 litre d'extrait brut et de 0,3 litre d'extrait purifié. On a minéralisé les
deux défécats et obtenu 30 mL de minéralisât B (pour l'extrait brut) et 30 mL de minéralisât P (pour
l'extrait purifié).
Le dosage pour le minéralisât B a donné une teneur en azote de 3,64 g par litre de minéralisât.
Le dosage sur le minéralisât P a été réalisé dans le distillateur de Kjeldahl selon le protocole suivant on
a introduit : 5 mL de minéralisât, quelques gouttes de phénolphtaléine, puis on a ajouté environ 10 mL
de lessive de Soude décarbonatée.
On a distillé environ 10 mL, en recueillant le distillât dans un flacon étiqueté "distillât P" et contenant
exactement 20 mL de solution d'acide sulfurique de concentration voisine de 0,05 mol/L.
Transvaser quantitativement le contenu du flacon "distillât P" dans un Erlen et doser, en présence de
quelques gouttes de rouge de méthyle, l'excès d'acide sulfurique par une solution d'hydroxyde de
sodium, de concentration voisine de 0,1 moi/L.
Réaliser un témoin sans distillation.
Déterminer la concentration molaire en ammoniac du « distillât P », puis la concentration
massique en azote protéique du minéralisât P (donnée N = 14 g/mol)
Déterminer la concentration en protéines des extraits B et P en mg/mL d'extrait (les protéines dosées
/contiennent 16 % d'azote). Déterminer l'activité spécifique des extraits B et P. (On aurait pu en déduire
le rendement et l'enrichissement de la purification réalisée, mais exceptionnellement aujourd'hui, je suis
gentil...)
Données : L'azote non protéique est négligeable.
Remarque : il est totalement stupide de faire un dosage de protéines par Kjeldahl lors d'une purification
d'enzyme mais un jour d'examen....On ne discute pas !
Annexe : Logigramme norme ISO 5725-6
Fanny Demay
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LA LEVURE DE MELASSE
matière d’œuvre par poste
MATERIEL
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
tubes à essais
10
fiole jaugée de 50mL
1
fiole jaugée de 100mL
1
pipette jaugée de 1mL
1
pipette jaugée de 20mL
1
pipette graduée de 2mL
1
pipette auto P1000
1
pipette auto P5000
1
burette de 25mL (grande taille)
1 pour 2
erlen de 200mL + becher poubelle 1
Bêcher de 100mL
papier d'aluminium, papier filtre, papier joseph, parafilm
1 pince en bois
2 capsules de pesées
Cuves de spectrophotomètre : 7 à prendre dans une boite neuve
REACTIFS
- solution de glucose à 0,005mol/L et fructose à 0,005mol/L
- solution contrôle sucres contenant glucose à 0,0025mol/L et fructose à 0,0025mol/L
- solution de saccharose à 0,3mol/L
- tampon acétate pH 4,7 à 0,05mol/L
- solution 3,5-Dinitrosalicytrate 3-5DNS
- Extraits B et P :
- Extrait P
- Extrait B
- Solution d'acide sulfurique H2SO4 à environ 0,05mol/L
- « distillat P » environ 30mL dans un flacon bouché
- Solution d'hydroxyde de sodium NaOH à environ 0,1mol/L
- Rouge de méthyle en flacon compte gouttes (1 pour 2 postes)
- Phénolphtaléine en flacon compte gouttes (1 pour 2 postes)
10 mL
5 mL
20 m L
5mL
30 m L
2 mL
2 mL
50 mL
120 mL
MATERIEL COMMUN
- Flacons d'hydrogénophtalate de potassium (en salle des balances)
- 2 bains-marie bouillants sur les paillasses latérales
- spectrophotomètre 530 nm
- 1 bain-marie à circulation à 30°>C + thermomètre précis autour de 30°C en bout de paillasse
- 1 Vortex par paillasse
- 2 flacons distributeurs réglés à 12mL contenant de l'eau déminéralisée
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